Imaging immunofluorescenza standardizzato di nanotubi tunneling e trasferimento mitocondriale tra astrociti e neuroni

Sommario

Questo protocollo standardizza i metodi di fissazione, colorazione e imaging confocale per visualizzare nanotubi in tunneling e trasferimento mitocondriale tra astrociti e neuroni in vitro.

Abstract

I mitocondri sono organelli essenziali che regolano la produzione di energia, la segnalazione cellulare e l'omeostasi metabolica nelle cellule neurali. I nanotubi tunneling (TNT) sono sottili strutture membranose che mediano la comunicazione intercellulare a lunga distanza e facilitano il trasferimento di componenti cellulari, inclusi i mitocondri, tra cellule connesse. La visualizzazione affidabile dei TNT e del trasferimento mitocondriale richiede una gestione attenta del campione perché queste strutture sono altamente fragili e sensibili a condizioni di fissazione, lavaggio e imaging. Questo protocollo descrive procedure standardizzate per la fissazione, la colorazione e l'imaging confocale di TNT negli astrociti e nei sistemi di cocultura astrocito-neurone. Il flusso di lavoro include la colorazione di membrana e citoscheletro per la visualizzazione del TNT, l'etichettatura mitocondriale per il tracciamento della localizzazione mitocondriale e la colorazione con immunofluorescenza per l'analisi della colocalizzazione con Miro1. Durante tutta la procedura vengono sottolineati passaggi fondamentali per preservare la morfologia del TNT, tra cui un lavaggio delicato e una manipolazione protetta dalla luce. Il protocollo delinea anche approcci di imaging per la caratterizzazione di TNT e mitocondri in preparazioni a cellule fisse. Questi metodi forniscono un quadro sperimentale riproducibile per studiare la formazione di TNT e il trasferimento mitocondriale tra cellule neurali in vitro.

Introduzione

I mitocondri fungono da fabbriche energetiche della cellula, fornendo l'energia necessaria alle attività cellulari attraverso la produzione di adenosina trifosfato, svolgendo anche ruoli importanti nella trasduzione del segnale cellulare e nell'equilibrio^{redox 1}. Nel sistema nervoso, i metaboliti mitocondriali possono aumentare la complessità e l'eccitabilità dei processi neuronali, supportando così la crescita e lo sviluppo^{neuronale 2}. I mitocondri non sono organelli statici; alterano continuamente la loro morfologia, posizione ed distribuzione per adattarsi a vari stress intracellulari ed extracellulari e richieste^{metaboliche 3}. Il trasferimento intercellulare mitocondriale contribuisce al mantenimento dell'omeostasi tissutale e promuove lo sviluppo in condizioni fisiologiche, mentre in condizioni patologiche partecipa alla riparazione dei danni, alla regolazione immunitaria e alla progressione^{della malattia 4,5}.

La comunicazione intercellulare di materiali ed energia è essenziale per vari processi biologici, tra cui l'omeostasi cellulare, la riparazione dei tessuti e la regolazione delle reti neurali. Gli studi attuali hanno rivelato molteplici modalità di comunicazione intercellulare, tra cui i nanotubi a tunneling (TNT) rappresentano uno dei meccanismi più studiati associati al trasferimento mitocondriale^{intercellulare 6}. I TNT sono strutture a membrana a forma di ponte a base di F-actin, con una morfologia tubolare che varia da 50 a 200 nm di diametro e si estende fino a diversi diametri cellulari in^{lunghezza 7}. Le ricerche hanno dimostrato che i TNT possono fungere da connessioni fisiche tra le cellule neurali ed è strettamente associato all'insorgenza e alla progressione di malattie neurodegenerative, tumori al cervello e altri disturbi. Ad esempio, il trasferimento mitocondriale dalla microglia ai neuroni tramite TNT è stato riportato come un recupero delle cellule^{neuronali 8,9}.

La ricerca attuale sui TNT affronta spesso diverse sfide, tra cui la fragilità strutturale dei TNT, che li rende soggetti a rotture e può di conseguenza influenzare gli esiti sperimentali; difficoltà a distinguere i TNT dai filopodi o da altre protuberanze di membrana; e sfide associate alla quantificazione accurata dei TNT intercellulari. Per migliorare la riproducibilità e la consistenza degli studi relativi al TNT, sono necessari metodi standardizzati per il lavaggio, fissazione, colorazione e imaging dei TNT per consentire una valutazione accurata della loro struttura e distribuzione minimizzando la variabilità sperimentale. Fattori come la densità cellulare prima della fissazione, la protezione dalla luce, l'intensità del lavaggio, la durata della fissazione e le condizioni di colorazione post-fissazione possono tutti influenzare la struttura e la stabilità dei TNT. In questo studio, descriviamo procedure per il pretrattamento, la colorazione e l'imaging confocale di TNT e strutture di TNT associate a mitocondri nei sistemi di coltura di astrociti e astrociti-neuroni.

