Questo protocollo descrive lo sviluppo di un sistema di segnalazione adenovirale basato su fibroblasti, controllato da un promotore del collagene di tipo I murino, finalizzato al monitoraggio longitudinale dell'attivazione dei fibroblasti e alla facilitazione dello screening ad alto rendimento di composti antifibrotici.
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Articolo metodologico
Un sistema reporter adenovirale basato su fibroblasti guidato dal promotore del collagene di tipo I alfa 1 di topo per lo screening di farmaci antifibrotici
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fibrosi cardiaca, caratterizzata da un'attivazione anomala dei fibroblasti e da un'eccessiva deposizione della matrice extracellulare, manca di terapie mirate, principalmente a causa dell'assenza di approcci longitudinali, scalabili e non distruttivi in vitro piattaforme di screening. I saggi tradizionali a punto finale e i modelli di cellule staminali intensivi in risorse escludono per loro natura il monitoraggio in tempo reale dell'evoluzione fibrotica. Per superare questi limiti, questo protocollo descrive la generazione, l'ottimizzazione e la validazione di un collagene di tipo I alfa 1 murino (Col1a1promotore-dipendente da adenovirus mCherry sistema di reporter fluorescente (Ad-mCol1a1p-mCherry) in fibroblasti NIH/3T3. Vengono descritti i passaggi fondamentali per il confezionamento del virus adenovirale ricombinante, l'ottimizzazione della trasduzione (molteplicità di infezione) per minimizzare la citotossicità e l'allestimento di un modello robusto di fibrosi indotta dal fattore di crescita trasformante beta (TGF-β). Grazie all'eliminazione della necessità di fissare le cellule, questo sistema consente un monitoraggio diretto e longitudinale della trascrizione del collagene in cellule vive. La specificità e l'affidabilità del modello sono validate farmacologicamente mediante l'inibitore del recettore di tipo I del TGF-β (ALK5) SB431542, con letture fluorescenti che si correlano ai marcatori endogeni della fibrosi quantificati tramite reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa e saggio immunoenzimatico (ELISA). In definitiva, questa piattaforma economicamente vantaggiosa fornisce uno strumento accessibile per lo screening ad alto rendimento di nuovi agenti antifibrotici, accelerando così la ricerca cardiovascolare traslazionale.
Introduzione
La gestione della fibrosi cardiaca presenta notevoli sfide cliniche. Caratterizzata dall'attivazione anomala dei fibroblasti quiescenti in miofibroblasti e dal deposito eccessivo di matrice extracellulare (ECM), rappresenta una via terminale irreversibile comune a scompenso cardiaco, infarto miocardico e altre malattie cardiovascolari1,2,3. Tuttavia, le attuali strategie terapeutiche presentano limitazioni significative. Gli interventi convenzionali—come diuretici, beta-bloccanti e inibitori del sistema renina-angiotensina-aldosterone—alleviano principalmente lo stress emodinamico sistemico e attenuano l'attivazione neuroumorale4,5,6,7. Queste terapie non riescono a colpire direttamente l'attivazione dei fibroblasti né a interrompere il deposito in corso di collagene. Inoltre, sebbene vie di segnalazione come la via TGF-β/Smad, lo stress ossidativo e il riprogrammamento metabolico siano alla base di questa patologia, la traduzione di queste conoscenze in terapie antifibrotiche dirette rimane difficoltosa a causa di tossicità sistemiche e meccanismi di somministrazione non specifici8,9,10. Pertanto, esiste un'urgente necessità di nuove terapie antifibrotiche specifiche per il bersaglio. Un importante collo di bottiglia traslazionale è la mancanza di sistemi di valutazione funzionale in grado di rilevare in modo sensibile e dinamico l'attivazione dei fibroblasti. I modelli sperimentali tradizionali presentano notevoli limitazioni che impediscono uno screening farmacologico efficiente11,12. Sebbene i modelli animali in vivo riproducano il rimodellamento cardiaco globale, presentano differenze interspecifiche, tempi sperimentali prolungati, costi elevati e bassa produttività11.
