Isolamento della microglia cerebrale per studiare la persistenza del virus dell'immunodeficienza umana-1

Nikesh Katuwal; Xiaoyi Li; Yuyang Tang; Guochun Jiang

doi:10.3791/71673

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Articolo metodologico

Isolamento della microglia cerebrale per studiare la persistenza del virus dell'immunodeficienza umana-1

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DOI:

10.3791/71673

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18 settembre 2026

Nikesh Katuwal¹ , Xiaoyi Li¹ , Yuyang Tang^*¹^,² , Guochun Jiang^*¹^,²^,³

¹UNC HIV Cure Center, University of North Carolina at Chapel Hill, ²Division of Infectious Diseases at the Department of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill, ³Department of Biochemistry & Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'isolamento, la purificazione e la coltura di cellule mieloidi/microglia umane altamente pure ottenute da tessuto cerebrale post mortem prelevato mediante autoptsi rapida da soggetti con e senza virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1). Fornisce una piattaforma ex vivo solida per lo studio della biologia delle cellule mieloidi/microgliali, delle riserve cerebrali di HIV, della neuroinfiammazione e delle strategie per la cura dell'HIV.

Abstract

Abbiamo messo a punto e ottimizzato un protocollo solido per isolare, coltivare e studiare cellule mieloidi cerebrali umane primarie (BrMCs) da tessuti cerebrali post mortem ottenuti mediante autoptsi rapida da soggetti con o senza HIV-1 (HIV), in cui >Il 97,3% delle BrMC sono microglia cerebrale (MG). Pertanto, queste BrMC isolate vengono indicate come MG o BrMC/MG per rappresentare in modo più accurato le popolazioni cellulari. Questo metodo consente un'analisi completa ex vivo studio della biologia delle microglia, inclusi i loro ruoli nel mantenimento delle riserve di HIV nel cervello, nella mediazione dell'infiammazione neurologica e nel contributo al danno neuronale, nonché la valutazione di strategie per la cura dell'HIV.

Per preservare la vitalità cellulare e l'integrità di RNA e proteine, i tessuti cerebrali sono stati raccolti entro 6 h dalla morte, a seguito di un'autopsia di ricerca rapida. Diverse regioni, tra cui le cortecce frontale, parietale e occipitale, l'ippocampo e i gangli della base, sono state processate mediante digestione enzimatica e dissociazione meccanica controllata, seguite da centrifugazione su gradiente di densità per generare sospensioni cellulari singole vitali con efficace rimozione dei detriti mielinici e lisi degli eritrociti. I BrMCs/MG sono stati quindi purificati utilizzando un approccio di isolamento in due passaggi, costituito dalla deplezione delle cellule T CD3⁺ seguita dall'arricchimento mediante microsferette magnetiche CD11b⁺ per garantire purezza e specificità.

Le cellule mieloidi purificate sono state coltivate in condizioni definite, integrate con M-CSF, per mantenere la vitalità e l'integrità funzionale durante la coltura prolungata ex vivo. Questa piattaforma ottimizzata fornisce una base affidabile e scalabile per analisi molecolari, immunologiche e virologiche a valle dei serbatoi cerebrali di HIV e dei meccanismi correlati nelle BrMCs/MG.

Introduzione

Le cellule mieloidi cerebrali (BrMC) e le microglia sono le principali cellule immunitarie innate del sistema nervoso centrale (SNC)¹^,²^,³. In condizioni fisiologiche, monitorano costantemente il cervello e svolgono compiti come il pruning sinaptico, la rimozione di detriti e il supporto ai neuroni⁴^,⁵^,⁶. In presenza di malattia, le microglia si attivano dal punto di vista immunologico, provocando neuroinfiammazione, che svolge un ruolo essenziale nella neurodegenerazione in diverse patologie del SNC⁷^,⁸^,⁹. Durante l'infezione da HIV-1 (HIV), le BrMC/microglia rappresentano il principale serbatoio virale nel cervello, insieme ai linfociti T del SNC e possibilmente agli astrociti; questi ultimi probabilmente hanno un ruolo marginale nei serbatoi di HIV nel SNC. Le microglia ospitano DNA provirale di HIV integrato in forma latente, ma mantengono un'espressione ridotta di RNA di HIV, nonostante una terapia antiretrovirale (ART) efficace¹⁰^,¹¹^,¹². L'infezione persistente da HIV nelle BrMC/microglia provoca un'infiammazione cronica ed è associata al disturbo neurocognitivo correlato all'HIV (HAND), anche sotto trattamento ART moderno, come dimostrato da sintomi cognitivi, comportamentali e motori fino al 50% delle persone con HIV (PWH)¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. Pertanto, comprendere la funzione delle microglia persistentemente infette da HIV è fondamentale per chiarire i meccanismi molecolari dell'infezione e della latenza da HIV, l'interazione tra microglia, astrociti e altre cellule del SNC, il danno neuronale e il processo patologico del HAND, aspetti cruciali per identificare bersagli terapeutici contro il neuroHIV¹¹^,¹²^,¹⁷.