Questo protocollo di ricerca può essere generalmente applicato alla maggior parte degli ambienti di laboratorio. La validazione in astrociti primari e in una linea cellulare neuronale ippocampale di topo ha confermato che il protocollo è adatto sia alle cellule neurali primarie sia alle linee cellulari immortalate. Tuttavia, questo protocollo presenta ancora diverse limitazioni. La microscopia confocale fornisce una risoluzione spaziale inferiore rispetto agli approcci di imaging a super-risoluzione per la visualizzazione del TNT, e la valutazione del trasferimento mitocondriale basata su MitoTracker può essere influenzata da perdite di coloranti e interferenze di segnale non^{mitocondriale 10}.

Protocollo

Questo studio non ha coinvolto soggetti umani né animali vertebrati vivi; venivano utilizzate solo linee cellulari commercialmente ottenute o stabilite, e non era richiesta alcuna approvazione etica.

1. Colorazione per TNT negli astrociti

1. Semina delle Celle
   1. Isolare i semi gli astrociti primari di ratto al passaggio 3 (P3) in piatti di coltura a fondo di vetro da 35 mm con una densità di 5 × 10⁴ cellule per piatto. Aggiungi 2 mL di mezzo Eagle Modificato/Nutriente F-12 (DMEM/F-12) di Dulbecco's Modified Eagle Medium, integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) e miscela antibiotica tripla al 1% (penicillina G, streptomicina e anfotericina B). Coltivare le cellule a 37°C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO₂.
   2. Incubare le cellule per circa 24 ore fino all'attacco.
2. Pretrattamento e fissazione
   1. Trasferire i piatti di coltura su un banco pulito in condizioni di protezione dalla luce dopo l'attacco della cella.
      NOTA: Minimizzare movimenti e vibrazioni inutili durante la maneggiazione per preservare l'integrità del TNT.
   2. Rimuovi delicatamente il mezzo di coltura in condizioni di scarsa luce.
      NOTA: Evitare di asciugare completamente la superficie cellulare durante la rimozione del mezzo perché i TNT potrebbero collassare e attaccarsi al substrato di coltura.
   3. Lavare delicatamente le cellule una volta con 500 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza ioni calcio e magnesio (pH 7,3–7,5). Aggiungi e rimuovi lentamente il PBS lungo la parete del piatto di coltura per evitare di disturbare le TNT intercellulari durante il lavaggio.
   4. Rimuovi con attenzione il PBS.
   5. Fissare le cellule con una soluzione fissativa commerciale al 4% contenente paraformaldeide (pH 7,2–7,4) per 30 minuti a temperatura ambiente (RT; 20°C–25°C) in condizioni di scarsa luce.
      ATTENZIONE: Maneggiare le soluzioni fissative utilizzando le attrezzature di protezione individuale appropriate ed eseguire tutte le procedure in conformità con le linee guida istituzionali sulla sicurezza chimica.
   6. Rimuovi la soluzione fissativa.
   7. Lava le cellule una volta con PBS.
3. Permeabilizzazione cellulare e colorazione fluorescente
   1. Permeabilizzare le celle con 500 μL di soluzione di permeabilizzazione Triton X-100 pronta all'uso per 20 minuti a RT.
      ATTENZIONE: Il Triton X-100 può disturbare strutture fragili in TNT. Minimizzare l'eccessiva agitazione durante la permeabilizzazione.
   2. Rimuovi la soluzione di permeabilizzazione.
   3. Lava le cellule una volta con PBS.
   4. Prepara la soluzione per le macchie immediatamente prima dell'uso. Diluire il colorante F-actin in PBS a una concentrazione finale di 1 μM e utilizzare 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) come colorante nucleare pronto all'uso. Mescola accuratamente le due soluzioni per le macchie prima di usarle.
      NOTA: I reagenti di colorazione a base di flaloidina possono essere utilizzati come alternative alla visualizzazione della F-actina.
   5. Mescola le soluzioni di F-actin e colorazione nucleare in un rapporto 1:1 (volumi uguali) in condizioni di protezione dalla luce.
   6. Aggiungi la soluzione di tinta preparata ai piatti di coltura.
   7. Incubare le cellule per 30 minuti a 37°C al buio.
   8. Rimuovi la soluzione macchiante.
   9. Lava le cellule tre volte con PBS usando 500 μL per lavaggio per 1 minuto per ogni lavaggio.
   10. Aggiungi 1 mL di PBS per evitare che le cellule si secchino durante la preparazione per l'imaging.
4. Imaging Confocale
   1. Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale rovesciato Nikon dotato di un obiettivo ×20. Usa eccitazione di 405 nm per DAPI e eccitazione di 488 nm per la colorazione con F-actina. Acquisire immagini con una risoluzione di 1024 × 1024 pixel in condizioni di protezione dalla luce a RT.
   2. Eseguire una valutazione qualitativa e una quantificazione manuale utilizzando almeno cinque campi visivi selezionati casualmente per campione. Quantificare il numero di TNT e il numero di celle TNT-positive contenenti una o più TNT in ciascun campo visivo (Figura 1A e 1B).
      NOTA: Acquisire immagini immediatamente dopo la colorazione per minimizzare la perdita di fluorescenza e la perturbazione strutturale dei TNT.