Per superare queste difficoltà, sono emerse diverse piattaforme di screening in vitro; tuttavia, permangono difetti metodologici fondamentali. I saggi di immunofluorescenza ad alto contenuto richiedono la fissazione distruttiva delle cellule e un processo laborioso, fornendo soltanto un'istantanea statica anziché catturare la cinetica in tempo reale dell'attivazione dei fibroblasti. Analogamente, le piattaforme che integrano il monitoraggio dell'impedenza senza etichette con spettrometria di massa (MS/MS) soffrono di mancanza di specificità e bassa scalabilità, poiché le riduzioni dell'impedenza causate da una tossicità cellulare generale possono essere facilmente confuse con una reale efficacia antifibrotica. Inoltre, i sistemi reporter ingegnerizzati mediante ripetizioni palindromiche corte interspaziate regolarmente (CRISPR) che utilizzano cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) per tracciare marcatori del citoscheletro (ad esempio, actina alfa-liscia muscolare [α-SMA]/ACTA2) presentano elevate barriere traslazionali13. Questi modelli basati su iPSC sono proibitivamente costosi, tecnicamente complessi e in gran parte inaccessibili per screening ad alto rendimento di routine. Inoltre, la dipendenza da marcatori citoscheletrici come l'α-SMA potrebbe non riflettere accuratamente l'endpoint patologico, poiché la loro espressione non correla strettamente con la secrezione funzionale e il deposito eccessivo della matrice extracellulare (ECM)14. Pertanto, questi sistemi non sono adeguati per mappare longitudinalmente le risposte cellulari precoci agli interventi farmacologici.
Al contrario, questo protocollo descrive un sistema longitudinale di reporter funzionale controllato dal promotore del gene della collagene di tipo I alfa 1 (Col1a1), con l'obiettivo di stabilire una piattaforma non distruttiva e robusta per monitorare l'attivazione dei fibroblasti. Poiché la collagene di tipo I è il componente principale della matrice extracellulare depositata durante il rimodellamento cardiaco, il rilevamento dell'attivazione trascrizionale del suo gene codificante, Col1a1, rappresenta un indicatore diretto e clinicamente rilevante dell'attivazione dei fibroblasti. Questo modello basato sul promotore di Col1a1 consente un monitoraggio continuo a livello molecolare dei processi fibrotici, offrendo una piattaforma sensibile, longitudinale e quantificabile, ottimizzata per lo screening di farmaci basati su meccanismi d'azione.
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Protocollo
Confermiamo che tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali. Poiché questo studio ha utilizzato esclusivamente la linea cellulare di fibroblasti embrionali di topo NIH Swiss (NIH/3T3) e il sistema reporter mCol1a1p-mCherry, e non ha coinvolto animali vertebrati, embrioni o soggetti umani, non è stata richiesta l'approvazione etica da parte di un comitato istituzionale per le procedure descritte in questo manoscritto.
Tutte le procedure che prevedono l'uso di vettori adenovirali ricombinanti sono state eseguite in conformità con le normative istituzionali sulla biosicurezza e le pratiche standard di Biosicurezza di Livello 2 (BSL-2). La manipolazione virale, la trasduzione, lo stoccaggio e lo smaltimento dei rifiuti sono stati effettuati utilizzando cappe biologiche certificate e idonei dispositivi di protezione individuale. I rifiuti liquidi contenenti materiale adenovirale sono stati decontaminati mediante soluzione di candeggina appena preparata prima dello smaltimento, e i materiali monouso contaminati sono stati sterilizzati in autoclave secondo i protocolli istituzionali di biosicurezza. Eventuali versamenti accidentali sono stati immediatamente disinfettati utilizzando agenti virucidi approvati, seguendo le procedure istituzionali per la gestione dei versamenti.
1. Panoramica del flusso di lavoro sperimentale
- Generare un adenovirus ricombinante sotto il controllo del promotore murino Col1a1 come descritto nel Passaggio 2.
- Ottimizzare le condizioni di trasduzione virale in fibroblasti NIH/3T3 come descritto nel Passaggio 3.
- Stabilire un modello in vitro di reporter per la fibrosi sensibile al TGF-β come descritto nel Passaggio 4.
- Convalidare la stabilità, specificità e riproducibilità biologica del modello mediante stimolazione dose-dipendente e tempo-dipendente con TGF-β come descritto nel Passaggio 4.
- Eseguire l'inibizione farmacologica utilizzando SB431542 come descritto nel Passaggio 5.
- Eseguire analisi downstream mediante saggio immunoenzimatico (ELISA) e reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) come descritto nel Passaggio 5.
NOTA: Fare riferimento a Figura 1A per una panoramica schematica del flusso di lavoro sperimentale. Fare riferimento alla Tabella dei Materiali per l'apparato sperimentale e i reagenti.
