Una procedura ripetitiva di perdita di peso per stabilire un modello murino di lesioni cerebrali traumatiche croniche

Sommario

Viene presentato un protocollo per stabilire un modello di topo con lesioni cerebrali cerebrali traumiche lievi e chiuse per studiare i meccanismi alla base del comportamento depressivo cronico in assenza di gravi lesioni strutturali cerebrali.

Abstract

Il trauma cranico (TBI) può portare a cambiamenti neuropatologici persistenti e a conseguenze neuropsichiatriche a lungo termine. Durante il recupero, una percentuale significativa di pazienti sviluppa disturbi affettivi, inclusi sintomi depressivi e disturbi legati al sonno, anche quando la tomografia computerizzata di routine o l'imaging a risonanza magnetica non mostrano anomalie strutturali evidenti. Sono necessari modelli sperimentali che riproducano queste caratteristiche per indagare i meccanismi alla base dei sintomi neuropsichiatrici cronici post-traumatici. Qui presentiamo un protocollo per stabilire un modello murino con lesioni cerebrali cerebrali traumistiche lievi e ripetitivi chiusi per studiare i meccanismi alla base del comportamento cronico simile alla depressione in assenza di evidenti lesioni strutturali cerebrali grossole rilevabili tramite esame macroscopico e risonanza magnetica ponderata T2. In questo metodo, il cranio intatto viene esposto e sottoposto a ripetuti impatti utilizzando parametri di caduta di peso definiti per cinque giorni consecutivi. Nelle condizioni descritte qui, la procedura produce una lesione cranica chiusa senza frattura cranica grossolana o contusione focale macroscopica. Dopo un intervallo post-lesione, i topi mostrano comportamenti simili a quelli depressivi senza mostrare anomalie strutturali focali evidenti durante l'esame grossolano o l'imaging per risonanza magnetica ponderata T2 nelle condizioni utilizzate in questo studio. Questo protocollo fornisce un approccio sperimentale per studiare comportamenti cronici simili alla depressione dopo lesioni cerebrali traumiche lievi e ripetitive e per valutare potenziali interventi terapeutici.

Introduzione

Tuttavia, poiché l'attuale paradigma fornisce principalmente un impatto lineare a un mouse con la testa fissa, dovrebbe essere interpretato come un modello rmTBI a testa chiusa ottimizzato per studiare gli esiti affettivi cronici, piuttosto che come una diretta imitazione biomeccanica di commozioni cerebrali sportive o di lievi infortuni stradali." La lesione cerebrale traumatica (TBI) è attualmente una delle principali cause di morbilità e mortalità legate al trauma, imponendo un notevole onere medico ed economico alle famiglie e alla società ^1,2. È importante notare che il danno al sistema nervoso centrale dopo un TCE non è transitorio; Di solito si evolve in modo cronico e progressivo. Uno studio sul TBI ha rivelato che anche dopo 18 anni dall'infortunio, l'attivazione microgliale persiste e la neuroinfiammazione cronica prolungata continua a causare un grave deterioramento^{neurale 3}. I dati epidemiologici indicano che fino al 28%–32% dei pazienti sviluppano gravi disturbi affettivi durante la fase⁴ di recupero prolungata. In questo articolo, rmTBI si riferisce al paradigma di induzione di lesioni cerebrali traumatiche lievi ripetitive, mentre la successiva fase cronica post-lesione, caratterizzata da persistenti alterazioni comportamentali, è qui chiamata lesione cerebrale traumatica cronica (c-TBI). Il termine c-TBI è qui usato per descrivere lo stato cronico post-lesione caratterizzato da persistenti alterazioni comportamentali dopo rmTBI, piuttosto che da un paradigma di lesione distinto. Questo utilizzo è concettualmente coerente con i nostri precedenti lavori che dimostrano che il TBI sperimentale può evolversi come un processo cronico progressivo associato ad anomalie istopatologiche e comportamentali a lungo termine.

Queste sequele neuropsichiatriche croniche compromettono gravemente la qualità della vita e gli esiti funzionali dei^{pazienti 5}. Tuttavia, la patogenesi esatta alla base di questi disturbi affettivi secondari rimane sfuggente e le opzioni di trattamento clinico sono fortemente limitate. Pertanto, indagare i meccanismi dei comportamenti depressivi indotti dal TCC e identificare obiettivi terapeutici precisi è di urgente necessità clinica e di significativa importanza pratica.

