Articolo metodologico

Evocazione anticipata di vocalizzazioni ultrasoniche appetitose in ratti e topi da laboratorio

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DOI:

10.3791/71661

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3 luglio 2026

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1Department of Speech, Language, and Hearing Sciences, Purdue University

In questo articolo

Sommario

Le vocalizzazioni a ultrasuoni di ratto e topo da laboratorio (USV) sono utili per studiare la funzione vocale e neurale. Questo protocollo descrive un paradigma cibo-ricompensa che esegue in modo affidabile USV appetitivi senza confondere l'accoppiamento. Descrive il condizionamento animale, la presentazione degli stimoli, la registrazione e l'analisi acustica, fornendo un metodo riproducibile per studiare la funzione affettivo-motivazionale e sensitivomotoria cranica.

Abstract

Le vocalizzazioni ultrasoniche (USV) in ratti e topi da laboratorio forniscono un modello prezioso per indagare la funzione vocale, il comportamento affettivo e i meccanismi neurali sottostanti che guidano la vocalizzazione. Molti paradigmi di elicitazione dell'USV comunemente utilizzati si basano sull'accoppiamento o sull'interazione sociale, che può introdurre confondenze ormonali e comportamentali che complicano l'interpretazione negli studi su invecchiamento, neurodegenerazione e modulazione endocrina. Per affrontare queste limitazioni, questo articolo descrive un paradigma di elicitazione USV a base di cibo-ricompensa che evoca in modo affidabile vocalizzazioni appetitose a 50 kHz in previsione di cibo appetibile. Include procedure standardizzate per la manipolazione, l'acclimatazione e il condizionamento comportamentale degli animali per stabilire risposte anticipative coerenti a una ricompensa appetibile. Gli animali subiscono esposizioni ripetute all'ambiente di registrazione seguite dalla ricompensa per favorire una produzione vocale stabile tra le sessioni. Gli USV vengono registrati in camere attenuate dal suono in condizioni ambientali controllate per garantire un alto rapporto segnale-rumore e una riproducibilità. È fornito un flusso di lavoro strutturato per la rilevazione e classificazione automatizzate, che consente l'estrazione dei principali parametri acustici, inclusi il numero totale di USV, la velocità, la gamma di frequenza, la durata, la potenza massima e la complessità. Il protocollo include passaggi di controllo qualità per verificare l'accuratezza della rilevazione e minimizzare gli artefatti. Eliminando le variabili legate all'accoppiamento e standardizzando le condizioni di registrazione, questo metodo fornisce un approccio controllato per eleggere e quantificare vocalizzazioni appetitose a 50 kHz durante sessioni ripetute. Il paradigma è particolarmente adatto per indagare i processi affettivo-motivazionali e la funzione sensorimotoria cranica e può essere adattato a diversi contesti sperimentali, inclusi studi su malattie neurologiche, neurodegenerazione e manipolazione ormonale, con una validazione specifica per lo studio.

Introduzione

Le vocalizzazioni ultrasoniche (USV) in ratti e topi da laboratorio sono ampiamente utilizzate come misura sperimentale del comportamento vocale e dello stato affettivo e forniscono un modello prezioso per studiare la comunicazione vocale in condizioni controllate. Ratti e topi producono segnali vocali a ultrasuoni in una varietà di contesti biologicamente rilevanti, tra cui accoppiamento, segnalazione di soccorso, gioco e comunicazionesociale 1,2,3,4,5. Poiché gli USV riflettono sia stati fisiologici che comportamentali, forniscono una misura sensibile e quantificabile negli studi su emozione, comportamento sociale e relazioni cervello–comportamento. I ratti e i topi da laboratorio producono USV comunicanti ad alte frequenze che variano da 30 a 90 kHz nei ratti e da 40 a 120 kHz nei topi, spesso chiamati "50 kHz USV". Nei ratti, gli USV a 50 kHz sono comunemente associati a stati affettivi positivi, anticipazione della ricompensa e comportamenti di approcciosociale 2,5,6,7. I topi producono USV a 50 kHz in contesti sociali e affettivi comparabili, ma mostrano una maggiore variabilità strutturale e dipendono fortemente dal contesto comportamentale e dai segnalisociali 8,9,10,11,12. Per questo motivo, gli USV sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca psicosociale e psicobiologica per studiare l'elaborazione emotiva, le interazioni sociali, i paradigmi di apprendimento e gli effetti delle manipolazioni farmacologiche sul sistemanervoso 5,11,13,14,15,16,17 . Più recentemente, gli USV sono stati adottati anche come misura di risultato in studi che indagano malattie neurologiche, neurodegenerazione, disturbi dello sviluppo e disfunzioni sensorimotorie craniche rilevanti per i disturbi della comunicazioneumana 5,18,19,20,21,22.

La produzione di USV avviene all'interno della laringe e richiede una precisa coordinazione neuromuscolare dei muscoli laringei intrinseci all'interno di un quadro cartilagineo 23,24,25. I modelli motori che controllano i muscoli come tiroaritenoide e cricotiroideo regolano la posizione delle corde vocali e la configurazione glottale durante la produzionedel suono 26. A differenza della fonazione umana, che si basa sull'oscillazione delle corde vocali indotta dal flusso, gli USV sono prodotti tramite un meccanismo di fischio aerodinamico in cui il flusso d'aria ad alta velocità esce dalla glotte e interagisce con le strutture laringee per generare un suonoultrasonico 23,24,25,27. Di conseguenza, le caratteristiche acustiche degli USV riflettono un controllo neuromuscolare coordinato della laringe, della configurazione del tratto vocale e dell'apporto di pressione subglottale, piuttosto che la biomeccanica vibratoria della mucosa delle corde vocali. Per la misurazione sperimentale, gli USV sono principalmente definiti e analizzati in base alle caratteristiche acustiche catturate durante le registrazioni. Queste caratteristiche acustiche USV, inclusi frequenza, durata e intensità, possono essere estratte utilizzando una pipeline di analisi automatizzata o semi-automatizzata, che costituisce la base per confronti quantitativi tra condizionisperimentali 5.

Un ampio corpus di letteratura ha utilizzato gli USV per esaminare le influenze ormonali sul comportamento vocale in ratti da laboratorio e topi. Molti studi hanno dimostrato che gli ormoni riproduttivi (ad esempio, estrogeni e progesterone) modulano la produzione di USV e le caratteristiche acustiche, in particolare nei contesti di accoppiamento 4,28,29. Ad esempio, lo stadio del ciclo estrole, l'ovaricotomia e la sostituzione ormonale hanno dimostrato di alterare i tassi di USV e le caratteristiche acustiche sia nelle femmine di ratto che nei topi, inclusa la modulazione da parte dello stato estroso e segnali ormonali riproduttivi neitopi 28,30,31,32,33. Tuttavia, queste indagini si sono basate in gran parte su paradigmi basati sull'accoppiamento, come la presentazione di una femmina estrale a un maschio di ratto o topo, che provoca vocalizzazioni robuste ma introduce una notevole variabilità legata alla motivazione sessuale, all'esperienza sociale e allo stato endocrino. Sebbene questi paradigmi siano altamente efficaci nel provocare un gran numero di USV, la complessità comportamentale e ormonale insita nei contesti riproduttivi può complicare l'interpretazione in studi focalizzati su output vocale quantificabile o manipolazione sperimentale controllata. Di conseguenza, differenze nell'interazione sociale, nella ricettività sessuale e nello stato motivazionale possono influenzare indipendentemente la produzione di USV, rendendo difficile isolare le variabili fisiologiche sotto indagine.