Figura 1. Percorso per l'allestimento e la validazione del sistema reporter adenovirale mCol1a1p-mCherry nei fibroblasti. (A) Panoramica schematica della costruzione del sistema reporter adenovirale (AdV) mCol1a1p-mCherry e del percorso sperimentale per la validazione del modello in fibroblasti NIH/3T3. Il percorso include il clonaggio del promotore, l'assemblaggio dell'adenovirus ricombinante, l'incapsidamento virale in cellule HEK293, l'ottimizzazione della multiplicità di infezione (MOI) e lo screening fluorescente ad alto contenuto per analisi successive. (B) Immagini fluorescenti rappresentative di fibroblasti NIH/3T3 infettati con l'adenovirus Ad-mCol1a1p-mCherry a MOI di 0, 1, 10, 100 e 1000. I nuclei sono stati colorati con Hoechst 33342 (blu) e la fluorescenza di mCherry (rosso) indica l'attività del promotore Col1a1. L'intensità della fluorescenza è stata quantificata mediante imaging ad alto contenuto e normalizzata rispetto al numero di nuclei. È stato scelto un MOI di 100 per esperimenti successivi sulla base di un'espressione del reporter robusta e omogenea con alterazioni morfologiche minime. Barre della scala = 200 µm. Questa figura è stata creata con BioRender.com con licenze approvate. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
2. Costruzione, confezionamento e amplificazione dell'adenovirus con promotore mCol1a1
- Costruzione del vettore adenovirale ricombinante
- Clonare il frammento del promotore murino Col1a1 di 2354 pb (coordinate genomiche: chr11:94824779–94827132; −2271 a +83 pb rispetto al sito di inizio della trascrizione [TSS]) a monte del gene reporter mCherry nel vettore shuttle adenovirale pDC315.
NOTA: La sequenza completa del promotore Col1a1 e la mappa dettagliata del plasmide pDC315-mCol1a1p-mCherry sono fornite nel File Supplementare 1 e nella Figura Supplementare 1. - Linearizzare il vettore pDC315 utilizzando BamHI e KpnI. Amplificare l'inserto del promotore mediante primer contenenti bracci di omologia di 15–25 pb.
NOTA: Utilizzare una strategia di clonaggio senza giunzioni basata sulla ricombinazione omologa per facilitare la ricombinazione in vitro. - Verificare il plasmide risultante mediante screening PCR e sequenziamento di Sanger.
NOTA: Esaminare attentamente la sequenza del giunto promotore-reporter per assicurarsi che non siano presenti slittamenti della cornice di lettura o codoni di stop prematuri. - Generare l'adenovirus ricombinante utilizzando il sistema AdMax mediante ricombinazione intracellulare mediata da Cre.
NOTA: Il plasmide di base pBHGloxΔE1,3Cre contiene un genoma Ad5 non replicativo con delezioni di E1/E3 e una cassetta espressiva della ricombinasi Cre che facilita la ricombinazione sito-specifica con il sito loxP sul vettore shuttle. - Co-trasfettare cellule HEK293 con il vettore shuttle pDC315-mCol1a1p-mCherry validato e il plasmide di base adenovirale pBHGloxΔE1,3Cre.
- Clonare il frammento del promotore murino Col1a1 di 2354 pb (coordinate genomiche: chr11:94824779–94827132; −2271 a +83 pb rispetto al sito di inizio della trascrizione [TSS]) a monte del gene reporter mCherry nel vettore shuttle adenovirale pDC315.
- Confezionamento e amplificazione dell'adenovirus
- Mantenere le cellule HEK293 in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS). Utilizzare cellule a basso passaggio (<20 passaggi) per il confezionamento dell'adenovirus.
- Sezionare le cellule HEK293 al 30%–40% di confluenza 24 h prima della trasfezione per ottenere una confluenza del 50%–60% al momento della trasfezione.
- Co-trasfettare le cellule HEK293 con 5 µg di plasmide shuttle e 5 µg di plasmide helper pBHGloxΔE1,3Cre utilizzando il reagente di trasfezione Lipofectamine 2000.
NOTA: Mantenere un rapporto DNA-reagente di 1:1 (10 µg di DNA totale per 10 µL di reagente di trasfezione). - Coltivare le cellule trasfettate a 37°C con 5% di CO₂ e monitorarle giornalmente per effetti citopatici.
NOTA: I primi effetti citopatici possono richiedere da 7 a 14 giorni per apparire. Se il mezzo diventa acido (giallo), effettuare un cambio parziale del mezzo delicato senza disturbare le cellule. - Raccogliere le cellule e il sopranatante quando si osservano effetti citopatici tipici, caratterizzati da arrotondamento e riduzione delle cellule, e almeno il 50% delle cellule si sono staccate dalla superficie di coltura.
