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Questo studio è stato condotto utilizzando linee cellulari di leucemia acuta mieloide umana consolidate e i loro derivati resistenti alla doxorubicina. Non sono stati coinvolti partecipanti umani, animali o campioni primari derivati dal paziente. Pertanto, non era richiesta l'approvazione del comitato di revisione istituzionale per la ricerca su soggetti umani e l'approvazione dell'etica animale. Le linee cellulari sono state ottenute dall'Istituto di Ematologia dell'Accademia Cinese delle Scienze Mediche di Tianjin, Cina, e mantenute presso l'Istituto di Ematologia del Fujian, Ospedale dell'Unione dell'Università Medica del Fujian. L'identità cellulare è stata confermata da cariotipo e valutazione morfologica prima degli esperimenti, e tutte le colture cellulari sono state testate per la contaminazione da micoplasmi. I prodotti chimici, le attrezzature e i software utilizzati nel protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Coltura cellulare e conferma del fenotipo resistente
Le cellule umane di leucemia mieloide acuta HL60 e K562 e i loro derivati resistenti alla doxorubicina, HL60/A e K562/A, sono stati ottenuti dall'Istituto di Ematologia dell'Accademia Cinese delle Scienze Mediche, Tianjin, Cina. Le cellule sono state coltivate in un mezzo Roswell Park Memorial Institute 1640, integrato con siero bovino fetale al 10% e 1% di penicillina-streptomicina a 37 °C in un incubatore umidificato contenente il 5% di anidride carbonica.
Le cellule HL60/A sono state mantenute in un mezzo completo contenente 1 μg/mL di doxorubicina, mentre le cellule K562/A sono state mantenute in un mezzo completo contenente 5 μg/mL di doxorubicina per preservare il fenotipo resistente. La dossorubina è stata rimossa dal mezzo di coltura 1 mese prima dei test sperimentali per evitare effetti acuti nella selezione del farmaco durante i saggi terapeutici.
Prima degli esperimenti, il fenotipo resistente è stato riconfermato confrontando i valori di concentrazione inibitoria mezza massimale di doxorubicina tra cellule parentali e resistenti. La stabilità della resistenza dopo 1 mese di coltura senza farmaci è stata valutata ripetendo il saggio di sensibilità alla dosorrubicina ed esaminando l'espressione della P-glicoproteina basale e della proteina 1 associata alla resistenza multifarmaco. Le colture sono state utilizzate per esperimenti solo quando i derivati resistenti mantenevano valori più alti di concentrazione inibitoria mezza massimale di doxorubicina e un'espressione del trasportatore più elevata rispetto ai loro omologhi genitori.
2. Preparazione dei farmaci e progettazione del trattamento
FTY720, doxorubicina e SC79 furono preparati come soluzioni di serie secondo le istruzioni del produttore. FTY720 e SC79 sono stati disciolti in dimetil solfosdo, e la doxorubicina è stata preparata nel solvente raccomandato e protetta dalla luce durante la manipolazione. Le soluzioni funzionanti venivano appena diluite in mezzo di coltura completo prima del trattamento. La concentrazione finale di dimetilsolfossido è stata mantenuta identica tra i gruppi di trattamento e non ha superato lo 0,1%.
I gruppi di controllo del veicolo hanno ricevuto la stessa concentrazione finale di dimetilsolfossido dei corrispondenti gruppi di trattamento. Per esperimenti di trattamento combinato, 5 μM FTY720 è stato utilizzato come concentrazione sensibilizzante. La doxorubicina è stata utilizzata a 4 μM per le cellule HL60/A e a 8 μM per le cellule K562/A negli saghi di apoptosi e accumulo intracellulare di doxorubicina, salvo diversa indicazione.
3. Test di vitalità cellulare e calcolo della concentrazione inibitoria a metà massimale
Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzi a 1 × 104 celle per pozzo in un mezzo completo da 100 μL. Per i test FTY720 a singolo farmaco, le cellule HL60, K562, HL60/A e K562/A sono state trattate con 0, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 e 100 μM FTY720 per 48 ore. Per i test di sensibilità alla doxorubicina, le cellule HL60/A e K562/A sono state trattate con concentrazioni seriali di doxorubicina in presenza o assenza di 5 μM FTY720 per 48 ore.