Figura 1: Colorazione a fluorescenza di nanotubi in tunneling (TNT) negli astrociti. (A) Immagini rappresentative della microscopia confocale che mostrano colorazione nucleare e F-actin in astrociti coltivati in piatti di coltura con fondo di vetro. (B) Vista ingrandita della regione in scatola nel pannello A. Frecce bianche indicano strutture simili a TNT tra celle adiacenti. (C) Immagini rappresentative che mostrano strutture simili a TNT interrotte a causa di una gestione impropria dei campioni. (D) Vista ingrandita della regione racchiusa nel pannello C. Le frecce gialle indicano strutture simili a TNT disturbate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Colorazione per il trasferimento mitocondriale dagli astrociti ai neuroni tramite TNT

1. Semina degli astrociti e marcatura mitocondriale
   1. Semi isolano gli astrociti primari di ratto al passaggio 3 (P3) in piatti di coltura a fondo di vetro da 35 mm a densità di 3 × 10⁴ cellule per piatto. Aggiungi 2 mL di mezzo completo DMEM/F-12 integrato con una miscela antibiotica al 10% FBS e all'1% tripla (penicillina G, streptomicina e anfotericina B). Coltivare le cellule a 37°C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO₂.
   2. Incubare le cellule per circa 24 ore fino all'attacco.
   3. Trasferisci i piatti di coltura su un banco pulito in condizioni di luce fioca dopo l'attacco della cella.
      NOTA: Minimizzare movimenti e vibrazioni inutili durante la maneggiazione per preservare l'integrità del TNT.
   4. Rimuovere delicatamente il mezzo di coltura in condizioni di protezione dalla luce. Evita di disturbare i TNT durante la rimozione del medium.
      NOTA: Evitare di asciugare completamente la superficie cellulare durante la rimozione del mezzo perché i TNT potrebbero collassare e attaccarsi al substrato di coltura.
   5. Ricostituire 50 μg di colorante MitoTracker liofilizzato in dimetilsolfosido (DMSO) per preparare una soluzione stock da 1 mM e conservare la soluzione stock a −20°C. Prima dell'uso, diluire la soluzione standard in 400 μL di mezzo DMEM/F-12 completo integrato con una miscela di antibiotici al 10% FBS e all'1% tripla di antibiotici per ottenere una concentrazione finale di MitoTracker di 50 μM.
      ATTENZIONE: Proteggere i coloranti fluorescenti dall'esposizione diretta alla luce durante le procedure di preparazione e incubazione.
   6. Aggiungi la soluzione lavorativa per la colorazione mitocondriale ai piatti di coltura.
   7. Incubare le cellule a 37°C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO₂ per 30 minuti in condizioni di protezione dalla luce.
   8. Rimuovere la soluzione di colorazione mitocondriale in condizioni protette dalla luce.
   9. Lavare delicatamente le cellule una volta con 500 μL di PBS senza ioni calcio e magnesio (pH 7,3–7,5). Aggiungi e rimuovi lentamente il PBS lungo la parete del piatto di coltura per evitare di disturbare le TNT intercellulari durante il lavaggio.
   10. Rimuovi con attenzione il PBS.
2. Cocultura astrociti-neuroni
   1. Il seme ha immortalato le cellule neuronali dell'ippocampo del topo al passaggio 3 (P3) nei piatti di coltura contenenti astrociti a una densità di 3 × 10⁴ cellule per piatto. Aggiungere cellule in un volume totale di 2 mL costituito da una miscela 1:1 di DMEM e mezzo completo DMEM/F-12 integrata con una miscela di antibiotici al 10% FBS e all'1% tripla di antibiotici. Stabilire la cocultura utilizzando un metodo di contatto diretto senza inserire Transwell. Coltivare le cellule a 37°C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO₂.
      NOTA: Aggiungere delicatamente cellule neuronali per minimizzare la perturbazione delle strutture preesistenti del TNT.
   2. Mantenere la cocultura per 24 ore in condizioni standard dell'incubatrice, proteggendo i campioni da esposizioni inutili alla luce durante le procedure di manipolazione.
3. Fissazione e permeabilizzazione
   1. Rimuovere il mezzo di coltura in condizioni di protezione dalla luce.
   2. Lava le cellule una volta con PBS.
   3. Fissare le cellule con una soluzione fissativa al 4% contenente paraformaldeide per 30 minuti a RT in condizioni di luce fioca.
      ATTENZIONE: Maneggiare le soluzioni fissative utilizzando le attrezzature di protezione individuale appropriate ed eseguire tutte le procedure in conformità con le linee guida istituzionali sulla sicurezza chimica.
   4. Rimuovi la soluzione fissativa.
   5. Lava le cellule una volta con PBS.
   6. Permeabilizza le celle con 500 μL di soluzione di permeabilizzazione Triton X-100 pronta all'uso per 20 minuti a RT in condizioni di luce fioca.
      ATTENZIONE: Il Triton X-100 può disturbare strutture fragili in TNT. Minimizzare l'eccessiva agitazione durante la permeabilizzazione.
   7. Rimuovi la soluzione di permeabilizzazione.
   8. Lava le cellule una volta con PBS.
4. Colorazione e Imaging con Fluorescenza
   1. Prepara la soluzione per le macchie immediatamente prima dell'uso. Diluire il colorante F-actin in PBS a una concentrazione finale di 1 μM e utilizzare DAPI come colorante nucleare pronto all'uso. Mescola bene le soluzioni per le macchie prima di usarle.
      NOTA: I reagenti di colorazione a base di flaloidina possono essere utilizzati come alternative alla visualizzazione della F-actina.
   2. Mescola le soluzioni di colorazione F-actina e nucleari in un rapporto 1:1 (volumi uguali) in condizioni di protezione dalla luce immediatamente prima dell'uso.
   3. Aggiungi la soluzione di tinta preparata ai piatti di coltura.
   4. Incubare le cellule per 30 minuti a 37°C al buio.
   5. Rimuovi la soluzione macchiante.
   6. Lava le cellule tre volte con PBS usando 500 μL per lavaggio per 1 minuto per ogni lavaggio.
   7. Aggiungi 1 mL di PBS per evitare che le cellule si secchino durante la preparazione per l'imaging.
   8. Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale rovesciato Nikon dotato di un obiettivo ×20. Usa eccitazione di 405 nm per DAPI, eccitazione di 488 nm per la colorazione con F-actina e eccitazione di 665 nm per la colorazione con MitoTracker. Acquisire immagini con una risoluzione di 1024 × 1024 pixel in condizioni di protezione dalla luce a RT.
   9. Esegui una valutazione qualitativa utilizzando almeno cinque campi visivi selezionati casualmente per campione. Valutare la presenza di strutture simili al TNT e segnali di fluorescenza associati ai mitocondri all'interno delle connessioni intercellulari della membrana (Figura 2A e 2B).
      NOTA: Acquisire immagini immediatamente dopo la colorazione per minimizzare la perdita di fluorescenza e la perturbazione strutturale dei TNT.