NOTA: Questa fase viene generalmente raggiunta da 10 a 15 giorni dopo la trasfezione. - Eseguire tre cicli di congelamento-scongelamento congelando i campioni a −70°C per 30 minuti e scongelandoli in un bagno a 37°C.
- Vortexare la sospensione per 30 s dopo ogni passaggio di scongelamento per favorire la lisi cellulare.
NOTA: Evitare un'incubazione prolungata a 37°C durante lo scongelamento per preservare la stabilità virale. - Preparare diluizioni seriali decrescenti del lisato virale (10−1 a 10−13) utilizzando DMEM completo. Aggiungere 90 µL di ogni diluizione virale a cellule HEK293 seminate in piastre a 96 pozzetti, utilizzando 10 pozzetti replicati per ogni diluizione.
NOTA: Un titolo virale di ≥1 × 109 PFU/mL è stato definito come punto finale sufficiente di amplificazione per la purificazione successiva. - Clarificare 10 mL di lisato virale grezzo attraverso un filtro da 0,45 µm per rimuovere i detriti cellulari.
- Trattare il lisato chiarificato con nucleasi Benzonase (10 U/mL) a 37°C per 30 minuti.
- Purificare l'adenovirus ricombinante utilizzando il kit Adeno-X Virus Purification Kit seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA: Mescolare il lisato con tampone di diluizione 1× prima di caricarlo sul filtro di purificazione pre-equilibrato. Lavare il filtro con tampone di lavaggio 1× ed eluire il virus purificato utilizzando 3 mL di tampone di eluizione 1×. - Incubare le piastre per 10 giorni e valutare gli effetti citopatici (CPE) al microscopio ottico. Assegnare un punteggio positivo al CPE in base all'arrotondamento e al distacco caratteristici delle cellule. Calcolare il titolo virale infettivo utilizzando il metodo di Spearman–Karber basato sul punteggio del CPE.
NOTA: Assicurarsi che il ceppo virale finale raggiunga almeno 1 × 1011 PFU/mL per le applicazioni successive. - Aliquotare l'adenovirus purificato e conservare il ceppo virale a −80°C.
NOTA: Conservare gli aliquote di adenovirus purificato a −80°C per la conservazione a lungo termine. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento per preservare l'infettività virale.
3. Coltura cellulare e ottimizzazione delle condizioni di infezione virale
- Mantenere i fibroblasti NIH/3T3 in DMEM/Miscela Nutritiva F-12 (DMEM/F12) integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina.
NOTA: Utilizzare cellule comprese tra i passaggi 3 e 8 che hanno raggiunto una confluenza del 70%–80% nel flacone di origine per garantire uno stato cellulare costante. - Sezionare i fibroblasti NIH/3T3 in piastre a 384 pozzetti a 4 × 103 cellule per pozzetto in 40 µL di mezzo di coltura completo.
- Incubare le cellule a 37°C con 5% di CO₂ per 12 h per consentire l'adesione cellulare e l'ingresso nella fase di crescita logaritmica.
NOTA: Per ridurre al minimo la distribuzione irregolare delle cellule e gli effetti di bordo, lasciare riposare le piastre a temperatura ambiente per 20–30 minuti prima dell'incubazione. Riempire i pozzetti esterni con soluzione salina fosfato sterile (PBS) o acqua sterile. - Infettare le cellule con l'adenovirus ricombinante a molteplicità di infezione (MOI) comprese tra 1 e 1.000, insieme a un controllo non infettato.
NOTA: Calcolare il volume virale richiesto utilizzando la seguente formula:
In questo caso, V è il volume della scorta virale (mL), N è il numero di cellule seminate per pozzetto (4 × 103), MOI è la molteplicità di infezione desiderata e T è il titolo infettivo del virus (PFU/mL). La scorta virale utilizzata in questo studio aveva un titolo infettivo di 1 × 1011 PFU/mL, determinato con il metodo di Spearman–Karber descritto al punto 2.2.12. - Assicurarsi che il volume della scorta virale aggiunto non superi il 10% del volume totale del pozzetto.
NOTA: Volumi eccessivi di scorta virale potrebbero alterare il pH del mezzo e indurre citotossicità non specifica. - Sostituire il mezzo contenente il virus con 40 µL di mezzo di coltura completo fresco 24 ore dopo l'infezione.
