Piattaforma di nano-attuazione magnetica per la meccanostimolazione remota e controllabile di cellule di Schwann con imaging confocale in tempo reale

Yang Wang; Ting Liu; Mingxi Yang; Chong Qi; Bin Liu

doi:10.3791/71685

Articolo metodologico

Piattaforma di nano-attuazione magnetica per la meccanostimolazione remota e controllabile di cellule di Schwann con imaging confocale in tempo reale

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DOI:

10.3791/71685

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8 settembre 2026

Yang Wang¹^,² , Ting Liu³ , Mingxi Yang¹^,² , Chong Qi⁴ , Bin Liu¹^,²

¹Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, ²Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, ³International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin Universit, ⁴Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta una piattaforma di nanoattuazione magnetica compatibile con il microscopio, che integra nanoparticelle superparamagnetiche fluorescenti, un elettromagnete calibrato e un'immagine confocale in tempo reale per stimolare a distanza e in modo controllato le cellule di Schwann e monitorare dinamicamente le loro risposte meccanosensoriali.

Abstract

Le forze meccaniche regolano in modo critico il comportamento cellulare, tuttavia molti metodi esistenti di stimolazione meccanica si basano su contatto fisico diretto o su ambienti extracellulari artificialmente ingegnerizzati, limitandone così la flessibilità negli studi dinamici su cellule vive. In questo lavoro presentiamo una piattaforma di nanoattuazione magnetica per la meccanostimolazione a distanza, senza contatto e controllabile di cellule di Schwann in vitro. Questa configurazione integrata consente stimolazione magnetica remota e imaging in tempo reale su cellule vive sincronizzati nella stessa sessione sperimentale. Il manoscritto descrive la preparazione di nanoparticelle superparamagnetiche fluorescenti (SPIONs), opzionalmente funzionalizzate per il targeting dell’actina (f-SPIONs), la costruzione e la calibrazione di un dispositivo elettromagnetico compatibile con il microscopio, la stima delle forze magnetiche a livello di singola particella e di singola cellula, e l’integrazione dell’attuazione magnetica con imaging confocale in tempo reale. Le cellule di Schwann sono cellule gliali altamente meccanosensibili che svolgono ruoli essenziali nello sviluppo, nel mantenimento e nella riparazione dei nervi periferici. Il monitoraggio in tempo reale delle loro risposte alla stimolazione meccanica è fondamentale per comprendere come le forze meccaniche influenzino l’organizzazione del citoscheletro e il comportamento cellulare. Questa piattaforma fornisce un flusso di lavoro riproducibile per lo studio della meccanobiologia delle cellule di Schwann e potrebbe essere adattata ad altri tipi cellulari meccanoresponsivi e a sistemi multicellulari.

Introduzione

I segnali meccanici regolano un'ampia gamma di processi cellulari, tra cui adesione, migrazione, proliferazione, differenziazione e plasticità fenotipica¹^,²^,³. Studi in meccanobiologia hanno dimostrato che sia i neuroni che le cellule gliali mostrano una marcata meccanosensibilità e capacità di risposta durante lo sviluppo⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Per indagare come le cellule percepiscano e rispondano alle forze meccaniche, sono stati sviluppati diversi approcci sperimentali, tra cui la microscopia a forza atomica (AFM), l'aspirazione con micropipetta, le pinzette ottiche, i sistemi di coltura basati su stiramento e le piattaforme microfluidiche⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Queste tecniche hanno notevolmente avanzato lo studio della meccanotrasduzione. Tuttavia, molte richiedono un contatto fisico diretto con le cellule o dipendono da ambienti meccanici artificiali predefiniti, risultando meno adatte a stimolazioni remote, dinamicamente controllabili e compatibili con l'acquisizione di immagini.

La somministrazione di forze mediata da nanoparticelle magnetiche offre una strategia alternativa per la meccanostimolazione a distanza¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Poiché la maggior parte dei tessuti biologici presenta una bassa suscettibilità magnetica, i campi magnetici applicati esternamente possono penetrare i campioni biologici senza contatto diretto ed agire selettivamente su particelle sensibili al campo magnetico introdotte all'interno di cellule o tessuti. In presenza di un gradiente di campo magnetico, queste particelle subiscono forze direzionali che possono essere utilizzate per indurre perturbazioni meccaniche a livello subcellulare, cellulare o tissutale⁸^,⁹. Questo approccio risulta interessante perché è senza contatto, regolabile, compatibile con l'immagine in tempo reale su campioni vivi e potenzialmente estendibile a sistemi biologici più complessi.

Le cellule di Schwann sono cellule gliali altamente meccanosensibili¹⁹^,²⁰ che svolgono ruoli fondamentali nello sviluppo, nel mantenimento e nella riparazione dei nervi periferici²¹^,²². L'osservazione dinamica delle risposte delle cellule di Schwann alla stimolazione fisica è importante per comprendere come le forze regolino l'organizzazione del citoscheletro e il comportamento cellulare. Tuttavia, molti sistemi convenzionali di applicazione della forza non sono facilmente compatibili con la microscopia in tempo reale ad alta risoluzione. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato una piattaforma di nanoattuazione magnetica che combina superparticelle magnetiche fluorescenti (f-SPIONs) mirate all'actina del citoscheletro, un dispositivo elettromagnetico personalizzato compatibile con lo stage di un microscopio confocale e un framework quantitativo per la stima della forza. Questa configurazione integrata consente stimolazione magnetica a distanza e imaging in tempo reale sincronizzato nella stessa sessione sperimentale.