Per chiarire i meccanismi patologici del TBI, i ricercatori hanno sviluppato vari modelli animali, tra cui il modello dell'impatto corticale controllato (CCI) è attualmente uno dei più^{diffusi 6,7}. La CCI consente un controllo preciso dei parametri d'impatto per generare lesioni focali altamente riproducibili. Tuttavia, sia i modelli CCI che quelli tradizionali di lesioni fluido-percussionistiche (FPI) richiedono tipicamente una craniotomia. Questi approcci sono particolarmente utili per studiare contusioni focali, perdita di tessuto e risposte neuroinfiammatorie gravi legate a lesioni, ma tendono a simulare un grave TCE aperto, che differisce significativamente dalle presentazioni cliniche più comuni di lievi lesioni cratali chiuse, come le commozioni cerebrali sportive ^8,9. In modo cruciale, la necrosi del tessuto cerebrale, le cicatrici gliali e la cavitazione in stadio avanzato causate da craniotomia e impatto presentano due limitazioni principali. Innanzitutto, gravi deficit strutturali spesso inducono disfunzioni motorie, che compromettono direttamente la valutazione accurata degli esiti comportamentali. In secondo luogo, la perdita fisica di tessuto interrompe le proiezioni neurali a lungo raggio. Come dimostrato in studi precedenti utilizzando il modello TBI indotto dalla CCI, i topi hanno mostrato contusioni cerebrali focali^{significative 4}. Questa alterazione strutturale ostacola gravemente l'applicazione di tecniche neuroanatomiche avanzate, come il tracciamento virale, rendendo in gran parte irrealizzabile indagare sui sintomi psichiatrici e sui relativi circuiti neurali. Di conseguenza, sebbene questi modelli rimangano utili per studi di TBI gravi o focali, possono essere meno adatti quando l'obiettivo è indagare anomalie affettive croniche dopo lesioni craniche lievi e ripetute, specialmente quando la preservazione dell'integrità strutturale è importante per analisi comportamentali e a livello di circuito.

Per superare i limiti dei modelli di TBI aperti gravi menzionati, questo studio dettaglia un protocollo per stabilire un modello murino di lesioni cerebrali cerebrali lievi e lievi ripetitive (rmTBI) utilizzando un metodo di caduta di peso sul cranio esposto e intatto senza craniotomia. Questo protocollo impiega parametri d'impatto precisamente definiti: un'altezza di caduta di 25 cm e un peso di 20 g. Il sito dell'impatto era puntato a 2 mm a sinistra della sutura sagittale e 2 mm a posteriore alla sutura coronale, utilizzando una punta metallica curva con un diametro di 4 mm per garantire la precisione e l'uniformità della forza dell'impatto. Inoltre, la frequenza specifica degli impatti ripetitivi per cinque giorni consecutivi garantisce la stabilità delle alterazioni patologiche croniche. Valutazioni complete che incorporano risonanza magnetica, istopatologia e sami comportamentali dimostrano che questo modello murino presenta comportamenti significativi simili alla depressione pur preservando l'integrità strutturale grossolana del cervello, senza evidenti contusioni focali o deficit motori. Questo profilo fenotipico cattura caratteristiche comportamentali selezionate di lesioni cerebrali lievi e ripetitive, inclusi cambiamenti simili a quelli neuropsichiatrici nonostante l'assenza di evidenti anomalie strutturali nelle neuroimmagini di routine 10,11,12,13. Tuttavia, poiché l'attuale paradigma fornisce principalmente un impatto lineare a un mouse con la testa fissa, dovrebbe essere interpretato come un modello rmTBI a testa chiusa ottimizzato per studiare gli esiti affettivi cronici, piuttosto che come una diretta imitazione biomeccanica di commozioni cerebrali sportive o di lievi infortuni stradali.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali dell'Istituto di Intelligenza Artificiale, Centro Nazionale Scientifico Comprensivo di Hefei (Approvazione n. IAI2024071004). Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Un diagramma schematico del protocollo sperimentale è mostrato nella Figura 1. Possono essere utilizzate apparecchiature equivalenti di altri fornitori, a condizione che vengano mantenute le caratteristiche critiche di prestazione, come il peso d'impatto di 20 g, l'altezza di caduta di 25 cm, il diametro della punta dell'impattatore di 4 mm, l'affidabile erogazione di isoflurano e impostazioni di risonanza magnetica comparabili a quelle utilizzate qui. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione degli animali

