Piattaforma di nano-attuazione magnetica per la meccanostimolazione remota e controllabile di cellule di Schwann con imaging confocale in tempo reale

Yang Wang; Ting Liu; Mingxi Yang; Chong Qi; Bin Liu

doi:10.3791/71685

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Piattaforma di nano-attuazione magnetica per la meccanostimolazione remota e controllabile di cellule di Schwann con imaging confocale in tempo reale

83 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/71685

⸱

8 settembre 2026

Yang Wang¹^,² , Ting Liu³ , Mingxi Yang¹^,² , Chong Qi⁴ , Bin Liu¹^,²

¹Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, ²Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, ³International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin University, ⁴Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta una piattaforma di nanoattuazione magnetica compatibile con il microscopio, che integra nanoparticelle superparamagnetiche fluorescenti, un elettromagnete calibrato e un'immagine confocale in tempo reale per stimolare a distanza e in modo controllato le cellule di Schwann e monitorare dinamicamente le loro risposte meccanosensoriali.

Abstract

Le forze meccaniche regolano in modo critico il comportamento cellulare, tuttavia molti metodi esistenti di stimolazione meccanica si basano su contatto fisico diretto o su ambienti extracellulari artificialmente ingegnerizzati, limitandone così la flessibilità negli studi dinamici su cellule vive. In questo lavoro presentiamo una piattaforma di nanoattuazione magnetica per la meccanostimolazione a distanza, senza contatto e controllabile di cellule di Schwann in vitro. Questa configurazione integrata consente stimolazione magnetica remota e imaging in tempo reale su cellule vive sincronizzati nella stessa sessione sperimentale. Il manoscritto descrive la preparazione di nanoparticelle superparamagnetiche fluorescenti (SPIONs), opzionalmente funzionalizzate per il targeting dell’actina (f-SPIONs), la costruzione e la calibrazione di un dispositivo elettromagnetico compatibile con il microscopio, la stima delle forze magnetiche a livello di singola particella e di singola cellula, e l’integrazione dell’attuazione magnetica con imaging confocale in tempo reale. Le cellule di Schwann sono cellule gliali altamente meccanosensibili che svolgono ruoli essenziali nello sviluppo, nel mantenimento e nella riparazione dei nervi periferici. Il monitoraggio in tempo reale delle loro risposte alla stimolazione meccanica è fondamentale per comprendere come le forze meccaniche influenzino l’organizzazione del citoscheletro e il comportamento cellulare. Questa piattaforma fornisce un flusso di lavoro riproducibile per lo studio della meccanobiologia delle cellule di Schwann e potrebbe essere adattata ad altri tipi cellulari meccanoresponsivi e a sistemi multicellulari.

Introduzione

I segnali meccanici regolano un'ampia gamma di processi cellulari, tra cui adesione, migrazione, proliferazione, differenziazione e plasticità fenotipica¹^,²^,³. Studi in meccanobiologia hanno dimostrato che sia i neuroni che le cellule gliali mostrano una marcata meccanosensibilità e capacità di risposta durante lo sviluppo⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Per indagare come le cellule percepiscano e rispondano alle forze meccaniche, sono stati sviluppati diversi approcci sperimentali, tra cui la microscopia a forza atomica (AFM), l'aspirazione con micropipetta, le pinzette ottiche, i sistemi di coltura basati su stiramento e le piattaforme microfluidiche⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Queste tecniche hanno notevolmente avanzato lo studio della meccanotrasduzione. Tuttavia, molte richiedono un contatto fisico diretto con le cellule o dipendono da ambienti meccanici artificiali predefiniti, risultando meno adatte a stimolazioni remote, dinamicamente controllabili e compatibili con l'acquisizione di immagini.

La somministrazione di forze mediata da nanoparticelle magnetiche offre una strategia alternativa per la meccanostimolazione a distanza¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Poiché la maggior parte dei tessuti biologici presenta una bassa suscettibilità magnetica, i campi magnetici applicati esternamente possono penetrare i campioni biologici senza contatto diretto ed agire selettivamente su particelle sensibili al campo magnetico introdotte all'interno di cellule o tessuti. In presenza di un gradiente di campo magnetico, queste particelle subiscono forze direzionali che possono essere utilizzate per indurre perturbazioni meccaniche a livello subcellulare, cellulare o tissutale⁸^,⁹. Questo approccio risulta interessante perché è senza contatto, regolabile, compatibile con l'immagine in tempo reale su campioni vivi e potenzialmente estendibile a sistemi biologici più complessi.