Il flusso di lavoro descritto in questo articolo comprende la preparazione di superparticelle magnetiche fluorescenti (SPIONs), la funzionalizzazione opzionale mirata all'actina mediante phalloidina per generare f-SPIONs, la caratterizzazione delle nanoparticelle, la costruzione del dispositivo elettromagnetico e la calibrazione del campo, la stima della forza magnetica e la stimolazione magnetica combinata con imaging confocale in tempo reale. Sebbene ottimizzato qui per cellule di Schwann, la piattaforma potrebbe fornire un quadro pratico per studi analoghi in altri sistemi viventi meccanicamente sensibili.

Protocollo

Gli esperimenti descritti in questo protocollo hanno utilizzato una linea cellulare stabilita di cellule di Schwann di ratto (RSC96) e non hanno coinvolto partecipanti umani né animali vivi. Questo studio è stato condotto nell'ambito di un progetto di ricerca più ampio che prevedeva esperimenti sugli animali, approvato dal Comitato per il Benessere Animale e l'Etica dell'Ospedale Principale dell'Università di Jilin (Numero di Approvazione: 2022-0045).

1. Preparazione di superparticelle magnetiche fluorescenti

Sintetizzare nanoparticelle di Fe₃O₄ rivestite con acido oleico.
NOTA: Le nanoparticelle di Fe₃O₄ rivestite con acido oleico sono state sintetizzate mediante decomposizione termica come descritto in precedenza²⁰^,²³.
1. Aggiungere 2 mmol di Fe(acac)₃, 6 mmol di acido oleico, 6 mmol di oleilammina e 5 mmol di 1,2-esadecandiolo a 20 mL di etere benzilico in un pallone reattore.
2. Agitare la miscela sotto atmosfera di azoto per 15 minuti fino a ottenere una soluzione precursore omogenea.
3. Riscaldare la miscela a 200 °C con una velocità di 20 °C/min.
4. Mantenere la reazione a 200 °C per 30 minuti.
5. Aumentare la temperatura a 265 °C e riflussare la miscela per 30 minuti.
6. Lasciare raffreddare naturalmente la miscela di reazione fino a temperatura ambiente.
7. Raccogliere le nanoparticelle di Fe₃O₄ mediante separazione magnetica.
8. Lavare le nanoparticelle 3 volte con etanolo.
9. Ridisperdere le nanoparticelle purificate in toluene.
Assemblare superparticelle di Fe₃O₄·Cy3.5.
NOTA: Le superparticelle di Fe₃O₄·Cy3.5 sono state preparate come descritto in precedenza²⁰^,²⁴^,²⁵.
1. Disperdere 28 mg di nanoparticelle di Fe₃O₄ rivestite con acido oleico in 4 mL di toluene in un pallone rotondo da 50 mL a tre collo.
2. Preparare una fase acquosa contenente 12,5 mg di sodio dodecilsolfato e 3 mg di Cyanine 3.5 (Cy 3.5) in 12,5 mL di acqua.
3. Combinare la sospensione di nanoparticelle di Fe₃O₄ in toluene (28 mg in 4 mL; 7 mg/mL) con la soluzione acquosa di tensioattivo/colorante per formare una microemulsione olio-in-acqua.
4. Mescolare accuratamente fino a ottenere un'emulsione stabile.
5. Riscaldare il pallone rotondo a tre collo a 60 °C e agitare continuamente a 300 giri/min per 6 ore.
  NOTA: Non è richiesta alcuna procedura di evaporazione sotto vuoto ridotto o con evaporatore rotante.
6. Evaporare il toluene nelle condizioni descritte sopra per indurre l'aggregazione delle nanoparticelle di Fe₃O₄. Trasferire, utilizzando una pipetta monouso, un piccolo aliquota della soluzione in un tubo da saggio e lasciarla in riposo. L'assenza di separazione di fase indica che il toluene è stato completamente rimosso.
7. Trasferire la sospensione di superparticelle di Fe₃O₄·Cy3.5 in provette da centrifuga da 15 mL. Centrifugare a 2.370 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per raccogliere le superparticelle, e scartare con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet.
8. Ridisperdere il pellet in acqua deionizzata ultrapura e centrifugare nuovamente a 2.370 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il soprannatante e ripetere la procedura di lavaggio per tre volte per rimuovere il colorante Cy3.5 libero residuo e il sodio dodecilsolfato.
Rivestire le superparticelle con polidopamina (PDA).
NOTA: Le superparticelle rivestite con polidopamina sono state preparate come descritto in precedenza²⁰^,²⁶.
1. Centrifugare la sospensione di superparticelle di Fe₃O₄·Cy3.5 a 2.370 × g per 5 minuti a temperatura ambiente e scartare il soprannatante.
2. Ridisperdere il pellet in tampone Tris 10 mM (pH 8,5).
3. Aggiungere 26 mg di monomero di dopamina alla sospensione.
4. Agitare la miscela a temperatura ambiente per 3 ore in condizioni alcaline.
5. Centrifugare la sospensione a 2.370 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
6. Rimuovere il soprannatante e ridisperdere il pellet in acqua ultrapura per ottenere le particelle di Fe₃O₄·Cy3.5@PDA (SPIONs).
Eventualmente funzionalizzare le particelle con phalloidina-Alexa Fluor 350.
NOTA: Le superparticelle sono state funzionalizzate sulla superficie utilizzando phalloidina-Alexa Fluor 350 disponibile in commercio²⁰.
1. Preparare 5 mL di soluzione acquosa contenente 100 unità di phalloidina-Alexa Fluor 350.
2. Aggiungere alla soluzione 200 µL di sospensione di Fe₃O₄·Cy3.5@PDA contenente 2 mg di particelle.
3. Agitare delicatamente la miscela a temperatura ambiente per 24 ore.
4. Centrifugare la miscela a 2.370 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
5. Scartare il soprannatante e ridisperdere il pellet in acqua deionizzata.
6. Conservare la formulazione finale di Fe₃O₄·Cy3.5@PDA@phalloidina (f-SPIONs) al riparo dalla luce fino all'uso.

