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Articolo metodologico

Un modello topino ex vivo per l'infiammazione del tessuto adiposo ad alto contenuto di grassi

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DOI:

10.3791/71651

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14 luglio 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Anatomy, Leipzig University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Utilizzando un modello ex vivo di espianti, piccoli pezzi della porzione rostrale del tessuto adiposo bianco viscerale di topi magri vengono coltivati per 7–10 giorni, permettendo l'induzione e lo studio dell'infiammazione del tessuto adiposo durante l'alimentazione ricca di grassi.

Abstract

Questo protocollo descrive un modello topino ex vivo che riproduce alcune caratteristiche cellulari e infiammatorie osservate nel tessuto adiposo viscerale (VAT) dopo l'alimentazione a dieta ad alto contenuto di grassi (HFD), senza intervento dietetico in vivo. Piccoli espiantili VAT di topi magri vengono coltivati per 7–10 giorni, durante i quali sviluppano spontaneamente un fenotipo infiammatorio molto simile a quello della IVA degli animali nutriti con HFD. È importante sottolineare che il modello preserva l'architettura del tessuto adiposo (AT), consentendo l'indagine dei processi infiammatori in un contesto fisiologicamente rilevante. Durante la coltura, emergono i principali segni distintivi dell'infiammazione correlata all'obesità, tra cui la formazione di strutture a forma di corona (CLS), l'accumulo di macrofagi (MMe) attivati metabolicamente e l'aumento della produzione di citochine infiammatorie. Nonostante la morte degli adipociti, altri fattori che causano infiammazione correlata all'obesità, tra cui stress metabolici come acidi grassi saturi, alterazione della gestione dei lipidi, eccesso di glucosio, stress ossidativo, ipossia, squilibrio delle adipochine e segnalazione paracrina–cellule immunitari, possono essere parzialmente rappresentati nel modello. Il sistema supporta un'ampia gamma di applicazioni a valle, tra cui imaging in tempo reale, citometria a flusso, PCR quantitativa, ELISA, immunocolorazione e sequenziamento di RNA a base o a singola cellula. Inoltre, trattamenti farmacologici e basati su citochine possono essere applicati per indagare le vie di segnalazione e le risposte specifiche per tipo cellulare. Questo modello facilmente personalizzabile si allinea ai principi delle 3R, riducendo l'uso animale per studi alimentari in vivo . Il modello è riproducibile, conveniente e semplice da implementare, offrendo una piattaforma versatile per studiare la morte degli adipociti, la dinamica delle cellule immunitarie e le strategie terapeutiche nell'infiammazione dell'AT.

Introduzione

Il tessuto adiposo (AT) è un organo metabolicamente attivo composto da circa il 20% di adipociti e da una miscela eterogenea di cellule immunitari, fibroblasti, cellule progenitrici e cellule vascolarinell'uomo. 1. L'AT è classificata in tessuto adiposo bianco uniloculare (WAT), tessuto adiposo marrone multiloculare (BAT) e tessuto adiposo beige intermedio, riflettendo eterogeneità nella composizione, funzione e posizione anatomica. La WAT è distribuita tra depositi sottocutanei (SCAT), viscerali (VAT), perivascolari e midollo adiposo, che differiscono per origine dello sviluppo, profili di espressione genica e funzione metabolica. Oltre al suo ruolo nell'immagazzinamento lipidico, l'AT funziona come organo endocrino secretando citochine, ormoni eadipochine 2. Rispetto allo SCAT, la VAT è più metabolicamente attiva e arricchita nelle cellule infiammatorie, rendendola particolarmente rilevante per studi sull'infiammazione dell'AT e sulle malattie metaboliche come il diabete di tipo 2 3,4,5.

L'AT è un regolatore chiave della salute metabolica e svolge un ruolo centrale nell'obesità, che è associata a numerose comorbidità. L'obesità favorisce l'ipertrofia degli adipociti, l'iperplasia e laproliferazione 6, mentre l'espansione e l'infiammazione dell'AT sono fortemente correlate con iperglicemia, iperinsulinemia, ipertrigliceridemia e tolleranza alglucosio compromessa 3. Si presume che l'espansione dell'AT sia accompagnata da un aumento della mortalità degli adipociti, con circa il 10% di ricambio cellulareannuale 7, che innesca il reclutamento di macrofagi essenziale per la pulizia e il rimodellamento deitessuti 8. Poiché gli adipociti sono sostanzialmente più grandi (100–200 μm) dei macrofagi, una fagocitosi efficiente da parte di queste cellule circa cinque volte più piccole è una sfida, compromettendo così l'omeostasi tissutale e favorendo l'infiammazione cronicadell'AT 9. I macrofagi del tessuto adiposo (ATM) mediano l'eliminazione degli adipociti morenti sovradimensionati sia fondendosi in cellule giganti multinucleate (MGC) sia formando strutture simili a una corona (CLS) attorno agli adipociti morti e degradandoli tramite esocitosilisosomica 10,11,12. L'abbondanza di CLS è correlata all'infiammazione associataall'obesità 11,13.

