Dissezione e isolamento dei gangli dorsali della radice del topo

Sommario

I gangli della radice dorsale (DRG) contengono i corpi cellulari dei neuroni sensoriali primari e trasmettono segnali sensoriali periferici al midollo spinale. Questo protocollo descrive un metodo per la dissezione DRG del muro che supporta l'isolamento standardizzato dei gangli strutturalmente intatti, l'identificazione anatomica segmentale, una guida intuitiva per gli utenti principianti e la riduzione del danno procedurale ai tessuti.

Abstract

I gangli della radice dorsale (DRG), che contengono i corpi cellulari dei neuroni sensoriali primari, fungono da strutture di rilievo critiche per la trasmissione dei segnali sensoriali dai tessuti periferici al midollo spinale. Svolgono ruoli essenziali negli studi sul dolore, sulle lesioni nervose e sulle malattie neurodegenerative. L'acquisizione di tessuto DRG intatto è cruciale per indagare le proprietà funzionali, l'espressione molecolare e le alterazioni patologiche dei neuroni sensoriali. Tuttavia, a causa delle loro dimensioni ridotte e della posizione profonda all'interno del canale vertebrale, l'identificazione accurata e l'isolamento della DRG presentano sfide tecniche significative. In questo studio, abbiamo sviluppato un protocollo standardizzato per l'isolamento della DRG del topo. Questo metodo fornisce una descrizione dettagliata della localizzazione anatomica della DRG, dell'esposizione del canale vertebrale e dei passaggi chiave coinvolti nell'isolamento dei ganglioni. L'intera procedura è illustrata con immagini rappresentative e registrazioni video. Questo approccio supporta l'acquisizione di DRG strutturalmente intatta con guida anatomica per l'identificazione segmentaria ed è adatto per la colorazione H&E e l'analisi di immunofluorescenza. Rispetto ai precedenti metodi di dissezione DRG, questo metodo consente il recupero standardizzato dei gangli identificati segmentalmente, fornisce una guida anatomica intuitiva per gli utenti principianti e riduce le lesioni procedurali del tessuto.

Introduzione

I gangli della radice dorsale (DRG), che contengono i corpi cellulari dei neuroni sensoriali primari, sono strutture essenziali per trasmettere segnali sensoriali periferici — inclusi stimoli meccanici, termici e nocicettivi — al midollo^{spinale 1,2,3} . Sebbene attualmente siano disponibili risorse di alta qualità che descrivono la DRG, sono comunque necessarie linee guida procedurali dettagliate per supportare un'identificazione e un'isolazione accurata della DRG dai segmenti toracici a quelli sacrali all'interno di un singolo campione, minimizzando al contempo il rischio di danni da DRG durante la raccolta del tessuto.

I neuroni DRG sono componenti chiave della via sensoriale periferica. I loro assoni si biforcano, con un ramo che si estende ai tessuti periferici e l'altro che si proietta nel corno dorsale del midollo spinale, svolgendo così ruoli critici nella trasmissione del dolore, lesioni nervose, risposte infiammatorie e patogenesi di vari disturbi^{neurologici 4}. Inoltre, i DRG hanno attirato notevole attenzione in aree di ricerca come la riparazione di lesioni nervose, i meccanismi del dolore cronico, la plasticità dei neuroni sensoriali e la regolazione^{neuroimmunitaria 5,6}. Un'ampia gamma di studi sperimentali richiede tessuto DRG intatto per applicazioni che includono la colorazione immunoistochimica, l'analisi del sequenziamento RNA, la coltura neuronale primaria e studi^{elettrofisiologici.} Pertanto, l'acquisizione di tessuto DRG strutturalmente intatto e accuratamente identificato come segmento è fondamentale per lo studio dei circuiti neurali sensoriali, delle caratteristiche molecolari neuronali e delle alterazioni patologiche.

I DRG si trovano vicino ai forami intervertebrali e sono collegati al midollo spinale tramite le radici dorsali. A causa delle loro dimensioni ridotte, della loro struttura ossea e della complessità dell'anatomia circostante, l'isolamento intatto presenta notevoli sfide tecniche. Inoltre, la mancanza di punti di riferimento anatomici chiari e di procedure standardizzate aumenta il rischio di danni strutturali o errata identificazione segmentaria durante la raccolta dei tessuti.