2. Caratterizzazione delle nanoparticelle

Determinare la morfologia e le dimensioni.
1. Preparare campioni di nanoparticelle per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) o per la microscopia elettronica a trasmissione ad alta risoluzione (HRTEM) secondo i requisiti dello strumento.
2. Acquisire immagini per determinare la morfologia complessiva delle particelle, la struttura nucleo-guscio e il diametro medio (Figura 1).
3. Preparare sospensioni acquose di nanoparticelle per la diffusione dinamica della luce (DLS).
4. Misurare il diametro idrodinamico e l'indice di polidispersione (PDI).
5. Confrontare i risultati ottenuti con microscopia elettronica e DLS per valutare l'uniformità della formulazione e il comportamento colloidale.
Determinare le proprietà magnetiche.
1. Preparare campioni di nanoparticelle essiccati o concentrati adatti all'analisi mediante dispositivo di interferenza quantistica a superconduttore (SQUID).
2. Registrare le curve di isteresi magnetica a 300 K.
3. Determinare la magnetizzazione di saturazione, la remanenza e la coercitività.
4. Verificare che le particelle mostrino un comportamento superparamagnetico con remanenza e coercitività trascurabili.
Determinare le proprietà fluorescenti.
1. Preparare una sospensione di f-SPION in acqua deionizzata ultrapura e trasferire la sospensione in una cuvetta di quarzo.
2. Registrare gli spettri di fotoluminescenza utilizzando un fluorimetro.
3. Verificare che il segnale fluorescente rimanga rilevabile dopo il lavaggio e la risospensione.
Convalidare la localizzazione associata all'actina quando si utilizza la formulazione mirata.
1. Acquisire cellule RSC96.
  NOTA: Le cellule RSC96 utilizzate in questo studio, una linea di cellule di Schwann di ratto trasformate spontaneamente ottenuta mediante coltura prolungata di cellule di Schwann primarie di ratto, sono state ottenute dalla Cell Bank dell'Accademia Cinese delle Scienze, Shanghai, Cina (CSTR: 19375.09.3101RATGNR6) e sono risultate negative per contaminazione da micoplasma e funghi. Sono state utilizzate cellule comprese tra il passaggio 3 e il 10.
2. Coltivare le cellule in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e con soluzione di penicillina-streptomicina al 1% (100 U/mL di penicillina e 100 µg/mL di streptomicina).
3. Sezionare le cellule RSC96 a una densità di 1 × 10⁵ cellule per piastra per microscopia da 35 mm e coltivarle per 24 h a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂ per consentire l'adesione cellulare.
4. Aspirare il mezzo di coltura esistente, lavare le cellule due volte con soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) e aggiungere mezzo di coltura completo contenente 15 µg/mL di f-SPION. Incubare le cellule con i f-SPION per 12 h.
5. Aspirare il mezzo di coltura e lavare le cellule due volte con PBS freddo contenente 1 mM di deferoxamina per rimuovere completamente le particelle non internalizzate.
6. Acquisire immagini confocali per valutare la distribuzione intracellulare delle particelle. Impostare i parametri di acquisizione su un pinhole di 1 unità Airy (AU) e un passo z di 0,43 µm per ottenere sezioni ottiche ad alta risoluzione delle strutture intracellulari.
7. Verificare se le particelle mostrano un arricchimento in regioni cellulari associate all'actina.