Le cellule di Schwann sono cellule gliali altamente meccanosensibili¹⁹^,²⁰ che svolgono ruoli fondamentali nello sviluppo, nel mantenimento e nella riparazione dei nervi periferici²¹^,²². L'osservazione dinamica delle risposte delle cellule di Schwann alla stimolazione fisica è importante per comprendere come le forze regolino l'organizzazione del citoscheletro e il comportamento cellulare. Tuttavia, molti sistemi convenzionali di applicazione della forza non sono facilmente compatibili con la microscopia in tempo reale ad alta risoluzione. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato una piattaforma di nanoattuazione magnetica che combina superparticelle magnetiche fluorescenti (f-SPIONs) mirate all'actina del citoscheletro, un dispositivo elettromagnetico personalizzato compatibile con lo stage di un microscopio confocale e un framework quantitativo per la stima della forza. Questa configurazione integrata consente stimolazione magnetica a distanza e imaging in tempo reale sincronizzato nella stessa sessione sperimentale.

Il flusso di lavoro descritto in questo articolo comprende la preparazione di superparticelle magnetiche fluorescenti (SPIONs), la funzionalizzazione opzionale mirata all'actina mediante phalloidina per generare f-SPIONs, la caratterizzazione delle nanoparticelle, la costruzione del dispositivo elettromagnetico e la calibrazione del campo, la stima della forza magnetica e la stimolazione magnetica combinata con imaging confocale in tempo reale. Sebbene ottimizzato qui per cellule di Schwann, la piattaforma potrebbe fornire un quadro pratico per studi analoghi in altri sistemi viventi meccanicamente sensibili.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Gli esperimenti descritti in questo protocollo hanno utilizzato una linea cellulare di Schwann di ratto ben caratterizzata (RSC96) e non hanno coinvolto partecipanti umani né animali vivi. Questo studio è stato condotto nell'ambito di un progetto di ricerca più ampio che prevedeva esperimenti sugli animali, approvato dal Comitato per il Benessere e l'Etica Animale del Primo Ospedale dell'Università Jilin (Numero di approvazione: 2022-0045).

1. Preparazione di superparticelle magnetiche fluorescenti

Sintetizzare nanoparticelle di Fe₃O₄ rivestite con acido oleico.
NOTA: Le nanoparticelle di Fe₃O₄ rivestite con acido oleico sono state sintetizzate mediante decomposizione termica come descritto in precedenza²⁰^,²³.
1. Aggiungere 2 mmol di Fe(acac)₃, 6 mmol di acido oleico, 6 mmol di oleylammina e 5 mmol di 1,2-esadecandiolo a 20 mL di etere benzilico in un pallone reattore.
2. Agitare la miscela sotto atmosfera di azoto per 15 minuti fino a ottenere una soluzione precursore omogenea.
3. Riscaldare la miscela a 200 °C con una velocità di 20 °C/min.
4. Mantenere la reazione a 200 °C per 30 minuti.
5. Aumentare la temperatura a 265 °C e riflussare la miscela per 30 minuti.
6. Lasciare raffreddare naturalmente la miscela di reazione fino alla temperatura ambiente.
7. Raccogliere le nanoparticelle di Fe₃O₄ mediante separazione magnetica.
8. Lavare le nanoparticelle 3 volte con etanolo.
9. Ridisperdere le nanoparticelle purificate in toluene.
Assemblare superparticelle di Fe₃O₄·Cy3.5.
NOTA: Le superparticelle di Fe₃O₄·Cy3.5 sono state preparate come descritto in precedenza²⁰^,²⁴^,²⁵.
1. Disperdere 28 mg di nanoparticelle di Fe₃O₄ rivestite con acido oleico in 4 mL di toluene in un pallone rotondo da 50 mL a tre collo.
2. Preparare una fase acquosa contenente 12,5 mg di sodio dodecilsolfato e 3 mg di Cyanine 3.5 (Cy 3.5) in 12,5 mL di acqua.
3. Combinare la sospensione di nanoparticelle di Fe₃O₄ in toluene (28 mg in 4 mL; 7 mg/mL) con la soluzione acquosa di tensioattivo/colorante per formare una microemulsione olio-in-acqua.
4. Mescolare accuratamente fino a ottenere un'emulsione stabile.
5. Riscaldare il pallone rotondo a tre collo a 60 °C e agitare continuamente a 300 giri/min per 6 ore.
  NOTA: Non è richiesta alcuna procedura di evaporazione sotto vuoto ridotto o con evaporatore rotante.
6. Evaporare il toluene nelle condizioni descritte sopra per indurre l'aggregazione delle nanoparticelle di Fe₃O₄. Trasferire, mediante una pipetta monouso, un piccolo aliquota della soluzione in un tubo da prova e lasciarla in riposo. L'assenza di separazione di fase indica che il toluene è stato completamente rimosso.
7. Trasferire la sospensione di superparticelle di Fe₃O₄·Cy3.5 in provette da centrifuga da 15 mL. Centrifugare a 2.370 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per raccogliere le superparticelle, e scartare con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet.
8. Ridisperdere il pellet in acqua deionizzata ultrapura e centrifugare nuovamente a 2.370 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il soprannatante e ripetere la procedura di lavaggio per tre volte per rimuovere il colorante Cy3.5 libero residuo e il sodio dodecilsolfato.
Rivestire le superparticelle con polidopamina (PDA).
NOTA: Le superparticelle rivestite con polidopamina sono state preparate come descritto in precedenza²⁰^,²⁶.
1. Centrifugare la sospensione di superparticelle di Fe₃O₄·Cy3.5 a 2.370 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e scartare il soprannatante.
2. Ridisperdere il pellet in tampone Tris 10 mM (pH 8,5).
3. Aggiungere 26 mg di monomero di dopamina alla sospensione.
4. Agitare la miscela a temperatura ambiente per 3 ore in condizioni alcaline.
5. Centrifugare la sospensione a 2.370 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
6. Rimuovere il soprannatante e ridisperdere il pellet in acqua ultrapura per ottenere le particelle di Fe₃O₄·Cy3.5@PDA (SPIONs).
Eventualmente funzionalizzare le particelle con phalloidina-Alexa Fluor 350.
NOTA: Le superparticelle sono state funzionalizzate superficialmente utilizzando phalloidina-Alexa Fluor 350 disponibile in commercio²⁰.
1. Preparare 5 mL di soluzione acquosa contenente 100 unità di phalloidina-Alexa Fluor 350.
2. Aggiungere alla soluzione 200 µL di sospensione di Fe₃O₄·Cy3.5@PDA contenente 2 mg di particelle.
3. Agitare delicatamente la miscela a temperatura ambiente per 24 ore.
4. Centrifugare la miscela a 2.370 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
5. Scartare il soprannatante e ridisperdere il pellet in acqua deionizzata.
6. Conservare la formulazione finale di Fe₃O₄·Cy3.5@PDA@phalloidina (f-SPIONs) al riparo dalla luce fino all'uso.

