Questo studio ha identificato i bersagli e le vie principali dello shikonin contro RCC tramite analisi multimetodo e validazione in vitro , fornendo un quadro per ulteriori studi meccanicistici.
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Articolo di ricerca
Questo studio ha identificato i bersagli e le vie principali dello shikonin contro RCC tramite analisi multimetodo e validazione in vitro , fornendo un quadro per ulteriori studi meccanicistici.
Il carcinoma a cellule renali (RCC) è uno dei tumori più comuni nel sistema urinario e presenta il tasso di mortalità più alto. Indagini precedenti hanno dimostrato che lo shikonin può trattare il carcinoma a cellule renali, ma il meccanismo rimane poco chiaro. Pertanto, il nostro studio mirava a chiarire il meccanismo della shikonin nel trattamento del carcinoma a cellule renali utilizzando la farmacologia di rete, il docking molecolare e saggi funzionali in vitro, inclusi proliferazione cellulare, migrazione e apoptosi, con validazione del western blot (WB). I bersagli di Shikonin sono stati selezionati utilizzando PharmMapper, SwissTargetPrediction e altri database, e sono stati identificati bersagli correlati al RCC tramite Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), GeneCard e altri database; I potenziali bersagli terapeutici sono stati ottenuti tramite analisi di intersezione. È stata costruita una rete di interazione proteina-proteina (PPI) e Cytoscape è stato utilizzato per selezionare i bersagli centrali, mentre è stato applicato il docking molecolare per analizzare l'affinità di legame tra shikonin e bersagli chiave. Sono stati raccolti in totale 374 bersagli shikonin e 1.087 bersagli correlati al RCC, e identificati 98 geni bersaglio sovrapposti. Sono stati identificati sei obiettivi principali (SRC, PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, PTPN11 e PIK3R1). Le analisi della Gene Ontology (GO) e della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) hanno mostrato che la shikonin esercitava effetti anti-RCC principalmente regolando l'attività delle proteine chinasi, HIF-1 e le vie di segnalazione IL-17. L'aggancio molecolare ha confermato che la shikonin aveva una forte affinità di legame con questi bersagli centrali. Studi in vitro utilizzando cellule RCC umane Caki-1 e 786-O hanno dimostrato che la shikonin inibiva significativamente la proliferazione e la migrazione cellulare in modo dipendente dalla dose, promuoveva l'apoptosi cellulare e aumentava le attività di caspasi-3 e caspasi-8. Gli esperimenti con Western Blot hanno ulteriormente verificato che la shikonin modulava l'espressione delle proteine bersaglio centrali e soppressa la via di segnalazione dell'HIF-1. Questo studio chiarisce sistematicamente il meccanismo farmacologico dello shikonin contro il carcinoma a cellule renali, fornendo una base teorica per lo sviluppo e l'applicazione dello shikonin come nuovo agente anti-RCC.
Il carcinoma a cellule renali (RCC) è il tumore maligno più comune del sistema urinario, rappresentando circa il 90% di tutti i tumori maligni renali e il 2%–3% dei tumori maligni adulti nel mondo. Secondo i dati GLOBOCAN 2022, nel 2022 ci sono stati circa 434.800 nuovi casi e 155.953 decessi per carcinoma a cellule renali, con l'incidenza e la mortalità del CCR che mostrano una continua tendenza al risalto. L'American Cancer Society ha stimato 80.980 nuovi casi e 14.510 decessi per carcinoma a cellule renali solo negli Stati Uniti nel 2025. Il carcinoma a cellule renali presenta il tasso di mortalità più alto tra i tumori maligni del sistema urinario, e i pazienti con RCC metastatico o resistente ai farmaci presentano comunque una prognosi negativa. Con l'ampia applicazione della terapia mirata e dell'immunoterapia, sono stati compiuti notevoli progressi nel trattamento clinico del RCC. Il trattamento standard di prima linea per il carcinoma delle cellule renali avanzato o metastatico adotta principalmente regimi combinati di inibitori dei punti di controllo immunitari, o regimi che combinano inibitori dei punti di controllo immunitari con inibitori anti-angiogenici della tirosina chinasi. Nonostante il continuo progresso degli approcci terapeutici, un gran numero di pazienti sperimenta ancora la progressione della malattia, resistenza ai farmaci o intolleranza al trattamento. Pertanto, lo sviluppo di nuovi anti-RCC con meccanismi chiari, sicurezza ed efficacia chiari rimane una necessità clinicaurgente 1,2,3.