3. Costruzione e calibrazione del dispositivo di stimolazione elettromagnetica (Figura 2)

Assemblare il dispositivo elettromagnetico.
1. Costruire un sistema compatto di bobine elettromagnetiche dimensionato per adattarsi al piatto del microscopio confocale e alla camera per cellule vive (Figura 2A,B).
2. Collegare la bobina a un alimentatore regolabile o a una sorgente di corrente esterna.
3. Simulare numericamente l'ambiente di campo magnetico gradiente utilizzando COMSOL Multiphysics 4.3b (Figura 2C,D).
4. Verificare che l'elettromagnete generi il corrispondente campo magnetico gradiente (GMF) a diverse correnti di ingresso (Figura 2G).
Misurare la densità di flusso magnetico e calibrare il campo magnetico a gradiente.
1. Posizionare l'elettromagnete accanto alla piastra di coltura, con la punta del polo rivolta verso il centro della piastra e situata a 1 mm dalla parete esterna della piastra (Figura 2E,F).
2. Mantenere questa configurazione geometrica relativa tra l'elettromagnete e la piastra di coltura durante tutti i successivi esperimenti di stimolazione magnetica in tempo reale e di acquisizione di immagini.
3. Utilizzare un gaussmetro digitale per misurare la densità di flusso magnetico in posizioni predeterminate all'interno della regione di stimolazione, impiegando la griglia di posizionamento posta sul fondo della piastra di coltura come riferimento spaziale.
4. Calcolare il gradiente del campo locale a partire dalla variazione spaziale della densità di flusso magnetico.
5. Calibrare e validare il gradiente del campo magnetico simulato numericamente utilizzando i valori del gradiente del campo magnetico misurati sperimentalmente e calcolati.

4. Stima delle forze magnetiche erogate dalla piattaforma.

Definire il modello di stima della forza.
1. Utilizzare l'equazione della forza per nanoparticelle magnetiche in un campo magnetico non uniforme²⁷^,²⁸:
2. Sotto l'ipotesi di allineamento superparamagnetico con il campo applicato, semplificare l'equazione in
  $Equazione della forza magnetica $F_{\text{f-SPION}}=m\frac{dB}{dr}$; formula per lo studio del campo magnetico.$
  dove:
  F è la forza nanomagnetica
  m è il momento di dipolo magnetico
  è il gradiente del campo magnetico
  dB/dr è il gradiente del campo magnetico (T/m) generato dal relativo dispositivo di generazione del campo magnetico.
3. Utilizzare il gradiente di campo misurato dal dispositivo calibrato in tutti i calcoli.
Stimare la forza agente su una singola nanoparticella.
1. Determinare le dimensioni medie delle particelle a partire da immagini HRTEM.
2. Calcolare il volume del nucleo magnetico assumendo una geometria sferica.
3. Stimare il volume magnetico specifico di Fe₃O₄ in base alla frazione magnetica del nucleo.
4. Calcolare il momento di dipolo magnetico secondo $Formula di calcolo della massa chimica $m=\rho \cdot V \cdot M_m$, equazione per la stechiometria.$
  dove:
  M_m rappresenta la magnetizzazione massica degli f-SPION (16 A·m²/kg) alla data intensità del campo;
  ρ è la densità di Fe₃O₄ (5,24 g/cm³).
  V è il volume del nucleo magnetico di Fe₃O₄ all'interno di ciascuno f-SPION (5,89 × 10⁻¹⁷ cm³).
5. Moltiplicare il momento di dipolo per il gradiente di campo misurato per stimare la forza agente su una singola nanoparticella ().
Stimare l'assorbimento delle nanoparticelle per cellula di Schwann.
1. Sezionare cellule di Schwann RSC96 a 5 × 10⁵ cellule per pozzetto in piastre da coltura cellulare da 35 mm.
2. Incubare le cellule per 24 h in condizioni di coltura standard.
3. Sostituire il mezzo con mezzo fresco contenente 15 µg/mL di f-SPION.
4. Incubare le cellule per ulteriori 12 h.
5. Lavare le cellule due volte con soluzione salina tamponata al fosfato fredda contenente 1 mM deferoxamina.
6. Raccogliere e contare le cellule.
7. Misurare il contenuto intracellulare di ferro mediante spettroscopia di emissione atomica con plasma accoppiato inductivamente (ICP-AES).
8. Calcolare il numero di particelle internalizzate per cellula dividendo la massa media di ferro per cellula per la massa di ferro per particella .
Stimare la forza trasferita a una singola cellula di Schwann.
1. Calcolare la forza a livello cellulare secondo
  
  dove:
  è la forza magnetica esercitata su un singolo f-SPION.
  $Equazione di concentrazione di SPION, $ n^\text{f-SPIONs}_\text{cell} $, notazione scientifica, diagramma.$ è il numero di f-SPION internalizzati per cellula.
  F_cell è la forza magnetica esercitata su una singola cellula.
2. Indicare il valore risultante come stima della forza magnetica trasferita a una singola cellula di Schwann (F_cell).
3. Specificare chiaramente che il valore è una stima basata su un modello e non una misurazione diretta della forza intracellulare.

5. Combinazione della stimolazione magnetica con l'immagine in tempo reale mediante microscopia confocale a scansione laser (CLSM)