2. Caratterizzazione delle nanoparticelle

Determinare la morfologia e le dimensioni.
1. Preparare campioni di nanoparticelle per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) o per la microscopia elettronica a trasmissione ad alta risoluzione (HRTEM) secondo i requisiti dello strumento.
2. Acquisire immagini per determinare la morfologia complessiva delle particelle, la struttura nucleo-guscio e il diametro medio (Figura 1).
3. Preparare sospensioni acquose di nanoparticelle per la diffusione dinamica della luce (DLS).
4. Misurare il diametro idrodinamico e l'indice di polidispersità (PDI).
5. Confrontare i risultati ottenuti con microscopia elettronica e DLS per valutare l'uniformità della formulazione e il comportamento colloidale.
Determinare le proprietà magnetiche.
1. Preparare campioni di nanoparticelle essiccati o concentrati adatti all'analisi mediante dispositivo di interferenza quantistica a superconduttore (SQUID).
2. Registrare le curve di isteresi magnetica a 300 K.
3. Determinare la magnetizzazione di saturazione, la remanenza e la coercitività.
4. Verificare che le particelle mostrino un comportamento superparamagnetico con remanenza e coercitività trascurabili.
Determinare le proprietà fluorescenti.
1. Preparare una sospensione di f-SPION in acqua deionizzata ultrapura e trasferire la sospensione in una cuvetta di quarzo.
2. Registrare gli spettri di fotoluminescenza utilizzando un fluorimetro.
3. Verificare che il segnale fluorescente rimanga rilevabile dopo il lavaggio e la risospensione.
Convalidare la localizzazione associata all'actina quando si utilizza la formulazione mirata.
1. Acquisire cellule RSC96.
  NOTA: Le cellule RSC96 utilizzate in questo studio, una linea cellulare di cellule di Schwann di ratto trasformata spontaneamente ottenuta mediante coltura prolungata di cellule di Schwann primarie di ratto, sono state ottenute dalla Cell Bank dell'Accademia Cinese delle Scienze, Shanghai, Cina (CSTR: 19375.09.3101RATGNR6) e sono risultate negative per contaminazione da micoplasma e funghi. Sono state utilizzate cellule comprese tra il 3° e il 10° passaggio.
2. Coltivare le cellule in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e con soluzione di penicillina-streptomicina al 1% (100 U/mL di penicillina e 100 µg/mL di streptomicina).
3. Sezionare le cellule RSC96 a una densità di 1 × 10⁵ cellule per piastra per microscopia cellulare da 35 mm e coltivarle per 24 h a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂ per consentire l'adesione cellulare.
4. Aspirare il mezzo di coltura esistente, lavare le cellule due volte con soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) e aggiungere mezzo di coltura completo contenente 15 µg/mL di f-SPION. Incubare le cellule con i f-SPION per 12 h.
5. Aspirare il mezzo di coltura e lavare le cellule due volte con PBS freddo contenente 1 mM di deferoxamina per rimuovere completamente le particelle non internalizzate.
6. Acquisire immagini confocali per valutare la distribuzione intracellulare delle particelle. Impostare i parametri di acquisizione su un pinhole di 1 unità Airy (AU) e un passo z di 0,43 µm per ottenere sezioni ottiche ad alta risoluzione delle strutture intracellulari.
7. Verificare se le particelle mostrano un arricchimento in regioni cellulari associate all'actina.