Figura 2: Colorazione a fluorescenza di mitocondri e TNT in un sistema di cocultura astrocito-neurone. (A) Immagini rappresentative della microscopia confocale che mostrano colorazione nucleare, mitocondriale e F-actin in astrociti e neuroni coltivati in piatti di coltura con fondo di vetro. Gli astrociti presentavano morfologie irregolari simili a quelle di una stella o poligonali con processi cellulari estesi, mentre le cellule neuronali apparivano rotonde o ovali con estensioni sottili simili a neurite. (B) Vista ingrandita della regione racchiusa nel pannello A. Le frecce bianche indicano strutture simili al TNT associate ai mitocondri tra le cellule. Le due popolazioni cellulari sono state distinte principalmente in base alla loro morfologia cellulare caratteristica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Colorazione di colocalizzazione immunofluorescenza per mitocondri e Miro1 nei TNT

1. Semina degli astrociti e marcatura mitocondriale
   1. Semi isolano gli astrociti primari di ratto al passaggio 3 (P3) in piatti di coltura a fondo di vetro da 35 mm a densità di 3 × 10⁴ cellule per piatto. Aggiungi 2 mL di mezzo completo DMEM/F-12 integrato con una miscela antibiotica al 10% FBS e all'1% tripla (penicillina G, streptomicina e anfotericina B). Coltivare le cellule a 37°C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO₂.
   2. Incubare le cellule per circa 24 ore fino all'attacco.
   3. Trasferisci i piatti di coltura su un banco pulito in condizioni di luce fioca dopo l'attacco della cella.
      NOTA: Minimizzare movimenti e vibrazioni inutili durante la maneggiazione per preservare l'integrità del TNT.
   4. Rimuovere delicatamente il mezzo di coltura in condizioni di protezione dalla luce. Evita di disturbare i TNT durante la rimozione del medium.
      NOTA: Evitare di asciugare completamente la superficie cellulare durante la rimozione del mezzo perché i TNT potrebbero collassare e attaccarsi al substrato di coltura.
   5. Ricostituire 50 μg di colorante MitoTracker liofilizzato in DMSO per preparare una soluzione di stocco da 1 mM e conservare la soluzione di stocco a −20°C. Prima dell'uso, diluire la soluzione standard in 400 μL di mezzo DMEM/F-12 completo integrato con una miscela di antibiotici al 10% FBS e all'1% tripla di antibiotici per ottenere una concentrazione finale di MitoTracker di 50 μM.
      ATTENZIONE: Proteggere i coloranti fluorescenti dall'esposizione diretta alla luce durante le procedure di preparazione e incubazione.
   6. Aggiungi la soluzione lavorativa per la colorazione mitocondriale ai piatti di coltura.
   7. Incubare le cellule a 37°C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO₂ per 30 minuti in condizioni di protezione dalla luce.
   8. Rimuovere la soluzione di colorazione mitocondriale in condizioni protette dalla luce.
   9. Lavare delicatamente le cellule una volta con 500 μL di PBS senza ioni calcio e magnesio (pH 7,3–7,5). Aggiungi e rimuovi lentamente il PBS lungo la parete del piatto di coltura per evitare di disturbare le TNT intercellulari durante il lavaggio.
   10. Rimuovi con attenzione il PBS.
2. Cocultura astrociti-neuroni
   1. Il seme ha immortalato le cellule neuronali dell'ippocampo del topo al passaggio 3 (P3) nei piatti di coltura contenenti astrociti a una densità di 3 × 10⁴ cellule per piatto. Aggiungere cellule in un volume totale di 2 mL costituito da una miscela 1:1 di DMEM e mezzo completo DMEM/F-12 integrata con una miscela di antibiotici al 10% FBS e all'1% tripla di antibiotici. Stabilire la cocultura utilizzando un metodo di contatto diretto senza inserire Transwell. Coltivare le cellule a 37°C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO₂.
      NOTA: Aggiungere delicatamente cellule neuronali per minimizzare la perturbazione delle strutture preesistenti del TNT.
   2. Mantenere la cocultura per 24 ore in condizioni standard dell'incubatrice, proteggendo i campioni da esposizioni inutili alla luce durante le procedure di manipolazione.
3. Fissazione e permeabilizzazione
   1. Rimuovere il mezzo di coltura in condizioni di protezione dalla luce.