Caricare le cellule di Schwann con nanoparticelle magnetiche.
1. Sezionare le cellule di Schwann in piatti di coltura ibidi compatibili con l’imaging o in camere di coltura microfluidiche.
2. Lasciare che le cellule aderiscano e si riprendano.
3. Sostituire il mezzo esistente con mezzo di coltura fresco contenente 15 µg/mL di f-SPIONs.
4. Incubare le cellule per 12 h per consentire il caricamento con f-SPIONs.
5. Verificare la morfologia cellulare prima di procedere.
Rimuovere le particelle non internalizzate.
1. Rimuovere il mezzo contenente le nanoparticelle.
2. Lavare le cellule due volte con PBS contenente 1 mM di deferoxamina.
3. Sostituire la soluzione di lavaggio con mezzo per cellule vive compatibile con l’imaging.
4. Verificare la presenza di un basso fondo di particelle extracellulari prima dell’imaging.
Integrare il dispositivo elettromagnetico con il sistema di imaging CLSM.
1. Assemblare l’elettromagnete con la camera di coltura per cellule vive, posizionando l’elettromagnete nella sua posizione precalibrata.
2. Posizionare la camera di coltura assemblata sul supporto del microscopio confocale (Figura 3). Verificare che il piatto di coltura si trovi all’interno della regione efficace di stimolazione (Figura 3A).
3. Attivare l’elettromagnete secondo i parametri preimpostati e verificare l’esposizione a un campo magnetico a gradiente efficace all’interno dell’area del piatto di coltura (Figura 3B).
4. Verificare che l’obiettivo possa raggiungere il piano focale senza interferenze.
5. Verificare che il dispositivo non ostacoli il posizionamento dell’obiettivo o lo spostamento del supporto.
6. Considerando il calore generato durante il funzionamento dell’elettromagnete, regolare le impostazioni di temperatura dei componenti della camera per cellule vive in base alle condizioni di coltura ottimali predeterminate, per garantire un ambiente interno di 37 °C e 5% CO₂ (Figura 3C).
7. Verificare che l’intero sistema funzioni in modo normale e stabile.
Imaging funzionale del Ca²⁺ in cellule vive.
1. Incubare le cellule con soluzione di Krebs–Ringer (pH 7,4) contenente 3 µM di Fluo-4 AM e 0,1% di Pluronic F-127 a 37 °C per 30 min.
2. Dopo l’incubazione, lavare le colture due volte con PBS e trasferirle sulla piattaforma di imaging per cellule vive del sistema CLSM per l’imaging (Figura 4A).
3. Utilizzando la griglia di posizionamento sul fondo del piatto di coltura ibidi, acquisire immagini di cinque posizioni predeterminate.
4. Dividere ogni campo di imaging in 25 regioni uguali e selezionare 0–3 cellule da ciascuna regione per la quantificazione della fluorescenza, in base alla densità cellulare effettiva all’interno di quella regione.
5. Definire il contorno completo di una singola cellula come area di interesse (ROI) e monitorare la risposta al calcio indotta magneticamente analizzando le variazioni dell’intensità di fluorescenza (ΔF) all’interno dell’ROI.
6. Calcolare la variazione dell’intensità di fluorescenza come ΔF = (F_stim- F₀). Considerare un evento di risposta al calcio un aumento dell’intensità di fluorescenza prima e dopo la stimolazione (ΔF/F₀) superiore al 10%.
  NOTA: F_unstim rappresenta l’intensità di fluorescenza prima della stimolazione con forza magnetica, F₀ rappresenta l’intensità di fluorescenza di base e F_stim rappresenta l’intensità di fluorescenza evocata dopo la stimolazione con forza magnetica.
7. Per la correzione dello sfondo, sottrarre dall’intensità di fluorescenza di ciascun ROI il valore medio dell’intensità di fluorescenza misurato in una regione priva di cellule.
8. Eseguire tre esperimenti indipendenti, includendo un piatto di coltura in ciascun esperimento.
Eseguire imaging in time-lapse e applicare stimolazione magnetica durante l’imaging.
1. Impostare i parametri di imaging in time-lapse come segue: un intervallo di acquisizione di 2,1 s per fotogramma, una durata totale di acquisizione di 650 s e imaging con sezione ottica ad alta risoluzione standard utilizzando 1 AU.
2. Durante l’imaging cellulare, acquisire continuativamente immagini per 50 s senza applicare corrente, per registrare l’intensità di fluorescenza intracellulare del calcio in assenza di stimolazione con forza magnetica (F_unstim) (Figura 2H e Figura 4B).
3. Normalizzare l’intensità di fluorescenza registrata nei primi 50 s e definirla come intensità di fluorescenza di base (F₀).
4. Successivamente, applicare una corrente costante di 3,0 A all’elettromagnete, esponendo le cellule di Schwann cariche di nanoparticelle magnetiche a un campo magnetico a gradiente di 3,25 T/m e sottoponendole quindi a stimolazione con forza magnetica. Continuare l’imaging in time-lapse per 10 min per registrare l’intensità di fluorescenza intracellulare del calcio durante la stimolazione con forza magnetica (F_stim) (Figura 2H e Figura 4C).
5. Calcolare quantitativamente la variazione dell’intensità di fluorescenza come ΔF/F₀ (Figura 4D,E).
Eseguire l’analisi statistica e analizzare i dati di fluorescenza del Ca²⁺.
1. Per ogni cellula, calcolare il valore mediano di ΔF/F₀ lungo la serie temporale analizzata e utilizzare questo valore come parametro di risposta al Ca²⁺ a livello cellulare.
2. Eseguire tre esperimenti indipendenti per ciascuna condizione sperimentale, con un piatto di coltura per condizione in ciascun esperimento. Raggruppare le cellule analizzate nei tre esperimenti indipendenti per la presentazione descrittiva e riportare n come numero totale di cellule analizzate in ciascun gruppo.
3. Valutare la normalità dei dati di ΔF/F₀ a livello cellulare utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov.
4. Poiché i dati di risposta alla fluorescenza del Ca²⁺ non sono distribuiti normalmente, presentare i dati come mediana e intervallo interquartile (IQR).
5. Analizzare le differenze tra i gruppi utilizzando il test non parametrico di Friedman, seguito da test di Wilcoxon per confronti a coppie, come precedentemente descritto.
6. Considerare P < 0,05 come indicativo di significatività statistica.