3. Costruzione e calibrazione del dispositivo di stimolazione elettromagnetica (Figura 2)

Assemblare il dispositivo elettromagnetico.
1. Costruire un sistema compatto di bobine elettromagnetiche dimensionato per adattarsi al piatto del microscopio confocale e alla camera per cellule vive (Figura 2A,B).
2. Collegare la bobina a un alimentatore regolabile o a una sorgente di corrente esterna.
3. Simulare numericamente l'ambiente di campo magnetico gradiente utilizzando COMSOL Multiphysics 4.3b (Figura 2C,D).
4. Verificare che l'elettromagnete generi il corrispondente campo magnetico gradiente (GMF) a diverse correnti di ingresso (Figura 2G).
Misurare la densità di flusso magnetico e calibrare il campo magnetico a gradiente.
1. Posizionare l'elettromagnete accanto alla piastra di coltura, con la punta del polo rivolta verso il centro della piastra e situata a 1 mm dalla parete esterna della piastra (Figura 2E,F).
2. Mantenere questa configurazione geometrica relativa tra l'elettromagnete e la piastra di coltura durante tutti i successivi esperimenti di stimolazione magnetica su cellule vive e di imaging.
3. Utilizzare un gaussmetro digitale per misurare la densità di flusso magnetico in posizioni predeterminate all'interno della regione di stimolazione, impiegando la griglia di posizionamento posta sul fondo della piastra di coltura come riferimento spaziale.
4. Calcolare il gradiente del campo locale a partire dalla variazione spaziale della densità di flusso magnetico.
5. Calibrare e validare il gradiente del campo magnetico simulato numericamente utilizzando i valori del gradiente del campo magnetico misurati sperimentalmente e calcolati.

4. Stima delle forze magnetiche erogate dalla piattaforma.

Definire il modello di stima della forza.
1. Utilizzare l'equazione della forza per nanoparticelle magnetiche in un campo magnetico non uniforme²⁷^,²⁸:
2. Sotto l'ipotesi di allineamento superparamagnetico con il campo applicato, semplificare l'equazione in
  $Diagramma dell'equazione della forza magnetica per il calcolo della dinamica delle SPION, che mostra $ F_{f-SPION} = m \frac{dB}{dr} $.$
  dove:
  F è la forza nanomagnetica
  m è il momento di dipolo magnetico
  è il gradiente del campo magnetico
  dB/dr è il gradiente del campo magnetico (T/m) generato dal corrispondente dispositivo di generazione del campo magnetico.
3. Utilizzare il gradiente di campo misurato dal dispositivo calibrato in tutti i calcoli.
Stimare la forza agente su una singola nanoparticella.
1. Determinare le dimensioni medie delle particelle a partire da immagini HRTEM.
2. Calcolare il volume del nucleo magnetico assumendo una geometria sferica.
3. Stimare il volume magnetico specifico di Fe₃O₄ in base alla frazione magnetica del nucleo.
4. Calcolare il momento di dipolo magnetico secondo
  dove:
  M_m rappresenta la magnetizzazione massica delle f-SPION (16 A·m²/kg) sotto l'intensità del campo data;
  ρ è la densità di Fe₃O₄ (5,24 g/cm³).
  V è il volume del nucleo magnetico di Fe₃O₄ all'interno di ciascuna f-SPION (5,89 × 10⁻¹⁷ cm³).
5. Moltiplicare il momento di dipolo per il gradiente di campo misurato per stimare la forza agente su una singola nanoparticella ( $FSPION statiche; formula $F_{f-SPION}$; concetto nell'analisi delle forze su nanoparticelle magnetiche.$ ).
Stimare l'assorbimento delle nanoparticelle per cellula di Schwann.
1. Sezionare cellule di Schwann RSC96 a 5 × 10⁵ cellule per pozzetto in piatti per coltura cellulare da 35 mm.
2. Incubare le cellule per 24 h in condizioni standard di coltura.
3. Sostituire il mezzo con mezzo fresco contenente 15 µg/mL di f-SPION.
4. Incubare le cellule per ulteriori 12 h.
5. Lavare le cellule due volte con soluzione salina tamponata al fosfato fredda contenente 1 mM deferoxamina.
6. Raccogliere e contare le cellule.
7. Misurare il contenuto intracellulare di ferro mediante spettroscopia di emissione atomica con plasma accoppiato inductivamente (ICP-AES).
8. Calcolare il numero di particelle internalizzate per cellula dividendo la massa media di ferro per cellula per la massa di ferro per particella .
Stimare la forza trasferita a una singola cellula di Schwann.
1. Calcolare la forza a livello cellulare secondo
  