NOTA: Utilizzare DMEM/F12 integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina, coerentemente con quanto indicato al punto 3.1. - Eseguire il cambio del mezzo utilizzando un manipolatore automatico di liquidi a bassa velocità oppure inclinando con attenzione le punte della pipetta multicanale contro la parete superiore laterale di ciascun pozzetto.
NOTA: Evitare l'aspirazione a vuoto standard durante la manipolazione di piastre a 384 pozzetti per ridurre al minimo il distacco cellulare. - Definire l'MOI ottimale come la dose virale più bassa che produce una fluorescenza mCherry visibile e omogenea, mantenendo al contempo la morfologia cellulare e i conteggi nucleari paragonabili a quelli delle cellule di controllo non infettate.
NOTA: Valutare l'espressione del reporter mediante conteggio nucleare con Hoechst e imaging a fluorescenza. Le cellule devono mantenere la loro tipica morfologia a forma di fuso senza arrotondamento né distacco. MOI eccessivamente elevati potrebbero indurre un'attivazione basale di mCherry attraverso risposte cellulari allo stress. I risultati rappresentativi della fluorescenza a diversi MOI sono mostrati in Figura 1B. - Selezionare l'MOI ottimizzato per tutti gli esperimenti successivi.
NOTA: In questo studio, è stato selezionato un MOI di 100 per gli esperimenti successivi.
4. Valutazione della stabilità del modello mediante stimolazione con TGF-β
- Infettare i fibroblasti NIH/3T3 con l'adenovirus ricombinante a un MOI ottimizzato di 100, come determinato al passaggio 3.9.
- Sottoporre i fibroblasti a sierum-starvation in DMEM/F12 contenente 0,2% di FBS per 12 h prima della stimolazione con TGF-β.
NOTA: La sierum-starvation è stata eseguita per sincronizzare le cellule e ridurre al minimo l'attivazione basale del promotore di Col1a1. - Preparare una soluzione madre di TGF-β umano ricombinante a 100 µg/mL utilizzando HCl 4 mM contenente 0,1% di albumina sierica bovina (BSA).
NOTA: Aliquotare la soluzione madre di TGF-β in piccoli volumi e conservarla a −80°C per evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. - Trattare le cellule con un gradiente di concentrazione di TGF-β compreso tra 0–40 ng/mL in sei replicati biologici indipendenti.
NOTA: La condizione a 0 ng/mL è servita come gruppo di controllo non stimolato. - Incubare le cellule stimolate a 37°C con 5% di CO₂ per 24, 48 o 72 h. Utilizzare piastre parallele distinte per ciascun punto temporale di acquisizione per ridurre al minimo la fototossicità cumulativa.
- Colorare le cellule con soluzione di Hoechst 33342 a una concentrazione finale di lavoro di 2,5 µg/mL per 15 minuti prima dell'acquisizione delle immagini.
NOTA: Preparare la soluzione di colorazione diluendo la soluzione madre di Hoechst 33342 a 10 mg/mL in un rapporto 1:4.000 in PBS sterile. Eseguire la colorazione in condizioni protette dalla luce per ridurre al minimo il fotobiancamento. - Acquisire immagini di fluorescenza utilizzando un sistema di imaging ad alto contenuto dotato di un obiettivo secco da 10×.
- Acquisire cinque campi non sovrapposti per pozzetto nel formato di piastra a 384 pozzetti per ciascuna condizione sperimentale.
NOTA: Mantenere impostazioni di imaging identiche in tutti i gruppi sperimentali per garantire la comparabilità. Utilizzare l'autofocus automatizzato basato su laser e mantenere le condizioni di controllo ambientale a 37°C con 5% di CO₂ durante l'imaging di cellule vive. - Acquisire immagini di fluorescenza di mCherry con eccitazione a 561 nm, filtro di emissione Bandpass 600/52 (BP600/52) e tempo di esposizione di 200 ms.
- Acquisire immagini di fluorescenza di Hoechst con eccitazione a 405 nm, filtro di emissione BP445/45 e tempo di esposizione di 30 ms.
NOTA: Impostare il guadagno della telecamera a 1,0 e acquisire tutte le immagini alla massima risoluzione della telecamera utilizzando un binning 1 × 1 per mantenere una rilevazione lineare della fluorescenza e massimizzare la risoluzione spaziale. - Analizzare le immagini acquisite utilizzando il software di analisi delle immagini CellPathfinder.