Al di fuori dei contesti di elicitazione riproduttiva dell'USV, esistono meno approcci standardizzati per esaminare la produzione di USV in condizioni controllate e non sociali sia nei ratti che nei topi. Studi emergenti suggeriscono che lo stato ormonale può influenzare la produzione di USV anche in contesti non riproduttivi. Ad esempio, la sostituzione dell'estradiolo è stata segnalata come alterando le caratteristiche acustiche e i tassi dell'USV a seconda del contesto sociale in cui vengono registratevocalizzazioni 28,30. In uno studio che ha esaminato gli USV al di fuori dei paradigmi di accoppiamento, lo stadio del ciclo estroso ha influenzato i parametri acustici sia nelle condizioni di isolamento sociale che di interazionediadica 28. Tuttavia, la variabilità tra contesto di registrazione, condizioni ambientali e paradigmi di elicitazione rimane una sfida importante per la riproducibilità e il confronto incrociato.

Date queste limitazioni, paradigmi sperimentali che minimizzano i confondimenti sociali e riproduttivi sono importanti per studiare gli USV in modo controllato e riproducibile. I paradigmi di ricompensa associati al cibo offrono un utile approccio alternativo per ottenere appetitivi USV a 50 kHz. I ratti, e in misura minore i topi, producono USV anticipatori in risposta a segnali associati alla ricompensa, incluso l'accesso a cibo appetibile, riflettendo stati motivazionali e aspettativadi ricompensa 6,9,34. In questo approccio, gli animali si acclimatano all'ambiente di registrazione e si condizionano ad associare l'esposizione in camera a una ricompensa alimentare appetibile, ottenendo una produzione vocale costante tra le sessioni. Rispetto ai paradigmi basati sull'accoppiamento, l'elicitazione guidata dalla ricompensa consente una standardizzazione precisa delle condizioni ambientali, riduce la variabilità legata all'interazione sociale o allo stato riproduttivo e può essere applicata sia tra i sessi che i modelli sperimentali. Inoltre, questo approccio è compatibile con una serie di sistemi di registrazione ultrasonica e supporta progetti di misurazioni ripetute. Queste caratteristiche rendono questo paradigma particolarmente adatto per studi che richiedono un'elicitazione consistente di USV e confronti quantitativi tra condizioni. Questo approccio diventa particolarmente importante quando si cerca di isolare cambiamenti relativamente sottili nella produzione vocale che altrimenti sarebbero mascherati dalla variabilità nel comportamento sociale o riproduttivo.

L'obiettivo generale del metodo attuale è fornire un protocollo dettagliato e riproducibile per erogare e quantificare vocalizzazioni ultrasoniche appetitose utilizzando un paradigma anticipativo condizionato di cibo-ricompensa. Il protocollo delinea le procedure per la manipolazione, l'acclimatazione e il condizionamento comportamentale degli animali, seguite da registrazioni standardizzate con USV effettuate in camere attenuate dal suono in condizioni ambientali controllate. Viene inoltre descritto un flusso di lavoro strutturato per la rilevazione e classificazione automatizzate, che consente l'estrazione dei parametri acustici a livello USV da ogni registrazione, inclusi il numero totale USV, la velocità, la gamma di frequenza, la durata, la potenza massima e la complessità. Questo quadro focalizzato sui metodi enfatizza la riproducibilità, la standardizzazione e l'adattabilità tra contesti di laboratorio e specie, fornendo una pipeline pratica per l'acquisizione e l'analisi coerente dei dati USV.

Questo protocollo fornisce un approccio standardizzato e riproducibile per erogare e registrare gli USV appetitivi, utilizzando un paradigma anticipatorio cibo-ricompensa, consentendo un'analisi dettagliata del comportamento vocale in condizioni sperimentali. Sebbene questo protocollo sia applicabile sia ai ratti da laboratorio che ai topi, dovrebbero essere considerate differenze specifiche specifiche per specie. Nei ratti, gli USV a 50 kHz sono ben caratterizzati e comunemente associati a stati affettivi positivi e anticipazione della ricompensa. Nei topi, gli USV sono più variabili sia nella struttura che nell'interpretazione comportamentale, non sono indicative affidabili di stati affettivi positivi e non dovrebbero essere interpretati come proxy diretti della valenzaemotiva 8,9. Inoltre, caratteristiche acustiche come la durata dell'USV, la gamma di frequenze e i modelli di modulazione differiscono tra le specie, il che può richiedere un aggiustamento dei parametri di rilevamento e classificazione. Anche le risposte comportamentali al condizionamento possono variare, con i ratti che generalmente mostrano vocalizzazioni appetitive più robuste e costanti nei paradigmi basati sulla ricompensa. Diversi passaggi di questo protocollo sono fondamentali per un'elicitazione affidabile di USV (ad esempio, durata dell'acclimatazione, accoppiamento ricompensa e coerenza della registrazione), mentre altri parametri (ad esempio, tipo di ricompensa, tipo di camera e parametri di acquisizione) possono essere adattati in base alla specie, al ceppo o al disegno sperimentale, a condizione che vengano completati la validazione e l'ottimizzazione dei parametri nell'adattamento di questo protocollo su ratti e topi da laboratorio.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali seguono le linee guida del Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (IACUC) della Purdue University e rispettano gli standard nazionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. I seguenti protocolli IACUC di Purdue sono stati approvati: 2008002069 (mouse A53TSynGFP), 0722002290 (ratto Sprague-Dawley) 2111002220 (ratto Long-Evans).

1. Preparazione e alloggio degli animali

  1. Selezione degli animali
    1. Seleziona ratti o topi adulti di almeno 3 mesi o più della ceppa, del sesso e della condizione sperimentale desiderate. Assicurati che gli animali siano abbinati per età e sesso tra i gruppi, quando possibile.
    2. Animali da casa in gabbie standard con un ciclo inverso di 12 ore di luce e buio con temperatura e umidità controllate.
      NOTA: Si raccomanda un ciclo di luce invertita per allineare i test comportamentali alla fase attiva (scura) degli animali, favorendo un coinvolgimento e vocalizzazione costanti. Tuttavia, la registrazione può anche essere effettuata secondo un ciclo standard chiaro/scuro se i test vengono eseguiti in modo coerente e il tempo è mantenuto in tutte le sessioni.
    3. Fornire accesso ad libitum a cibo e acqua, salvo diversa specificazione per condizionamento e manipolazione sperimentale.
    4. Ospitare gli animali in gruppo, quando possibile. Se l'alloggio sociale non è fattibile, prevedi un arricchimento aggiuntivo nella gabbia e/o programma del tempo di socializzazione per ridurre lo stress negli animali con una solacasa 35.
      NOTA: Gli animali adulti sono stati utilizzati in dataset rappresentative per garantire risposte comportamentali stabili e schemi coerenti di USV. Questo protocollo può essere adattato sia per animali più giovani che più anziani; tuttavia, le differenze legate all'età nel comportamento vocale e nella risposta condizionata dovrebbero essere considerate e validate all'interno dello specifico disegno dello studio. Questo protocollo non è raccomandato per topi e cuccioli di ratto pre-svezzamento.
  2. Gestione e socializzazione degli animali
    1. Maneggiare gli animali quotidianamente per 5–7 giorni consecutivi nella stanza alloggiata sotto una stazione di trasferimento animali. Esegui tutte le manipolazioni utilizzando l'attrezzatura di protezione individuale appropriata (ad esempio, camice e guanti).
    2. Acclimatare gli animali all'interazione con i ricercatori utilizzando procedure di manipolazione standardizzate. Metodi di gestione a basso stress (ad esempio, manipolazione in tunnel o tubo) possono essere utilizzati per minimizzare lo stress, in particolare nei topi, a condizione che il metodo scelto venga applicato in modo coerente tra animali e sessioni. Se si utilizza una manipolazione diretta, solleva e tieni delicatamente ogni animale per diversi minuti per abituarlo al ricercatore e alla manipolazione di routine.
    3. Utilizzare una procedura di manipolazione standardizzata per tutti gli animali per garantire la coerenza (ad esempio, introdurre le mani nella gabbia e lasciare annusare per 30 secondi, sollevare e tenere delicatamente l'animale per 10 secondi, ripetere la presa tre volte).
    4. Incorporare tutte le tecniche di manipolazione specifiche per l'esperimento utilizzate per l'esperimento, come sollevare l'animale nella gabbia di prova o tenerlo supino per le iniezioni, nella procedura di socializzazione per abituare gli animali all'intero flusso di lavoro sperimentale e minimizzare la variabilità legata allo stress durante le sessioni di registrazione.