Risultati

La microscopia elettronica a trasmissione ad alta risoluzione (HRTEM) ha mostrato che la formulazione finale delle nanoparticelle possedeva un nucleo magnetico aggregato e uno strato esterno dopo la modifica superficiale (Figura 1). Le f-SPIONs finali avevano un diametro medio complessivo di 63,36 ± 16,65 nm, con un nucleo magnetico ricco di Fe₃O₄ di circa 56,60 ± 6,19 nm e uno strato esterno composto da polidopamina e falloidina-Alexa Fluor 350 con uno spessore medio di circa 5,79 ± 1,36 nm. Questi risultati hanno confermato la corretta realizzazione di un'architettura di superparticella adatta all'attuazione magnetica e alla visualizzazione basata sulla fluorescenza.

L'analisi della isteresi magnetica ha mostrato che le particelle presentavano un comportamento superparamagnetico pronunciato, con rimanenza e coercitività trascurabili. In presenza di un campo magnetico applicato di 10.000 Oe (1,0 T), la loro magnetizzazione di saturazione ha raggiunto circa 35 A·m²/kg (Figura 5). In assenza di un gradiente di campo magnetico, gli f-SPIONs hanno mostrato una buona dispersibilità in un mezzo acquoso (Figura 6A). Quando esposti a un campo magnetico con gradiente, gli f-SPIONs hanno dimostrato una sensibile risposta magnetica (Figura 6B). L'analisi della fluorescenza ha inoltre confermato che le particelle mantenevano la rilevabilità ottica dopo la sintesi e la modifica superficiale (Figura 7).

Il dispositivo di stimolazione elettromagnetica è stato integrato con successo nel sistema di imaging su cellule vive (Figura 3). La calibrazione del campo magnetico ha mostrato che il dispositivo genera un campo magnetico a gradiente stabile nella regione della coltura cellulare (Figura 2E,F), con un campo magnetico a gradiente in vitro di circa 3,25 T/m nella configurazione sperimentale attuale (Figura 2G).

L'immagine confocale ha dimostrato un efficiente caricamento delle nanoparticelle magnetiche fluorescenti nelle cellule di Schwann (Figura 7). Dopo il lavaggio, il segnale fluorescente è rimasto principalmente associato alle cellule piuttosto che a particelle libere nel mezzo. Per la formulazione mirata all'actina, l'immagine confocale ha inoltre mostrato un arricchimento delle particelle nelle regioni cellulari associate all'actina.

L'acquisizione confocale in time-lapse ha dimostrato che la stimolazione magnetica e l'imaging su cellule vive possono essere eseguite all'interno dello stesso flusso sperimentale, mantenendo un accesso ottico stabile alle cellule per tutta la durata del periodo di stimolazione (Figura 2H e Figura 4A).

Un riepilogo quantitativo ha ulteriormente collegato la progettazione delle nanoparticelle, la calibrazione del dispositivo e il carico cellulare. Sotto un campo magnetico gradiente in vitro di 3,25 T/m, si è stimato che la forza magnetica agente su un singolo f-SPION fosse di circa 1,59 × 10^-5 pN. Sulla base della quantificazione del ferro intracellulare, ogni cellula di Schwann RSC96 ha internalizzato approssimativamente 9,30 ± 2,88 × 10³ particelle, corrispondenti a una forza magnetica totale stimata di circa 0,15 ± 0,05 pN per cellula.

Rispetto alla fluorescenza di base, in seguito alla stimolazione magnetica mediata da f-SPIONs, le cellule RSC96 hanno mostrato dinamiche attive di Ca²⁺ e segnali di fluorescenza di Ca²⁺ significativamente aumentati (Figura 4D). Un'analisi quantitativa dei segnali di fluorescenza di Ca²⁺ ha rivelato che la variazione dell'intensità della fluorescenza di Ca²⁺ (ΔF/F₀) all'interno delle cellule RSC96 nel gruppo sottoposto a stimolazione magnetica (62,96 [35,07–91,67]) era significativamente più elevata rispetto a quella del gruppo controllo normale (-5,74 [-15,66–1,20]), del gruppo controllo con f-SPIONs (-16,70 [-22,02–-12,00]) e del gruppo controllo con campo magnetico a gradiente (-12,90 [-21,24–-6,97]) (Figura 4E).