Shikonin è il principale costituente bioattivo estratto da Radix Arnebiae, e il suo derivato acetilshikonin ha mostrato effetti farmacologici anti-RCC prominenti. Le evidenze esistenti hanno dimostrato che lo shikonin esercita attività anti-RCC attraverso meccanismi regolatori multitarget e multipercorso. Meccanicamente, la shikonin può aumentare l'espressione del gene soppressore tumorale TEK e inibire la fosforilazione della cascata di segnalazione AKT/mTOR, sopprimendo così la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle celluleRCC 4; Inoltre, la shikonina induce l'accumulo di specie reattive intracellulari dell'ossigeno (ROS) per scatenare disfunzioni mitocondriali, innescando ulteriormente molteplici schemi di morte cellulare programmata tra cui apoptosi, necroptosi e autofagia nelle celluleRCC 5. Modula inoltre l'espressione di microRNA come miR-15b e miR-99b e regola i geni target associati all'apoptosi, inclusi FOXO1 e PDCD4, tramite la via MAPK/ERK, con questi effetti regolatori che mostrano una specificità evidentedella linea cellulare 6. In particolare, lo shikonin mantiene una potente attività antitumorale contro le linee cellulari RCC resistenti al sunitinib, suscitando effetti terapeutici attivando complessi di necrosomi, inibendo la via AKT/mTOR e inducendo l'arresto del ciclo cellulareG2/M 7. Sebbene gli effetti anti-RCC dello shikonin siano stati parzialmente validati da studi sperimentali esistenti, i principali bersagli terapeutici, le principali reti di segnalazione e i meccanismi molecolari di regolazione sottostanti dello shikonin contro il RCC rimangono poco chiari; Inoltre, mancano ancora previsioni sistematiche, verifiche molecolari e conferme sperimentali dei suoi obiettivi centrali, creando un importante vuoto nella ricerca negli studi attuali.
La farmacologia di rete e l'aggancio molecolare rappresentano approcci tecnici complementari nella ricerca moderna sui farmaci naturali e nell'esplorazione dei meccanismi farmacologici. Da una prospettiva sistematica, la farmacologia delle reti può decodificare sistematicamente le caratteristiche olistiche di interazione multitarget e multipercorso tra composti bioattivi e bersagli correlati alla malattia. Al contrario, l'aggancio molecolare consente la verifica a livello molecolare dell'affinità di legame e del modello stabile di interazione tra composti a piccole molecole e proteine bersaglio centrali. La combinazione di queste due metodologie costruisce un ciclo sistematico a circuito chiuso di ricerca che prevede la previsione olistica del bersaglio seguita dalla verifica molecolare. Combinare la validazione sperimentale con la farmacologia di rete e il docking molecolare è un approccio mainstream per la ricerca sui farmaci naturali, che facilita la chiarificazione della patogenesi delle malattie e l'elucidazione dei meccanismi farmacologici dei composti, fornendo un quadro teorico per la ricerca di base e l'applicazione traslazionale dei farmaci 8,9.
In questo studio, è stata applicata la farmacologia di rete per prevedere i candidati target dello shikonin nel trattamento del carcinoma a cellule renali. L'aggancio molecolare è stato utilizzato per verificare teoricamente potenziali bersagli, e i principali obiettivi d'azione sono stati infine determinati tramite esperimenti in vitro e ulteriormente confermati dagli esperimenti Western Blot (WB). L'intero processo di questo studio è mostrato nella Figura 1.
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Tutte le linee cellulari umane utilizzate in questo studio sono state acquistate da banche cellulari commerciali autenticate, e non sono stati raccolti tessuti umani freschi né campioni di pazienti. Non era quindi richiesta un'approvazione etica per questo studio in vitro basato su cellule.
Ottenere e prevedere obiettivi shikonin
La parola chiave "shikonin" è stata ricercata nel database di PubChem. La struttura SDF di shikonin fu scaricata e ottenne la sua notazione semplificata del sistema molecolare di input line-entry (SMILES). Secondo i requisiti dei rispettivi database di bersagli, potenziali bersagli shikonin sono stati previsti e raccolti dai database PharmMapper, SwissTargetPrediction, HERB e SEA Search Server il 3 marzo2026 10, 11, 12.