   2. Lava le cellule una volta con PBS.
   3. Fissare le cellule con una soluzione fissativa commerciale al 4% contenente paraformaldeide (pH 7,2–7,4) per 30 minuti a RT in condizioni di luce scarsa.
      ATTENZIONE: Maneggiare le soluzioni fissative utilizzando le attrezzature di protezione individuale appropriate ed eseguire tutte le procedure in conformità con le linee guida istituzionali sulla sicurezza chimica.
   4. Rimuovi la soluzione fissativa.
   5. Lava le cellule una volta con PBS.
   6. Permeabilizza le celle con 500 μL di soluzione di permeabilizzazione Triton X-100 pronta all'uso per 20 minuti a RT in condizioni di luce fioca.
      ATTENZIONE: Il Triton X-100 può disturbare strutture fragili in TNT. Minimizzare l'eccessiva agitazione durante la permeabilizzazione.
   7. Rimuovi la soluzione di permeabilizzazione.
   8. Lava le cellule una volta con PBS.
4. Bloccaggio e colorazione immunofluorescenza
   1. Blocca le cellule con siero di capra al 5% per 1 ora a RT in condizioni di scarsa luce. Prepara la soluzione bloccante diluendo il siero di capra 1:20 in PBS.
   2. Rimuovi la soluzione bloccante.
   3. Diluire l'anticorpo anti-Miro1 monoclonale del coniglio nel PBS con un rapporto di diluizione di 1:100. Aggiungere la soluzione primaria diluita di anticorpi ai vasi di coltura e incubare durante la notte (12–16 ore) a 4°C.
      NOTA: Proteggere i campioni etichettati con fluorescenze dall'esposizione diretta alla luce durante tutta la procedura di colorazione.
   4. Rimuovi la soluzione primaria degli anticorpi.
   5. Lava le cellule tre volte con PBS usando 500 μL per lavaggio per 1 minuto per ogni lavaggio.
   6. Diluire l'anticorpo secondario fluorescente anti-coniglio IgG nel PBS con un rapporto di diluizione di 1:100. Aggiungere 500 μL di soluzione secondaria diluita di anticorpi a ciascuna ciotola di coltura e incubare per 1 ora in condizioni protette dalla luce.
      NOTA: Un controllo senza anticorpi primari non è stato incluso nel presente studio. Gli esperimenti futuri dovrebbero incorporare controlli di immunofluorescenza appropriati per convalidare ulteriormente la specificità della colorazione.
   7. Rimuovi la soluzione secondaria di anticorpi fluorescenti.
5. Controcolorazione e imaging fluorescente
   1. Prepara la soluzione per le macchie immediatamente prima dell'uso. Diluire il colorante F-actin in PBS a una concentrazione finale di 1 μM e utilizzare DAPI come colorante nucleare pronto all'uso. Mescola bene le soluzioni per le macchie prima di usarle.
      NOTA: I reagenti di colorazione a base di flaloidina possono essere utilizzati come alternative alla visualizzazione della F-actina.
   2. Aggiungi la soluzione per le tinture ai piatti di coltura.
   3. Incubare le cellule per 30 minuti a 37°C al buio.
   4. Rimuovi la soluzione macchiante.
   5. Lava le cellule tre volte con PBS usando 500 μL per lavaggio per 1 minuto per ogni lavaggio.
   6. Aggiungi 1 mL di PBS per evitare che le cellule si secchino durante la preparazione per l'imaging.
   7. Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale rovesciato Nikon dotato di un obiettivo ×20. Raccogli immagini Z-stack utilizzando una dimensione di passo di 5 μm su un intervallo totale di imaging di 40 μm (8 sezioni ottiche). Usare eccitazione a 405 nm per DAPI, eccitazione a 488 nm per la colorazione con F-actina, 594 nm per l'immunocolorazione Miro1 e 665 nm per la colorazione con MitoTracker. Acquisire immagini con una risoluzione di 1024 × 1024 pixel in condizioni di protezione dalla luce a RT.
   8. Esegui una valutazione qualitativa utilizzando almeno cinque campi visivi selezionati casualmente per campione. Valutare strutture simili a TNT, segnali di fluorescenza associati ai mitocondri e apparente localizzazione tra Miro1 e colorazione associata ai mitocondri all'interno delle connessioni intercellulari della membrana (Figura 3A–3C).
      NOTA: Acquisire immagini immediatamente dopo la colorazione per minimizzare la perdita di fluorescenza e la perturbazione strutturale dei TNT.