2. Acclimatazione all'ambiente di prova e condizionamento comportamentale

  1. Preparazione alle sessioni di acclimatazione
    1. Accendi tutte le camere di registrazione e le attrezzature prima dell'uso. Pulisci le gabbie comportamentali in policarbonato con etanolo al 70% e pulisci accuratamente, assicurandoti che tutte le superfici siano asciutte prima dell'uso.
    2. Trasferire gli animali dalla stanza alloggiata alla sala di registrazione utilizzando un carrello coperto da una tenda o un lenzuolo oscurante per mantenere le condizioni di illuminazione e minimizzare lo stress ambientale.
  2. Acclimatazione della camera
    1. Metti una gabbia pulita in policarbonato senza lettiere in una camera di registrazione. Trasferire ogni animale in una gabbia, con un solo animale per gabbia per camera di registrazione. Chiudi bene la porta della camera.
    2. Lascia l'animale nella camera per 10 minuti per corrispondere alla durata delle future sessioni di registrazione.
  3. Associazione ricompensa gastronomica
    1. Rimuovi l'animale dalla camera dopo la sessione di 10 minuti e riportalo nella sua gabbia di casa.
    2. Fornisci una nuova ricompensa alimentare appetibile che pesa circa 0,1–0,4 g immediatamente al ritorno nella gabbia domestica.
    3. Alterna tra 1 e 2 tipi di ricompensa nei giorni (ad esempio, 1–2 pezzi di Loop o Puffs, mezzo pezzo di Garden Veggie Spaw, una arachide sgusciata) per mantenere novità e motivazione tra una sessione e l'altra.
      NOTA: Evita di usare le ricompense alimentari selezionate e appetibili in altri contesti per preservare il condizionamento anticipato dell'elicitazione USV. Assegna diversi cibi appetibili per altri compiti, se necessario. Gli animali non sono soggetti a restrizioni alimentari per questo paradigma. L'alimentazione ad libitum standard viene mantenuta nella gabbia domestica al di fuori della consegna con ricompensa.
  4. Programma di condizionamento
    1. Ripeti l'acclimatazione e la coppia con ricompensa una volta al giorno per almeno 3–5 giorni consecutivi.
    2. Esegui il condizionamento e le successive sessioni di registrazione di 10 minuti alla stessa ora ogni giorno (ad esempio, durante il ciclo buio tra le 09:00 e le 12:00) utilizzando personale costante.
      NOTA: Gli animali mostreranno comportamenti di stress ridotti (ad esempio, riduzione della defecazione/minzione del 50%–100%) e l'insorgenza di USV anticipati a 50 kHz durante i giorni di condizionamento. I topi potrebbero richiedere più giorni di condizionamento rispetto ai ratti.

3. Impostazione di registrazione della vocalizzazione ultrasonica

  1. Condizioni dell'equipaggiamento
    1. Effettua registrazioni in una stanza buia o sotto luci rosse per allinearsi con il ciclo di luce inverso degli animali.
    2. Limitare l'ingresso nella stanza e rimanere in uno spazio adiacente durante le sessioni per minimizzare le interferenze acustiche.
  2. Allestimento della camera di registrazione
    1. Utilizzare camere di registrazione attenuate dal suono (esterno: 60 cm × 60 cm × 82 cm; interno: 56 cm × 53 cm × 60 cm) progettate per minimizzare il rumore esterno e le interferenze elettroniche.
    2. Utilizzare più camere (ad esempio, quattro in totale) e assegnare gli animali alle camere utilizzando un programma randomizzato e controbilanciato tra giorni di registrazione e condizioni sperimentali.
      NOTA: Le assegnazioni di camera sono strutturate in modo che gli animali di ogni gruppo sperimentale siano distribuiti in tutte le camere, e ogni animale venga registrato in più camere durante le sessioni di registrazione quando possibile. Questo approccio minimizza il potenziale bias specifico della camera e previene la confusione sistematica tra condizioni di camera e condizioni sperimentali.
    3. Annota l'assegnazione della camera per ogni sessione (ad esempio, identificazione animale, gruppo, numero di camera, data, tipo di sessione) in un quaderno di laboratorio o in un foglio di calcolo (ad esempio, Excel). Incorporare questi metadati nelle analisi statistiche a valle (ad esempio, come effetto casuale o covariato) per tenere conto della potenziale variabilità legata alla camera.
      NOTA: Se si utilizzano più camere di registrazione, si adottano strategie per minimizzare il rumore elettrico e la diafonia tra i canali (ad esempio, separazione spaziale delle camere, messa a terra coerente e uso di cavi schermati dove applicabile). La camera attenuante del suono aiuta anche a ridurre il rumore acustico ambientale e ultrasonico, oltre alle interferenze esterne.
  3. Preparazione della gabbia
    1. Usa gabbie pulite in policarbonato all'interno di ogni camera di registrazione. Non aggiungere la lettiera alle gabbie per minimizzare il rumore legato al movimento.
    2. Pulisci accuratamente ogni gabbia con etanolo al 70% tra gli animali e lascia asciugare completamente prima della prossima registrazione.
  4. Configurazione del sistema di registrazione
    1. Accendi il computer di registrazione e avvia il software di acquisizione. Assicurati che l'interfaccia di registrazione multicanale sia connessa e riconosciuta.
    2. Crea un nuovo esperimento cliccando su File/Esperimento, poi su Nuovo e inserisci i metadati richiesti, inclusi nome dell'esperimento, specie e numero di canali di registrazione (ad esempio, fino a quattro). Vedi il File Supplementare 1 per screenshot dell'interfaccia software.
    3. Esegui una breve registrazione di prova cliccando su Registra Ecgrafie, poi su Anteprima Ecografia e sul pulsante cerchio prima di ogni sessione per verificare l'integrità del segnale, la funzione del canale e i livelli accettabili di rumore di fondo (Supplementare File 2).
    4. Crea una sessione di test cliccando su Design Test Session, poi su Nuova Sessione di Test, e imposta la durata della registrazione a 10 minuti cambiando il timer (ad esempio, 00:10:00 per 10 minuti). Assegnare le identificazioni degli animali ai canali di camera appropriati (File Supplementare 3).
    5. Verifica tutte le informazioni della sessione prima di iniziare la registrazione, poiché le impostazioni non possono essere modificate dopo il completamento.
      NOTA: Tutti i parametri di acquisizione sono definiti dal sistema all'interno di Sonotrack e non vengono regolati manualmente dall'utente tra animali o sessioni. Mantenere la configurazione identica della camera e i parametri di registrazione su tutti gli animali e le sessioni per garantire la coerenza dei dati. I seguenti parametri di acquisizione sono preconfigurati con il sistema:
      Frequenza di campionamento: ≥250 kHz
      Intervallo di rilevamento di frequenza: 15–125 kHz
      Tipo di microfono: microfoni a condensazione a ultrasuoni
      Posizionamento del microfono: fissato sopra il centro di ogni gabbia (~13–100 cm dall'animale)
      Guadagno: Non regolabile dall'utente; Controllati automaticamente dal sistema e mantenuti costanti su tutte le registrazioni
      Intervallo dinamico di ingresso: ~10 mV (segnale minimo rilevabile) a 10 V (ingresso massimo) come specificato dal produttore
      Formato file: Registrazioni continue esportate come . file WAV e metadati come . File DAT
      Sebbene questo protocollo sia implementato utilizzando un sistema USV integrato, il flusso di lavoro non dipende da una singola piattaforma commerciale. Il paradigma può essere adattato ad altri sistemi di registrazione ultrasonica a condizione che vengano utilizzati parametri di acquisizione comparabili, inclusi la frequenza di campionamento e la gamma di frequenza appropriate per USV di ratti o topi da laboratorio. Analogamente, altre camere attenuate dal suono possono essere utilizzate se minimizzano efficacemente le interferenze acustiche e supportano condizioni comportamentali stabili.