  dove:
  $FSPION statiche; formula $F_{f-SPION}$; concetto nell'analisi delle forze su nanoparticelle magnetiche.$ è la forza magnetica esercitata su una singola f-SPION.
  è il numero di f-SPION internalizzate per cellula.
  F_cell è la forza magnetica esercitata su una singola cellula.
2. Indicare il valore risultante come stima della forza magnetica trasferita a una singola cellula di Schwann (F_cell).
3. Specificare chiaramente che il valore è una stima basata su modello e non una misurazione diretta della forza intracellulare.

5. Combinazione della stimolazione magnetica con l'immagine in tempo reale mediante microscopia confocale a scansione laser (CLSM)

Caricare le cellule di Schwann con nanoparticelle magnetiche.
1. Sezionare le cellule di Schwann in piatti di coltura ibidi compatibili con l’imaging o in camere di coltura microfluidiche.
2. Lasciare che le cellule aderiscano e si riprendano.
3. Sostituire il mezzo esistente con mezzo di coltura fresco contenente 15 µg/mL di f-SPIONs.
4. Incubare le cellule per 12 h per consentire il caricamento con f-SPIONs.
5. Verificare la morfologia cellulare prima di procedere.
Rimuovere le particelle non internalizzate.
1. Rimuovere il mezzo contenente le nanoparticelle.
2. Lavare le cellule due volte con PBS contenente 1 mM di deferoxamina.
3. Sostituire la soluzione di lavaggio con mezzo per cellule vive compatibile con l’imaging.
4. Verificare un basso fondo di particelle extracellulari prima dell’imaging.
Integrare il dispositivo elettromagnetico con il sistema di imaging CLSM.
1. Assemblare l’elettromagnete con la camera di coltura per cellule vive, posizionando l’elettromagnete nella sua posizione precalibrata.
2. Posizionare la camera di coltura per cellule vive assemblata sullo stage del microscopio confocale (Figura 3). Verificare che il piatto di coltura si trovi all’interno della regione efficace di stimolazione (Figura 3A).
3. Alimentare l’elettromagnete secondo i parametri preimpostati e verificare l’esposizione a un campo magnetico a gradiente efficace all’interno dell’area del piatto di coltura (Figura 3B).
4. Verificare che l’obiettivo del microscopio possa raggiungere il piano focale senza interferenze.
5. Verificare che il dispositivo non ostacoli il posizionamento dell’obiettivo o il movimento dello stage.
6. Considerando il calore generato durante il funzionamento dell’elettromagnete, regolare le impostazioni di temperatura dei componenti della camera per cellule vive in base alle condizioni di coltura ottimali predeterminate, per garantire un ambiente interno di 37 °C e 5% CO₂ (Figura 3C).
7. Verificare che l’intero sistema funzioni in modo normale e stabile.
Imaging funzionale del Ca²⁺ in cellule vive.
1. Incubare le cellule con soluzione di Krebs–Ringer (pH 7.4) contenente 3 µM di Fluo-4 AM e 0,1% di Pluronic F-127 a 37 °C per 30 min.
2. Dopo l’incubazione, lavare le colture due volte con PBS e trasferirle sulla piattaforma di imaging per cellule vive del sistema CLSM per l’acquisizione delle immagini (Figura 4A).
3. Utilizzando la griglia di posizionamento sul fondo del piatto di coltura ibidi, acquisire immagini di cinque posizioni predefinite.
4. Dividere ogni campo di imaging in 25 regioni uguali e selezionare da 0 a 3 cellule per ogni regione per la quantificazione della fluorescenza, in base alla densità cellulare effettiva all’interno di quella regione.
5. Definire il contorno completo di una singola cellula come regione di interesse (ROI) e monitorare la risposta al calcio indotta magneticamente analizzando le variazioni dell’intensità di fluorescenza (ΔF) all’interno dell’ROI.