Figura 3: Colorazione da colocalizzazione di mitocondri e Miro1 nei TNT in un sistema di cocultura astrocito-neurone. (A) Immagini rappresentative della microscopia confocale che mostrano colorazione nucleare, mitocondriale, Miro1 e F-actin in astrociti e neuroni coltivati in piatti di coltura con fondo di vetro. Le frecce bianche indicano regioni di apparente localizzazione tra segnali associati ai mitocondri e Miro1 all'interno di strutture simili a TNT. (B) Immagine tridimensionale ricostruita a Z-stack che mostra strutture simili a TNT formate tra celle adiacenti. (C) Ricostruzione laterale della stessa immagine a pila Z che mostra strutture simili a TNT che si estendono tra celle adiacenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Nelle preparazioni di monocoltura di astrociti, sono state osservate sottili protuberanze di membrana che collegano cellule adiacenti dopo colorazione con F-actin e nucleare (Figura 1A e 1B). Sono state rilevate molteplici strutture simili al TNT che si estendono tra gli astrociti vicini, e i singoli astrociti formavano frequentemente connessioni con diverse cellule circostanti. La conservazione efficace di strutture simili al TNT era associata a una gestione delicata durante le procedure di lavaggio e fissazione. Un eccessivo disturbo meccanico durante la rimozione o il lavaggio del mezzo ha portato a una minore rilevabilità e a una rottura strutturale di queste connessioni a membrana, come dimostrato nelle strutture simili al TNT interrotte dopo una gestione impropria del campione (Figure 1C e 1D).

Nelle preparazioni di cocultura astrocito-neurone, sono stati osservati segnali di fluorescenza associati ai mitocondri all'interno di strutture simili al TNT che collegano cellule adiacenti dopo la colorazione con MitoTracker e l'imaging confocale (Figura 2A e 2B). Queste strutture sono state visualizzate insieme a F-actin e colorazione nucleare per supportare la valutazione morfologica delle connessioni simili al TNT. Una corretta protezione della luce e una riduzione dell'intensità del lavaggio hanno migliorato la conservazione del segnale di fluorescenza e della morfologia del TNT durante la preparazione per l'imaging.