Tuttavia, esistono sfide tecniche nello studio delle microglia mediante tessuto cerebrale umano post mortem. L'elevato contenuto di mielina, specialmente nella sostanza bianca, può intrappolare le cellule e ostruire i filtri, riducendo il recupero cellulare a meno che la mielina non venga rimossa prima della selezione immunomagnetica¹⁸^,¹⁹. Dopo la morte del soggetto con infezione da HIV (PWH), i marcatori di superficie cellulare, come TMEM119 e P2RY12, possono degradarsi, rendendo così più difficile l'identificazione accurata delle microglia²⁰^,²¹. Inoltre, le cellule mieloidi nei cervelli infettati da HIV comprendono monociti periferici e macrofagi residenti nei tessuti che condividono alcuni marcatori comuni con le microglia; pertanto, sono necessari passaggi aggiuntivi per arricchire la popolazione pura di cellule mieloidi cerebrali (BrMCs), in particolare delle microglia²²^,²³.

Gli approcci attuali per l'isolamento di microglia umana non funzionano bene con tessuti post-mortem infettati da HIV. La citometria a flusso attivata da fluorescenza fornisce risultati completi ma richiede apparecchiature costose, richiede più tempo e produce un basso rendimento cellulare da piccole quantità di preziosi tessuti cerebrali umani²⁴^,²⁵. L'immunopanning è specifica, ma non consente di elaborare campioni provenienti da molte regioni cerebrali contemporaneamente e richiede un tempo di incubazione lungo, il che non è adatto per tessuti post-mortem che necessitano di una rapida lavorazione dopo la spedizione notturna²⁶^,²⁷. Inoltre, nessuno di questi metodi permette il recupero sia di linfociti T che di cellule mieloidi dallo stesso campione, cosa necessaria per ottenere un profilo immunitario completo delle cellule del SNC infettate da HIV¹⁷^,²⁸.

Questo protocollo fornisce un approccio riproducibile, affidabile ed efficiente per l'isolamento e l'arricchimento di microglia e altre cellule immunitarie del sistema nervoso centrale da tessuti cerebrali umani post-mortem infettati da HIV. La dissociazione meccanica controllata combinata con una lieve digestione enzimatica (ad esempio, TrypLE Express e DNase I) preserva in larga misura gli antigeni di superficie e riduce al minimo l'aggregazione cellulare²⁹^,³⁰. La mielina viene rimossa mediante centrifugazione su gradiente di densità al Percoll, seguita da separazione immunomagnetica di cellule T CD3⁺ e cellule mieloidi CD11b⁺³¹^,³². È importante notare che l'uso di condizioni enzimatiche lievi preserva i principali marcatori mieloidi, tra cui CD11b e CD68, nonché biomarcatori specifici della microglia come TMEM119 e P2RY12, consentendo una caratterizzazione accurata delle cellule del sistema nervoso centrale e analisi dei percorsi di segnalazione a valle³³. L'approccio di selezione in due fasi genera inoltre una frazione altamente pura di cellule T CD3⁺ adatta a studi virologici e immunologici, particolarmente rilevante per il NeuroHIV, data la funzione delle cellule T nella riserva virale nel sistema nervoso centrale e nel danno neurologico associato all'HIV dopo l'infiltrazione delle cellule T nel cervello³⁴^,³⁵.