6. Calcolare la variazione dell’intensità di fluorescenza come ΔF = (F_stim- F₀). Considerare un evento di risposta al calcio un cambiamento dell’intensità di fluorescenza prima e dopo la stimolazione (ΔF/F₀) superiore al 10%.
  NOTA: F_unstim rappresenta l’intensità di fluorescenza prima della stimolazione con forza magnetica, F₀ rappresenta l’intensità di fluorescenza di base e F_stim rappresenta l’intensità di fluorescenza evocata dopo la stimolazione con forza magnetica.
7. Per la correzione del fondo, sottrarre dall’intensità di fluorescenza di ciascun ROI il valore medio dell’intensità di fluorescenza di fondo misurato in una regione priva di cellule.
8. Eseguire tre esperimenti indipendenti, includendo un piatto di coltura in ciascun esperimento.
Eseguire imaging in time-lapse e applicare stimolazione magnetica durante l’acquisizione.
1. Impostare i parametri di imaging in time-lapse come segue: un intervallo di acquisizione di 2,1 s per fotogramma, una durata totale di acquisizione di 650 s e imaging ottico a sezione standard ad alta risoluzione utilizzando 1 AU.
2. Durante l’imaging cellulare, acquisire immagini continuamente per 50 s senza alimentazione elettrica per registrare l’intensità di fluorescenza del calcio intracellulare in assenza di stimolazione con forza magnetica (F_unstim) (Figura 2H e Figura 4B).
3. Normalizzare l’intensità di fluorescenza registrata nei primi 50 s e definirla come intensità di fluorescenza di base (F₀).
4. Successivamente, applicare un’alimentazione elettrica costante di 3,0 A all’elettromagnete, esponendo le cellule di Schwann caricate con nanoparticelle magnetiche a un campo magnetico a gradiente di 3,25 T/m e sottoponendole così a stimolazione con forza magnetica. Continuare l’imaging in time-lapse per 10 min per registrare l’intensità di fluorescenza del calcio intracellulare durante la stimolazione con forza magnetica (F_stim) (Figura 2H e Figura 4C).
5. Calcolare quantitativamente la variazione dell’intensità di fluorescenza come ΔF/F₀ (Figura 4D,E).
Eseguire l’analisi statistica e analizzare i dati di fluorescenza del Ca²⁺.
1. Per ogni cellula, calcolare il valore mediano di ΔF/F₀ lungo la serie temporale analizzata e utilizzare questo valore come parametro di risposta al Ca²⁺ a livello cellulare.
2. Eseguire tre esperimenti indipendenti per ciascuna condizione sperimentale, con un piatto di coltura per condizione in ciascun esperimento. Raggruppare le cellule analizzate nei tre esperimenti indipendenti per la presentazione descrittiva e riportare n come numero totale di cellule analizzate in ciascun gruppo.
3. Valutare la normalità dei dati di ΔF/F₀ a livello cellulare mediante il test di Kolmogorov-Smirnov.
4. Poiché i dati di risposta della fluorescenza del Ca²⁺ non sono distribuiti normalmente, presentare i dati come mediana e intervallo interquartile (IQR).
5. Analizzare le differenze tra i gruppi utilizzando il test non parametrico di Friedman, seguito da test di Wilcoxon per confronti a coppie, come precedentemente descritto.
6. Considerare P < 0,05 indicativo di significatività statistica.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

La microscopia elettronica a trasmissione ad alta risoluzione (HRTEM) ha mostrato che la formulazione finale delle nanoparticelle possedeva un nucleo magnetico aggregato e uno strato esterno dopo la modifica della superficie (Figura 1). I f-SPIONs finali avevano un diametro medio complessivo di 63,36 ± 16,65 nm, con un nucleo magnetico ricco di Fe₃O₄ di circa 56,60 ± 6,19 nm e uno strato esterno composto da polidopamina e falloidina-Alexa Fluor 350 con uno spessore medio di circa 5,79 ± 1,36...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