Struttura delle nanoparticelle in immagini al microscopio elettronico; analisi al microscopio elettronico che mostra dettagli delle nanoparticelle aggregate.
Figura 1: Morfologia e struttura a nucleo-guscio degli f-SPIONs mediante HRTEM. (A) Gli f-SPIONs sono sferici e mostrano una tipica struttura a nucleo-guscio, con un nucleo magnetico interno composto da nanoparticelle di Fe₃O₄ e Cy3.5. (B) Il guscio esterno è composto da PDA e phalloidina-Alexa Fluor 350. Le immagini nel pannello B mostrano ingrandimenti rappresentativi delle regioni evidenziate in rosso nel pannello A, con linee bianche e frecce che indicano lo spessore misurato del guscio. La barra della scala nel pannello B corrisponde a 10 nm. Sono state effettuate tre misurazioni indipendenti, per un totale di 680 nanoparticelle analizzate. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Diagramma del dispositivo elettromagnetico con filo di rame e nucleo di ferro; simulazioni del campo magnetico; grafico del campo.
Figura 2: Costruzione, calibrazione e funzionamento dell'elettromagnete personalizzato per la stimolazione magnetica di cellule vive. (A,B) La bobina dell'elettromagnete è stata avvolta attorno a un nucleo di ferro utilizzando un filo di rame smaltato da 1,1 mm, per un totale di 410 spire. La bobina aveva un diametro esterno di 60 mm, un diametro interno di 20 mm, una lunghezza di 110 mm e una resistenza in corrente continua di circa 1,2 Ω. La punta del polo misurava 13,0 mm × 12,0 mm × 3,0 mm (lunghezza × larghezza × altezza) ed era realizzata in permalloy 1J50. (C,D) La corrente massima in ingresso all'elettromagnete non superava i 3 A. Con una corrente di ingresso di 3 A, vicino alla punta del polo si generava un gradiente di campo magnetico di circa 6,7 T/m. (E,F) Distribuzione del gradiente di campo magnetico all'interno della piastra di coltura vicino alla punta del polo con una corrente di ingresso di 3 A. Un gradiente di campo magnetico statico medio di circa 3,25 T/m è stato generato nella regione di imaging cellulare. (G) Gradienti di campo magnetico generati dall'elettromagnete a diverse correnti di ingresso: 1 A, 2 A e 3 A. (H) Protocollo per l'acquisizione di immagini in time-lapse di cellule vive, l'applicazione di corrente e l'esposizione al campo magnetico gradiente in questo studio. Le immagini in time-lapse sono state acquisite continuamente per 50 s senza applicazione di corrente. Successivamente è stata applicata una corrente continua costante di 3,0 A e l'acquisizione in time-lapse è proseguita per 10 minuti. DC: Corrente continua. GMF: Campo magnetico gradiente. I pannelli E, F e G sono stati adattati con autorizzazione da Liu et al.²⁰. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Integrazione dell'elettromagnete nella camera per colture cellulari in vivo. (A) Un elettromagnete compatto su misura posizionato in una posizione calibrata all'interno della camera per colture cellulari in vivo, per esporre l'area della piastra di coltura cellulare a un campo magnetico a gradiente. (B) Configurazione integrata del sistema di imaging CLSM, della piattaforma di nanoattuazione magnetica e dell'alimentatore esterno a corrente continua. (C) L'ottimizzazione delle impostazioni di temperatura per i singoli componenti della camera per colture cellulari garantisce una temperatura stabile all'interno della piastra di coltura durante il funzionamento dell'elettromagnete. (D) Parametri di impostazione della temperatura per i singoli componenti della camera per colture cellulari. CLSM: microscopia confocale a scansione laser. PV: Valore misurato. SV: Valore impostato. Top Heater: Temperatura del riscaldatore del coperchio superiore. Stage heater: Temperatura di riscaldamento della piattaforma del microscopio e della base della camera di coltura. Bath heater: Temperatura del bagno d'acqua. Lens heater: Temperatura del riscaldatore dell'obiettivo. Temp sensor: Temperatura effettiva misurata dalla sonda termica. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Diagramma di nanoattuazione magnetica; f-SPIONs, ioni calcio, microscopia DIC, risultati di fluorescenza.
Figura 4: Immagini rappresentative delle risposte al calcio nelle cellule di Schwann sotto stimolazione magnetica. (A) Flusso di lavoro integrato per la stimolazione magnetica e l’imaging in tempo reale del Ca²⁺ nella piattaforma di nanoattuazione magnetica. (B) Immagine di fluorescenza di baseline del Ca²⁺ acquisita prima della stimolazione magnetica (F_unstim). (C) Immagine di fluorescenza del Ca²⁺ acquisita dopo la stimolazione magnetica (F_stim), che mostra la variazione dell’intensità di fluorescenza (ΔF). (D) Tracciati del segnale di Ca²⁺ risolti nel tempo registrati prima e dopo la stimolazione magnetica. (E) Analisi quantitativa e confronto delle variazioni della fluorescenza del Ca²⁺ (ΔF/F₀) tra i diversi gruppi sperimentali. DIC: Contrasto a Interferenza Differenziale. F_unstim: intensità di fluorescenza prima della stimolazione con forza magnetica. F₀: intensità di fluorescenza di baseline. F_stim: intensità di fluorescenza indotta dopo la stimolazione con forza magnetica. ΔF: variazione dell’intensità di fluorescenza. “Normal” rappresenta il gruppo di controllo normale, “f-SPIONs+GMF” rappresenta il gruppo di nanoattuazione magnetica, “f-SPIONs” rappresenta il gruppo di controllo con f-SPIONs, e “GMF” rappresenta il gruppo di controllo con campo magnetico a gradiente. Sono stati eseguiti tre esperimenti indipendenti, con una piastra di coltura per condizione sperimentale in ciascun esperimento. Per ogni cellula, il valore mediano di ΔF/F₀ lungo la serie temporale analizzata è stato utilizzato come parametro di risposta a livello cellulare. I dati sono presentati come mediana e intervallo interquartile (IQR), e n indica il numero totale di cellule analizzate nei tre esperimenti indipendenti. L’analisi statistica è stata effettuata mediante il test di Friedman seguito dal test dei ranghi con segno di Wilcoxon, come precedentemente riportato da Liu et al. I dati quantitativi nel pannello E sono stati adattati con autorizzazione da Liu et al.²⁰. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafici di magnetizzazione rispetto al campo, ciclo di isteresi a 300 K, analisi delle proprietà magnetiche, grafico.
Figura 5: Proprietà superparamagnetiche dei f-SPIONs. (A) Ciclo di isteresi magnetica dei f-SPIONs, che mostra un comportamento tipicamente superparamagnetico. (B) Vista ingrandita del ciclo di isteresi in prossimità di un campo magnetico nullo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Esperimento del campo magnetico: bobina con provetta. Effetto dell'accensione/spegnimento del GMF sulla dispersione (PDI: 0,16).
Figura 6: Disperdibilità in acqua e risposta al campo magnetico gradiente dei f-SPIONs. (A) In assenza di un campo magnetico gradiente, i f-SPIONs rimangono ben dispersi nel mezzo acquoso. (B) Quando viene applicato il campo magnetico gradiente, i f-SPIONs migrano rapidamente e si accumulano lungo la direzione del gradiente del campo. GMF: Campo magnetico gradiente. PDI: Indice di polidispersione. La freccia indica la direzione del campo magnetico gradiente. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Imaging cellulare con nanoparticelle di Fe3O4; microscopia a fluorescenza che mostra fusione tra DIC, Cy3.5 e phalloidina.
Figura 7: Imaging a fluorescenza mediante CLSM dell'internalizzazione di f-SPION in cellule di Schwann. (A) Imaging mediante CLSM di cellule di Schwann dopo co-incubazione con f-SPION (15 µg/mL) per 12 h e successivo lavaggio (pinhole = 1 AU; passo z = 0,43 µm), che mostra una morfologia cellulare preservata e un minimo fondo di particelle extracellulari. (B) Fluorescenza rossa rilevata nel canale Cy3.5 (Ex/Em: 561–568/607 nm), indicativa della presenza di f-SPION marcati con Cy3.5 all'interno delle cellule di Schwann. (C) Fluorescenza blu rilevata nel canale Alexa Fluor 350 (Ex/Em: 350–360 nm/440–460 nm), che conferma l'incorporazione efficace del modulo di funzionalizzazione phalloidina-Alexa Fluor 350. (D) Immagine fusa che mostra un notevole sovrapposizione spaziale tra i segnali di fluorescenza rossa e blu, coerente con la corretta costruzione delle superparticelle magnetiche-fluorescenti. DIC: Contrasto interferenziale differenziale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