Ottenere bersagli del carcinoma a cellule renali
Utilizzando il carcinoma a cellule renali come parola chiave, i target di malattie di origine umana sono stati recuperati dal Therapeutic Target Database (TTD), OMIM e GeneCards, con specie limitate a Homo sapiens e Relevance Score > 50. Inizialmente sono stati ottenuti un totale di 1148 bersagli e, dopo aver riassunto e deduplicato, sono stati infine acquisiti 1087 bersagli unici correlati al carcinoma a cellulerenali: 13, 14, 15.
Identificazione degli obiettivi di intersezione dello shikonin per il trattamento del carcinoma a cellule renali
I bersagli genici previsti per shikonin e carcinoma a cellule renali sono stati inseriti in Venny 2.1, uno strumento di analisi online. I bersagli sovrapposti sono stati identificati tramite analisi di intersezione e visualizzati in un diagramma di Venn.
Istituzione della rete componente-bersaglio-malattia
Utilizzando lo shikonin come punto di partenza principale per la ricerca, abbiamo integrato le informazioni di associazione fisiologica tra questi bersagli principali e RCC, e costruito una rete di interazione molecolare del sistema ternario "componente-bersaglio-malattia" utilizzando il software di visualizzazione Cytoscape.
Costruzione della rete di interazione proteica e acquisizione di bersagli principali di shikonin nel trattamento del carcinoma a cellule renali
Database di interazioni proteiche STRING è lo strumento principale per costruire reti di interazione proteina-proteina (PPI), che consente l'estrazione e la visualizzazione della relazione di interazione tra proteine. In questo studio, i bersagli sovrapposti tra shikonin e carcinoma a cellule renali sono stati sottoposti al database STRING, con la specie impostata su Homo sapiens per ulteriori recuperi. Clicca sul pulsante Continua per l'analisi successiva. Nel modulo Impostazioni in fondo alla pagina dei risultati dell'analisi, il punteggio minimo richiesto per l'interazione è stato impostato a un alto livello di confidenza di 0,900. Allo stesso tempo, proteine non correlate e nodi disconnessi nella rete venivano nascosti per ottenere la mappatura mutua ottimizzata della rete PPI. I dati venivano memorizzati in formato TSV e importati nel software Cytoscape. I parametri corrispondenti venivano regolati in modo che la dimensione del nodo e la tonalità del colore riflettessero i valori corrispondenti, mentre lo spessore dei bordi riflettesse il punteggio del tasso di legame. La mappa della rete PPI è statastabilita il 16,17.
Sulla base della rete PPI sopra citata, i target principali sono stati accuratamente selezionati. Il plug-in di cytohubba veniva aperto nel modulo Apps di Cytoscape, e si cliccava il pulsante Calcola per avviare il programma di calcolo. L'algoritmo MCC veniva selezionato tra i 6 nodi più alti classificati per opzione, e si premeva il pulsante Invia per completare il calcolo. I sei principali obiettivi principali sono stati selezionati per l'abbellimento e il download dei dati.
Analisi di arricchimento GO e analisi della via KEGG dello shikonin nel trattamento del carcinoma a cellule renali
Il database Metascape veniva utilizzato per l'analisi di arricchimento GO. In questo studio, le intersezioni mirate allo shikonin con il carcinoma a cellule renali sono state importate nel database. Per prima cosa, la specie selezionata era Homo sapiens (umano), poi è stata selezionata la modalità di Analisi Personalizzata. L'Analisi di Arricchimento è stata effettuata per le tre dimensioni dell'arricchimento funzionale GO: funzioni molecolari, componenti cellulari e processi biologici. Il limite del p-value è stato impostato a 0,01 e il pulsante per l'analisi dell'arricchimento è stato cliccato per eseguire l'analisi utilizzando la piattaforma di microcredito e costruire una visualizzazione di analisi di arricchimento GO dello shikonin nel trattamento del carcinoma a cellulerenali 18,19.
Il database KOBAS 3.0 è stato utilizzato per eseguire analisi di arricchimento delle vie di segnalazione KEGG sui bersagli sovrapposti tra shikonina e carcinoma a cellule renali, e questo database può realizzare annotazioni delle vie e analisi statistiche di arricchimento dei geni. I target di incrocio selezionati sono stati importati nel database KOBAS 3.0; la fonte della specie selezionata era H. sapiens (umano), il tipo di screening era limitato al percorso di segnalazione KEGG e la soglia del valore p per l'analisi di arricchimento era impostata a <0,01. Dopo l'analisi, sono stati ottenuti i risultati di arricchimento della via KEGG. Sulla base dei risultati dell'analisi di arricchimento, il p-value è stato utilizzato come base per l'ordinamento e i primi 10 percorsi di segnale KEGG sono stati selezionati. L'elaborazione della visualizzazione è stata completata con l'aiuto di una piattaforma di microsegnalazione e, infine, è stato disegnato il diagramma di Sankey di arricchimento KEGG con il diagramma delle bolle disalvataggio 20,21.
Verifica dell'aggancio molecolare
La struttura tridimensionale (3D) di shikonin è stata recuperata dal database PubChem, e il software Open Babel è stato applicato per trasformare la struttura 3D in formato PDB standard. Le strutture proteiche tridimensionali dei bersagli principali identificati tramite analisi farmacologica di rete sono state scaricate in formato PDB dal database proteico RCSB e dal database AlphaFold. Le strutture cristalline delle proteine bersaglio includevano PIK3CA (ID PDB: 9B4T), PIK3CD (ID PDB: 8BCY), PIK3R1 (ID PDB: 7CIO), PTPN11 (ID PDB: 9R16), SRC (ID PDB: 9NS1), PIK3CB (struttura prevista per AlphaFold, AF-Q8BTI9-F1-model_v6). Molecole d'acqua ed eteroatomi sono stati rimossi, sono stati aggiunti idrogeni polari e sono state assegnate cariche di Gasteiger utilizzando AutoDock Tools. Il software AutoDock Tools veniva utilizzato per selezionare la scatola di attracco di dimensioni appropriate per coprire l'intera proteina bersaglio per l'aggancio molecolare. Infine, è stata ottenuta la visualizzazione delle coppie di componenti bersaglio-attivi con energia di legame ottimale. Il software PyMol è stato utilizzato per analizzare i siti di legame, il tipo e la distanza di interazione del legame e per generare un'immagine di visualizzazione conformazionaletridimensionale 22,23.
Test di citotossicità
Le cellule Caki-1 sono state inoculate in piastre di coltura da 96 pozzi a una densità di 5.000 cellule per pozzo e trattate con shikonin a concentrazioni di 12,5, 25, 50 e 100 μmol/L per 12 ore e 24 ore, rispettivamente. Per le cellule 786-O, è stato eseguito solo un trattamento di 24 ore con lo stesso gradiente di concentrazione. L'effetto citotossico dello shikonin su entrambe le linee cellulari è stato valutato utilizzando il saggio MTT. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicati biologici con tre repliche tecniche per ciascuna condizione. I risultati sono espressi come valori IC50 . Sebbene la tendenza complessiva inibitoria fosse coerente tra le due linee cellulari, lo shikonin ha mostrato una citotossicità più forte verso le cellule Caki-1. Pertanto, le cellule Caki-1 sono state selezionate per esperimenti funzionali successivi.
Effetto dello shikonin sulla migrazione delle cellule Caki-1 determinato tramite il saggio su ferita a graffio
Le cellule Caki-1 e le cellule 786-O in fase logaritmica sono state seminate in placche a 6 pozzi. Linee di graffio parallele venivano create sul fondo di ogni pozzo utilizzando una punta sterile di pipetta da 200 μL. Dopo l'attacco notturno, è stato utilizzato il PBS per lavare le cellule coltivate. Le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di shikonin (12,5, 25, 50 e 100 μmol/L) per 12 ore. Dopo 12 ore, la variazione dell'area del graffio nello stesso sito è stata osservata al microscopio.
La formula per calcolare l'effetto dello shikonin sull'attività di crescita delle cellule Caki-1 era la seguente: mobilità = [(0 h area scratch − 12 h area scratch) / 0 h area scratch] × 100%.
Determinazione delle attività Caspase-3 e Caspase-8
Le cellule Caki-1 nella fase logaritmica di crescita sono state prelevate, e la concentrazione cellulare è stata regolata a 5 × 106 cellule/mL, seguita da un'incubazione per 12 ore. Dopo che le cellule Caki-1 sono state trattate con diverse concentrazioni di shikonin (12,5, 25, 50 e 100 μmol/L) e incubate per 24 ore, è stata effettuata la rilevazione cellulare come descritto nel kit di test Caspasi.