I nanoparticelle di ossido di ferro sono ampiamente riconosciute come nanomateriali magnetici con favorevole biocompatibilità. In quanto agenti di contrasto per imaging a risonanza magnetica ampiamente utilizzati, le nanoparticelle superparamagnetiche di Fe₃O₄ sono state ampiamente applicate nella diagnostica clinica mediante imaging²⁹^,³⁰. In uno studio recente del nostro gruppo²⁰, si è dimostrato che le f-SPIONs esibiscono una citotossici...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in conflitto.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation of China (numeri di concessione 82571677 e 82001304 a Y.W.), dal Special Program for Medical and Health Care Talents in Jilin Province (numero di concessione JLSRCZX2025-134 a Y.W.) e dal Bethune Program Project di Jilin University (numero di concessione 2024B19 a Y.W.). Gli autori ringraziano il College of Chemistry di Jilin University (State Key Laboratory of Supramolecular Structure and Materials) e l'Istituto di Chimica Applicata di Changchun, Accademia Cinese delle Scienze, per l'assistenza nella progettazione, sintesi e caratterizzazione dei nanomateriali. Gli autori ringraziano inoltre l'Istituto di Medicina Traslazionale del Primo Ospedale di Jilin University per l'assistenza nelle immagini CLSM.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1,2-esadecandiolo	Sigma-Aldrich	213748	Grado tecnico, 90%; utilizzato nella sintesi per decomposizione termica
35 mm ibidi µ-piastre	ibidi	80156	Utilizzato per la coltura cellulare e l'immagine delle cellule di Schwann
Etere benzilico	Sigma-Aldrich	108014	98%; solvente per Fe₃O₄ sintesi di nanoparticelle
Microscopio confocale a scansione laser	Nikon	AXR (Ti2-E)	Utilizzato per l'immagine di cellule vive e l'immunofluorescenza
Elettromagnete personalizzato	Personalizzato	N/A	Elettromagnete unipolare compatto per la generazione di campi magnetici gradienti in vitro
Acido cianina3.5 carbossilico	Duofluor Inc.	D10128	Colorante fluorescente utilizzato per Fe₃O₄·Assemblaggio di superparticelle Cy3.5; PM 593,20; conservare a -20 °C, protetto dalla luce
Sale di mesilato di deferoxamina	Sigma-Aldrich	D9533	Agente chelante del ferro utilizzato per rimuovere il ferro non internalizzato e associato alla membrana
Gaussmetro digitale	CAMPO MAGNETICO AMPIO	WT103	Utilizzato per misurare la densità di flusso magnetico e calibrare il campo magnetico gradiente generato dall'elettromagnete personalizzato
Cloridrato di dopamina	Sigma-Aldrich	H8502	≥98% (TLC); utilizzato per il rivestimento di polidopamina
Strumento per la diffusione dinamica della luce	Malvern Instruments	Zetasizer Nano-ZS	Utilizzato per la misurazione del diametro idrodinamico e del PDI
Fluo-4 AM	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	F14201	Indicatore del calcio utilizzato per la rilevazione del calcio in cellule vive²⁺ imaging
Spettrofotometro a fluorescenza	Shimadzu	RF-6000	Utilizzato per la caratterizzazione della fotoluminescenza
Microscopio elettronico a trasmissione ad alta risoluzione	JEOL	JEM-F200	Utilizzato per l'immagine HRTEM della morfologia delle nanoparticelle e del nucleo–struttura a guscio
Spettrometro atomico ad emissione con plasma accoppiato induttivamente	PerkinElmer	Optima 3300 DV	Utilizzato per la quantificazione del ferro intracellulare
Acetilacetonato di ferro(III), Fe(acac)₃	Sigma-Aldrich	F300	97%; precursore per Fe₃O₄ sintesi di nanoparticelle
Incubatore per cellule vive da posizionare sul palchetto del microscopio	TOKAI HIT	TENP&CO₂	Utilizzato per l'immagine confocale di cellule vive durante la stimolazione magnetica
Acido oleico	Sigma-Aldrich	O1008	≥99% (GC); ligando di superficie per Fe₃O₄ sintesi di nanoparticelle
Oleylamine	Sigma-Aldrich	O7805	Grado tecnico, 70%; ligando per la sintesi di nanoparticelle
Falloidina–Alexa Fluor 350	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	A22281	Reagente opzionale per la funzionalizzazione mirata all'actina
Pluronic F-127	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	P3000MP	Utilizzato per facilitare il caricamento di Fluo-4 AM per la rilevazione del calcio in cellule vive²⁺ imaging
Alimentatore programmabile in corrente continua regolato	Tongmen	eTM-L605SPL (60 V, 5 A)	Utilizzato per alimentare l'elettromagnete personalizzato per la generazione di un campo magnetico a gradiente in vitro
Cellule di Schwann RSC96	Banca cellulare dell'Accademia cinese delle scienze	N/A	Linea cellulare di cellule di Schwann derivata da ratto
Dodecilsolfato di sodio (SDS)	Sigma-Aldrich	436143	reagente ACS, ≥99,0%; tensioattivo per microemulsione olio-in-acqua
magnetometro SQUID	Quantum Design Inc.	MPMS-XL	Utilizzato per la misura dell'isteresi magnetica a 300 K
Toluene	Sigma-Aldrich	244511	Anidro, 99,8%; solvente per l'assemblaggio di superparticelle
Microscopio elettronico a trasmissione	FEI	EP 5018/40, Tecnai Spirit Biotwin	Utilizzato per l'osservazione dell'ultrastruttura di tessuti cellulari e nervosi