La vitalità delle cellule è stata misurata utilizzando il test Cell Counting Kit-8 secondo le istruzioni del produttore. Dopo il trattamento, il reagente Kit di Conteggio Cellulare 8 è stato aggiunto a ciascun pozzo e la piastra è stata incubata a 37 °C per 2 ore. L'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di microplacche.
La vitalità relativa delle celle è stata calcolata come segue: vitalità relativa delle celle = [(assorbenza dei pozzi trattati - assorbenza dei pozzi a vuoto) / (assorbenza dei pozzi a controllo del veicolo - assorbenza dei pozzi a vuoto)] × 100%
I valori di concentrazione inibitoria a metà massimo sono stati calcolati utilizzando una regressione non lineare con un modello logistico dose-risposta a quattro parametri in GraphPad Prism, versione 9.5. Ogni esperimento includeva tre repliche biologiche indipendenti, con tre pozzi tecnici per ogni condizione di trattamento.
4. Analisi della combinazione di farmaci
Gli effetti di FTY720 sulla sensibilità alla doxorubicina sono stati valutati confrontando le relazioni dose-risposta di doxorubicina in presenza o assenza di FTY720. Le cellule HL60/A e K562/A sono state trattate con concentrazioni seriali di doxorubicina sola o doxorubicina combinate con FTY720 per 48 ore.
La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando il saggio Cell Counting Kit-8, e i valori di concentrazione inibitoria a metà massimo sono stati calcolati tramite regressione non lineare con un modello logistico dose-risposta a quattro parametri. I cambiamenti nella sensibilità alla doxorubicina sono stati interpretati in base a variazioni nelle curve dose-risposta e differenze nei valori di concentrazione inibitoria a metà massimo tra i gruppi di trattamento.
Poiché gli esperimenti non erano stati progettati come uno studio completo a matrice di dosi a rapporto fisso, non è stata effettuata un'analisi formale a combinazione indice. Pertanto, i risultati sono stati interpretati come evidenza di alterazione della sensibilità alla doxorubicina piuttosto che come sinergia farmacologica definitiva.
5. Analisi dell'apoptosi tramite Annessa V e citometria di flusso di propidio ioduro
Le cellule HL60/A e K562/A sono state iniziate in piastre a 6 pozzi a 4 × 10cellule da 5 /mL e trattate per 48 ore con veicolo, solo FTY720, doxorubicina sola o doxorubicina combinata con FTY720. Per il trattamento combinato, 5 μM FTY720 è stato combinato con 4 μM di doxorubicina nelle cellule HL60/A o 8 μM doxorubicin nelle cellule K562/A.
Dopo il trattamento, sono state raccolte cellule, incluse quelle sospese nel mezzo di coltura, e lavate due volte con soluzione salina tamponata a freddo fosfato. Le cellule sono state risospese nel tampone di legame dell'Annexin V alla concentrazione raccomandata dal produttore del kit di rilevamento dell'apoptosi. Ogni campione è stato colorato con 5 μL di isotiocianato di Annexin V-fluoresceina o Annexin V-allophycocyanin e 5 μL di iodio propidio, seguito da un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
I campioni sono stati analizzati immediatamente tramite citometria di flusso. Controlli non colorati, controlli a singola colorazione e controlli fluorescenti meno uno venivano utilizzati per impostare le porte di compensazione e quadranti. I detriti venivano esclusi tramite la diffusione frontale e la dispersione laterale. Le prime cellule apoptotiche sono state definite come cellule Annexin V-positive e propidial ioduro, mentre cellule tardo apoptotiche o morte sono state definite come Annexin V-positive e propidium ioduro. L'apoptosi totale è stata calcolata come la somma delle frazioni cellulari apoptotiche precoci e tardi. Sono stati acquisiti almeno 10.000 eventi di singola cellula vitali per ogni campione.
6. Saggio intracellulare di accumulo di doxorubicina
Le cellule HL60/A e K562/A sono state seminate in piastre a 6 pozzi a 4 × 10cellule da 5 /mL e coltivate durante la notte. Le cellule sono state poi trattate con il controllo del veicolo, doxorubicina da sola o doxorubicina combinata con 5 μM FTY720. Le cellule HL60/A sono state trattate con doxorubicina da 4 μM, mentre le cellule K562/A con doxorubicina a 8 μM. Le cellule sono state incubate per 4 ore a 37 °C e protette dalla luce.
Dopo il trattamento, le cellule venivano prelevate e lavate due volte con soluzione salina fredda tamponata con fosfato per rimuovere la doxorubicina extracellulare. Le cellule sono state risospese in soluzione salina tamponata fosfato e analizzate tramite citometria a flusso utilizzando la fluorescenza intrinseca della doxorubicina. Cellule non trattate sono state utilizzate per definire l'autofluorescenza di fondo, mentre quelle trattate con doxorubicina sono state utilizzate come riferimento fluorescente positivo. L'accumulo intracellulare di doxorubicina è stato quantificato come intensità mediana di fluorescenza dopo l'esclusione di detriti e aggregati. I valori mediani di intensità di fluorescenza sono stati normalizzati al gruppo con doxorubicina sola all'interno di ogni esperimento indipendente.
7. Analisi citometrica a flusso dell'espressione della P-glicoproteina e della proteina 1 associata alla resistenza multifarmaco
Le celle HL60/A e K562/A sono state seminate in piastre a 6 pozzi a 2 × 106 celle /mL e trattate con 5 μM FTY720 o controllo del veicolo per 24 ore. Dopo il trattamento, le cellule sono state lavate due volte con soluzione salina fosfatata fredda e risospese in un tampone di colorazione cellulare da 100 μL.
Le cellule sono state colorate con anticorpo anti-P-glicoproteico coniugato con ficoeritrina e con la proteina 1 associata alla resistenza multifarmacologica coniugata con Alexa Fluor 647 alla diluizione raccomandata dal produttore. Erano inclusi controlli isotipo abbinati, controlli non colorati, controlli a singola colorazione e controlli fluorescenti meno uno per la configurazione e la compensazione dei gate. I campioni sono stati incubati per 30 minuti a 4 °C al buio, lavati due volte con tampone di colorazione cellulare e risospesi in tampone di colorazione cellulare da 500 μL prima dell'acquisizione.
La citometria in flusso è stata eseguita utilizzando un citometro di flusso BD FACScan. Sono stati acquisiti almeno 10.000 eventi di singola cellula vitali per ogni campione. I livelli di espressione della P-glicoproteina e della proteina 1 associata alla resistenza multifarmaco sono stati quantificati come intensità mediana di fluorescenza dopo la sottrazione del corrispondente segnale isotipo-controllo. I valori normalizzati sono stati espressi rispetto al gruppo veicolo-controllo all'interno di ogni esperimento indipendente.
8. Western blotting e quantificazione densitometrica
Dopo i trattamenti indicati, le cellule sono state raccolte e lavate due volte con soluzione salina tamponata a freddo fosfato. La proteina totale è stata estratta utilizzando un tampone per il saggio di radioimmunoprecipitazione integrato con inibitori di proteasi e fosfatasi. La concentrazione proteica è stata misurata utilizzando un kit di analisi proteica con acido bicinconinico.
Un totale di 30 μg di proteina per corsia è stato separato tramite elettroforesi in gel di dodecile solfato di sodio-poliacrilammide e trasferito sulle membrane di difluoruro di polivinilidene. Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% o albumina sierica bovina al 5% in soluzione salina Tween 20 con Tween 20 tamponata con Tris per 1 ora a temperatura ambiente.