Negli AT sani, gli ATM sono prevalentemente macrofagi anti-infiammatori simili a M2, mentre l'obesità favorisce uno spostamento verso un fenotipo pro-infiammatorio simile aM1 14,15. Emergono sottogruppi meccanicisticamente distinti di macrofagi, inclusi macrofagi metabolicamente attivati (MMe) e macrofagi associati ai lipidi (LAM), che svolgono ruoli importanti nell'eliminazione degli adipociti morti tramite esocitosilisosomica 16,17,18.

Per indagare l'infiammazione dell'AT in un ambiente multicellulare fisiologicamente rilevante, il protocollo ha stabilito un modello topino ex vivo basato su colture organotipiche di impianto di VAT derivate da topi magri. Gli expiantili VAT coltivati per 7–10 giorni sviluppano un fenotipo infiammatorio comparabile a quello osservato dopo almeno 12 settimane di alimentazione ad alto contenuto di grassi (HFD) per quanto riguarda la formazione del CLS, il fenotipo dei macrofagi e la produzione di citochineinfiammatorie 9,19. È importante sottolineare che questo approccio riduce l'uso degli animali, elimina la necessità di approvazioni per interventi alimentari e contribuisce ai principi delle 3R riducendo la dipendenza da studi di intervento dietetico a lungo termine. Rispetto ai tradizionali sistemi di coltura cellulare bidimensionale (2D), come i modelli di coltura a singola cellula (ad esempio, cellule 3T3-L1 o colture primarie di adipociti), questo metodo preserva la complessità tissutale e la diversità cellulare, consentendo così di studiare le interazioni fisiologiche cellula-cellula, comprese quelle tra cellule immunitarie e adipociti.

Gli espiantili AT colti sono compatibili con una vasta gamma di approcci analitici. L'imaging confocale dal vivo consente il monitoraggio dell'accumulo di ATM, della formazione di CLS e della formazione diMGC 9,19. La digestione della collagenasi consente l'isolamento della frazione vascolare stromale (SVF) per analisi citometriche di flusso, inclusi saggi di proliferazione e la determinazione dei fenotipi12 simili a M1, M2 o MMe. Analisi dell'espressione genica, inclusa la PCR quantitativa (qPCR) e il sequenziamento dell'RNA, possono essere eseguite su interi expianti, cellule SVF o macrofagiselezionati 9. L'espressione proteica e l'attività enzimatica possono essere valutate tramite Western blotting o ELISA12,20,21, mentre l'architettura tissutale e l'espressione dei marcatori possono essere visualizzate tramite colorazione intera e immunofluorescenza 9,22. Inoltre, interventi farmacologici e genetici, tra cui la deplezione dell'ATM e il trattamento con citochine, sono facilmente fattibili 21,23,24.

In sintesi, questo modello topino ex vivo di infiammazione AT simile all'HFD consente di indagare la morte degli adipociti, l'osservazione diretta in situ del comportamento cellulare e manipolazioni farmacologiche o genetiche rilevanti per l'immunologia AT (Figura 1).