1. Preparate gli animali.
   1. Usa topi maschi C57BL/6N di età compresa tra 8 e 10 settimane e con un peso di 20–25 g.
   2. Ospita i topi in gabbie ventilate individualmente (IVC) in una struttura specifica per animali liberi da patogeni (SPF). Fornisci cibo e acqua ad libitum e mantieni un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio sotto temperatura e umidità controllate.
   3. Acclimatare i topi alla stanza di alloggio prima dell'esperimento e eseguire controlli sanitari di routine in conformità con le procedure istituzionali di cura degli animali.
2. Assegna i gruppi.
   1. Assegna casualmente i topi al gruppo Naive, al gruppo Sham e al gruppo c-TBI. Gli investigatori responsabili dell'interpretazione della risonanza magnetica, della valutazione patologica grossolana e della valutazione comportamentale/analisi dei dati sono stati accecati all'assegnazione di gruppo.
   2. Annota il numero di identificazione dell'animale e l'assegnazione di gruppo prima della prima sessione di infortunio.

2. Preparazione per l'intervento chirurgico e l'anestesia

1. Prepara gli strumenti chirurgici e il sistema anestetico.
   1. Prepara un bisturi sterile dotato di lama n. 11, cotton cotton fighetti sterili, soluzione fisiologica sterile, soluzione di povidone-iodio al 10%, sutura monofilamento di polipropilene non assorbibile 5-0, nastro adesivo e unguento oftalmico clortetraciclina.
   2. Sterilizza gli strumenti chirurgici prima dell'uso, posizionali su un campo chirurgico pulito e mantiene una tecnica asettica per tutta la procedura. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata, inclusi guanti, camice da laboratorio e protezione per gli occhi.
   3. Prepara una borsa termica termostatica e impostala a 37 °C ± 0,5 °C.
   4. Collega la camera di induzione e il cono nasale al sistema di anestesia gasosa per animali da laboratorio.
   5. Imposta la portata di ossigeno tra 0,5 e 1,0 L/min e prepara il vaporizzatore di isoflurano per l'induzione e la manutenzione. Esegui l'anestesia in un'area ben ventilata o utilizza un sistema approvato per la raccolta dei gas residui.
2. Prepara il topo per l'intervento.
   1. Somministrare buprenorfina HCl (0,1 mg/kg, intraperitoneale) 30 minuti prima dell'anestesia e dell'intervento chirurgico secondo il protocollo animale approvato.
   2. Inserire il topo nella camera di induzione e indurre l'anestesia con isoflurano. Imposta il vaporizzatore al 3%–5% per l'induzione e monitora il topo continuamente finché il riflesso di raddrizzarsi non si perde e il movimento spontaneo degli arti cessa. Non superare il 5% di isoflurano durante l'induzione.
   3. Trasferire il topo in un frame stereotassico in posizione prona e mantenere l'anestesia attraverso un cono nasale. Riduci l'impostazione del vaporizzatore a 1%–2% per il mantenimento, mantenendo il flusso di ossigeno a 0,5–1,0 L/min.
      1. Durante la procedura, mantenere una frequenza respiratoria stabile di circa 60–100 respiri al minuto. Se la frequenza respiratoria scende sotto 60 respiri al minuto o la respirazione diventa superficiale o irregolare, ridurre immediatamente la concentrazione di isoflurano, fornire riscaldamento di supporto e ritardare l'impatto fino alla ripresa della respirazione stabile. Non superare il 2% di isoflurano durante la manutenzione.
   4. Confermare un'anestesia adeguata assenza di riflesso di ritiro del pedale, fissare la testa con le barre auricolari del corpo stereotassico senza danneggiare le membrane timpaniche (Figura 2A) e mantenere il topo in posizione prona. Se non si può ottenere un'anestesia adeguata entro i limiti indicati di induzione e mantenimento, o se si verifica una depressione respiratoria eccessiva, escludere l'animale da quella sessione di lesione.
   5. Applicare unguenta oftalmica clortetraciclina su entrambi gli occhi, radere il cuoio capelluto e disinfettare il sito chirurgico con una soluzione al 10% di povidone-iodio.