- Identificare i nuclei nel canale Hoechst come oggetti primari utilizzando un diametro nucleare di riferimento di 20 µm e un intervallo di area compreso tra 20–400 µm2.
- Definire le regioni di interesse (ROI) citoplasmatiche nel canale mCherry espandendole dal confine nucleare utilizzando un diametro cellulare di riferimento di 60 µm.
NOTA: Applicare un filtro “Exclude Edge” durante la segmentazione per rimuovere le cellule parziali che toccano i bordi dell'immagine. - Calcolare l'intensità media di fluorescenza per ciascuna cellula identificata e determinare l'intensità media di fluorescenza per pozzetto a partire dai cinque campi acquisiti.
5. Validazione dell'affidabilità del modello mediante ELISA e reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale
- Infettare i fibroblasti NIH/3T3 con l'adenovirus ricombinante a un MOI ottimizzato di 100, come descritto al Passo 3.9.
- Pretendere le cellule con SB431542 per 30–60 minuti prima della stimolazione con TGF-β.
NOTA: Preparare una soluzione stock di SB431542 a 20 mM in dimetilsulfossido (DMSO) e conservare le aliquote a −20°C. - Trattare le cellule con 10 ng/mL di TGF-β e SB431542 a concentrazioni finali di 1, 5, 10 e 15 µM. Includere un gruppo di controllo con veicolo contenente 0,1% (v/v) di DMSO senza trattamento con SB431542.
NOTA: Mantenere la concentrazione finale di DMSO al 0,1% (v/v) in tutti i gruppi di trattamento. - Preparare la soluzione lavorativa di TGF-β utilizzando un metodo di diluizione in due passaggi.
NOTA: Diluire la soluzione stock di TGF-β a 100 µg/mL (preparata in 4 mM HCl contenente 0,1% di BSA) 1:100 in PBS sterile prima di un'ulteriore diluizione nel mezzo di coltura completo per raggiungere la concentrazione lavorativa finale di 10 ng/mL. - Incubare le cellule trattate in piastre a 6 pozzetti per 24 h a 37°C con 5% di CO₂.
- Raccogliere 2 mL di supernatante di coltura da ogni pozzetto per l'analisi con ELISA.
- Centrifugare i supernatanti raccolti a 1.000 × g per 5 minuti a 4°C per rimuovere i detriti cellulari.
- Aliquotare i supernatanti chiarificati e conservarli a −80°C fino all'analisi con ELISA.
NOTA: I supernatanti chiarificati possono essere conservati a −80°C prima dell'analisi con ELISA. - Lavare delicatamente le cellule aderenti con PBS freddo a ghiaccio dopo la rimozione del supernatante.
- Aggiungere direttamente 1 mL di reagente TRIzol in ogni pozzetto per lisare le cellule.
NOTA: Pipettare il lisato più volte per assicurare un'omogeneizzazione completa prima di trasferire i campioni in provette per microcentrifuga. I lisati di RNA possono essere conservati a −80°C prima dell'estrazione dell'RNA. - Estrarre l'RNA totale dai lisati per l'analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa (RT-qPCR).
- Eseguire la trascrizione inversa utilizzando 1 µg di RNA totale.
NOTA: Eseguire la trascrizione inversa utilizzando le seguenti condizioni di reazione: 25°C per 10 minuti, 42°C per 15 minuti e 85°C per 2 minuti. - Eseguire la PCR quantitativa utilizzando PerfectStart Green qPCR SuperMix. Preparare ogni reazione in un volume finale di 20 µL contenente 5 µL di DNA complementare (cDNA) come stampo.
- Eseguire le reazioni di qPCR utilizzando le seguenti condizioni di ciclaggio: denaturazione iniziale a 94°C per 30 s, seguita da 40 cicli di 94°C per 5 s, 60°C per 15 s e 72°C per 10 s.
NOTA: Eseguire l'analisi della curva di denaturazione dopo l'amplificazione per confermare la specificità del prodotto. - Normalizzare l'espressione genica di Col1a1 rispetto a 18S rRNA come controllo interno.
NOTA: Tutte le sequenze dei primer sono fornite in Tabella Supplementare 1. - Quantificare i livelli di proteina Collagene I secreta nei supernatanti chiarificati mediante ELISA secondo le istruzioni del produttore. L'intervallo della curva standard per il saggio ELISA del collagene di tipo I murino è compreso tra 0,78 e 50 ng/mL, con una sensibilità di rilevamento del saggio di 0,37 ng/mL.