Rispetto ai metodi esistenti di dissezione DRG del topo, il metodo stabilito in questo studio presenta diversi vantaggi. Innanzitutto, i metodi di isolamento DRG nei topi precedentemente riportati generalmente richiedono la rimozione della colonna vertebrale dall'animale, seguita da segmentazione e apertura della linea mediana della colonna isolata, dopodiché i DRG vengono sezionati dai forami intervertebrali. Durante questo processo, la transezione della colonna vertebrale e i tagli ripetuti possono facilmente causare danni meccanici alla DRG e possono anche causare l'omissione di alcuni segmenti o un'identificazione segmentaria poco^{chiara 8}. Al contrario, il nostro metodo viene eseguito direttamente in situ nel topo, senza isolamento o transezione preliminare della colonna vertebrale, riducendo così il rischio di perdita di DRG durante la raccolta dei tessuti. Durante tutta la procedura, gli strumenti vengono applicati principalmente alle strutture ossee e ai tessuti connettivi che circondano il DRG, piuttosto che afferrare o tirare direttamente il ganglio stesso, preservandone così l'integrità.

In secondo luogo, i metodi esistenti spesso mancano di punti di riferimento anatomici chiari e stabili per identificare i diversi segmenti DRG. Poiché i nervi collegati alla DRG vengono frequentemente intercettati durante la rimozione della colonna vertebrale, diventa difficile determinare con precisione l'origine segmentaria della singola DRG basandosi sul percorso nervoso e sui pattern di ramificazione. Al contrario, il nostro metodo viene eseguito direttamente in situ nel topo e quindi preserva le relazioni anatomiche naturali tra la DRG, i nervi connessi e le strutture circostanti, permettendo l'identificazione di diversi segmenti DRG in base alle connessioni nervose e ai punti di riferimento anatomici locali. Proponiamo l'uso delle caratteristiche morfologiche di L2 e L3 come punti di riferimento anatomici chiave, insieme alla relazione anatomica tra L3–L5 e il nervo sciatico, seguita da un'identificazione sequenziale dei segmenti adiacenti sia nella direzione rostrale che caudale.

Inoltre, questo metodo fornisce una descrizione relativamente sistematica dei passaggi chiave, inclusa l'esposizione della colonna vertebrale e del canale vertebrale, l'apertura del canale vertebrale con la successiva esposizione del midollo spinale, l'esposizione della DRG e la localizzazione e dissezione guidate al microscopio stereometrico. Il flusso di lavoro è chiaro e i punti di riferimento anatomici sono ben definiti, il che può migliorare la standardizzazione procedurale e la riproducibilità, soprattutto per i principianti. I DRG ottenuti con questo metodo mantengono una buona integrità tissutale ed è quindi ben adatta per analisi a valle, inclusi immunofluorescenza e colorazione H&E.

In questo studio, abbiamo stabilito un metodo standardizzato di dissezione e isolamento per la DRG dei topi e fornito illustrazioni schematiche per la localizzazione anatomica, insieme a immagini rappresentative e documentazione video della procedura di campionamento. Questo metodo supporta l'isolamento della DRG dal livello toracico a quello sacrale in un singolo campione, riducendo al contempo il rischio di danni da DRG durante la raccolta del tessuto.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in rigorosa conformità con il protocollo approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Ospedale Shanghai East. Le procedure di dissezione descritte in questo studio sono state eseguite utilizzando topi adulti C57BL/6 (maschi o femmine, 12 settimane di età, 25–30 g). La Figura 1 mostra gli strumenti di dissezione utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione

NOTA: Per i campioni fissati in perfusione, adottare misure protettive appropriate per evitare l'esposizione al fissativo. Esegui la dissezione in una cappa o su un banco ben ventilato e indossa l'attrezzatura di protezione personale adeguata durante tutta la procedura, inclusi guanti, indumenti protettivi e occhiali di sicurezza.