figure-introduction-1
Figura 1: Riassunto grafico del flusso di lavoro. Il tessuto adiposo viscerale (AT) viene isolato dai topi, tagliato in piccoli expianti e coltivato per 7–10 giorni. Durante il periodo di coltura, gli espianti sviluppano un fenotipo infiammatorio, consentendo lo studio dell'infiammazione del tessuto adiposo in condizioni controllate ex vivo . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali e sono stati approvati dalle autorità regolatorie competenti. Csf1r-eGFP-Adipoq-ERT2-Cre-CAG-td Sono stati utilizzati topi di pomodoro ("MacFat", RRID: Csf1r-eGFP: RRID:IMSR_JAX:018549, Adipoq-iCreERT2: RRID:IMSR_JAX:025124, CAG-tdTomato: RRID:IMSR_JAX:007914)27,28 per esperimenti di microscopia rappresentativa. Questa linea di segnalazione consente la visualizzazione dei macrofagi tramite l'espressione di GFP e degli adipociti tramite l'espressione di tdTomatoes. Poiché l'espressione del tdTomato si perde dopo la morte degli adipociti, la vitalità degli adipociti può essere monitorata durante la coltura. I topi reporter Csf1r-eGFP ("MacGreen", RRID:IMSR_JAX:018549)28 sono stati utilizzati per la visualizzazione dei macrofagi e le analisi della citometria a flusso. I topi C57BL/6J (RRID:IMSR_JAX:000664) sono stati utilizzati per esperimenti non di immagini, inclusi analisi scRNA-seq e qPCR. Tutte le linee transgeniche sono state mantenute come topi eterozigoti su uno sfondo C57BL/6J.

Gli esperimenti sugli animali seguivano i 'Principi di cura degli animali da laboratorio' (pubblicazione NIH n. 85e23, revisionata nel 1985) e specifiche leggi nazionali e furono approvati dalle autorità locali dello stato di Sassonia: Landesdirektion a Lipsia, Germania (applicazione sperimentale sugli animali: TV11-21-MEZ). Secondo le autorità locali, gli esperimenti descritti non costituiscono test sugli animali, poiché si afferma che "se un vertebrato viene ucciso esclusivamente per utilizzare i propri organi o tessuti a fini scientifici, ciò non è considerato test sugli animali ai sensi della § 7(2) dell'Animal Welfare Act (TierSchG), ma piuttosto uccisione ai sensi della § 4(3) dell'Animal Welfare Act (TierSchG)." L'uccisione degli animali deve essere riportata in un 'rapporto sugli animali'. Questo rapporto è incluso nella domanda di sperimentazione animale. Anche il comitato etico della Facoltà di Medicina dell'Università di Lipsia ha approvato i progetti di ricerca. Secondo le linee guida dell'applicazione sperimentale animale TV11-21-MEZ, i topi vengono eutanasiati con un'overdose dell'isoflurano anestetico inalato. Una concentrazione efficace di gas (5% nel gas portatore O₂) viene fornita tramite un vaporizzatore di isoflurano. La procedura di eutanasia si completa quando viene confermato un arresto circolatorio definitivo (assenza di respirazione [test della piuma] e battito cardiaco [palpazione]).

I topi sono stati ospitati in una struttura a temperatura controllata (22 ± 2 °C), senza patogeni specifici, presso l'Università di Lipsia, in gruppi fratelli di 3–5 animali durante un ciclo di 12 ore di luce e oscurità. Gli animali avevano accesso ad libitum all'acqua e a una dieta standard di cibo (9% kcal grassi; Sniff GmbH, Germania). Sono stati condotti esperimenti rappresentativi utilizzando maschi e femmine di topi. I reagenti, le sostanze chimiche e i kit utilizzati nel protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparativi

  1. Prepara reagenti e attrezzature
    1. Prepara il mezzo di coltura in condizioni sterili integrando RPMI-1640 con siero fetale bovino (FBS) al 10% e soluzione antibiotica all'1%.
    2. Riscaldare il mezzo di coltura e il PBS sterile a 37 °C.
    3. Pulire tutte le attrezzature e l'area di lavoro all'interno della cappa di coltura tissutale con il 70% di etanolo.
  2. Prepara gli animali
    1. Sacrifica i topi secondo le linee guida istituzionali. Opzionalmente, pesa gli animali.
    2. Metti gli animali in un becher di vetro contenente il 70% di etanolo.
    3. Strofina l'esterno del vaso di vetro con etanolo e trasferiscilo nel cappuccio della coltura tissutale.