Negli esperimenti di colocalizzazione con immunofluorescenza, sono stati osservati segnali di fluorescenza sovrapposti corrispondenti alla colorazione associata ai mitocondri e immunocolorazione con Miro1 all'interno di strutture simili al TNT in preparazioni di cocoltura astrocito-neuroni (Figura 3A). Queste osservazioni suggeriscono una possibile associazione tra Miro1 e mitocondri localizzati all'interno di strutture simili a TNT. L'imaging tridimensionale ricostruito a Z-stack ha ulteriormente supportato la presenza di strutture simili al TNT che si estendono tra celle adiacenti (Figura 3B e 3C). La conservazione del TNT, l'intensità del segnale di fluorescenza e la qualità dell'immagine sono state influenzate da condizioni di fissazione, permeabilizzazione e di imaging.

Discussione

Il primo passo critico nel protocollo sperimentale descritto sopra è il pretrattamento protetto dalla luce prima della fissazione. Le strutture simili al TNT sono altamente fragili e mantenere condizioni di protezione dalla luce dopo la rimozione dall'incubatore è importante per preservare l'intensità del segnale di fluorescenza e l'integrità strutturale durante la preparazione del campione. Il secondo passo fondamentale è eseguire il lavaggio PBS con manipolazione delicata per minimizzare la rottura delle strutture simili al TNT causata dal flusso di fluidi. L'aderenza a queste procedure chiave di gestione aiuta a preservare la morfologia e la stabilità delle strutture simili al TNT e migliora la coerenza dei risultati di imaging successivi. Un'aspirazione eccessiva, un lavaggio prolungato o una forte agitazione del fluido possono portare al collasso o alla frammentazione di strutture simili al TNT durante la lavorazione del campione. Grazie alla loro natura altamente dinamica, i TNT sono sensibili alla luce. La fototossicità indotta dall'esposizione alla luce può causare disturbi del TNT, rendendo queste strutture difficili da visualizzare¹¹. Pertanto, durante gli esperimenti legati al TNT dovrebbero essere mantenute condizioni protette dalla luce.

Il movimento mitocondriale intracellulare contribuisce alla distribuzione dell'energia cellulare, in particolare nei neuroni. Studi hanno dimostrato che i mitocondri possono muoversi lungo filamenti di actina e^{microtubuli 12}. Studi recenti hanno anche dimostrato che i TNT possono funzionare come strutture di comunicazione intercellulare a lunga distanza associate al trasferimento mitocondriale tra cellule^{neurali 13}. L'approccio metodologico descritto in questo studio consente la visualizzazione di strutture simili al TNT e dei segnali di fluorescenza associati ai mitocondri nei sistemi di coltura cellulare neurali. Studi precedenti hanno dimostrato che il trasferimento intercellulare mitocondriale tra cellule neurali può contribuire alla riparazione dei tessuti e ai processi neuroprotettivi in disturbi neurologici come il morbo di Parkinson e la lesione ischemica^{cerebrale 14,15}. Utilizzando i metodi descritti in questo studio, sono state osservate strutture simili al TNT tra astrociti e tra astrociti e neuroni, insieme a segnali di fluorescenza associati ai mitocondri localizzati all'interno di queste strutture.

Come osservato negli studi^{precedenti 10}, la colorazione con MitoTracker è soggetta a perdite di coloranti e a trasferimento di segnali non mitocondriali, che possono ridurre l'affidabilità dei dati. Per affrontare questa limitazione, le future indagini dovrebbero adottare metodi più robusti, come la marcatura mitocondriale codificata geneticamente, per ottenere risultati più conclusivi. Nelle condizioni sperimentali attuali, i due tipi cellulari sono stati distinti principalmente in base alla morfologia cellulare, un approccio che potrebbe ridurre la specificità di identificazione del tipo cellulare. Studi futuri dovrebbero incorporare la marcatura fluorescente specifica per tipo cellulare per migliorare l'accuratezza dell'analisi della cocultura. Miro1 è una proteina adattatrice localizzata nella membrana mitocondriale esterna ed è stata implicata nei processi di trasporto mitocondriale nei^{neuroni 16,17}. Utilizzando il protocollo di colocalizzazione immunofluorescenza descritto in questo studio, sono stati osservati segnali di fluorescenza sovrapposti corrispondenti alla colorazione associata ai mitocondri e immunocolorazione con Miro1 all'interno di strutture simili al TNT. Queste osservazioni suggeriscono una possibile associazione tra Miro1 e mitocondri localizzati all'interno di strutture simili a TNT. Tuttavia, la risoluzione spaziale della microscopia confocale convenzionale può limitare la valutazione definitiva della colocalizzazione molecolare all'interno di sottili protuberanze di membrana.