- Analizzare tutti gli standard e i campioni in duplicati tecnici e misurare la densità ottica (OD) a 450 nm utilizzando un lettore per micropiastre.
NOTA: Utilizzare supernatanti chiarificati non diluiti per massimizzare la sensibilità del saggio nel rilevamento del Col1a1 secreto.
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Risultati
Una panoramica schematica della costruzione e del confezionamento del virus adenovirale ricombinante mCol1a1p-mCherry è mostrata in Figura 1A. Il promotore murino Col1a1 è stato clonato a monte del gene reporter mCherry e inserito in un vettore adenovirale, seguito dal confezionamento virale e dall'amplificazione in cellule HEK293. Il flusso di lavoro illustra i passaggi sperimentali chiave, inclusa l'infezione virale, la stimolazione fibrotica, l'interven...
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Discussione
La fibrosi cardiaca contribuisce al progredire dello scompenso cardiaco e lo sviluppo di terapie antifibrotiche efficaci è limitato dalla mancanza di piattaforme di screening longitudinali2,13. I metodi convenzionali per valutare l'efficacia antifibrotica, tra cui il Western blotting, la RT-qPCR e la colorazione immunofluorescente, si basano su misurazioni endpoint che richiedono la lisi o la fissazione cellulare. Questi approcci impediscono il monitoraggio in te...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interessi da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della National Natural Science Foundation of China (32371158 a H.X.), del National Key R&D Program (2023YFA1800902 a H.X.), del programma "Tianchi Talent", del Progetto Aperto del National Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling (Peking University) (202404 a R.Z; 202403 a Y.M.W.) e del Progetto Aperto del Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Ministry of Education (Peking University) (KF202404 a H.X.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Micropiatto da 384 pozzetti con fondo in vetro | Cellvis, USA | P384-1,5H-N | Piastra da 384 pozzetti con fondo in vetro utilizzata per la semina cellulare, l'infezione virale, la colorazione e l'analisi mediante imaging a fluorescenza. |
| Plasmide con scheletro adenovirale | Microbix, Canada | pBHGloxΔE1,3Cre | Plasmide utilizzato per generare il genoma adenovirale ricombinante a lunghezza intera. |
| Vettore Shuttle Adenovirale: pDC315-mCol1a1p-mCherry | GeneChem, Cina | Servizio personalizzato | Vettore shuttle adenovirale ricombinante contenente il promotore murino di Col1a1 di 2354 pb che regola l'espressione di mCherry. |
| Benzonasi Nucleasi | Merck Millipore, USA | 70664-3 | Endonucleasi utilizzata durante la purificazione di adenovirus per rimuovere gli acidi nucleici contaminanti. |
| Cappa biologica di sicurezza (Classe II) | Esco Lifesciences Group, Singapore | AC2-4S1 | Cappa di sicurezza biologica certificata utilizzata per la manipolazione di adenovirus ricombinanti e procedure di coltura cellulare sterili. |
| Mezzo di coltura cellulare (DMEM/F12 completo) | HyClone, USA | 12800-017 | Mezzo di coltura completo utilizzato per la manutenzione delle cellule NIH/3T3 e HEK293. |
| Software di analisi delle immagini CellPathfinder | Yokogawa Electric Corporation, Giappone | Versione 3.08.01 | Software di analisi delle immagini utilizzato per la quantificazione automatizzata della fluorescenza e la segmentazione cellulare. |
| Sistema di screening ad alto contenuto CellVoyager CV8000 | Yokogawa Electric Corporation, Giappone | CV8000 | Sistema di imaging ad alto contenuto utilizzato per l'acquisizione della fluorescenza di mCherry e Hoechst. |
| CO2 Incubatrice per colture cellulari | Thermo Fisher Scientific, USA | 3111 | Incubatrice umidificata mantenuta a 37 °C con 5% CO2 per la coltura cellulare di cellule di mammifero |
| Dimetilsolfossido (DMSO) | Sigma-Aldrich, USA | D2650 | Solvente utilizzato per la preparazione di SB431542. |
| Dulbecco’Mezzo Eagle modificato/miscela nutriente F-12 (DMEM/F-12) | Servicebio, Cina | G4610 | Mezzo di coltura basale utilizzato per fibroblasti NIH/3T3. |