Complessivamente, questo approccio sequenziale in due fasi — la deplezione iniziale delle cellule T CD3⁺ seguita dall'arricchimento delle cellule mieloidi CD11b⁺ dalla frazione negativa per CD3 — migliora sia la purezza cellulare che il rendimento delle cellule del SNC, massimizzando al contempo l'utilizzo di questi campioni tissutali preziosi, limitati e di grande valore. Le cellule isolate sono adatte per una vasta gamma di applicazioni successive, tra cui sequenziamento dell'RNA su popolazione cellulare intera e a singola cellula, citometria a flusso, saggi funzionali e analisi virologiche, inclusa la quantificazione di DNA/RNA dell'HIV e saggi di riproduzione virale per determinare le riserve virali in grado di replicarsi all'interno delle cellule immunitarie residenti nel SNC¹⁷^,³⁶^,³⁷.

Questo protocollo è compatibile con laboratori attrezzati per l'elaborazione di tessuto cerebrale post mortem in condizioni BSL-2+, poiché molti soggetti con HIV sono sottoposti a soppressione della terapia antiretrovirale (ART) o presentano solo una breve interruzione della ART alla fine della vita. Richiede soltanto piattaforme standard di separazione immunomagnetica e citometria a flusso per validare la specificità delle BrMC/microglia dopo l'isolamento. Con lievi modifiche, può essere adattato anche allo studio di malattie del sistema nervoso centrale come la malattia di Alzheimer, la sclerosi multipla, il long COVID19 e il trauma cranico³⁸^,³⁹^,⁴⁰. Il protocollo è stato inoltre ottimizzato per l'isolamento di cellule cerebrali da primati non umani (NHP) infettati con SIVmac251 o SIVmac239¹²^,⁴¹, nonché da modelli murini umanizzati di infezione o latenza da HIV, fornendo un modello fisiologicamente rilevante dell'infezione da HIV nel cervello. A differenza dei cervelli umani, questi modelli animali sono più facilmente accessibili e rappresentano una risorsa complementare preziosa per studi meccanicistici e traslazionali sull'infezione da HIV, la latenza da HIV e le condizioni neuroHIV associate.

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Protocollo

NOTA: manipolare tutti i tessuti umani e di primati non umani in condizioni di livello di sicurezza biologica 2 (BSL-2). Utilizzare dispositivi di protezione individuale adeguati, tra cui camice, guanti, mascherina e visiera, durante il trattamento con Percoll, tampone ACK e DMSO. Smaltire i rifiuti chimici e biologici secondo le linee guida istituzionali. Sciacquare tutti gli strumenti monouso utilizzati durante la dissociazione del tessuto, come bisturi, pipette e piastre di Petri, in una soluzione di ipoclorito al 10% prima di gettarli nei sacchetti per rifiuti biologici. Sciacquare gli strumenti riutilizzabili, come pinze e forbici, con SDS al 10% prima di lavarli e sterilizzarli in autoclave.

1. Raccolta del tessuto cerebrale

Campioni umani
NOTA: I tessuti umani utilizzati in questo studio sono stati ottenuti seguendo protocolli approvati dal Comitato per la Revisione Istituzionale (IRB) dell'Università della California, San Diego (UCSD; IRB n. 160563)¹². I donatori erano individui affetti da HIV in trattamento con terapia antiretrovirale (ART). Le caratteristiche principali dei donatori, inclusi età, sesso, intervallo post-mortem (PMI) e stato di terapia ART, sono brevemente riassunte qui, e sono state descritte con attenzione nella pubblicazione precedente¹².
1. Raccogliere i tessuti entro ≤6 h dalla morte per preservare la vitalità cellulare e l'integrità dell'RNA e spedirli al laboratorio di elaborazione entro 24 h.
Campioni di primati non umani (NHP)
NOTA: I macachi rhesus (Macaca mulatta) sono stati ospitati presso il Centro Nazionale per la Ricerca sui Primati di Emory (ENPRC, PROTO201700286) o presso il Centro Nazionale per la Ricerca sui Primati della California (CNPRC, UCD IACUC n. 22832). Le procedure di cura e sperimentazione animale sono state condotte in conformità con le normative dei rispettivi Comitati Istituzionali per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) e in ottemperanza alle linee guida istituzionali e federali. Tutte le strutture per la cura degli animali sono accreditate dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti e dall'Associazione per la Valutazione e l'Accreditamento delle Strutture per la Cura degli Animali da Laboratorio Internazionale (AAALAC).
1. Raccogliere i tessuti immediatamente dopo la necroscopia¹².
Raccolta dei tessuti
NOTA: Eseguire tutte le operazioni di manipolazione in barche pesatrici preraffreddate poste sul ghiaccio.
1. Raccogliere da 2 a 20 g per regione cerebrale (ad esempio, corteccia frontale, parietale, occipitale, ippocampo, gangli della base), in base alla disponibilità del tessuto.
2. Collocare i tessuti in DMEM/F12 freddo arricchito con ART: 100 nM Nevirapina, 200 nM Raltegravir, 25 nM Darunavir. Mantenere i tessuti a 4 °C.
Condizioni di trasporto
1. Conservare i campioni in provette sigillate a 4 °C su ghiaccio.
2. Fare trasportare le provette da personale qualificato secondo le normative UN3373 Categoria B¹². Spedire in 24 ore su ghiaccio al laboratorio di elaborazione.

2. Preparazione del tessuto

Trasferire il tessuto in provette da 50 mL. Lavare il tessuto 10–15 volte capovolgendo delicatamente le provette con 20–40 mL di HBSS freddo con DNasi (10 U/mL) fino a quando il sopranatante risulti limpido.
NOTA: Questo passaggio elimina sangue, detriti e contaminanti; assicurarsi che il volume sia sufficiente affinché i pezzi di tessuto possano muoversi liberamente durante il lavaggio.
Rimuovere e scartare le meningi e i vasi di grandi dimensioni utilizzando pinze sterili.
Trasferire il tessuto in una nuova piastra di Petri e registrare il peso del tessuto (escluso il contenitore) per regione cerebrale.
Lacerare il tessuto in frammenti di ~1–2 mm utilizzando una pinza sterile in ~10 mL di HBSS + DNasi I (10 U/mL).
NOTA: Il trinciamento può essere eseguito nella piastra di Petri utilizzando un bisturi.

3. Digestione enzimatica

Preparare la miscela di digestione mescolando 10 mL di enzima ricombinante di dissociazione cellulare e DNasi I (10 U/mL finali).
Riscaldare preventivamente lo shaker rotante a 37 °C e l'enzima ricombinante di dissociazione cellulare con DNasi I (10 U/mL finali) in un incubatore a 37 °C.
Trasferire il tessuto nella miscela di digestione del passaggio 3.1 in fiasche (T150 per volumi > 50 mL; fiasche più piccole se <50 mL) e incubare in shaker rotatori a: 37 °C, 150 rpm, 30 min.
Pipettare delicatamente usando pipette da 10 mL, quindi da 5 mL per aspirare e rilasciare più volte.
NOTA: Evitare una pipettaggio troppo energico.
Incubare per 5 min a temperatura ambiente per permettere al tessuto di sedimentare.
Raccolta delle cellule
1. Raccogliere il soprannatante in un tubo da 50 mL; questa è la Raccolta n. 1. Aggiungere il 10% di FBS nel soprannatante raccolto per inibire l'attività enzimatica.
2. Risospendere il tessuto rimanente in HBSS + DNasi I (10 U/mL) + FBS al 10% (10 mL/g di tessuto). Pipettare delicatamente e filtrare attraverso filtri da 70–100 µm.
  NOTA: Se la digestione enzimatica è adeguata, tutto il tessuto passerà attraverso il filtro.
3. Centrifugare a 500 × g, a temperatura ambiente, per 10 min; questa è la Raccolta n. 2.
  NOTA: Per massimizzare il recupero, lasciare sedimentare la sospensione e trasferire solo il soprannatante in un nuovo tubo.
Elaborazione finale
1. Centrifugare le raccolte (C1 e C2) a 500 × g per 10 min.
2. Eliminare i soprannatanti. Riunire i pellet cellulari di C1 e C2 in un unico tubo.

4. Rimozione dei detriti mielinici (gradiente al Percoll)

Preparare Percoll isotonico (SIP) mescolando 9 parti di Percoll con 1 parte di HBSS 10x. Prepararne una quantità sufficiente per avere circa 2,5 mL/g di tessuto.
Preparare la soluzione di lavoro al 35% di Percoll mescolando 3,5 mL di SIP con 5,5 mL di HBSS 1x. Prepararne una quantità sufficiente per avere circa 4,5 mL/g di tessuto.
Separazione per densità
1. Risospendere il pellet cellulare ottenuto al passaggio 3.7.2 in Percoll al 35%. Utilizzare circa 4,5 mL di Percoll al 35% per grammo del peso originale del tessuto (ovvero il peso del tessuto misurato prima della dissociazione).
2. NOTA: Risospendere le cellule in Percoll al 35% in una provetta da 50 mL (massimo 30 mL per provetta). Se i tessuti sono di grandi dimensioni, dividere le cellule in più provette da 50 mL.
3. Soavemente sovrapporre a ciascuna provetta 10 mL di HBSS 1x. Incubare per 5 minuti sul ghiaccio o a 4 °C.
4. Centrifugare a 800 ×g, per 45 minuti, a 4 °C (senza freno durante la decelerazione).
Recupero del livello
1. Eliminare con attenzione il sopranatante e lo strato di mielina senza disturbare l'interfase inferiore.
2. Raccogliere il pellet e l'interfase (al di sotto dello strato di mielina, contenente cellule cerebrali miste e la frazione di Percoll) in una nuova provetta conica da 50 mL per evitare il trasferimento di detriti.
Diluizione e lavaggio
1. Aggiungere HBSS in rapporto 3:1 (ad esempio, 30 mL di HBSS per ogni 10 mL di sospensione raccolta) per diluire il Percoll (diluizione ~3x).
2. Centrifugare a 1.000 × g, per 10 minuti a 4 °C (utilizzare freno e accelerazione completi).
3. Eliminare completamente il sopranatante.
Lisi dei globuli rossi e conteggio cellulare
1. Trattare il pellet cellulare ottenuto al passaggio 4.5.3 con buffer ACK (5 mL, 10 minuti, 37 °C).
2. Contare le cellule vitali utilizzando il blu di tripano.
3. NOTA: Resa attesa: ~0,1–1 × 10⁶cellule del SNC/g di tessuto, a seconda delle condizioni dei tessuti.
4. Aggiungere 10 mL di PBS per inattivare il buffer di lisi ACK. Centrifugare a 500 × g per 5 minuti.
  NOTA: Punto di arresto opzionale: le cellule possono essere coltivate durante la notte prima del sorting a una densità di 0,5–1 × 10⁶ cellule/mL di mezzo (DMEM/F-12, integrato con glutammina e piruvato di sodio (500 mL), 10% FBS inattivato termicamente, soluzione tampone HEPES 1x, antibiotico-antimicotico 1x (5,5 mL di soluzione madre 100x), 10 ng/mL di MCSF (soluzione madre 1.000x).
  Dopo il completamento dei passaggi sopra descritti — dissociazione del tessuto, lisi dei globuli rossi, conteggio cellulare e coltura notturna opzionale — le popolazioni di cellule CD3⁺ e CD11b⁺ sono state isolate utilizzando kit commerciali per l'isolamento cellulare, seguendo le istruzioni del produttore. Informazioni dettagliate riguardo ai kit, ai reagenti e alla procedura completa di isolamento sono riportate nella Tabella dei materiali, con una breve panoramica del flusso di lavoro di isolamento fornita di seguito.

5. Isolamento di cellule T CD3⁺ (selezione positiva)

NOTA: isolare prima i CD3⁺ dalla sospensione cellulare monocellulare preparata, utilizzando un kit di selezione positiva immunomagnetico in formato di rilascio per CD3 (vedere la Tabella dei Materiali). Conservare sia la frazione CD3⁺ che quella CD3^- ottenute in questo passaggio. La frazione CD3^- è necessaria per il Passaggio 6.