Le membrane sono state incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro la proteina chinasi B totale, la proteina chinasi B fosforilata, il bersaglio meccanicistico totale della rapamicina, il bersaglio meccanicistico fosforilato della rapamicina, la caspasi-3 tagliata, la poli(adenosina difosfato-ribosio) polimerasi tagliata, la P-glicoproteina, la proteina 1 associata alla resistenza multifarmacologica e la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi. Dopo il lavaggio, le membrane sono state incubate con gli anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano appropriati per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando una rilevazione potenziata della chemiluminescenza.
Le intensità delle bande sono state quantificate utilizzando il software ImageJ, versione 1.53t. La proteina chinasi B fosforilata è stata normalizzata in proteica chinasi B totale, e il bersaglio meccanicistico fosforilato della rapamicina è stato normalizzato al bersaglio meccanicistico totale della rapamicina. P-glicoproteina, proteina 1 associata alla resistenza multifarmaco, caspasi-3 tagliata e poli(adenosina difosfato-ribosio) polimerasi tagliata sono state normalizzate in gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi. I valori normalizzati sono stati espressi come variazioni di piega rispetto al gruppo veicolo-controllo o doxorubicina solo, a seconda del confronto. Le analisi Western blot sono state effettuate utilizzando tre repliche biologiche indipendenti. Le immagini Western blot non ritagliate venivano depositate nel repository pubblico dei dati o caricate come file supplementari.
9. Esperimento di soccorso SC79
Per esaminare se la segnalazione della proteina chinasi B fosse associata agli effetti osservati delle cellule FTY720, HL60/A e K562/A, sono state trattate con FTY720 in presenza o assenza di SC79, un attivatore della proteina chinasi B. Le cellule sono state pretrattate con 5 μM FTY720 per 12 ore e poi trattate con 30 μM SC79 o controllo veicolo per ulteriori 12 ore.
Dopo il trattamento, sono stati valutati tramite Western blotting la proteina chinasi B, il bersaglio meccanicistico fosforilato della rapamicina, la P-glicoproteina e i livelli di proteina 1 associata alla resistenza multifarmacologica. Parallelamente, l'apoptosi è stata valutata tramite Annexin V e colorazione con iodio propidio dopo il trattamento con doxorubicina, FTY720 e SC79. Gli effetti del salvataggio sono stati interpretati come prove associate al percorso. Poiché non è stato eseguito alcun esperimento di sovraespressione genetica o di knockdown, le conclusioni causali sono state formulate con cautela.
10. Analisi statistica e rendicontazione dei dati
Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando GraphPad Prism, versione 9.5, e IBM SPSS Statistics, versione 23.0. Le repliche biologiche sono state definite come esperimenti indipendenti condotti in giorni diversi utilizzando cellule coltivate indipendentemente. Le repliche tecniche erano definite come pozzi ripetuti o misurazioni ripetute all'interno dello stesso esperimento biologico.
I dati venivano presentati come media ± errore standard della media, salvo diversa specificazione. I confronti a due gruppi sono stati analizzati utilizzando un test Student a due code non accoppiati quando i dati erano distribuiti approssimativamente normalmente. I confronti tra tre o più gruppi sono stati analizzati utilizzando un'analisi unidirezionale della varianza seguita dal test post hoc di Tukey. Gli esperimenti che coinvolgevano due fattori indipendenti, come la concentrazione di farmaci e la condizione di trattamento, sono stati analizzati utilizzando un'analisi bidirezionale della varianza seguita da una corretta adeguata a confronto multiplo.
Quando le assunzioni di normalità non erano supportate, venivano utilizzati test non parametrici. I valori p esatti venivano riportati ogni volta che era possibile. La significatività statistica è stata definita come p < 0,05 dopo correzione per confronti multipli. Tutte le legende delle figure specificavano il numero di repliche biologiche, il test statistico utilizzato, il significato delle barre di errore e la soglia di significatività. I singoli valori di replicazione biologica sono stati mostrati in diagrammi a scatter o sovrapposti a grafici a barre ogni volta che è possibile.