1. Mantenere i topi sotto un ciclo di luce di 12 ore e 12 ore di buio a una temperatura ambiente di circa 24 °C e umidità relativa del 55%, con accesso ad libitum a cibo e acqua.
2. Prima di iniziare la dissezione, sopportare il topo in una camera di anidride carbonica finché la respirazione non si è completamente interrotta. Conferma la morte, poi posiziona l'animale in posizione supina su una tavola di sezionamento e fissa gli arti con spilli per mantenere una postura stabile.
3. Spruzza il pelo sulla regione toracoaddominale con etanolo al 70% per ridurre la contaminazione dei peli e mantenere un campo operativo pulito.
4. Usa le forbici per aprire la pelle lungo la linea mediana del torace e dell'addome. Estendi l'incisione in modo cranico lungo la linea mediana ventrale per esporre completamente la gabbia toracica. Sollevare l'estremità inferiore dello sterno e tagliare la parete toracica lungo entrambi i lati dell'arco costale per aprire la cavità toracica ed esporre il cuore. Rimuovere parte dello sterno e delle costole se necessario per ottenere una vista chiara del cuore.
5. Fai una piccola incisione nell'atrio destro con delle forbici per creare uno sbocco per il sangue e perfusare. Riempi una siringa da 20 mL con PBS preraffreddato (4 °C) e inserisci lentamente l'ago nel ventricolo sinistro vicino all'apice del cuore. Stabilizza l'ago ed evita di perforare la parete ventricolare.
6. Perfusi il PBS preraffreddato lentamente e uniformemente finché il fegato diventa pallido, il flusso di uscita è limpido e la maggior parte del sangue è stata lavata via. Successivamente, si sostituisce il PBS con 20 mL di paraformaldeide preraffreddata al 4% (4 °C) e si continua la perfusione a ritmo lento e costante finché gli arti non diventano rigidi, la coda si arriccia e i tessuti cambiano dal rosso al pallido, indicando che la fissazione è in gran parte completa.
7. Dopo la perfusione, prelevare l'ago, rimuovere qualsiasi residuo di liquido dalla cavità toracica e procedere immediatamente alla raccolta del tessuto. Se è necessario tessuto non fissato per le analisi a valle, perfusi solo con PBS preraffreddato e ometti il passaggio di fissazione del paraformaldeide al 4%.
   NOTA: Mantieni una velocità di perfusione lenta, costante e uniforme durante tutta la procedura per evitare rotture cardiache o gonfiore dei tessuti causati da pressione eccessiva. Esegui tutte le procedure sopra menzionate a temperatura ambiente.