4. Procedura di registrazione USV

  1. Inizio della sessione
    1. Inserire gli animali nelle camere di registrazione seguendo la stessa procedura utilizzata durante l'acclimatazione. Assicurati di assegnare correttamente la camera.
    2. Chiudi le porte della camera e apri la corrispondente sessione di test cliccando su Sessione di Test di Progettazione, poi Apri Sessione di Test nel software di registrazione (File Supplementare 4).
  2. Esecuzione della registrazione
    1. Inizia a registrare usando l'interfaccia software cliccando su Registra Ecografia, poi Esegui Sessione di Test e cerchia il pulsante di registrazione (Supplementare File 5). Monitorare i segnali in tempo reale se lo desideri.
    2. Permette al software di registrare continuamente per 10 minuti.
  3. Completamento della sessione
    1. Permette al software di interrompere automaticamente la registrazione alla fine della sessione. Salva immediatamente la registrazione per evitare la perdita di dati premendo il pulsante X, poi Salva (File Supplementare 6).
    2. Rimuovi gli animali dalle camere e riportali nelle loro gabbie di casa.
  4. Consegna della ricompensa
    1. Fornire subito dopo aver riportato ogni animale nella gabbia di casa, fornisci una ricompensa alimentare standardizzata e gustosa.
    2. Mantieni la coerenza nei tempi delle ricompense in tutte le sessioni.
  5. Calendario delle registrazioni
    1. Esegui sessioni di registrazione una volta al giorno per 3–5 giorni consecutivi dopo il condizionamento.
    2. Mantenere gli stessi tempi, procedure di gestione e condizioni ambientali in tutte le sessioni.
      PUNTO DI PAUSA: Conserva e salva i file registrati dopo ogni sessione per un'analisi successiva.

5. Pulizia post-sessione e spegnimento

  1. Pulizia della camera e delle attrezzature
    1. Rimuovere le gabbie e pulire tutte le gabbie, i coperchi e gli inserti usando sapone e acqua dopo la fine delle sessioni. Asciuga accuratamente prima di conservarlo.
    2. Pulire interni e superfici della camera con etanolo al 70% secondo necessità.
  2. Spegnimento delle apparecchiature
    1. Chiudi tutte le sessioni di registrazione e chiudi il software di acquisizione.
    2. Disattiva le camere di registrazione e assicurati che tutte le porte della camera siano chiuse.
  3. Trasporto animali
    1. Copri le gabbie con un lenzuolo o una tenda oscura e trasporta gli animali nell'area abitativa.
    2. Riporta gli animali nelle loro gabbie domestiche e assicurati l'accesso a cibo e acqua.

6. Rilevamento, classificazione e esportazione dei dati tramite vocalizzazione ultrasonica tramite software

  1. Carica file di registrazione USV
    1. Apri il software di classificazione delle chiamate e permette al menu principale di caricarsi.
    2. Seleziona Carica File/i USV e scegli se caricare file nativi di esperimenti Sonotrack tramite Carica dati USV (file Sonotrack) oppure file audio in forma d'onda compatibili tramite Importa dati USV (file WAV).
    3. Naviga nella cartella del computer fino alla cartella file contenente le registrazioni e seleziona l'esperimento/sessione desiderata cliccando su Accetta.
    4. Nel software di classificazione delle chiamate, seleziona il nome appropriato dell'esperimento, la sessione di test e i canali corrispondenti del microfono, poi carica i dati nello spazio di lavoro cliccando OK.
    5. Verifica che la/le registrazione o le registrazioni siano visualizzate correttamente nel menu principale del software con nome file, numero di sessione e informazioni sul canale.
  2. Inizializzare le impostazioni di classificazione
    1. Apri l'interfaccia di classificazione all'interno del software cliccando su USV Classificatore.
    2. Seleziona il file di impostazione dei valori predefiniti per le impostazioni di classificazione predefinite fornite all'interno dell'ambiente software oppure modifica e crea impostazioni di classificazione personalizzate tramite il menu USV Explorer & Impostazioni nella pagina principale dell'interfaccia software.
    3. Conferma che i filtri di rilevamento con i seguenti parametri siano elencati nella lista dei parametri:
      Gamma di frequenza: 25.000–99.990 Hz (ottimizzata per vocalizzazione di ratto a 50 kHz). Per le registrazioni con topo, possono essere necessari intervalli ultrasonici più ampi (~40.000–120.000 Hz) per catturare l'intero repertorio delle vocalizzazioni, a seconda della tensione e del contesto.
      Durata minima della chiamata: 4 ms (gli USV più brevi vengono automaticamente cancellati)
      Soglia di classificazione per chiamate brevi: 4 ms
      Rilevamento armonico: abilitato
    4. Confermare che i parametri di classificazione basati sulla modulazione di frequenza siano i seguenti:
      Chevron e fattore a forma di U: 4 kHz
      Fattore di modulazione verso l'alto e verso il basso: 2 kHz
      Fattore di seguimento: 2 kHz
      Tolleranza fuori centro della frequenza massima: 0,4
      Soglie di rilevamento dei passaggi:
      Differenza di frequenza a sinistra vs. destra: 35 kHz
      Differenza di frequenza sinistra vs. media: 32 kHz
    5. Conferma che i parametri temporali e di segmentazione siano elencati come segue:
      Ungere i componenti se separati da <5 ms (tempo) o <6 kHz (frequenza)
      Rimuovere i componenti sovrapposti se la sovrapposizione supera il 75%
      Fattore di ritardo: 17
      Fattori di soglia di classificazione USV indefiniti:
      Corto: 1
      Lungo: 7
    6. Conferma che le regole di preelaborazione e gestione degli artefatti siano attivate:
      Elimina i componenti brevi: ON
      Unire componenti chiuse: ON
      Rimuovere componenti sovrapposti: ON
      Cancella chiamate sbagliate: ON
    7. Conferma che il riepilogo dell'esportazione e i formati dati dettagliati siano elencati come segue:
      Formato della tabella dei risultati: CSV + Excel
      Formato immagini dei risultati: Solo jpg
      File audio di registrazione: ON
      Armonici: Con armonici
    8. Conferma che tutti i parametri di rilevamento e classificazione siano stati applicati correttamente come indicato sopra, poi clicca su OK.
      NOTA: Consulta https://www.metris.nl/en/products/sonotrack/CallClassification per i link a un video tutorial sull'interfaccia software di classificazione delle chiamate fornito dal produttore. Le impostazioni predefinite derivano dalla letteratura consolidata e sono appropriate per la maggior parte delle applicazioni36. Questi parametri sono stati utilizzati per tutte le analisi rappresentative. Possono essere create impostazioni personalizzate per condizioni sperimentali specializzate. Quando si utilizzano impostazioni personalizzate, tutti i valori dei parametri (ad esempio, limiti di frequenza, soglie di durata, criteri di modulazione e regole sugli artefatti) devono essere riportati insieme ai risultati per garantire la riproducibilità tra gli studi.
  3. Eseguire rilevamento e classificazione automatici
    1. Seleziona la funzione Start Classification per avviare l'elaborazione automatica.
    2. Permette al software di scansionare l'intera registrazione, rilevare vocalizzazioni ultrasoniche e classificare ogni USV.
    3. Monitorare gli indicatori di progresso in tempo reale, inclusi grafici di classificazione (Figura 1) e tabelle che si popolano durante l'elaborazione.
    4. Consentire al programma di completare l'elaborazione di tutti gli USV all'interno della registrazione.
      NOTA: Il processo automatizzato di rilevamento e classificazione può richiedere diverse ore. Il software rileva gli USV, estrae le caratteristiche acustiche e le classifica in base a modelli di modulazione di frequenza (ad esempio, verso l'alto, piatto, complesso).
  4. Riepilogo delle esportazioni e dati dettagliati
    1. Dopo che il software ha completato l'elaborazione, seleziona Exit USV Classifer e naviga nella cartella del computer nella cartella dei file contenente i dati di classificazione per visualizzare gli output dei fogli di calcolo.
    2. Apri sia i file di fogli di calcolo del dataset sommario che quelli dettagliati (ad esempio, Excel o CSV) per ogni esperimento, sessione e canale.
    3. Apri i risultati riassuntivi per confermare l'inclusione del totale degli USV, delle distribuzioni per categorie e dei valori percentuali (Figura 2).
    4. Apri l'output dettagliato per verificare i dati per USV, inclusi orario di inizio, ora di fine, durata e parametri acustici.
    5. Salva tutti i file esportati e i dati associati utilizzando una convenzione di denominazione standardizzata, inclusi identificazione animale, sessione e condizione per analisi statistiche a valle.
  5. Controllo qualità
    1. Durante la validazione iniziale, selezionare casualmente il 10%–20% delle registrazioni tra le condizioni rappresentative (ad esempio, gruppi di trattamento e sessioni di registrazione) per la revisione manuale.
    2. Eseguire l'ispezione manuale degli spettrogrammi e la riproduzione audio per confermare i benchmark di prestazioni come definito di seguito:
      Rilevamento accurato dell'USV (presenza di veri positivi e assenza di USV mancati)
      Accuratezza di rilevamento di almeno il 90% di accordo con l'identificazione manuale
      Segmentazione appropriata dei singoli USV (rumori o artefatti rilevati erroneamente come USV)
      Tasso di falsi positivi non superiore al 10%
      Corretta classificazione dei tipi di USV basata su modelli di modulazione di frequenza
      Accordo di classificazione di almeno l'85% tra assegnazione automatica e manuale di tipo USV
    3. Identificare e documentare tutti gli errori comuni, inclusi rumori di fondo o artefatti elettrici rilevati come USV, sovrasegmentazione o fusione degli USV adiacenti e errata classificazione degli USV.
    4. Se le prestazioni non soddisfano i criteri di validazione, si aggiustano soglie di rilevamento, limiti di frequenza o parametri di classificazione, si rilancia la rilevazione e classificazione automatiche per le registrazioni interessate e si ripete la validazione fino a raggiungere prestazioni accettabili.
    5. Una volta validato, memorizza il set di parametri finali per tutti gli esperimenti successivi. Le procedure di controllo qualità di routine successive sono limitate a controlli mirati delle registrazioni quando necessario (ad esempio, aggiornamenti software, aggiustamenti dei parametri o dati o schemi di registrazione imprevisti).
    6. Memorizza set di parametri validati, dataset esportati e documentazione sul controllo qualità in un formato sicuro per garantirne la riproducibilità.
      NOTA: Il controllo qualità completo è richiesto solo durante la configurazione iniziale della pipeline di rilevamento e classificazione. Una volta validati, i parametri stabiliti vengono applicati in modo coerente tra gli esperimenti, con il controllo qualità ripetuto solo se si verificano cambiamenti metodologici. L'analisi USV non è limitata a una singola piattaforma software e può essere implementata utilizzando sistemi alternativi, a condizione che i criteri di rilevamento e classificazione siano chiaramente definiti e applicati in modo coerente.