3. Stabilire il modello ripetitivo della lesione cerebrale lieve e traumatica

1. Espone il teschio.
   1. Eseguire un'incisione longitudinale della linea mediana, lunga circa 0,5 cm a 1 cm, sul cuoio capelluto utilizzando un bisturi sterile dotato di lama n. 11.
   2. Dissezionare in modo diretto il tessuto sottocutaneo e il periosto con pinze sterili o cotton cotton fiamps per esporre completamente il cranio senza graffiare la superficie ossea.
   3. Strofinare la superficie del cranio con un cotton fioc sterile inumidito con soluzione fisiologica per visualizzare i punti di riferimento cranici, inclusi il bregma e la sutura coronale.
2. Prepara il dispositivo d'impatto.
   1. Installa una punta metallica curva a impatto di 4 mm di diametro sul dispositivo di caduta libera di pesi.
   2. Imposta l'altezza del drop a 25 cm e usa un peso d'impatto da 20 g (Figura 2B).
3. Dare l'impatto.
   1. Identificare il sito d'impatto in un punto a 2 mm a sinistra della sutura sagittale e a 2 mm posteriore alla sutura coronale sulla superficie del cranio (Figura 2C).
   2. Allinea la punta dell'impattatore verticalmente sopra il punto bersaglio, abbassa delicatamente finché non tocca la superficie del cranio e assicurati che la punta rimanga centrata e perpendicolare al cranio prima di rilasciare il peso.
   3. Rilascia il peso di 20 g da un'altezza di 25 cm per ottenere un singolo impatto.
   4. Per il gruppo Naive, non eseguire anestesia o intervento chirurgico. Per il gruppo Sham, somministrare l'anestesia e fare un'incisione al cuoio capelluto, ma non effettuare l'impatto.
4. Sutura l'incisione e fornisci cure post-operatorie.
   1. Rimuovere la punta dell'impattatore immediatamente dopo l'impatto e ispezionare il sito chirurgico.
   2. Chiudere l'incisione del cuoio capelluto con una sutura interrotta di monofilamento di polipropilene non assorbibile 5-0 e disinfettare il sito dell'incisione con una soluzione di povidone-iodio al 10%.
   3. Posiziona il topo su una borsa termica termostatica mantenuta a 37 °C ± 0,5 °C, monitora la respirazione fino al completo recupero della coscienza e alla libera camminata, e poi riporta il topo nella sua gabbia di casa.
      NOTA: Il recupero è definito dal ritorno di una respirazione spontanea regolare, dal recupero del riflesso di raddrizzamento e dalla camminata spontanea. L'apnea acuta e l'emorragia visibile devono essere monitorate immediatamente dopo ogni impatto e durante il recupero precoce. Gli animali che mostrano apnea prolungata, emorragia visibile, che non riescono a ritrovare il riflesso di raddrizzamento entro 10 minuti dall'interruzione dell'isoflurano o che non si muovono spontaneamente entro 15 minuti dovrebbero essere esclusi da ulteriori procedure e gestiti secondo il protocollo animale approvato.
   4. Getta lame e aghi usati in un contenitore approvato per oggetti taglienti. Smaltire i rifiuti animali e i materiali contaminati in conformità con le normative istituzionali sulla biosicurezza.
5. Ripeti l'infortunio.
   1. Ripeti i passaggi 3.1–3.4 ogni 24 ore per 5 giorni consecutivi per ottenere un totale di 5 impatti.
   2. Monitorare il peso corporeo e l'attività in modo continuo durante il periodo di recupero post-operatorio. Escludere gli animali dalle analisi successive se sviluppano fratture craniche, emorragie visibile, crisi epilettiche, cerchiare persistenti o incapacità di nutrirsi o bere in modo indipendente.

4. Acquisizione di immagini a risonanza magnetica

NOTA: In questo studio, la risonanza magnetica è stata eseguita al giorno 7 dopo l'ultimo infortunio. I topi sono stati scansionati sotto anestesia isoflurana e non sono stati sacrificati prima dell'immagini. La raccolta dei tessuti è stata effettuata dopo l'imaging secondo il programma sperimentale.