2. DRG e nervi adiacenti (Figura 2)

1. Esposizione della colonna vertebrale e del canale vertebrale (3–5 min)
   1. Metti il mouse in posizione prona e fissalo sulla tavola di disseczione. Effettuare un'incisione longitudinale lungo la linea mediana della pelle dorsale con forbici, estendendo l'incisione dalla coda verso il collo.
   2. Usa forbici per separare la pelle dorsale dal tessuto connettivo sottostante e rifletti la pelle lateralmente su entrambi i lati per esporre completamente la muscolatura dorsale. Asciuga i capelli aderenti alla superficie del tessuto connettivo con carta assorbente, oppure risciacqua il campo chirurgico con soluzione salina per mantenere pulita l'area operatoria.
   3. Incisci longitudinalmente i muscoli dorsali e il tessuto connettivo lungo entrambi i lati della colonna vertebrale per esporre completamente le strutture vertebrali.
      NOTA: Impedire alle forbici di penetrare troppo in profondità nella cavità toracica o addominale durante l'incisione dei tessuti dorsali, poiché ciò potrebbe influire sulle procedure successive di dissezione.
   4. Rimuovere con attenzione il tessuto connettivo e il muscolo residuo che ricopreno la colonna vertebrale con un ronger osseo. Se il tessuto residuo interferisce con la visualizzazione, taglialo con forbici se necessario per ottenere la piena esposizione della colonna vertebrale. Successivamente, taglia le vertebre cervicali dalla parte dorsale con forbici per staccare l'estremità cranica della colonna vertebrale dalla testa e facilitare i passaggi successivi.
2. Apri il canale vertebrale ed esponi il midollo spinale (Figura 3; 8–10 min).
   1. Inserire microforbici curve nel canale vertebrale a livello cervicale e tagliare lungo entrambi i lati delle lamine per aprire il canale.
      NOTA: Fai attenzione a evitare lesioni al midollo spinale durante la procedura.
   2. Rimuovere le lamine dorsali per esporre gradualmente la parte dorsale del midollo spinale.
   3. Continuare a tagliare le lamine dorsali lungo l'asse longitudinale della colonna vertebrale con microforbici curve, estendendosi progressivamente dalla regione toracica a quella sacrale per esporre completamente l'aspetto dorsale del midollo spinale.
3. Esposizione del DRG (Figura 4; 8–10 min)
   1. Dopo aver completamente esposto la superficie dorsale del midollo spinale, si utilizza un rongeur osseo per aprire delicatamente lateralmente le strutture del canale vertebrale su entrambi i lati e alternare la manipolazione tra sinistro e destro.
   2. Una volta che il canale vertebrale è stato completamente separato su entrambi i lati, osserva la DRG situata all'interno dei forami intervertebrali sotto uno stereomicroscopio.
4. Identificazione della DRG (Figura 5; 8–10 min)
   1. Una volta che il canale vertebrale è stato completamente riflesso bilateralmente e il midollo spinale è completamente esposto, si esaminano i fasci nervosi della radice dorsale che si formano dalla superficie dorsale del midollo spinale sotto uno stereomicroscopio. Segui le radici dorsali lateralmente e identifica la DRG vicino ai forami intervertebrali come strutture ovali o ovoidali.
   2. Confermare durante l'identificazione che la DRG si trova all'interfaccia tra la radice dorsale del nervo spinale e il forame intervertebrale, e osservate che è disposta come una coppia bilaterale in ciascun segmento spinale. Identificare il DRG come un ganglio formato dai corpi cellulari dei neuroni sensoriali, con un lato che entra nel corno dorsale del midollo spinale e l'altro che si estende nei tessuti periferici.
   3. Utilizzare uno stereomicroscopio per identificare la DRG come una struttura gialla tenue o grigio-bianca, leggermente gonfia, con una forma più piena e confini relativamente distinti.
5. Effettuare l'identificazione segmentaria e la dissezione della DRG (Figura 6; 8–10 min)
   1. Utilizzare le pinze microchirurgiche sotto uno stereomicroscopio per sollevare delicatamente il fascio nervoso della radice dorsale e così ottenere la piena esposizione del DRG attaccato.
   2. Utilizzare le seguenti caratteristiche per determinare l'identità segmentaria della DRG: designare la DRG collegata a fibre nervose ramificate molteplici (>2 rami) come L2 e più DRG craniche, e designare la DRG collegata a fibre nervose biforcate (solo due rami) come L3 e più DRG caudali. Successivamente, identificare sequencialmente i restanti segmenti DRG sopra e sotto in base alla posizione dei forami intervertebrali.
      NOTA: Le fibre nervose che nascono dal DRG L3–L5 si fondono per formare il nervo sciatico.
   3. Utilizzare forbici curve microchirurgiche o forcette microchirurgiche per separare con cura il tessuto connettivo e le fibre nervose che circondano il DRG, liberando progressivamente il ganglio dalle sue attacchie ai tessuti attorno al forame intervertebrale.
   4. Trancettate le fibre nervose della radice dorsale che collegano il DRG al midollo spinale e contemporaneamente si recide il fascio nervoso che si estende verso la periferia per isolare il ganglio.
   5. Isolare con cura la DRG usando forze microchirurgiche. Se è necessaria una conservazione a lungo termine e una successiva analisi di immunofluorescenza, si inserisce immediatamente il DRG isolato in un tubo centrifuga da 0,5 mL contenente il 4% di paraformaldeide e si fissa il tessuto per 3 ore. Dopo la fissazione, lavare il tessuto per 3 × 5 minuti con 0,1 M PBS (componenti principali: NaCl, KCl, Na2HPO4 e KH2PO4), e trasferire il tessuto in una soluzione al 30% di saccarosio per la disidratazione finché non affonda sul fondo. Infine, inserire il tessuto nell'OCT e conservarlo a −80 °C per una conservazione a lungo termine.