2. Isolamento del tessuto adiposo (Figura 2)

  1. Prepara il topo
    1. Metti il topo in posizione supina in una piastra di vetro usando una pinza smussata, oppure fissalo su una tavola disseczionale.
    2. Aggiungi uno strato sottile di PBS preriscaldato a una piastra di Petri.
    3. Cambia con un paio di guanti nuovi.
    4. Solleva la pelle addominale inferiore con una pinza e fai una piccola incisione orizzontale con forbici per aprire la cavità addominale.
    5. Effettuare un'incisione verticale (~2 cm dal caudale al rostrale) che si estende dal taglio iniziale per esporre gli organi interni.
  2. Isola il cuscinetto adiposo
    1. Utilizzando piccole forbici affilate e pinze appuntite, individua ed elimina il tessuto adiposo bianco. Usa un set separato di strumenti per prevenire la contaminazione.
    2. Maschi di topi: Il grasso gonadale è attaccato solo all'epididimo e al testicolo. Solleva con cura il cuscinetto adiposo e taglia sopra l'epididimo, oppure elimina epididimo e testicolo insieme al grasso gonadale e rimuovili dopo.
    3. Topi femmine: Il grasso gonadadico è attaccato al corno uterino e alle ovaie ed è più prominente rispetto ai maschi. Sollevare con attenzione il cuscinetto adiposo e accisa lungo il corno uterino e le ovaie.
    4. Metti i cuscinetti isolati di grasso nella piastra di Petri riempita di PBS.
    5. Rimuovere epididimi residui, testicoli, ovaie o vasi sanguigni utilizzando una lametta.
    6. Trasferisci il pad grasso pulito in una seconda piastra di Petri contenente PBS già riscaldato. Opzionalmente, pesa i cuscinetti grassi.
      NOTA: Pesare i cuscinetti adiposi prima della coltura permette la normalizzazione della massa tissutale tra una condizione sperimentale e l'altra.

figure-protocol-1
Figura 2: Isolamento e coltura degli espianti viscerali di tessuto adiposo. (A,B) Apertura della cavità addominale ed esposizione del tessuto adiposo viscerale. (C, D) Isolamento del tessuto adiposo epididimale dai topi maschi, il grasso è attaccato all'epididimo (cerchi rossi) e al testicolo (cerchi blu). (E, F) Isolamento del tessuto adiposo gonadico dalle femmine di topi, il grasso è attaccato al corno uterino (cerchi verdi) e alle ovaie. (G, H) Preparazione e potatura degli espianti di tessuto adiposo. (I, J) Trasferimento degli espianti nei pozzi di coltura e posizionamento degli inserti di coltura cellulare. (K, L) Immagini rappresentative degli espiantili durante la coltura in lastre a 6 pozzi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Preparazione e coltura dell'impianto

  1. Prepara le espiantitanze
    ATTENZIONE: Le lame sono affilate e possono causare ferite. Maneggiare con cura e smaltire le lame in conformità con le procedure di sicurezza istituzionale.
    1. Taglia il cuscinetto adiposo in strisce e poi in cubetti di circa 10mm 3 (~10 mg per espiante) usando una lametta.
  2. Stabilire colture di espiantitandi
    1. Aggiungi 1–1,5 mL di substrato colturale a ciascun pozzo di una piastra a 6 pozzi.
      NOTA: Per la normalizzazione, utilizzare circa 50 mg di tessuto adiposo per 1 mL di mezzo di coltura.
    2. Trasferisci cinque espianti in ciascun pozzo usando un cucchiaio o una spatola sterile.
    3. Disposizionete le espiantiere in modo uniforme in un motivo circolare.
    4. Copri gli espianti con un inserto di coltura cellulare usando pinze sterili.
      NOTA: Evita di introdurre bolle d'aria durante il posizionamento degli inserti e assicurati che gli expianti siano centrati al loro interno.
    5. Incubare gli eximpianti a 37 °C, 5% CO₂ e 21% O₂ per 7–10 giorni.
      NOTA: Usa PBS preriscaldato e mezzo di coltura per migliorare la vitalità del tessuto. Lavora rapidamente per ridurre al minimo il tempo in cui i cuscinetti adiposi rimangono fuori dall'incubatrice. Evita la contaminazione con il pelo del topo. Se i peli aderiscono al tessuto, rimuovi e sciacqualo con PBS caldo.

4. Analisi a valle

  1. Dopo il periodo di coltura di 7–10 giorni, si raccolgono espianti, cellule della frazione vascolare stromale o supernatanti per analisi a valle, inclusi microscopia, citometria a flusso, qPCR, ELISA o sequenziamento RNA, secondo necessità per l'endpoint sperimentale.