Riferimenti

Cheng B, et al. Mechanobiology across timescales. Nat Rev Phys. 2025;7:621-44.
Di X, et al. Cellular mechanotransduction in health and diseases: from molecular mechanism to therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:282.
Pillai EK, Franze K. Mechanics in the nervous system: from development to disease. Neuron. 2024;112(3):342-61.
Franze K. The mechanical control of nervous system development. Development. 2013;140(15):3069-77.
Franze K, Guck J. The biophysics of neuronal growth. Rep Prog Phys. 2010;73:094601.
Moore SW, Sheetz MP. Biophysics of substrate interaction: influence on neural motility, differentiation, and repair. Dev Neurobiol. 2011;71(11):1090-101.
Franze K, Janmey PA, Guck J. Mechanics in neuronal development and repair. Annu Rev Biomed Eng. 2013;15:227-51.
Sun W, et al. Biophysical approaches for applying and measuring biological forces. Adv Sci (Weinh). 2022;9(5):e2105254.
Mohammed D, et al. Innovative tools for mechanobiology: unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:162.
Constantinou I, Bastounis EE. Cell-stretching devices: advances and challenges in biomedical research and live-cell imaging. Trends Biotechnol. 2023;41:939-50.
Polacheck WJ, Li R, Uzel SGM, Kamm RD. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 2013;13(12):2252-67.
Li Z, et al. Non-invasive acquisition of mechanical properties of cells via passive microfluidic mechanisms: a review. Biomicrofluidics. 2021;15(3):031501.
Xiao Y, Du J. Superparamagnetic nanoparticles for biomedical applications. J Mater Chem B. 2020;8(3):354-67.
Yang X, et al. Nanotechnology enables novel modalities for neuromodulation. Adv Mater. 2021;33(52):e2103208.
Semeano AT, et al. Effects of magnetite nanoparticles and static magnetic field on neural differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev Rep. 2022;18(4):1337-54.
Lee B, et al. Design of oxide nanoparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 2025;10:252-67.
Kim YJ, et al. Magnetoelectric nanodiscs enable wireless transgene-free neuromodulation. Nat Nanotechnol. 2025;20:121-31.
Signorelli L, Hescham SA, Pralle A, Gregurec D. Magnetic nanomaterials for wireless thermal and mechanical neuromodulation. iScience. 2022;25(11):105401.
Liu T, Wang Y, Lu L, Liu Y. SPIONs-mediated magnetic actuation promotes nerve regeneration by inducing and maintaining repair-supportive phenotypes in Schwann cells. J Nanobiotechnology. 2022;20:159.
Liu T, et al. f-SPION-mediated magnetic stimulation induces reparative Schwann cell reprogramming via cytoskeletal dynamics-gated activation of Piezo1. J Nanobiotechnology. 2026;24:298.
Jessen KR, Mirsky R, Lloyd AC. Schwann cells: development and role in nerve repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(7):a020487.
Jessen KR, Mirsky R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. J Physiol. 2016;594(13):3521-31.
Sun S, Zeng H. Size-controlled synthesis of magnetite nanoparticles. J Am Chem Soc. 2002;124(28):8204-5.
Zhuang J, Wu H, Yang Y, Cao YC. Controlling colloidal superparticle growth through solvophobic interactions. Angew Chem Int Ed Engl. 2008;47(12):2208-12.
Bai F, et al. A versatile bottom-up assembly approach to colloidal spheres from nanocrystals. Angew Chem Int Ed Engl. 2007;46(35):6650-3.
Tang L, et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(43):15344-9.
Tay A, Kunze A, Murray C, Di Carlo D. Induction of calcium influx in cortical neural networks by nanomagnetic forces. ACS Nano. 2016;10(2):2331-41.
Tay A, Di Carlo D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Lett. 2017;17(2):886-92.
Cheng FY, et al. Characterization of aqueous dispersions of Fe(3)O(4) nanoparticles and their biomedical applications. Biomaterials. 2005;26(7):729-38.
Lee N, et al. Iron oxide-based nanoparticles for multimodal imaging and magnetoresponsive therapy. Chem Rev. 2015;115(19):10637-89.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Esplora altri articoli

Nanoparticelle superparamagnetiche Stimolazione magnetica Imaging di cellule vive Organizzazione del citoscheletro Stimolazione elettromagnetica Meccanobiologia

Questo articolo è stato pubblicato

Video in arrivo

Tienimi aggiornato: