Articolo metodologico

Ibridazione a reazione a catena FISH nel lobo ottico di Drosophila in via di sviluppo

DOI:

10.3791/71681

⸱

17 luglio 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, New York University, 2Department of Biological Sciences, Columbia University, 3Department of Biology, The City College of New York

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per eseguire ibridazione ibridazione a reazione a catena fluorescente in situ (HCR-FISH) nei lobi ottici larvali di Drosophila melanogaster . Sono dettagliate procedure per la progettazione della sonda, l'ibridazione, l'amplificazione e il montaggio dei tessuti per facilitare la visualizzazione del lobo ottico in sviluppo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comprendere lo sviluppo neurale richiede una caratterizzazione precisa di quando e dove i geni sono espressi. Tecniche come l'ibridazione in situ hanno da tempo permesso la visualizzazione dell'espressione genica nei tessuti in via di sviluppo. Sebbene l'ibridazione in situ sia ampiamente utilizzata negli embrioni di Drosophila melanogaster , la sua applicazione allo sviluppo del sistema visivo è stata limitata da diverse sfide tecniche. Ad esempio, le sonde lunghe spesso penetrano male nel lobo ottico, e i protocolli che si basano su reporter catalitici diffusibili, come la perossidasi di rafano, spesso producono bassi rapporti segnale/rumore nelle preparazioni a montaggio completo. L'ibridazione a reazione a catena fluorescente in situ (HCR-FISH) supera molte di queste limitazioni e consente una rilevazione del segnale più robusta. Come nel FISH convenzionale, i monomeri sonda del DNA si ibridano con sequenze di RNA all'interno dei tessuti. In HCR-FISH, tuttavia, le sonde amplificatrici coniugate fluorescenti formano strutture stabili a forno che innescano la polimerizzazione di ulteriori monomeri, amplificando così l'intensità del segnale. L'uso di set di sonde multiplexate consente anche l'uso di oligonucleotidi più corti (~45 nt, rispetto a fino a 1.000 nt nel FISH convenzionale), migliorando la penetrazione della sonda e producendo una colorazione più uniforme nei campioni a montaggio intero. Questo articolo descrive un protocollo HCR-FISH ottimizzato per il lobo ottico larvale di Drosophila . Il protocollo adatta gli approcci esistenti di HCR-FISH ottimizzando le condizioni di fissazione e aumentando le concentrazioni di sonde e forcina per migliorare l'intensità del segnale e la penetrazione dei tessuti. Sono fornite liste di reagenti e procedure passo dopo passo. Vengono presentate anche potenziali applicazioni nella neurobiologia dello sviluppo, tra cui la visualizzazione dei neuroni neonati e la caratterizzazione dei modelli di espressione genica nei casi in cui i metodi convenzionali, come proteine marcate endogenamente o la colorazione degli anticorpi, non forniscono informazioni sufficienti.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comprendere come il cervello è assemblato richiede di identificare sia la diversità dei tipi cellulari presenti sia i repertori genici espressi all'interno di ciascun tipocellulare 1. I recenti progressi nel sequenziamento dell'RNA a singola cellula hanno permesso ai ricercatori di affrontare queste domande ad altarisoluzione 2. Tuttavia, molti approcci a singola cellula non preservano le informazioni spaziali, richiedendo ulteriori esperimenti per mappare i cluster cellulari trascrizionali nelle loro posizioni all'interno del cervello in sviluppo.

I sistemi binari di espressione genica come GAL4-UAS possono fornire informazioni posizionali ma non sonoquantitativi 3. Inoltre, i ritardi tra l'espressione genica e il rilevamento del reporter possono oscurare i modelli di espressione fisiologicamente rilevanti durante le prime fasi dello sviluppo. L'immunocolorazione è un altro approccio ampiamente utilizzato per determinare i pattern di espressione specifici del tessuto4. Tuttavia, le proteine secrete sono spesso diffuse e difficili da localizzare con precisione.

Approcci di marcatura dei nucleotidi, come l'ibridazione in situ (ISH), sono stati ampiamente utilizzati anche per ottenere informazioni spaziali sull'espressionegenica 5. Nell'ISH, gli oligonucleotidi marcati del DNA si legano alle sequenze di RNA complementari inversi di interesse. I primi metodi ISH utilizzavano sonde di DNAradiomarcate 6, mentre i protocolli successivi incorporavano marcatori più sicuri come digossigenina, fluoresceina e rodamina 7,8,9. Gli scienziati hanno rapidamente adattato l'ISH per l'uso in Drosophila melanogaster, dove è stato applicato per caratterizzare l'organizzazione dei cromosomi politeni e mappare i modelli di espressione di geni gap come l'hunchback negli embrioni a montaturaintera 10,11.

Nonostante la sua ampia utilità, diverse limitazioni tecniche ostacolavano l'adozione dell'ISH in preparazioni più spesse a montatura intera, come il lobo ottico larvale. Molti protocolli in situ si basavano su reporter catalitici diffusibili, come la perossidasi di rafano, che spesso portavano a bassi rapportisegnale-rumore 12. Inoltre, molti approcci utilizzavano sonde lunghe mirate a singole sequenze per migliorarne la specificità. Sebbene efficaci negli embrioni di Drosophila e nei cromosomi politenici, le sonde lunghe penetrano scarsamente nel cervello larvale e spesso producono una marcaturadisomogenea 10,11,13.

Lo sviluppo dell'ibridazione fluorescente a singola molecola fluorescente ISH (smFISH) e dell'ibridazione a reazione a catena fluorescente in situ (HCR-FISH) ha affrontato molte di questelimitazioni 14,15. Utilizzando set di sonde corte disposte su una singola regione genica, smFISH riduce la lunghezza media della sonda da circa 1.000 nt a circa 40 nt16. Questo migliora notevolmente la penetrazione della sonda mantenendo una forte intensità del segnale. HCR-FISH migliora ulteriormente i rapporti segnale/rumore utilizzando sonde amplificatrici coniugate fluorescenti che aumentano la precisione posizionale e amplificano l'uscita del segnale. È importante sottolineare che questo passaggio di amplificazione sembra scalare linearmente con la concentrazione del trascrizione, permettendo una misurazione quantitativa dei livelli di espressionegenica 17.

HCR-FISH inizia con sonde iniziatrici complementari alla sequenza bersaglio. Questi oligonucleotidi di DNA non marcati contengono una sequenza iniziatrice a singolo filamento che si lega al dominio di ingresso di una sonda amplificatrice H1 marcata fluorescente. Gli amplificatori H1 adottano una struttura a gomino che mantiene l'inattività catalitica fino al legame alla sequenza iniziatrice. Al momento del collegamento, l'amplificatore H1 si apre ed espone una sequenza che si lega a una sonda partner, H2. Questa interazione apre la forcina H2, permettendole di legare un'altra sonda H1 (Figura 1)15. I cicli ripetuti di legame H1/H2 generano un polimero stabile che amplifica il segnale di fluorescenza riducendo il rumore di fondo. Poiché ogni sequenza di iniziatore è specifica di una coppia corrispondente H1/H2, più sonde con sequenze di iniziatore distinte e fluorofori possono essere usate simultaneamente per etichettare diversi geni all'interno dello stesso campione.

figure-introduction-1
Figura 1: Rappresentazione grafica del flusso di lavoro HCR-FISH. Le sonde di DNA contenenti sequenze iniziatrici si ibridano in un trascrizione di RNA bersaglio. I forcini amplificatori del DNA marcati fluorescenti si legano alla sequenza iniziatrice e subiscono polimerizzazione sequenziale per formare catene di amplificazione stabili a doppio filamento. La coniugazione diretta del fluoroforo migliora l'amplificazione del segnale e il rapporto segnale-rumore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I recenti miglioramenti a HCR-FISH ne hanno ulteriormente aumentato l'utilità. La progettazione della sonda a iniziatore diviso migliora la specificità dell'amplificatore, e gli anticorpi secondari coniugati agli iniziatori HCR consentono immunoistochimica simultanea eHCR-FISH 18. Inoltre, le opzioni di fluorofori ampliate ora permettono l'imaging multiplexato di fino a 10 genisimultaneamente 19,20.

Sebbene i primi esperimenti di prova di concetto per HCR-FISH siano stati condotti su pesci zebra (Danio rerio), il metodo ha acquisito ampio uso in molti sistemi, in particolare in organismi non modello dove gli anticorpi sono costosi o non disponibili15. La sintesi delle sonde offre anche un'alternativa più rapida alla generazione di anticorpi, che può richiedere mesi di sviluppo. Di conseguenza, HCR-FISH fornisce un approccio rapido per la validazione dei geni candidati identificati tramite dataset di sequenziamento RNA a singolacellula 21. Anche negli organismi modello genetici consolidati, HCR-FISH fornisce un metodo prezioso per mappare spazialmente neuroni appena nati quando i segnalatori GAL4 o l'immunoistochimica non riescono a segnare adeguatamente specifiche popolazioni cellulari.

Questo articolo descrive un protocollo HCR-FISH ottimizzato per il lobo ottico larvale di Drosophila al terzo stadio. Il protocollo adatta metodi precedentemente pubblicati in altri organismi per l'uso nel sistemavisivo di Drosophila 22. Le condizioni di fissazione comunemente utilizzate per l'immunoistochimica di Drosophila erano ottimizzate per applicazioni FISH. Le concentrazioni di sonda e forcina sono state aumentate per migliorare l'intensità del segnale e la penetrazione dei tessuti. Sono stati utilizzati tubi PCR al posto delle piastre spot per ridurre il consumo di reagenti e semplificare la gestione di piccoli campioni di tessuto. Inoltre, i tempi di lavaggio e ibridazione sono stati accorciati per adattarsi alle dimensioni più piccole del cervello di Drosophila rispetto ad altri sistemi di insetti comunemente utilizzati per HCR-FISH.

Le applicazioni rappresentative dimostrano come questo approccio possa fornire informazioni posizionali per specifiche popolazioni neuronali durante lo sviluppo. Questi esperimenti indicano che alcuni trascrivi, come quelli bruschi, possono essere rilevati prima con HCR-FISH rispetto a colorazione di anticorpi o linee di segnalazione. Vengono inoltre discusse potenziali sfide, strategie di risoluzione dei problemi e applicazioni di HCR-FISH per lo studio dello sviluppo dei sistemi visivi in Drosophila .

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti con Drosophila melanogaster sono stati condotti in conformità con le linee guida del City College of New York, della Columbia University e della New York University per la cura e l'uso degli organismi di ricerca. Gli strumenti di ricerca utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparare i buffer

NOTA: Preparare tutti i reagenti in tubi privi di nucleasi utilizzando punte di filtro.
NOTA: Indossa i guanti durante tutta la procedura. Pulire le superfici di lavoro con la soluzione di decontaminazione RNase prima di iniziare.

  1. Prepara soluzioni prive di nucleasi
    1. Prepara 1x PBS-T diluendo 20x PBS, Triton X-100 e glicina in acqua priva di nucleasi a concentrazioni finali di 1x PBS, 1% (v/v) Triton X-100 e 1 mM glicina.
    2. Prepara 5 SSCT diluendo 20x SSC e Tween-20 in acqua priva di nucleasi per preparare 5x SSC contenente 0,1% (v/v) Tween-20.
    3. Diluire 20x PBS in acqua senza nucleasi per preparare 1x PBS.

2. Sonde di progettazione

  1. Per progettare sonde commercialmente, si seleziona l'isoforma di interesse per la specie di interesse e ordina le sonde abbinate all'amplificatore desiderato utilizzando l'interfaccia web del fornitore.
    NOTA: Le chimiche commerciali delle sonde HCR e le sequenze di iniziatore sono proprietarie e brevettate da Molecular Instruments.
    1. Modifica la regione target nell'interfaccia web se si desidera il rilevamento specifico per il trascritto o pre-mRNA.
    2. Ordina circa 20 sonde per trascrizioni altamente espresse. Utilizzare fino a 40 sonde per trascritti a bassa abbondanza in preparazioni intere di Drosophila .
      NOTA: Ordina oligos specializzati per trascrizioni più brevi che contengono meno siti di legame delle sonde.
  2. Per progettare le sonde manualmente, scarica la sequenza FASTA per la trascrizione target. Determina se colpire una singola isoforma o tutte le isoforme del gene.
    NOTA: Dare priorità agli esoni costitutivi o alle isoforme altamente espresse identificate dai dataset di sequenziamento dell'RNA per migliorare il segnale.
    1. Se si progettano sonde per il rilevamento pre-mRNA, si progettano sonde che attraversano giunzioni intron-esone. Progetta sonde che attraversino giunzioni di giunzione per rilevare trascrizioni mature. Utilizzare sonde introniche per rilevare i trascrizioni nascenti all'interno dei nuclei.
      NOTA: Le sonde introniche potrebbero non colocalizzare con i trascritti citoplasmatici maturi e potrebbero richiedere marcatori aggiuntivi per l'identificazione cellulare.
    2. Determina la dimensione del set della sonda. Utilizzare almeno circa 5 sonde per trascrizioni brevi quando non possono essere progettati set di sonde più grandi. Utilizzare 20 sonde per applicazioni standard e circa 40 sonde per una sensibilità ottimale nei campioni a montaggiointero 18,23.
    3. Se progetti le tue sonde, usa sequenze da 25nt separate da uno spaziatore a 2bp e aggiungi sequenze di iniziatore divisi all'estremità 5' di ogni oligo.
      NOTA: Sebbene le sequenze di iniziatore diviso di prima generazione siano disponibili pubblicamente, le sequenze di iniziatore commerciali di nuova generazione sonoproprietarie 18.
    4. Se progetti le tue sonde, valida le sequenze delle sonde. Assicurati che le sonde all'interno di ogni set abbiano temperature di fusione simili. Conferma il 100% di identità tra le sonde.
      NOTA: Evitare regioni fortemente ricche di G e mantenere un contenuto di GC simile tra lesonde 24. Minimizzare le sequenze ripetitive e valutare il legame fuori bersaglio usando BLAST25.
    5. Utilizzare software di progettazione delle sonde disponibile pubblicamente quandoappropriato 26,27.
      NOTA: Gli strumenti di progettazione open source potrebbero non riprodurre le prestazioni ottimizzate delle pipeline commerciali di progettazione di sonde.

3. Dissezionare, fissare e preibridizzare i cervelli

  1. Buffer di ibridazione della sonda preriscaldata fino a 37 °C.
    ATTENZIONE: Il buffer di ibridazione della sonda contiene formamide. Maneggiare sotto una cappa chimica indossando l'attrezzatura di protezione individuale adeguata.
  2. Diluire ogni sonda impostata a una concentrazione finale di 1 μM utilizzando acqua distillata senza nucleasi.
  3. Aliquota circa 250 μL di PBS privo di nucleasi su un piatto dissezionante.
  4. Trasferire una larva errante del terzo stadio nel PBS usando la pinza. Tieni l'addome con una pinza e afferra i ganci della bocca con un secondo paio. Allontana i ganci della bocca dal corpo per isolare il cervello e il cordone nervoso ventrale (VNC).
  5. Rimuovere i corpi grassi e le ghiandole salivari mantenendo il VNC. Trasferire cervelli dissezionati in un tubo contenente 600 μL di PBS freddo e privo di nucleasi.
    NOTA: Tieni i lobi ottici sommersi durante tutta la dissezione per evitare l'asciugatura dei tessuti.
  6. Ripetere la dissezione fino a raccogliere circa sei lobi ottici. Completare le dissezioni entro 20 minuti per minimizzare la degradazione del tessuto.
  7. Aggiungere 200 μL di paraformaldeide (PFA) al 16% per ottenere una concentrazione finale del 4% di PFA. Inverti delicatamente il tubo per mescolarlo e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
    ATTENZIONE: Il PFA è tossico e mutagenico. Maneggiare sotto una cappa chimica mentre si indossano i guanti.
  8. Rimuovere il fissativo dai campioni e depositarlo come rifiuto chimico designato. Lavare i campioni tre volte con 600 μL di PBS freddo privo di nucleasi, utilizzando una piastra dissezionante per raccogliere le soluzioni di lavaggio.
    NOTA: Ispezionare le soluzioni di lavaggio per la perdita di tessuto e recuperare eventuali cervelli spostati al microscopio dissezionale.
  9. Trasferire i cervelli in un tubo PCR contenente 100 μL di buffer di ibridazione della sonda preriscaldato.
    Mescola delicatamente facendo sbattere il tubo e incuba per 10 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Assicurati che il cervello rimanga sommerso e non aderisca alle pareti dei tubi.

4. Ibridazione delle sonde

  1. Prepara una soluzione di sonda da 4 nM aggiungendo 0,4 pmol di ciascuna sonda impostata al Probe Hybridization Buffer per un volume finale di 100 μL.
    NOTA: Aumentare la concentrazione della sonda fino a 16 nM se l'intensità del segnale è bassa nelle colorazioni iniziali.
  2. Rimuovere il buffer di preibridazione senza disturbare il tessuto. Aggiungi la soluzione di sonda diluita a ogni campione.
  3. Incubare i campioni a 37 °C su un nutatore per 16–24 ore.

5. Amplificare il segnale della sonda

  1. Porta il buffer di amplificazione a temperatura ambiente. Preparare circa 200 μL di buffer di amplificazione per campione.
  2. Equilibra il buffer di lavaggio. Riscaldare il tampone con sonda a 37 °C usando un bagno d'acqua.
    ATTENZIONE: Il buffer di lavaggio della sonda contiene formamide. Maniglia sotto una cappa chimica.
  3. Rimuovi la soluzione della sonda e conserva a -20 °C per il riutilizzo.
    NOTA: Riutilizzare le soluzioni della sonda finché l'intensità della colorazione non diminuisce.
  4. Lavare i campioni quattro volte per 10 minuti ciascuno in un tampone di lavaggio a sonda preriscaldato a 37 °C. Lava i campioni due volte per 5 minuti ciascuno in SSCT a temperatura ambiente 5x.
  5. Aggiungi 100 μL di buffer di amplificazione senza forcini di capelli. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
  6. Riscalda un termociclatore a 95 °C. Aggiungi 2 μL di ciascun calcio a forno da 3 μM per separare i tubi PCR. Prepara un tubo per ogni specie di forcino.
    NOTA: Aumentare la concentrazione dell'amplificatore se la colorazione produce punti radi o un basso rapporto segnale-rumore.
  7. Incubare le forcine a 95 °C per 90 secondi. Proteggi i tubi dalla luce e incuba a temperatura ambiente per almeno 30 minuti.
  8. Prepara la soluzione di amplificazione. Combinare le forcine nell'Amplification Buffer per un volume finale di 100 μL per campione.
  9. Rimuovere il buffer di amplificazione dai campioni. Aggiungi un buffer di amplificazione contenente forcina per capelli.
    Incubare tutta la notte a temperatura ambiente su un nutator protetto dalla luce (avvolto in alluminio).
  10. Rimuovi la soluzione di amplificazione. Lava i campioni due volte per 5 minuti in 150 μL di 5x SSCT. Lava i campioni tre volte per 10 minuti in 150 μL di 5x SSCT su un nutator. Eseguire due brevi lavaggi in PBS senza nucleasi per rimuovere il detersivo.

6. Montare cervelli per l'imaging

  1. Attacca un adesivo per immagini distanziante a una vetrina di vetro. Premi delicatamente con la parte inferiore di una pinza per rimuovere le bolle d'aria intrappolate.
  2. Taglia il cervello attraverso il cordone nervoso ventrale usando una pinza.
  3. Metti il cervello al centro del pozzo distanziatore. Orientare il tessuto lateralmente con il lobo ottico rivolto verso l'alto.
  4. Aggiungere un mezzo di montaggio antifade sufficiente (circa 25 μL) per riempire il pozzo senza introdurre bolle d'aria. Distribuisci il mezzo di montaggio in modo uniforme usando la pinza.
  5. Metti un sottoveste sopra il campione e sigilla con lo smalto.

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Risultati

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Per gli scienziati che studiano la neurobiologia dello sviluppo, HCR-FISH offre un metodo robusto per visualizzare i modelli di espressione genica e determinare le posizioni spaziali dei neuroni in sviluppo all'interno del lobo ottico di Drosophila .

Nel lobo ottico di Drosophila (Figura 2A), i neuroni all'interno del neuropilo midollaro derivano da cellule staminali neurali (neuroblasti) derivate da un neuroepit...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio descrive un adattamento di HCR-FISH per l'uso nel lobo ottico larvale di Drosophila melanogaster . Gli approcci convenzionali di ibridazione in situ spesso funzionano male nel tessuto cerebrale larvale intero a causa della penetrazione limitata della sonda e della bassa intensità del segnale. Il protocollo qui presentato ottimizza diversi passaggi critici per migliorare la qualità della colorazione nel lobo ottico in sviluppo. Le condizioni di fissazione c...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Claude Desplan per aver fornito accesso alle sonde HCR-FISH di Molecular Instruments e al dpp-GAL4; Linea di mosca UAS-Stinger. Gli autori ringraziano inoltre Aneesh Acharya e Harry Choi di Molecular Instruments per i feedback tecnici e le discussioni riguardanti l'implementazione di HCR-FISH. Questo protocollo è stato adattato da metodologie HCR-FISH precedentemente pubblicate e non pubblicate sviluppate da MegYounger 22 anni, Hunter Whitbeck, Bogdan Sieriebriennikov, Amanda Araujo Gomes Ferreira, Yen-Chung Chen e Yanqiqi Zeng. Bogdan Sieriebriennikov è stato sostenuto dal Programma di Scienza della Frontiera Umana (LT000010/2020-L). Jennifer Malin è stata sostenuta dalla sovvenzione R00 dei National Institutes of Health EY032269.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10% Tween-20Bio-Rad Laboratories1662404NA
20x PBS, pH7.4Growcells.comMRGF-63962,74M NaCl, 53,7 mM KCl, 20,3 mM Na2HPO4, 29,4 mM KH2PO4 
20x SSCQuality Biological351-003-1313M NaCl, 0,3M Sodium Citrate
37 °C incubatorFisher Scientific (Isotemp)15-015-2633NA
37 °C water bathFisher ScientificFSGPD15DNA
Aluminum foilReynolds Wrap/Fisher Brand15-078-291NA
Antibody: Mouse-anti-AbruptDSHBAbrupt; RRID: AB_528344 Dilution: 1:20
Antibody: Chicken anti-GFPMillipore SigmaCatalog# 06-896; RRID: AB-619712Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-GFPLife Technologies#11122; RRID: AB_221569Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-DllGenscript/Desplan lab-Dilution: 1:200
Antibody: Rat anti-NCadherinDSHBDN-Ex #8, RRID: AB_528121Dilution: 1:50
Antibody: Rabbit anti-SoxNGenscript/Desplan lab-Dilution: 1:200
Antibody: Guinea Pig anti-Traffic jamGift from D. Godt-Dilution: 1:2.000
Antibody: Donkey anti-Rat 405Jackson ImmunoResearchCode # 712-475-150; RRID: AB_2340680Dilution: 1:100
Antibody: Donkey anti-Chicken 488Jackson ImmunoResearchCode #703-545-155; RRID: AB_2340375Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Mouse 488Jackson ImmunoResearchCode #715-545-151; RRID: AB_2341099Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit 488Jackson ImmunoResearchCode #711-545-152; RRID: AB_2313584Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit A555Thermo ScientificCatalog #A-31572; RRID: AB_162543Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat Cy3Jackson ImmunoResearchCode #712-165-153; RRID: AB_2340667Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Guinea Pig 647Jackson ImmunoResearchCode #706-605-148; RRID: AB_2340476Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat 647Jackson ImmunoResearchCode #712-605-153; RRID: AB_2340694Dilution: 1:200
Antifade mountantThermo Fisher ScientificS36940 (SlowFade Gold Antifade Mountant)Other slowfades will work as well, including ones with DAPI (S36936)
Confocal MicroscopeZeissLSM-880NA
Cover slips (22 x 30)VWR16004-332NA
Fly: D. melanogaster: ab-GFP-FLAGBDSC38626; RRID: BDSC_38626NA
Fly: D. melanogaster: Canton SBDSC64349; RRID: BDSC_64349NA
Fly: D. melanogaster: dpp-Gal4BDSC1553; RRID: BDSC_1553NA
Fly: D. melanogaster: ham-GFP.FPTBBDSC83660; RRID: BDSC_83660NA
Fly: D. melanogaster: yw; 10xUAS-myr-GFP;BDSC32198; RRID: BDSC_32198NA
Fly: D. melanogaster: UAS-StingerBDSC84277; RRID: BDSC_84277NA
Fly: D. melanogaster:  wit-KO-Gal4BDSC600136; RRID: BDSC_600136NA
ForcepsDumont#5 or #55sNA
Glass slidesVWR16005-106NA
GlycineMillipore SigmaG7126-10MGNA
HCR Amplification bufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitNA
HCR-Gold AmplifiersMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitNA
HCR HiFi ProbesMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitNA
HCR Probe Hybridization BufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitContains formamide
HCR Probe Wash BufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitContains formamide
Nail polish (clear)Electron Microscopy Sciences72180NA
Nuclease-free water (not DEPC-treated)Thermo Fisher ScientificAM9937NA
Nutating mixerCorning/Fisher Scientific10-320-100NA
Paraformaldehyde, 16% (w/v)Electron Microscopy Sciences15710Toxic
PCR Machine/Thermal CyclerBio-Rad1851148 (C1000 Touch Thermal Cycler)NA
PCR pull-apart tube strips with dome cap strips (0.2 mL) USA Scientific#1402-2400NA
Petri dishes (150 x 15 mm; for making dissecting dishes)Fisher ScientificFB0875714NA
RNase ZAPThermoFisher ScientificAM9780NA
Slide spacer stickersSUNJinIS016 (iSpacer stickers (0,2 mm deep))NA
Sylgard elastomer kit (for making dissecting dishes)Fisher ScientificNC9285739NA
Triton X-100Merck Millipore SigmaX100NA

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