7. Considerazioni sulla sicurezza

  1. Manipolazione degli animali
    1. Maneggiare gli animali utilizzando l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) appropriata, inclusi guanti e camice.
    2. Segui le linee guida istituzionali per la gestione e lo smaltimento sicuro di qualsiasi residuo animale.
  2. Sicurezza chimica
    1. Usa etanolo al 70% in un'area ben ventilata. Evita l'inalazione e il contatto con gli occhi.
    2. Lascia evaporare completamente l'etanolo prima di mettere gli animali in gabbia.
  3. Sicurezza dell'attrezzatura
    1. Assicurati che tutte le apparecchiature elettriche siano correttamente messe a terra prima dell'uso.
    2. Tieni i liquidi lontani dalle apparecchiature di registrazione per prevenire danni o rischi elettrici.

8. Analisi statistica

  1. Esegui tutte le analisi statistiche in R (v4.3.2) e GraphPad Prism (v10). Definisci l'unità sperimentale come l'animale individuale. Per le analisi longitudinali di vocalizzazione ultrasonica (USV), si ricavano i risultati da registrazioni ripetute raccolte in punti temporali sperimentali. Presentare tutti i dati come media ± errore standard della media (SEM), con i valori individuali degli animali mostrati in tutte le figure. Esegui tutti i test statistici a doppia coda salvo diversa indicazione. Definire la significanza statistica come α = 0,05.
  2. Per lo studio su ormoni e idratazione del ratto, analizza gli esiti dell'USV utilizzando modelli generalizzati di effetti misti lineari (GLMM) per valutare gli effetti dello stato ormonale, dello stato di idratazione, del tempo e delle loro interazioni (Figura 3). Includere intercetti casuali per l'identificazione animale annidati all'interno della coorte per tenere conto delle misure ripetute e degli effetti di lotto. Seleziona le distribuzioni dei modelli in base alle caratteristiche di risultato: usa distribuzioni gamma per la durata e l'intervallo di frequenza, modelli lineari a effetti misti per la potenza massima e modelli binomiali negativi per i conteggi degli USV per affrontare la sovradispersione. Valutare gli effetti fissi utilizzando test di Wald chi-quadrato di tipo III (χ2). Segui gli effetti significativi con confronti post hoc pianificati utilizzando medie marginali stimate (emmeans) con correzione di Tukey per confronti multipli, limitando le analisi a ipotesi a priori. Definire la significanza statistica come α = 0,05 (a due code).
  3. Per il pilota di addestramento vocale A53T con α-sinucleina (Figura 4), valutate le differenze di gruppo tra condizioni di controllo e addestramento utilizzando test t a campioni indipendenti a due code per ciascuna caratteristica USV, includendo numero totale, durata, intervallo di frequenza e intensità massima. Analizza separatamente tipi di USV semplici, complessi e combinati. Applicare la correzione di Welch quando le assunzioni di varianza vengono violate. Non applicare correzioni a confronto multiplo a causa della natura esplorativa del dataset pilota e della dimensione limitata del campione. Definire la significanza statistica come α = 0,05.

Risultati

L'implementazione con successo di questo protocollo di registrazione e analisi USV produce registrazioni di alta qualità con rumore di fondo minimo, condizioni sperimentali ottimizzate, permettendo una visualizzazione e un'estrazione affidabile dei singoli USV. In queste condizioni, gli animali producono USV misurabili durante il periodo di registrazione di 10 minuti che sono chiaramente visibili sugli spettrogrammi e possono essere rilevati e classificati tramite software di classificazione delle chiamate. Le registrazioni rappresentative mostrano contorni distinti degli USV con contorni acustici ben definiti, incluse strutture USV piatte e modulate in frequenza, permettendo un'estrazione accurata dei parametri acustici (Figura 1).