Effetti della shikonina sul tasso di apoptosi delle cellule Caki-1
Le cellule Caki-1 a crescita logaritmica sono state seminate in piastre di coltura a 6 pozzi. Le cellule sono state trattate con shikonin a concentrazioni di 12,5, 25, 50 e 100 μmol/L per 24 ore in assenza di un gruppo di controllo. Le cellule sono state delicatamente sospese nel PBS, raccolte e contate. Un totale di 1 × 105 celle sospese sono state centrifugate a 300 × g per 5 minuti. Il sovrantantante fu scartato e la pellet cellulare fu delicatamente resuscita in 195 μL di buffer di legame Annexin V-FITT. Successivamente, sono stati aggiunti 5 μL di Annexin V-FITC, seguiti da 10 μL di soluzione di colorazione al propidio ioduro, entrambi con miscelazione delicata. Le cellule sono state incubate a temperatura ambiente (20–25 °C) al buio per 15 minuti prima dell'analisi.
Analisi delle vie di segnalazione cellulare
Le cellule Caki-1 sono state trattate con shikonin di 12,5, 25, 50 e 100 μmol/L. Dopo 24 ore, le cellule sono state prelevate in PBS freddo, lisate con un tampone di lisi cellulare contenente inibitore della proteasi, e la concentrazione proteica è stata misurata. La proteina è stata isolata su un gel al 10% di solfato di dodecil di sodio (SDS)-poliacrilammide. Dopo il trasferimento alle membrane PVDF, le membrane sono state bloccate con il 5% di BSA per 3 ore, quindi incubate durante la notte a 4 °C con un diverso anticorpo primario. Successivamente, le membrane sono state incubate con l'anticorpo secondario con una diluizione di 1:3000. Le bande proteiche sono state rilevate con il sistema di rilevamento ECL e analizzate quantitativamente utilizzando il software ImageJ.
Analisi statistica
I risultati sperimentali sono stati presentati come la deviazione media ± standard (x ± s, n = 3). Prima dell'analisi statistica parametrica, la normalità veniva verificata tramite il test di Shapiro-Wilk e l'omogeneità della varianza veniva valutata dal test di Levene. L'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) combinata con il test post hoc di Tukey è stata eseguita utilizzando il software SPSS. I grafi statistici venivano costruiti con il software GraphPad Prism. Il test t a campioni indipendenti è stato utilizzato per confronti a coppie tra gruppi, e p < 0,05 ha indicato differenze statisticamente significative.
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Ottenere e prevedere obiettivi shikonin
Utilizzando i quattro database menzionati, sono stati previsti potenziali obiettivi shikonin e identificati 426 obiettivi dopo integrazione e sintesi. I bersagli riassunti sono stati deduplicati, risultando in 374 bersagli, come mostrato nella Figura 2A.
Ottenere bersagli del carcinoma a cellule renali
Un totale di 1.147 bersagli sono stati ottenuti dopo aver riassunto i dati relativi ...
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PIK3CA è formalmente noto come isoforma alfa della subunità catalitica fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato 3-chinasi. PIK3CA, componente centrale della via PI3K/AKT/mTOR, svolge un ruolo essenziale nell'occorrenza, nello sviluppo e nel trattamento del carcinoma a cellule renali (RCC). Gli studi hanno dimostrato che PIK3CA è un gene mutante ad alta frequenza di questo sottotipo (6/57, 11%), e la sua mutazione è direttamente correlata all'attivazione anomala della via PI3K/AKT. Inoltre, tal...