Abbiamo effettuato immagini Z-stack per confermare la presenza di strutture simili al TNT tra le cellule, supportando così la validazione strutturale di queste connessioni di membrana. Sebbene l'attuale protocollo sia adatto alla maggior parte degli ambienti sperimentali, l'imaging confocale delle cellule fisse può causare la perdita di fragili strutture simili al TNT durante la lavorazione del campione rispetto all'imaging con cellule vive, limitando così una quantificazione accurata del^{TNT 18}. Inoltre, l'imaging delle cellule fisse non consente una determinazione univoca della direzionalità del trasferimento mitocondriale, il che richiede ulteriori indagini in studi futuri. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro sperimentale standardizzato per la colorazione di strutture simili al TNT, segnali associati ai mitocondri e proteine correlate nei sistemi di coltura cellulare neurale. Rispetto alle procedure di lavaggio e fissazione incontrollate, il protocollo enfatizza una maneggiamento delicato del campione e la conservazione della fluorescenza durante la preparazione per l'imaging. Questi metodi possono aiutare a migliorare la consistenza e la riproducibilità sperimentale negli studi di imaging correlati al TNT.

In sintesi, questo studio fornisce un protocollo di laboratorio pratico e ampiamente applicabile per la valutazione qualitativa dei TNT e l'indagine del trasporto mitocondriale tramite strutture simili al TNT. Tuttavia, fasi di elaborazione del campione come la fissazione e il lavaggio possono introdurre variabilità nella quantificazione rispetto agli approcci di imaging a cellule vive. Inoltre, la microscopia confocale offre una risoluzione spaziale inferiore rispetto alla microscopia a super-risoluzione, il che limita la caratterizzazione strutturale dettagliata dei TNT. Inoltre, la colorazione mitocondriale basata su MitoTracker è influenzata da perdite di coloranti e trasferimento di segnali aspecifici, che dovrebbero essere affrontati in studi futuri per migliorare l'accuratezza sperimentale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1% miscela di antibiotici tripla	Biosharp	BL142A	Previene la contaminazione batterica e fungina durante la coltura cellulare
Fissativo cellulare tissutale 4%	Solarbio	P1110	Reagente di fissazione cellulare
Anticorpo anti-Miro1	Abcam	AB319154	Anticorpo primario contro Miro1
Astrociti	Cellule primarie isolate in laboratorio	NA	Gli astrociti sono stati isolati dalla corteccia cerebrale di cuccioli di ratti SD neonatali di età compresa tra 1 e 3 giorni. La purezza delle cellule isolate è stata confermata essere >95% mediante colorazione GFAP e le cellule di passaggio 3 (P3) sono state utilizzate per tutti gli esperimenti
Medium per coltura cellulare astrocitica (DMEM/F-12)	Gibco	6125011	DMEM e F-12 sono stati miscelati in un rapporto 1:1 (v/v), integrati con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% di antibiotici tripli
Microscopio confocale	Nikon AX	ECLIPSE TI2-E	Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale Nikon AX (Nikon Corporation, Giappone) controllato da NIS-Elements (versione 5.4)
DAPI	Servicebio	G1012-100ML	Colorante per colorazione nucleare
DMSO	BioFroxx	1084ML100	Solvente utilizzato per la preparazione di soluzioni di stock di coloranti fluorescenti
Colorante per colorazione F-actin	Thermo Fisher Scientific	A57243	Reagente di colorazione F-actin per la visualizzazione di strutture citoscheletriche e nanotubi tunnel
Siero bovino fetale	ExCell Bio	FSD500	Fornisce nutrienti essenziali per la coltura cellulare
Anticorpo secondario fluorescente (Capra Anti-Coniglio IgG)	ABclonal	AS039	Anticorpo secondario per colorazione immunofluorescente
Piatto per coltura cellulare con fondo in vetro	NEST	801001	Piatto per imaging per microscopia confocale
Siero di capra	Solarbio	210C051	Reagente di blocco per colorazione immunofluorescente
MitoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	M22426	Colorante per colorazione mitocondriale
Neuroni	Cell Bank of CAS	HT22-GNM47	Cellule neuronali ippocampali murine immortalizzate sono state mantenute in DMEM completo. Le cellule al passaggio 3 (P3) sono state raccolte e utilizzate per esperimenti successivi.
Medium per coltura cellulare neuronale (DMEM)	Servicebio	G4511-500ML	DMEM integrato con GlutaPlus e piruvato di sodio, senza HEPES, integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% di antibiotici tripli
Soluzione salina fosfatata (PBS)	Servicebio	G4203-500ML	Buffer di lavaggio utilizzato durante la fissazione e la colorazione
Triton X-100	Solarbio	P1080	Reagente di permeabilizzazione cellulare