I risultati quantitativi degli esperimenti riusciti includono il numero totale di USV, il tasso di USV (USV/min), la gamma di frequenza, la durata, la potenza massima e il rapporto di complessità USV (semplice vs. complesso). Negli animali ben condivideti, il conteggio totale degli USV è costante nei giorni di registrazione e i tassi di USV rimangono stabili all'interno degli individui. I parametri di intervallo di frequenza e durata rientrano nelle gamme specifiche di specie attese (ad esempio, banda 30–90 kHz per gli USV dei ratti e banda 40–120 kHz per gli USV dei topi) e paradigma con chiara separazione tra vocalizzazioni semplici e complesse. Il rapporto di complessità fornisce una misura aggiuntiva del comportamento vocale, con spostamenti verso USV semplici o complessi che possono riflettere gli effetti delle manipolazioni sperimentali. La Figura 2 mostra output rappresentativi di una singola sessione di registrazione per illustrare la classificazione e la distribuzione degli USV tra tipi di USV semplici e complessi, schemi di modulazione di frequenza e bins di durata, e per dimostrare la rilevazione e l'analisi efficace del comportamento vocale utilizzando questo metodo di elicitazione. In particolare, la Figura 2A mostra il numero totale di USV identificati categorizzati in vari tipi semplici e complessi; La Figura 2B mostra la distribuzione degli USV tra i modelli di modulazione di frequenza (piatti, verso l'alto, verso il basso e profili complessi); e la Figura 2C presenta la distribuzione degli USV raggruppati per durata totale.

I dataset rappresentativi degli esperimenti riusciti dimostrano la variabilità tra animali alla base e tra gruppi sperimentali o momenti temporali. I dati mostrati nella Figura 3 sono derivati da un dataset indipendente pubblicato utilizzando ratti Long-Evan di 5-7 mesi e dimostrano come lo stato fisiologico (ad esempio, manipolazioni ormonali o di idratazione) possa riflettersi in caratteristiche acustiche quantificabili dell'USV, come durata, potenza o intervallo difrequenza 37. Questi risultati sono presentati come esempi di come il protocollo consenta l'estrazione e l'analisi dei dataset USV esportati dal software, piuttosto che come prove definitive degli effetti biologici. Al contrario, la Figura 4 presenta dati pilota non pubblicati di un singolo ceppo di topo (topi con sovraespressione di alfa-sinucleina A53T) e fascia d'età (3–5 mesi) sottoposti a un paradigma di allenamento vocale, in cui non sono state osservate differenze significative tra gruppi di controllo e addestrati. Questo esempio dimostra la capacità del protocollo di catturare sia risultati variabili che nulli, sottolineando l'importanza di un'ottimizzazione e validazione specifiche per studio. Insieme, questi dataset illustrano i risultati analitici generati dal protocollo su ratti e topi da laboratorio.

Al contrario, registrazioni subottimali sono caratterizzate da un rumore di fondo eccessivo, una chiarezza dello spettrogramma ridotta o una rilevazione incoerente degli USV. Per questo protocollo, le registrazioni sono considerate subottimali quando l'ispezione visiva dello spettrogramma indica un rumore di fondo che oscura sostanzialmente la struttura dell'USV nell'intervallo di 20–100 kHz, o quando artefatti di rumore (ad esempio, rumore a banda larga o segnali legati al movimento) causano rilevamenti falsi positivi superiori a ~10% degli eventi totali rilevati durante la revisione manuale. Le registrazioni sono considerate subottimali anche quando le condizioni segnale-rumore impediscono una chiara discriminazione visiva degli USV dall'attività di fondo (cioè, l'incapacità di distinguere in modo affidabile i contorni degli USV dal rumore di base nella maggior parte della registrazione). In questi casi, le sessioni vengono escluse o rianalizzate dopo l'aggiustamento dei parametri di rilevamento. Un condizionamento comportamentale subottimale può portare a conteggi di USV bassi o molto variabili tra le sedute. Le registrazioni che producono un'uscita di USV marcatamente ridotta (ad esempio, un conteggio totale di USV >50% inferiore rispetto alla mediana della coorte alla base per una data condizione sperimentale) vengono esaminate per eventuali problemi di acclimatazione o deviazioni procedurali. In questi casi, il numero totale di USV e il tasso di USV sono spesso ridotti, e i parametri acustici estratti possono uscire dalle fasce previste o mostrare un'elevata variabilità. Ulteriori indicatori di esiti subottimali includono una classificazione incompleta o imprecisa degli USV, spesso dovuta a impostazioni di rilevamento inappropriate o scarsa qualità della registrazione. La classificazione errata può essere presente come sovrapposizione di tipi USV semplici/brevi o mancata rilevazione di vocalizzazioni multi-elemento (complesse). Le registrazioni vengono segnalate per la rianalisi quando la classificazione automatica mostra un accordo dell'<85% con l'ispezione manuale nei sottoinsiemi revisionati. Questi problemi possono essere identificati durante il controllo qualità confrontando le caratteristiche dello spettrogramma con le classificazioni assegnate e rivedendo i risultati riassuntivi per distribuzioni atipiche nei pattern a livello di coorte.

L'applicazione efficace di questo protocollo è confermata da (1) una chiara visualizzazione degli USV negli spettrogrammi, (2) una rilevazione e classificazione coerenti tra le sessioni, e (3) una variazione stabile o biologicamente interpretabile nelle misure quantitative degli esiti. Quando questi criteri vengono soddisfatti, il metodo fornisce un approccio sensibile e riproducibile per valutare i cambiamenti nel comportamento vocale e nella funzione laringea attraverso condizioni sperimentali.