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questa ricerca è stata finanziata dalla Commissione Provinciale della Salute del Guizhou per la scienza e la tecnologia (gzwkj2024-516); Programma Nazionale e Provinciale di Talenti per l'Innovazione in Scienza e Tecnologia dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese del Guizhou, Università di Medicina Tradizionale Cinese del Guizhou TD Hopes [2023] 005; Fondazione Provinciale per le Scienze Naturali del Guizhou [numeri di sovvenzione: ZK [2024] 404]; Complesso proteico-polisaccaridi di Chuanxiong basato sulle caratteristiche del latte di Pickering a lunga circolazione per promuovere il trattamento del mal di testa con Chuanxiong (82360779).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 786-O | American Type Culture Collection (ATCC) | RRID: CVCL_1051 (ATCC CRL-1932) | Linea cellulare di carcinoma a cellule renali a chiaro margine umano |
| AlphaFold database | European Molecular Biology Laboratory (EMBL) - EBI | AlphaFold Protein Structure Database | Database di previsione della struttura proteica (AlphaFold Protein Structure Database) |
| AutoDock Tools software | Scripps Research Institute | 1.5.7 | Software di docking molecolare per la previsione del legame ligando-proteina |
| Caki-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | RRID: CVCL_0234 (ATCC HTB-46) | Linea cellulare di carcinoma a cellule renali a chiaro margine umano |
| Caki-1 cells | Mudanjiang Normal University | HTB-46 (RRID: CVCL_0234) | Linea cellulare di carcinoma a cellule renali a chiaro margine umano |
| Caspase 3 and caspase 8 detection kits | Credit Suisse Biotechnology Co Ltd (QUANZHOU, China) | Caspase-3 Activity Assay Kit, Cat. No. RX302848M, Caspase-8 Activity Assay Kit, Cat. No. RX302849M | Utilizzati per rilevare l'attività della caspasi per valutare l'apoptosi cellulare |
| Cytoscape software | Cytoscape Consortium | 3.9.1 | Utilizzato per la costruzione e la visualizzazione di reti biologiche |
| DMEM medium | Hyclone | SH30022.01 | Medium di coltura cellulare per la coltura cellulare Caki-1 e 786-O |
| Fetal bovine serum | Gbico | 10099-141 | Supplemento di coltura cellulare per la crescita cellulare Caki-1 e 786-O |
| GeneCards | Weizmann Institute of Science | https://www.genecards.org/ | Database genico umano completo per l'annotazione del gene bersaglio |
| GraphPad Prism | GraphPad, San Diego, CA, USA | version 8.3.0 | Per la costruzione di grafici statistici |
| HERB database | Chinese Academy of Sciences | http://herb.ac.cn | Database componente-bersaglio della medicina tradizionale cinese |
| ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | Fiji | Software di analisi delle immagini per la morfologa cellulare e la quantificazione delle bande del Western blot |
| inverted microscope | Olympus, IX73, Japan | 100× magnification. | Utilizzato per osservare i cambiamenti morfologici cellulari dopo il trattamento con shikonin |
| KOBAS 3.0 database | Peking University | http://bioinfo.org/kobas/ | Strumento di analisi di arricchimento dell'ontologia genica e del percorso |
| Metascape database | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | https://metascape.org/gp/index.html) | Strumento di arricchimento della funzione genica e di analisi della rete |
| Microcredit platform | National Center for Bioinformation (China) | http://www.bioinformatics.com.cn/ | Piattaforma di analisi bioinformatica online per l'elaborazione dei dati |
| MTT assay kit | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (Beijing, China) | Cat. No. M8180 | Utilizzato per rilevare la vitalità cellulare (assay antiproliferativo) |
| OMIM | Johns Hopkins University School of Medicine | https://www.omim.org/ | Online Mendelian Inheritance in Man (database di malattie genetiche umane) |
| PharmMapper database | East China University of Science and Technology | https://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/ | Database di previsione del bersaglio di farmaci a piccole molecole |
| PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, and PTPN11 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA) | Anticorpi primari per l'analisi Western blot delle proteine bersaglio |
| PyMol software | Schrödinger, Inc. | 2.2.0 | Software di visualizzazione molecolare per l'analisi della struttura proteica |
| RCSB protein database | RCSB Protein Data Bank (Rutgers University) | https://www.rcsb.org/ | Database di strutture proteiche (PDB) per la modellazione molecolare |
| SEA Search Server database | University of California, San Francisco | https://sea.bkslab.org | Approccio Ensemble di Similarità per la previsione del bersaglio |
| Shikonin (purity 98% | leaf organisms originating in China | Y0001439 | Piccolo composto molecolare utilizzato per il trattamento del carcinoma a cellule renali (RCC) in questo studio |
| SPSS | IBM, Armonk, NY, USA | version 20.0 | Per l'analisi statistica |
| STRING | European Molecular Biology Laboratory (EMBL) | https://stringdb.org/ | Database di rete di interazione proteina-proteina |
| SwissTargetPrediction database | Swiss Institute of Bioinformatics | https://www.swisstargetprediction.ch/ | Strumento di previsione del bersaglio a piccole molecole per la scoperta di farmaci |
| Therapeutic Target Database | Shanghai Institute of Materia Medica | https://ttd.idrbrab.cn | Database di bersagli terapeutici e farmaci |
| Venny 2.1 | Spanish National Center for Biotechnology (CNB-CSIC) | https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html) | Strumento di diagramma di Venn per l'analisi di intersezione dei dati |