Preparare il buffer di rilascio.
1. Preparare il buffer di rilascio 1x diluendo il concentrato di buffer di rilascio 40x nel buffer di separazione cellulare nel giorno dell'uso e mantenerlo a 4–6 °C o sul ghiaccio.
  NOTA: Preparare 2,5 mL di buffer di rilascio 1x per ogni campione da processare.
Preparare il campione cellulare ed etichettarlo con il cocktail di selezione.
1. Risospendere il pellet cellulare ottenuto al passaggio 4.6.3 a 1 × 10⁸ cellule/mL in buffer di separazione cellulare in un tubo conico rotondo da 5 mL.
2. Aggiungere il cocktail di selezione CD3 al campione in una quantità di 100 µL per mL di campione. Mescolare delicatamente il campione e incubare per 3 min a temperatura ambiente.
Etichettare il campione con particelle magnetiche.
1. Vortexare le particelle magnetiche per 30 s immediatamente prima dell'uso. Aggiungere le particelle magnetiche al campione in una quantità di 100 µL per mL di campione. Mescolare delicatamente il campione e incubare per 3 min a temperatura ambiente.
2. Portare il campione a un volume totale di 2 mL aggiungendo buffer di separazione cellulare e mescolare aspirando e dispensando delicatamente la sospensione due o tre volte.
Isolare la reazione CD3⁺ mediante separazione magnetica.
1. Posizionare il tubo aperto nel separatore cellulare magnetico e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
2. NOTA: Le cellule legate alle particelle magnetiche costituiscono la frazione CD3⁺ e rimangono attaccate alla parete del tubo all'interno del campo magnetico; il sopranatante non legato costituisce la frazione CD3^-.
3. Senza rimuovere il tubo dal separatore magnetico, pipettare il sopranatante in un tubo conico pulito da 15 mL, etichettato per la frazione CD3^-.
4. Rimuovere il tubo dal separatore magnetico e risospendere delicatamente le cellule trattenute in 2 mL di buffer di separazione cellulare.
5. Ripetere i passaggi da 5.4.1 a 5.4.3 per un totale di tre separazioni magnetiche di 5 min, raccogliendo tutti i sopranatanti nello stesso tubo destinato alla frazione CD3^-.
Rilasciare la frazione CD3⁺ dalle particelle magnetiche.
1. Aggiungere 2,5 mL di buffer di rilascio 1x (preparato al passaggio 5.1.2) alle cellule trattenute e mescolare aspirando e dispensando delicatamente la sospensione due o tre volte. Incubare la sospensione per 3 min a temperatura ambiente.
2. Posizionare il tubo aperto nel separatore cellulare magnetico e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
3. Senza rimuovere il tubo dal separatore magnetico, pipettare il sopranatante in un tubo conico pulito da 15 mL, etichettato per la frazione CD3⁺.
  NOTA: Il buffer di rilascio stacca le particelle magnetiche dalle cellule marcate: il sopranatante risultante è la frazione CD3⁺ purificata, mentre le particelle magnetiche residue rimangono legate alla parete del tubo nel campo magnetico e vengono scartate.
Conteggio cellulare e criopreservazione
1. Contare le cellule e conservare l'aliquota CD3⁺ congelando rapidamente le aliquote a -80 °C dopo aver criopreservato le cellule rimanenti in una miscela criogenica (90% FBS + 10% DMSO) per 24 h in un mezzo di congelamento a base di isopropanolo, quindi trasferire il campione in azoto liquido.

6. Isolamento di cellule mieloidi CD11b⁺ (dalla frazione CD3⁻)

NOTA: La frazione CD3^- recuperata dal passaggio 5.4.4 è stata sottoposta a un secondo passaggio di selezione positiva immunomagnetica per isolare le cellule mieloidi CD11b⁺ utilizzando microperle magnetiche anti-CD11b e un separatore magnetico in formato colonna (vedere la Tabella dei Materiali).

Preparare il buffer di separazione e determinare il numero di cellule.
1. Preparare il buffer di separazione al 1x a base di BSA diluendo la concentrazione 20x in soluzione isotonica per il lavaggio e mantenere il buffer preparato freddo (4–8 °C) fino all'uso.
2. Determinare il numero totale di cellule nella frazione CD3 utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatico.
Etichettare le cellule con microsfere magnetiche anti-CD11b.
1. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 × g per 10 minuti ed aspirare completamente il soprannatante.
2. Risospendere il pellet cellulare in 80 µL di buffer di separazione al 1x a base di BSA per ogni 1 × 10⁷ cellule totali.
3. Aggiungere 20 µL di microsfere magnetiche anti-CD11b per ogni 1 × 10⁷ cellule totali, mescolare accuratamente e incubare per 15 minuti a 4–8 °C.
4. NOTA: L'incubazione su ghiaccio umido invece che in frigorifero potrebbe richiedere un tempo di incubazione più lungo. Incubare a temperature più elevate o per tempi superiori a quelli raccomandati potrebbe aumentare il rischio di etichettatura cellulare non specifica.
5. Lavare le cellule etichettate aggiungendo 1 mL di buffer di separazione al 1x per ogni 1 × 10⁷ cellule, centrifugare a 300 × g per 10 minuti ed aspirare completamente il soprannatante.
6. Risospenderne fino a 1 × 10⁸ cellule totali in 500 µL di buffer di separazione.
Eseguire la separazione magnetica mediante colonna.
1. Posizionare una colonna per separazione magnetica nel separatore magnetico ed equilibrarla risciacquandola con 500 µL di buffer di separazione al 1x per colonne a piccolo volume o con 1 mL di buffer di separazione al 1x per colonne a grande volume; scartare l'effluente del risciacquo.
  NOTA: Utilizzare una colonna a piccolo volume quando il campione contiene un numero ridotto di cellule totali. Utilizzare una colonna a grande volume per campioni con un numero elevato di cellule totali, come preparazioni derivate dalla milza o preparazioni immunitarie combinate.
2. Posizionare un tubo pulito da 5 mL in polistirene con fondo rotondo sotto la colonna equilibrata ed applicare la sospensione cellulare etichettata (500 µL per colonne a piccolo volume o 1 mL per colonne a grande volume) sulla parte superiore della colonna.
3. Dopo che il campione è completamente penetrato nella colonna, lavare la colonna tre volte, aggiungendo 500 µL di buffer di separazione al 1x per ogni lavaggio per colonne a piccolo volume o 1 mL per ogni lavaggio per colonne a grande volume. Aggiungere ogni lavaggio successivo solo dopo che il serbatoio della colonna si è svuotato.
  NOTA: L'effluente combinato raccolto nei passaggi 6.3.2 e 6.3.3 costituisce la frazione non etichettata, CD11b^-.
4. Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e posizionarla su un tubo pulito da 5 mL in polistirene, etichettato per la frazione CD11b⁺.
5. Pipettare 1 mL (per colonne a piccolo volume) o 2 mL (per colonne a grande volume) di buffer di separazione al 1x sulla parte superiore della colonna ed espellere immediatamente le cellule etichettate nel tubo di raccolta premendo con decisione lo stantuffo fornito con la colonna.
Quantificazione ed elaborazione successiva delle frazioni CD11b⁺
1. Contare le cellule provenienti da entrambe le frazioni (CD11b⁺ e CD11b^-) e conservare l'aliquota CD11b^- mediante congelamento rapido a -80 °C dopo aver criopreservato le cellule rimanenti in una miscela crioprotettiva (90% FBS + 10% DMSO) per 24 ore in un mezzo di congelamento a base di isopropanolo, quindi trasferire il campione in azoto liquido.
2. Utilizzare le cellule CD11b⁺ per esperimenti successivi.

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Risultati

Il flusso di lavoro ottimizzato descritto in questo protocollo consente l'isolamento riproducibile di linfociti T vitali e altamente arricchiti, nonché di BrMC/microglia, da tessuti cerebrali umani post-mortem infetti da HIV. L'esecuzione corretta del protocollo viene confermata attraverso una serie di controlli di qualità, inclusa la valutazione della vitalità cellulare, la quantificazione del rendimento e la caratterizzazione immunofenotipica in fasi chiave. Di seguito sono descritti i risultati rappresentativi di un e...

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Discussione

Per ottenere dati riproducibili con questo protocollo, è fondamentale seguire attentamente ogni passaggio. Omettere o accelerare una qualsiasi fase può ridurre il rendimento cellulare, la vitalità e la purezza. Il fattore più critico prima dell'analisi è la rapidità con cui i tessuti vengono processati dopo la morte⁴². I tessuti cerebrali umani devono essere manipolati il più rapidamente possibile, idealmente entro 6–12 h. Attendere più a lungo provoca la degradazione degli antigeni di superficie ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Ringraziamenti

We thank Dr. Sara Gianella from the “Last Gift” cohort at UC San Diego for collecting human tissues. We also thank Dr. Ann Chahroudi at the Emory National Primate Research Center, Dr. Afam Okoye at Oregon Health & Science University, and Dr. Satya Dandekar at the University of California, Davis, for providing rhesus macaque tissues. This work was supported by R21MH128034, R01MH136852, R21AI167709, R01MH139446, and R01AI186609. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
siringhe da 10 mL	VWR	Cat# 76837-040
Pipette sierologiche da 25 mL	VWR	Cat# 76201-710
tampone di lisi ACK	Thermo Fisher Scientific	Cat# A1049201
Antibiotico-antimicotico (100x)	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15240112
Soluzione di risciacquo autoMACS	Miltenyi Biotec	Cat# 130-091-222
Cappa di sicurezza biologica (BSL-2)
CD11b MicroBeads, umano e murino – linfofilizzato	Miltenyi Biotec	Cat# 130-097-142
CD11b MicroBeads, primate non umani	Miltenyi Biotec	Cat# 130-091-100
Kit MicroBead CD3, primati non umani	Miltenyi Biotec	Cat# 130-092-012
Lame per il conteggio cellulare	Thermo Fisher Countess	Cat# C10312	Alternativa VWR, Cat# 10228-0050
Clorox candeggina germicida	Essendant	Cat# 50371500
Piatti per coltura Corning non trattati	Thermo Fisher Scientific	Cat# 08-772-32
M-CSF da scimmia cynomologus	Kingfisher Biotech	Cat# RP1612Y-100
Siringhe monouso con punte Luer-Lok	BD	Cat# 14-829-45
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	Cat# 11320082
DNasi I, ricombinante, priva di RNasi	Roche	Cat# 4716728001
EasySep Buffer	STEMCELL Technologies	Cat# 20144
EasySep FITC Positive Selection Kit II	STEMCELL Technologies	Cat# 17682
EasySep Release Human CD3 Positive Selection Kit	STEMCELL Technologies	Cat# 17751
Falcon Cell Strainers, 70 µm e 100 µm	Corning	Cat# 21008-950
Siero fetale bovino (FBS)	VWR	Cat#97068-091
Pinzette curve fini	VWR	Cat# 82027-410
Gentamicina	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15750060
Gibco RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	Cat# 11875-119
HBSS, 1x senza calcio, magnesio e rosso fenolo	Thermo Fisher Scientific	Cat# 14175103
HBSS, 10x con calcio, magnesio, rosso fenolo	Thermo Fisher Scientific	Cat# 14060040
Emocitometro o contatore cellulare automatico
M-CSF umano	PeproTech	Cat# 300-25	Cat# alternativo 78057
Soluzione isotonica per risciacquo/diluizione per separazione magnetica	Miltenyi Biotec	130-091-222
L-glutammina (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	Cat# 25030-061
Soluzione madre MACS BSA (20x)	Miltenyi Biotec	Cat# 130-091-376
Sistema di separazione magnetica	EasySep o MACS
Colonne per MS	Miltenyi Biotec	Cat# 130-042-201
Penicillina-Streptomicina	Thermo Fisher Scientific	Cat# 15140122
Percoll	Cytiva/GE Healthcare,	Cat# GE17-0891-01
Camici protettivi	Kappler ProVent	Cat# 17-988-497B
Centrifuga refrigerata
Piruvato di sodio (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	Cat# 11360070
Pinzette per campioni	VWR	Cat# 82027-440	Alternative Cat# 82027-438
Lame da bisturi monouso sterili	Cardinal Health	Cat# 11213-237	VWR-alternativa Cat# 89140-800
TrypLE Express Enzima (1x), fenolo rosso	ThermoFisher	Cat# 1250510

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