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Figura 1: Esempio di spettrogrammi grezzi e processati di USV rappresentative utilizzati per l'analisi acustica. Questa figura presenta dati pilota non pubblicati da uno studio sull'invecchiamento dei ratti. Spettrogrammi grezzi e processati rappresentano un USV semplice (superiore) e complesso (inferiore) prodotto da una rata femmina ovariectomizzata Sprague-Dawley di 15 mesi, generata tramite software di classificazione delle chiamate. Asse X = tempo (ms); Asse Y = frequenza (kHz); gradiente colore = potenza (dB), con giallo/verde che indicano potenza superiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Esempi di output riassuntivi USV da una singola sessione di registrazione. Questa figura presenta dati pilota non pubblicati provenienti da uno studio di fattibilità sull'addestramento vocale. La classificazione rappresentativa deriva da una registrazione basale di 10 minuti di un maschio transgenico di 3 mesi che sovraespresse alfa-sinucleina da un dataset pilota di allenamento vocale. (A) Totale degli USV identificati categorizzati per tipo di classificazione, dimostrando la distribuzione degli USV semplici e complessi all'interno della sessione (totale degli USV = 42). (B) Distribuzione degli USV raggruppati per modulazione di frequenza (ΔF, kHz), inclusi modelli piatti (ΔF ~0), verso l'alto, verso il basso e complessi. (C) Distribuzione degli USV raggruppata per durata totale (Td, ms). La rilevazione e la classificazione degli USV venivano eseguite utilizzando software con parametri (inclusi soglie di rilevamento e regole di classificazione) definiti nella sezione Metodi/Protocolli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Risultati rappresentativi dell'USV nelle manipolazioni ormonali e di idratazione del ratto Long-Evans. Questa cifra è riprodotta dai dati pubblicati sul Journal of Speech, Language, and HearingResearch 37. Le misure USV sono mostrate la sfida pre- e post-idratazione in tre gruppi ormonali (Control; OVX + Estradiolo [OVX + E2]; OVX + Placebo [OVX + PL]) e due stati di idratazione (euidratazione [EUHY]; disidratazione [DEHY]) con N = 8 animali per gruppo (età: 5–7 mesi). Sono rappresentate metriche USV semplici (colonna a sinistra) e complesse (colonna destra): numero totale di USV (A,B), durata (C,D), intervallo di frequenza (E,F) e potenza massima (G,H). I grafici a barre rappresentano i mezzi di gruppo ± SEM, e i singoli punti rappresentano i valori di ogni animale. I pattern di riempimento delle barre indicano il gruppo ormonale: solido = Controlli, slashed = OVX + E2, cross-hatched = OVX + PL. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando modelli generalizzati di effetti misti lineari (GLMM) con test chi-quadrati di Wald di tipo III per valutare gli effetti del gruppo ormonale, lo stato di idratazione e la loro interazione. Confronti post hoc sono stati effettuati utilizzando medie marginali stimate (emmeans) con correzione di Tukey per test multipli. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Risultati rappresentativi dell'USV nei topi di sovraespressione di A53T alfa-sinucleina seguendo un paradigma pilota di addestramento vocale. Questa figura presenta un dataset pilota non pubblicato generato per uno studio di fattibilità sull'addestramento vocale. I dati sono derivati da un totale di 8 topi (età: 3–5 mesi), distribuiti equamente tra i gruppi (Controllo: n = 4; Addestramento: n = 4) con rappresentazione equilibrata per sesso (due femmine e due maschi per gruppo) e distribuzione dei genotipi (Controllo: TG+ = 3, TG− = 1; Addestramento: TG+ = 2, TG− = 2). Le metriche USV sono mostrate come variazione percentuale dal pre- al post-addestramento per ciascun genotipo, raggruppate tra i sessi. Gli USV semplici (nella fila superiore) e complessi (nella riga inferiore) sono tracciati separatamente per il conteggio totale degli USV, la durata, l'intervallo di frequenza e l'intensità massima. I grafici a barre rappresentano i mezzi di gruppo ± SEM, e i singoli punti rappresentano i valori di ogni animale. L'addestramento consisteva in un paradigma di condizionamento vocale acqua-ricompensa di 5 giorni, in cui i topi subivano una lieve restrizione d'acqua e venivano addestrati a emettere USV in risposta all'erogazione della ricompensa d'acqua all'interno della camera di registrazione. Le differenze di gruppo tra condizioni di controllo e di addestramento sono state valutate utilizzando test t a campioni indipendenti a due code (correzione di Welch applicata quando opportuno) sui punteggi di cambiamento normalizzati per ciascuna caratteristica USV. Non sono state osservate differenze significative tra i gruppi di controllo e addestrati in questo dataset pilota. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Configurazione software per vocalizzazione ultrasonica (USV).Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Software di vocalizzazione ultrasonica (USV) - Registrazione del test.Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Software di vocalizzazione ultrasonica (USV) - Sessione di test Create.Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 4: Software di vocalizzazione ultrasonica (USV) - Sessione di test aperta.Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 5: Software di vocalizzazione ultrasonica (USV) - Registrazione di esecuzione.Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 6: Software di vocalizzazione ultrasonica (USV) - Sessione di test finale.Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

L'attuale protocollo fornisce un approccio riproducibile per suscitare vocalizzazioni ultrasoniche appetitive a 50 kHz (USV) utilizzando un paradigma cibo-ricompensa, con diversi passaggi critici necessari per garantire risultati coerenti e interpretabili. Prima di tutto, la gestione e l'acclimatazione degli animali sono essenziali per ridurre la variabilità legata allo stress nell'outputvocale 13. La maneggiamento quotidiano in condizioni controllate e l'abituazione sistematica alla camera di prova favoriscono un comportamento anticipatorio affidabile e una produzione stabile di USV tra le sessioni. Il condizionamento comportamentale alla ricompensa alimentare è un altro passo chiave; un condizionamento incoerente o insufficiente può portare a bassi tassi di vocalizzazione o a un'elevata variabilitàinter-animale 6,34. Mantenere condizioni di personale e test costanti, inclusa la registrazione durante il ciclo buio o in condizioni di luce rossa, eliminare le fonti di rumore ambientale e standardizzare la configurazione della camera, è altrettanto fondamentale per ottimizzare la qualità del segnale e minimizzare gliartefatti 5. Senza questi controlli, diventa difficile determinare se i cambiamenti negli USV riflettano il comportamento o semplicemente il rumore introdotto dall'ambiente di registrazione.

Questo protocollo è progettato con flessibilità per adattarsi a modifiche basate su specifiche esigenze sperimentali. Ad esempio, il tipo e la novità delle ricompense alimentari appetibili possono essere regolati per mantenere la motivazione durante sessioni ripetute, in particolare negli studi longitudinali o con modelli di malattia. La durata delle sessioni di acclimatazione e registrazione può essere modificata a seconda della specie, della varietà o dei vincoli sperimentali. La risoluzione dei problemi comuni riguarda principalmente la risoluzione di bassa uscita USV o rumore eccessivo. I bassi tassi di vocalizzazione possono spesso essere migliorati prolungando i periodi di condizionamento, aumentando la rilevanza della ricompensa o confermando che gli animali sono testati durante la fase attiva. Gli artefatti acustici possono essere minimizzati garantendo una corretta pulizia delle camere tra gli animali, eliminando la lettiera e materiali superflui, e verificando un posizionamento e parametri di registrazione coerenti del microfono. Inoltre, randomizzare gli animali tra le camere di registrazione aiuta a mitigare la potenziale variabilità specifica della camera e aumenta il rigore sperimentale.

Un punto di forza principale di questo metodo risiede nel suo allineamento con i recenti sforzi di standardizzazione delle metodologie di laboratorio USV su ratti e topi, come evidenziato da Shembel et al. (2025)5. La standardizzazione tra paradigmi di elicitation, ambienti di registrazione e pipeline di analisi è essenziale per migliorare la riproducibilità e permettere confronti incrociati. Questo protocollo affronta direttamente queste priorità implementando procedure di acclimatazione strutturate, presentazione controllata dello stimolo e condizioni di registrazione coerenti. L'uso di un paradigma cibo-ricompensa supporta un'elicitazione affidabile e ripetibile degli USV e riduce la variabilità comportamentale associata ai paradigmi sociali o basati sull'accoppiamento 5,28. La registrazione durante la fase attiva degli animali e la minimizzazione del rumore ambientale sono ulteriormente in linea con le raccomandazioni delle migliori pratiche per ottimizzare la qualità del segnale e la rilevanzabiologica 5. Inoltre, l'uso di misure acustiche definite per risultati, inclusi numero USV, velocità, intervallo di frequenza, durata, potenza massima e rapporto di complessità, supporta pratiche di analisi trasparenti e standardizzate, fondamentali data la variabilità degli approcci di classificazione nelcampo 5.