1. Prepara l'animale per la risonanza magnetica.
   1. Anestesiare il topo con isoflurano e posizionarlo su un letto compatibile con risonanza magnetica dotato di un cono nasale.
   2. Monitorare la respirazione durante tutta la scansione e mantenere la temperatura corporea tra 37 °C ± 0,5 °C.
2. Acquisire immagini ponderate T2
   1. Acquisire immagini su un magnete superconduttore da 9,4 T con un diametro di 30 cm e un sistema a gradiente con una resistenza massima di gradiente di 1000 mT/m e una velocità massima di slew di 10000 T/m/s.
   2. Usa una bobina di volume da 86 mm per la trasmissione a radiofrequenza e una bobina di superficie planare da 15 mm per la ricezione del segnale.
   3. Acquisire immagini spin-echo rapido multi-fetta ad alta risoluzione ponderate T2 utilizzando i seguenti parametri: tempo di ripetizione = 3000 ms, tempo di eco = 46,34 ms, lunghezza del treno eco = 13, larghezza di banda del ricevitore = 220 Hz/pixel, campo visivo = 20 × 20^{mm 2}, matrice di acquisizione = 208 × 208, spessore della fetta = 0,5 mm, gap della sezione = 0 mm e numero di eccitazioni = 2.
   4. Prendi 30 fette per coprire tutto il cervello. Usa un tempo totale di acquisizione di 1 min 33 s. Nel presente studio, la risonanza magnetica ponderata T2 è stata utilizzata solo per la valutazione qualitativa. Non è stata effettuata alcuna analisi quantitativa tramite risonanza magnetica.
      NOTA: Le immagini della risonanza magnetica sono state esaminate qualitativamente da un investigatore accecato, accecando al compito di gruppo.

5. Valutazione della neuropatologia grossolana

1. Effettua la raccolta dei tessuti.
   1. Anestesiare profondamente il topo secondo il protocollo animale approvato.
   2. Aprire la cavità toracica, esporre il cuore, inserire un ago di perfusione nel ventricolo sinistro e incidere l'atrio destro.
   3. Perfusi con soluzione salina normale, poi perfondi con paraformaldeide (PFA) al 4%. Esegui l'intera procedura di perfusione in una cappa chimica certificata ed evita il contatto diretto con la pelle o gli occhi con la PFA. Smaltire tessuti e rifiuti liquidi in conformità con le normative sui rifiuti pericolosi e sulla biosicurezza.
   4. Raccogli il cranio e il cervello intatto e cattura immagini grossolane usando una fotocamera ad alta risoluzione.
      NOTA: La valutazione patologica grossolana è stata effettuata da un investigatore cieco per un compito di gruppo.

6. Monitorare il peso corporeo

1. Annota il peso corporeo.
   1. Pesa ogni topo prima della prima sessione di lesione e nei giorni 1, 3, 7, 14, 21 e 30 dopo l'infortunio, e annota i valori per valutare lo stato di salute generale nel tempo.

7. Eseguire il test beam-walk

1. Prepara l'apparecchio.
   1. Usa una trave orizzontale di legno lunga 1 m e larga 1 cm e sospendila a 30 cm dal suolo.
2. Coordinazione motoria di prova.
   1. Posiziona il mouse all'estremità iniziale del fascio, lascialo attraversare fino al punto finale e registra il tempo necessario per attraversare il fascio.
   2. Eseguire il test prima dell'infortunio e nei giorni 1, 3, 7, 14, 21 e 30 dopo l'infortunio.
      NOTA: I test comportamentali erano programmati per minimizzare gli effetti di trasferimento tra i test. Poiché il test di sospensione di coda (TST) e il test di nuoto forzato (FST) sono più stressanti rispetto al test in campo aperto (OFT), sono stati eseguiti per primi, seguiti dal labirinto OFT e Barnes in momenti successivi. Questa sequenza è stata selezionata per ridurre il potenziale confondimento dovuto all'abitudine precedente o all'esposizione esplorativa ripetuta durante le successive valutazioni comportamentali.

8. Esecuzione del test della sospensione di coda

1. Prepara l'apparecchio.
   1. Esegui il test al giorno 7 dopo l'infortunio e posiziona un cilindro di Plexiglas sopra la coda per evitare che la coda si arrampichi. Usa un cilindro lungo 4 cm con un diametro esterno di 1,6 cm, un diametro interno di 1,2 cm e un peso di 1,6 g.
2. Registra il comportamento.
   1. Fissa la coda alla scatola di sospensione con del nastro adesivo, assicurati che il mouse non raggiunga il fondo della scatola e sospendi il mouse per 3 minuti.
   2. Registra l'intera sessione con una telecamera ad alta risoluzione e analizza manualmente il tempo di mobilità e il tempo di immobilità dal video registrato da un osservatore cieco.