3. Confermare i componenti dei ganglioni.

1. Risultati della colorazione H&E (Figura 7)
   1. Fissare immediatamente la DRG isolata in un fissativo istologico convenzionale, ad esempio il 4% di paraformaldeide. Dopo la fissazione, risciacquare il tessuto in un tampone fosfato di 0,1 M, eseguire disidratazione, pulizia e immersione della paraffina secondo le procedure istologiche standard e preparare sezioni di tessuto da 4–6 μm per l'analisi della colorazione a valle.
   2. Eseguire colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) sulle sezioni per valutare la struttura complessiva e la morfologia cellulare della DRG. Utilizzare le sezioni colorate per identificare i componenti cellulari e l'organizzazione dei tessuti del ganglio e per determinare la qualità del DRG raccolto.
   3. Esaminare le sezioni colorate con H&E al microscopio e confermare che la DRG è composta prevalentemente da numerosi corpi cellulari neuronali sensoriali. Identifica i neuroni con somata grandi, rotonde o ovoidali, e osserva i loro nuclei chiaramente visibili così come i nucleoli prominenti presenti in alcuni neuroni. Confermare inoltre la presenza di cellule gliali satellitari molto opposte che circondano i neuroni in una caratteristica disposizione anellona.
   4. Esaminare l'interno del ganglio e identificare i fasci delle fibre nervose e i setti del tessuto connettivo per confermare che l'architettura tissutale complessiva sia intatta e chiaramente organizzata. Verifica che i confini cellulari siano ben definiti e che non siano presenti evidenti disturbi tissutali o disorganizzazione strutturale.
   5. Confermare l'isolamento DRG riuscito sulla colorazione H&E grazie alla presenza di una struttura complessiva preservata, morfologia cellulare ben definita e assenza di evidenti lesioni meccaniche. Rilevare danni al campione osservando l'architettura cellulare interrotta, margini indistinti o distruzione localizzata del tessuto che si verifica durante la dissezione o la lavorazione. Utilizzare questi risultati H&E come base pratica per valutare la qualità della raccolta del DRG e l'integrità del tessuto.
2. Risultati della colorazione immunofluorescenza TUBB3 (Figura 8)
   1. Fissare immediatamente la DRG isolata con paraformaldeide al 4% per 3 ore. Una volta completata la fissazione, risciacqua il fazzoletto tre volte in 0,1 M PBS, lasciando 5 minuti per ogni lavaggio. Successivamente, si posiziona il tessuto in una soluzione al 30% di saccarosio finché non si deposita sul fondo, si immerge nell'OCT e si tagliano le sezioni congelate a 8–12 μm per una colorazione immunofluorescenza a valle.
   2. Riscaldare le sezioni a temperatura ambiente, sciacquarle per 3 × 5 minuti in PBS e effettuare il prelievo di antigeni con la soluzione di prelievo antigenico Tris-EDTA. Lascia raffreddare le sezioni naturalmente a temperatura ambiente, lavale di nuovo 3 × 5 minuti con PBS e blocca con il 5% di BSA per 30–60 minuti a temperatura ambiente. Dopo il passaggio di blocco, applicare l'anticorpo primario TUBB3 marcato con fluorofori e incubare le sezioni durante la notte a 4 °C. Il giorno successivo, lavare le sezioni tre volte con PBS, colorare i nuclei con DAPI, montare le sezioni e catturare immagini con un microscopio a fluorescenza.
   3. Ispezionare le sezioni DRG e verificare che gli esemplari ben conservati presentino un profilo gangliare distinto, una struttura tissutale intatta e una disposizione cellulare ordinata. Osserva l'immunofluorescenza di TUBB3 principalmente nei corpi cellulari neuronali sensoriali e nelle fibre nervose per definire la distribuzione neuronale complessiva all'interno del ganglio. Utilizza la controcolorazione DAPI per identificare le cellule più grandi a TUBB3 positive come neuroni sensoriali, e si noti che i piccoli nuclei DAPI-positivi distribuiti intorno a queste cellule mostrano un pattern morfologico coerente con i nuclei delle cellule gliali satellitari. Identificare danni correlati alla dissezione o all'elaborazione causati da continuità tissutale interrotta, localizzazione irregolare del segnale TUBB3, morfologia neuronale poco definita o aumenti focali del segnale di fondo.
   4. Applicare la colorazione immunofluorescenza TUBB3 come indicatore supplementare dell'integrità del tessuto DRG. Riconosci l'isolamento DRG riuscito grazie alla presenza di un contorno ganglionale preservato, segnali di fluorescenza distinti nei corpi cellulari neuronali sensoriali e nelle fibre nervose, morfologia cellulare chiara e una colorazione di fondo minima.

Risultati

L'isolamento efficace del DRG richiede la conservazione dell'integrità del ganglio, senza compressioni, schiacciamenti o strappi evidenti. Sollevare delicatamente le fibre nervose connesse lateralmente, liberare progressivamente il ganglio dai tessuti circostanti e transectare le fibre nervose connesse solo dopo che il ganglione è stato completamente mobilitato, in modo da poterlo rimuovere intatto. Evita la trazione diretta sul corpo ganglionale con strumenti durante la procedura. Dopo ...

Discussione

La DRG, in quanto componenti chiave del sistema nervoso sensoriale periferico, svolge un ruolo fondamentale nella trasmissione di informazioni sensoriali meccaniche, termiche e nocicettive al sistema nervoso^{centrale 9,10,11}. I neuroni DRG presentano una caratteristica morfologia pseudounipolare, con un processo che si estende ai tessuti periferici e l'altro che si proietta nel corno dorsale del ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.5 mL centrifuge tube	Non specificato	Non specificato	Usato per la conservazione fissa DRG
20 mL siringa	Non specificato	Non specificato	Usato per perfusione cardiaca
Soluzione di saccarosio al 30%	Non specificato	Non specificato	Usato per la disidratazione dei tessuti prima dell'incorporamento OCT
Paraformaldeide al 4%	Servicebio	G1101
BSA al 5%	Solarbio	SW3015
Etanolo al 70%	Non specificato	Non specificato	Usato per ridurre la contaminazione da peli prima della dissezione
Carta assorbente	Non specificato	Non specificato	Usato per rimuovere i peli dal tessuto connettivo
Topi adulti C57BL/6	Vital River	Non specificato	maschi o femmine; 12 settimane di età; 25–30 g
Anticorpo anti-coniglio IgG coniugato ad Alexa Fluor 488	Servicebio	GB25303
Anticorpo anti-TUBB3	Proteintech	CL488-66375	Usato per l'immunofluorescenza TUBB3
Camera di anidride carbonica	Non specificato	Non specificato	Usato per l'eutanasia
DAPI	Servicebio	G1012
Tavola di dissezione	Non specificato	Non specificato	Usato per fissare il topo durante la dissezione
Microscopio a fluorescenza	Non specificato	Non specificato	Usato per l'imaging delle sezioni colorate con immunofluorescenza
Ronghelli ossei Friedman-Pearson	RWD	S21022-14	Estratto dal manoscritto: ronghiello osseo (RWD, S21022-14)
Kit di soluzione di colorazione H&E	Servicebio	G1005
Forbici microchirurgiche curve	ASSI	SDCT16R8	Estratto dal manoscritto: forbici micro curve (ASSI, SDCT16R8)
Pinzette microchirurgiche	Fine Science Tools	11254-20	Estratto dal manoscritto: pinzette microchirurgiche (FST, 11254-20)
Composto OCT	Sakura Finetek	No. 4583
PBS	Servicebio	G2156
Pini	Non specificato	Non specificato	Usati per fissare gli arti sulla tavola di dissezione
Salino	Non specificato	Non specificato	Usato per sciacquare il campo chirurgico
Forbici	Fine Science Tools	14060-09	Estratto dal manoscritto: forbici (FST, 14060-09)
Stereomicroscopio	Leica Microsystems, Wetzlar, Germania	10447197	Estratto dal manoscritto: stereomicroscopio (Leica, 10447197)
Soluzione di recupero dell'antigene Tris-EDTA	Solarbio	C1038