L'interpretazione degli USV differisce anche significativamente tra ratti e topi e dovrebbe essere considerata nell'applicazione di questo protocollo tra specie. Nei ratti, vocalizzazioni ultrasoniche a 50 kHz sono marcatori ben stabiliti di stati affettivi positivi e legati alla ricompensa. Al contrario, gli USV topi sono più eterogenei sia nella struttura acustica che nel contesto comportamentale, e gli USV all'interno di intervalli di frequenza alte simili non si corrispondono direttamente alla valenza affettiva. Invece, gli USV del topo possono riflettere una combinazione di comunicazione sociale, eccitazione e stati comportamentali dipendenti dal contesto. Di conseguenza, l'attuale protocollo tratta gli USV come letture comportamentali specifiche per specie piuttosto che come un marcatore affettivo singolo su ratti e topi da laboratorio. Nonostante i punti di forza, vanno considerati diversi limiti nell'applicazione di questo metodo. Sebbene il paradigma cibo-ricompensa riduca i confondimenti ormonali e sociali, cattura specificamente vocalizzazioni appetitose guidate dalla ricompensa e potrebbe non generalizzare ad altri contesti comportamentali come il disagio o la comunicazione sociale. La motivazione per le ricompense alimentari può variare anche tra animali, condizioni sperimentali o stati patologici, influenzando potenzialmente l'output vocale indipendentemente dalla funzione motoriavocale 6,34. È importante sottolineare che i dataset rappresentativi qui presentati derivano da un singolo ceppo di ratti da laboratorio e un singolo ceppo di topi da laboratorio, il che limita la generalizzabilità. Sebbene il protocollo sia progettato per essere applicabile a ratti e topi da laboratorio, dovrebbero essere previste differenze specifiche per specie e ceppo nel comportamento vocale, nella risposta al condizionamento e nelle caratteristiche acustiche, e è giustificata una validazione più ampia tra ceppi e contesti sperimentali. Inoltre, sebbene il software di classificazione automatica faciliti un'analisi ad alto rendimento, la variabilità nelle soglie di rilevamento e negli algoritmi di classificazione può influire sulla comparabilità tra gli studi. Il protocollo è presentato utilizzando un sistema integrato per la riproducibilità, ma è pensato per essere ampiamente adattabile su piattaforme di registrazione ultrasonica con specifiche equivalenti. È quindi necessaria un'attenta validazione dei parametri di analisi e una segnalazione coerente delle caratteristiche acustiche per garantire l'affidabilità dei dati. Infine, la necessità di apparecchiature specializzate per la registrazione a ultrasuoni e camere attenuanti del suono potrebbe limitare l'accessibilità per alcuni laboratori.

È importante sottolineare che i risultati rappresentativi inclusi in questo protocollo incorporano una combinazione di dataset eterogenei, inclusi esempi di singola sessione, dati di addestramento pilota e risultati sperimentali illustrativi. Questi esempi sono destinati a dimostrare la gamma di risultati attesi e gli approcci analitici comuni, piuttosto che fornire conclusioni biologiche definitive. Pertanto, questi dataset dovrebbero essere interpretati come dimostrazioni metodologiche piuttosto che come risultati guidati da ipotesi. Inoltre, sono inclusi riferimenti a dataset pubblici o non pubblicati per illustrare potenziali applicazioni del protocollo, ma non devono essere interpretati come risultati validati nel contesto di questo rapporto focalizzato sui metodi.

L'importanza di questo metodo risiede nella sua capacità di fornire un paradigma controllato e non sociale per lo studio del comportamento vocale, aderendo al contempo agli standard emergenti di rigore metodologico e riproducibilità. Eliminando le variabili legate all'accoppiamento e standardizzando le condizioni di elicitazione e registrazione, questo approccio offre chiari vantaggi rispetto ai paradigmi tradizionali, soprattutto quando l'obiettivo è isolare le influenze fisiologiche sulla produzione vocale indipendentemente dal contesto sociale. Il protocollo è particolarmente adatto per applicazioni in modelli di malattie neurodegenerative, studi di manipolazione endocrina e indagini sulla funzione sensorimotoria cranica, dove minimizzare le variabili di confusione è fondamentale. Più in generale, questo metodo contribuisce agli sforzi continui per armonizzare le pratiche di ricerca sull'USV e fornisce un quadro standardizzato per eleggere e quantificare il comportamento vocale. Sebbene tale standardizzazione sia un passo necessario per valutare il potenziale degli USV come biomarcatori traslazionali della funzione affettiva e sensorimotoria, l'attuale protocollo non stabilisce di per sé la validità dei biomarcatori. Piuttosto, consente l'acquisizione e l'analisi coerente dei dati necessarie affinché studi futuri possano verificare rigorosamente la rilevanza traslazionale.

Dichiarazioni

Non ci sono conflitti di interesse rilevanti.

Ringraziamenti

Il lavoro incluso in questo articolo è stato sostenuto in parte dal National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (NIDCD) dei National Institutes of Health (NIH) con il numero di premi R01DC0020179, un New Investigators Research Grant (A.J.S.) della American Speech-Language Hearing Foundation, dei Collins Medical Trust Grants (A.J.S.) e di fondi iniziali forniti ad A.J.S. dalla Purdue University.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
70% etanoloFisher ScientificBP28184Usato per pulire la camera tra gli animali
Trattamenti appetibili aggiuntivi (ad esempio, arachidi sgusciate)Bio-ServF6711Variazione opzionale di ricompensa per mantenere il coinvolgimento
Stazione di trasferimento degli animali (se utilizzata)NUAIREAllerGard NU-621Fornisce un ambiente di gestione controllato durante la socializzazione dell'esperimento (se applicabile al protocollo)
Tenda oscurante/lenzuoloMainstays (Walmart)https://www.walmart.com/ip/Mainstays-Super-Soft-Brushed-Microfiber-Bed-Sheet-Set-Rich-Black-King-4-Piece/12946065251Usato per eliminare luci ambientali e disturbi sonori esterni durante il trasferimento
Carrello (trasporto)Metro13-460-126Supporta le gabbie durante il trasferimento
Interfaccia computer/acquisizioneWindows10 Professional 64bitDeve soddisfare i requisiti software Sonotrack; utilizzato per la registrazione e l'archiviazione dei dati
Dispositivo di archiviazione dati (disco rigido esterno/server)GlyphBBPR4000Per l'archiviazione sicura di grandi file acustici
Fruit LoopsKellogg's4119210032Ricompensa alimentare appetibile per mantenere la novità e la motivazione
Garden Veggie StrawsSensible Portions829515300494Ricompensa alimentare appetibile per mantenere la novità e la motivazione
Detergente da laboratorio (sapone delicato)Dawn91064Usato per la pulizia post-sessione delle gabbie e degli inserti
Asciugamano di cartaToolBox5520208Usato con etanolo per la pulizia
Gabbie di registrazione in policarbonato (senza lettiera)UNO Life Science Solutions31200260Usato nella camera di registrazione per minimizzare gli artefatti acustici
DPI: camice monouso da laboratorioFisherbrand12-893-005XXLPreviene la contaminazione e il trasferimento di odori
DPI: guanti in nitrileAnsell19-168-967DPreviene la contaminazione e il trasferimento di odori
Sistema di illuminazione rossaKenallhttps://kenall.com/Animal-Research-Lab-Lighting#:~:text=Red%20LED%20lighting%20is%20ideal%20for%20animal%20research,for%20nocturnal%20animals%20such%20as%20mice%20and%20rats.Illuminazione a bassa visibilità per mantenere il ciclo di luce inversa consentendo al tempo stesso la visibilità dell'esperimento
Reese's PuffsGeneral Mills10016000275666Ricompensa alimentare appetibile per mantenere la novità e la motivazione
SmartChamber per topi e rattiMetrisSC-B100Camera fonoisolante per la registrazione delle vocalizzazioni ultrasoniche
Software di classificazione automatica delle chiamate Sonotrack (v1.4)MetrisST-S400Usato per il rilevamento, la classificazione e l'esportazione dei parametri acustici USV
Configurazione di base SonotrackMetrisST-R2P0-MHardware di acquisizione dati per la registrazione ultrasonica
Microfono ad ultrasuoni di fascia alta SonotrackMetrisST-B200Intervallo di frequenza ~15-125 kHz per il rilevamento USV dei roditori
Gabbie domestiche standardInnoviveM-BTM (Topo); R-BTM-H (Ratto)Gabbie standard per l'allevamento/trasferimento
TimerFisherbrand06-664-251Garantisce sessioni di registrazione standardizzate di 10 minuti

Riferimenti

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