9. Esecuzione del test di nuoto forzato

1. Prepara l'apparecchio.
   1. Eseguire il test al decimo giorno dopo l'infortunio e riempire un cilindro trasparente alto 25 cm e con un diametro di 15 cm con acqua mantenuta a 23–25 °C. Usa una profondità d'acqua che impedisca alla coda e agli arti posteriori di toccare il fondo.
2. Registra il comportamento.
   1. Metti il mouse nell'acqua per 6 minuti e registra l'intera sessione con una fotocamera ad alta risoluzione.
   2. Analizzare manualmente gli ultimi 4 minuti della registrazione da un osservatore accecato, quantificare il tempo di mobilità e il tempo di immobilità.
   3. Definisci immobilità solo come i movimenti minimi necessari per mantenere la testa fuori dall'acqua.

10. Esecuzione del test in campo aperto

1. Prepara l'apparecchio.
   1. Esegui il test al giorno 14 dopo l'infortunio in una stanza silenziosa sotto illuminazione costante. Questo ultimo momento è stato scelto per fornire separazione dalle sessioni precedenti di TST e FST e così ridurre il trasferimento legato allo stress acuto nell'OFT.
   2. Usa una scatola da campo aperto di 40 cm × 40 cm × 40 cm.
2. Registra e analizza il comportamento esplorativo.
   1. Metti il mouse al centro dell'arena e lascialo esplorare liberamente per 6 minuti.
   2. Monitora il comportamento per 6 minuti usando un software di monitoraggio e analisi comportamentale. Calibra le dimensioni dell'arena nel software per farle corrispondere agli apparecchi da 40 cm × 40 cm e suddividi virtualmente l'arena in una griglia 5 × 5.
   3. Definisci i 16 quadrati esterni come zona periferica e i 9 quadrati interni come zona centrale. Imposta il colore dell'animale più scuro rispetto a quello di sfondo. Traccia solo il corpo dell'animale; Non seguire la testa o la coda. Cattura manualmente lo sfondo.
   4. Usa il software per misurare la velocità media, il tempo trascorso nella zona centrale, il tempo trascorso nella zona periferica e la distanza totale percorsa durante l'intero periodo di test.
   5. Pulisci e deodora l'apparecchio prima e dopo ogni prova per rimuovere i segnali olfattivi.

11. Eseguire il labirinto Barnes

1. Prepara l'apparecchio.
   1. Inizia la valutazione del labirinto Barnes al giorno 30 dopo l'infortunio.
   2. Usa una piattaforma circolare in acciaio inox di 1 m di diametro con 20 fori distanziati uniformemente.
   3. Posiziona la scatola di fuga sotto un foro designato per il bersaglio, posiziona segnali visivi intorno al labirinto e mantieni costante la posizione del foro per tutte le prove.
2. Conduzione della fase di addestramento
   1. Attiva un rumore bianco a 90 dB come stimolo avversivo durante l'allenamento.
   2. Posiziona il mouse sotto un cilindro trasparente al centro della piattaforma per 120 secondi.
   3. Rimuovi il cilindro e lascia esplorare il mouse fino a 180 secondi.
   4. Registra una prova vincente quando tutte e quattro le zampe entrano nella scatola di fuga.
   5. Guida il mouse nella scatola di fuga se non riesce a localizzare il bersaglio entro 180 s e registra la latenza come 180 s.
   6. Lascia che il mouse rimanga nella scatola di fuga per 60 secondi.
   7. Ripeti la prova di allenamento una volta dopo un intervallo di 4–5 ore in ogni giorno di allenamento e continua ad allenarti per 4 giorni consecutivi.
3. Svolgimento del giorno di riposo e della fase di prova
   1. Sospendere l'addestramento per un giorno dopo la fase di addestramento.
   2. Posiziona il mouse al centro della piattaforma il giorno del test e permette l'esplorazione fino a 180 secondi.
   3. Imposta il diametro del labirinto a 100 cm per la calibrazione in scala e assicurati che l'arena di tracciamento sia centrata nel fotogramma video. Imposta il colore dell'animale più scuro dello sfondo. Traccia solo il corpo dell'animale; Non seguire la testa o la coda. Cattura manualmente lo sfondo.
   4. Registra la latenza per entrare nella scatola di fuga, la velocità media e la distanza totale percorsa durante la sessione di test di 180 s utilizzando un software di tracciamento e analisi comportamentale. Definisci la zona di fuga nel software in base alla posizione del foro target designato prima dell'analisi.