5. Analisi statistica

  1. Esegui analisi statistiche utilizzando GraphPad Prism 10.2. Selezionare i set di dati per gli outlier utilizzando il test ROUT (Q = 1%) e valutare la normalità usando il test di Shapiro–Wilk (α = 0,05).
  2. Confrontare due gruppi utilizzando test t di Student accoppiati o test Wilcoxon a coppie abbinate, se appropriato. Confronta più gruppi usando ANOVA unidirezionale seguita dal test post hoc di Dunnett. Consideriamo differenze statisticamente significative a p < 0,05.
  3. Presenta i dati come media ± SEM. Salvo diversa indicazione, defini n come il numero di repliche biologiche (singoli topi).

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Risultati

La vitalità generale del tessuto è stata mantenuta durante tutto il periodo di coltura ed è stata monitorata utilizzando diversi approcci complementari. La vitalità tissutale può essere valutata tramite microscopia confocale utilizzando coloranti di vitalità comeCalcein 25, colorazione con anticorpi contro Perilipina per valutare l'integrità della membranaadipocitaria 17,26, o espressione di proteine repor...

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Discussione

Data la crescente prevalenza globale di malattie metaboliche e diabete, comprendere i meccanismi alla base dell'infiammazione del tessuto adiposo (AT) rimane un importante obiettivo di ricerca. Per rispondere a questa esigenza, è stato sviluppato un sistema di coltura ex vivo per espianti-pianticelle che consente l'induzione e l'analisi dell'infiammazione AT in condizioni sperimentali controllate.

Un requisito critico di questo metodo è la conservazio...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Constance Hobusch e Florian Kirmse per l'eccellente assistenza tecnica. Le analisi di citometria a flusso sono state effettuate presso il Core Unit Fluorescence Technologies dell'Università di Lipsia, con il supporto tecnico di Kathrin Jäger e Pia Glöckner. Questo lavoro fu sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione Tedesca per la Ricerca), Progetto Numero 209933838 – SFB 1052 (Progetto B09).

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Materiali

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Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BD OptEIA Mouse TNF ELISA KitBD Biosciences560478
Bodipy 558/568 C12Flow cytometry: 1:10000; Staining: 1:2000InvitrogenD3835
Bovine Serum Albumin3%SigmaA9647
CD107a (LAMP1) – AF647Staining: 1:100; Flow cytometry: 1:200BioLegend121610
CD11c – BV605Flow cytometry: 1:100BioLegend117334
CD16/32Flow cytometry: 1:100Invitrogen14-0161-82
CD301 – AF647Flow cytometry: 1:50Bio-RadMCA2392A647
CD36 – PEFlow cytometry: 1:400BioLegend102606
CD45 – PEFlow cytometry: 1:100BD Pharmingen555483
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 350 Flow Cytometry Assay KitEdU: 5 µMInvitrogenC10632
Clodronate Liposomes500 µg/ml clodronateLiposoma
Collagenase Type 21 mg/ml, 315 U/mgWorthingtonLS004176
CyQUANT LDH Cytotoxicity Assay KitInvitrogenC20301
DAPIFlow cytometry: 0.2 µg/mlThermo Fisher62248
Ethanol70%Carl RothT913.1
F4/80 – AF647Flow cytometry: 1:100InvitrogenMF48021
F4/80 – PE-Cy7Flow cytometry: 1:200Invitrogen25-4801-82
Fetal Calf Serum1.10Gibco10270106
Fetal Calf Serum1.20Gibco10270106
HBSS (-Mg, -Ca)Gibco14170138
HEPES13 mMRothHN77.2
Hoechst 333421:10,000Life TechnologiesH3570
LysoTracker – AF647Flow cytometry: 1:20000; Staining: 1:10000InvitrogenH34477
MAC-2Staining: 1:1000CedarlaneCL8942AP
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µmMerck MilliporePICM0RG50
PBS (-Mg, -Ca)Gibco14190169
PBS (-Mg, -Ca)Gibco14190169
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/ml)0.111111111Gibco11548876
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/ml)0.111111111Gibco11548876
Perilipin2 µg/mlAbcamab3526
Plexxicon 562240 µMPlexxicon Inc.HY-114153
RPMI-Media 1640with 11 mM glucoseSigma AldrichR8758
RPMI-Media 1640SigmaR8758
TC-Insert for 6-well platesSarstedt83.3930.040
TPP tissue culture test plate 6TPP92006
Triton X-1001%Carl Roth3051.2
Zinc chloride0.8 mMSigmaZ0152
Zinc formalinePolyscience21516-3.75
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Riferimenti

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