| Siero fetale bovino (FBS) | Ausbian, Australia | VS500T | Supplemento di siero utilizzato al 10% (v/v) per la preparazione del mezzo di coltura completo. |
| Colorante fluorescente Hoechst 33342 | Invitrogen, USA | H3570 | Colorante nucleare utilizzato per l'immagine di fluorescenza e la normalizzazione del conteggio nucleare. |
| Cellule HEK293 | ATCC, USA | CRL-1573 | Linea cellulare impiegata per la produzione e l'amplificazione di adenovirus. |
| TGF-β ricombinante umanoβ1 | MedChemExpress, Cina | HY-P78214 | Citochina utilizzata per indurre l'attivazione fibrotica nei fibroblasti NIH/3T3. |
| Software per l'acquisizione delle immagini | Yokogawa Electric Corporation, Giappone | Versione 3.08.01.03 | Software utilizzato per l'acquisizione automatizzata di immagini a fluorescenza e il controllo del microscopio. |
| Reagente di trasfezione basato su lipidi | Invitrogen, USA | 11668-019 | Reagente di trasfezione utilizzato per il trasferimento di plasmidi adenovirali in cellule HEK293. |
| Tubi per microcentrifuga | Axygen, USA | MCT-150-C | Tubi utilizzati per la conservazione del lisato di RNA e la lavorazione del campione. |
| Lettore di micropiastre | Tecan, Svizzera | Scintilla | Lettore multimodale per micropiastre utilizzato per le misurazioni dell'assorbanza in ELISA. |
| Kit ELISA per collagene di tipo I da topo | Meike Biotechnology, Cina | MK6778A | Kit ELISA utilizzato per quantificare il collagene di tipo I secreto nei supernatanti di coltura. |
| Fibroblasti murini NIH/3T3 | Procell Life Science, Cina | CL-0171 | Linea cellulare di fibroblasti murini utilizzata per l'allestimento e la validazione del modello reporter. |
| Enzima di restrizione PacI | New England Biolabs, USA | R0547S | Enzima di restrizione utilizzato per la linearizzazione del plasmide adenovirale. |
| Penicillina–Soluzione di streptomicina | Gibco, USA | 15140-122 | Soluzione di antibiotico aggiunta al 1% (v/v) per prevenire contaminazioni batteriche. |
| PerfectStart Green qPCR SuperMix | TransGen Biotech, Cina | AQ602 | Miscela master per qPCR a base di SYBR Green utilizzata per l'analisi di PCR quantitativa. |
| Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) | Servicebio, Cina | G4202 | Buffer utilizzato per il lavaggio delle cellule e la preparazione dei reagenti. |
| Vettore shuttle pDC315-EGFP | GeneChem, Cina | N/A | Vettore shuttle adenovirale parentale utilizzato per la costruzione del plasmide reporter. |
| Sistema qPCR | Applied Biosystems, USA | QuantStudio 5 | Sistema di PCR in tempo reale utilizzato per l'analisi quantitativa dell'espressione genica. |
| Enzimi di restrizione (BamHI e KpnI) | Abclonal, Cina | RK21101, RK21104 | Enzimi di restrizione utilizzati per la linearizzazione del vettore shuttle. |
| Reverse Transcription Kit | TransGen Biotech, Cina | AT311 | Kit di trascrizione inversa utilizzato per la sintesi di cDNA prima della RT-qPCR. |
| Reagente di lisi RNA | Invitrogen, USA | 15596026 | Reagente utilizzato per l'estrazione di RNA totale da cellule in coltura. |
| SB431542 | MedChemExpress, Cina | 301836-41-9 | TGF-β inibitore del recettore di tipo I utilizzato per esperimenti di inibizione farmacologica |
| Servizio/Reagenti di sequenziamento Sanger | Shanghai Boshang Biotechnology Co., Ltd., Cina | Servizio personalizzato | Servizio/reagenti di sequenziamento utilizzati per la verifica della sequenza del plasmide. |
| Pipette sierologiche | Corning, USA | 4488 | Pipette sterili utilizzate per la manipolazione di liquidi durante le procedure di coltura cellulare. |
| T30 Termociclatore | LongGene Scientific Instruments, Cina | T30 | Termociclatore utilizzato per la trascrizione inversa e l'amplificazione PCR. |
| Soluzione di tripsina-EDTA | Gibco, USA | 25200-056 | Reagente per la dissociazione cellulare utilizzato per il passaggio cellulare di routine. |
| Kit per la purificazione virale | Takara Bio USA | 631533 | Kit utilizzato per la purificazione di adenovirus ricombinante. |
| Bagno termico | Shanghai Yiheng Scientific Instruments, Cina | HWS-12 | Bagno termostatato utilizzato durante il congelamento adenovirale–cicli di scongelamento |
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