12. Analisi dei dati

1. Prepara il dataset.
   1. Compila i dati comportamentali, di imaging e di peso corporeo in un software statistico e grafico.
   2. Esprimi i dati come media ± errore standard della media (SEM).
2. Esegui analisi statistiche.
   1. Analizzare i dati longitudinali sul peso corporeo e la camminata al fascio in questo studio utilizzando un modello lineare a effetti misti con gruppo, tempo e la loro interazione come effetti fissi e l'animale come effetto casuale, seguito da test di confronto multiplo post hoc quando applicabile.
   2. Analizza i risultati dei labirinti TST, FST, OFT e Barnes utilizzando ANOVA unidirezionale ordinaria per dati normalmente distribuiti con varianze omogenee, seguito dal test post hoc di Tukey quando l'ANOVA complessiva era significativa. Per i dati non parametrici, si utilizza il test di Kruskal-Wallis seguito dal test post hoc di Dunn.
   3. Riportare valori esatti di p. ogni volta che disponibili, insieme alla statistica di test, ai gradi di libertà e a una misura della dimensione dell'effetto (R² per ANOVA unidirezionale). Derivare tutti i valori p riportati dai test statistici sopra specificati ed eseguire tutte le analisi nel software statistico e grafico.
   4. Stabilire la significanza statistica a p. < 0,05.

Risultati

Imaging e valutazione neuropatologica dei topi con c-TBI

Per valutare lo stato di salute generale e la funzione motoria basale degli animali, sono stati monitorati i pesi corporei e le prestazioni durante la camminata a trave secondo la timeline mostrata nella Figura 1. Le differenze longitudinali di gruppo sono state analizzate utilizzando un modello lineare a effetti misti con l'animale come effetto casuale. Pri...

Discussione

Questo studio dettaglia un protocollo sperimentale standardizzato per stabilire un modello murino ripetitivo con lesioni cerebrali traumatiche lievi (rmTBI) utilizzando un metodo ripetuto di caduta libera e perdita di peso. Assicurando il topo esposto al cranio in un apparato stereotassico e applicando impatti ripetuti a coordinate definite usando un peso di 20 g abbassato da un'altezza di 25 cm per cinque giorni consecutivi, è stato indotto un fenotipo comportamentale caratterizzato da ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
5-0 nonabsorbable polypropylene monofilament suture	Jinhuan Medical	I303	chiusura della ferita
Anesthesia machine	RWD Life Science	R550	costruzione di modelli animali
ANY-maze behavioral tracking software	Stoelting	Version 7	software comportamentale
Barnes maze	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XB108	software comportamentale
Biorender	BioRender	https://biorender.com	software di disegno per la ricerca scientifica
Buprenorphine	Sigma-Aldrich	Y0001108	analgesia postoperatoria
Electric shaver	AUX	AUX-C5-1	depilazione preoperatoria
Forced swimming test	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	software comportamentale
GraphPad Prism 9.5	La Jolla	9.5	software statistico
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	costruzione di modelli animali
Mice	Charles river	C57/6N	animale da esperimento
Open field test	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XZ301	software comportamentale
Ophthalmic ointment	BEIJING TWINLUCK PHARMACEUTICAL	H11021342	prevenzione dell'essiccazione corneale durante l'anestesia
Paraformaldehyde (PFA), 4%	Biosharp	BL539A	perfusione e fissazione dei tessuti
Phosphate-buffered saline (PBS)	Biosharp	BL1425A	perfusione e lavaggio dei tessuti
Povidone-iodine solution, 10%	Beyotime	27883-25g	disinfezione della pelle prima dell'intervento
Preclinical Magnetic Resonance Imaging System	United Imaging Life Science Instrument	uMR9.4T	software di imaging
Scalpel blade No. 11	Jinhuan Medical	K3-11	incisione cutanea durante l'intervento
Scalpel handle	Jinhuan Medical	K6-10	utilizzato con lama di bisturi n. 11
Stereotaxis instrument	RWD Life Science	68025	costruzione di modelli animali
Sterile gauze	HYNAUT	BK05	controllo del sanguinamento e pulizia chirurgica
Tail suspension test	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	software comportamentale
Weight-drop impactor	RWD Life Science	68093	costruzione di modelli animali