I nanoparticelle di ossido di ferro sono ampiamente riconosciute come nanomateriali magnetici con favorevole biocompatibilità. In quanto agenti di contrasto per imaging a risonanza magnetica ampiamente utilizzati, le nanoparticelle superparamagnetiche di Fe₃O₄ sono state ampiamente applicate nella diagnostica clinica mediante imaging²⁹^,³⁰. In uno studio recente del nostro gruppo²⁰, si è dimostrato che le f-SPIONs esibiscono una citotossicità estremamente bassa ed eccellente sicurezza biologica. La piattaforma di attuazione nanomagnetica, costruita utilizzando le f-SPIONs come attuatori meccanici in combinazione con un elettromagnete controllabile, ha attivato efficacemente la dinamica del citoscheletro nelle cellule di Schwann, indotto l'apertura del canale ionico meccanosensibile Piezo1, innescato l'ingresso transmembrana di Ca²⁺ e successivamente promosso il "riprogrammamento" dell'espressione genica e cambiamenti fenotipici nelle cellule²⁰.

Diversi passaggi sono particolarmente importanti per l'implementazione con successo di questa piattaforma. Il primo passaggio fondamentale è la preparazione delle nanoparticelle. Le particelle devono rimanere ben disperse, magneticamente rispondenti e otticamente rilevabili dopo la sintesi e la modifica della superficie. L'aggregazione in qualsiasi fase può ridurre la coerenza dell'assorbimento cellulare, alterare le proprietà magnetiche effettive e compromettere la qualità dell'immagine in cellule vive.

Il secondo passaggio critico è la procedura di caricamento cellulare e lavaggio. La concentrazione delle nanoparticelle e il tempo di incubazione devono essere sufficienti a produrre un caricamento intracellulare rilevabile senza causare un'eccessiva accumulazione extracellulare o compromettere la morfologia cellulare. È essenziale rimuovere accuratamente le particelle non internalizzate e quelle associate alla membrana, in particolare quando l'immagine di fluorescenza viene utilizzata per valutare la localizzazione intracellulare. Un lavaggio inadeguato può portare a un'errata interpretazione dei modelli di localizzazione e può anche alterare le stime delle forze a livello cellulare.

Il terzo passaggio fondamentale è l'allineamento geometrico del dispositivo di stimolazione magnetica rispetto al campione. Poiché la forza magnetica dipende direttamente dal gradiente del campo locale, la posizione relativa tra la bobina elettromagnetica e il piano del campione deve rimanere coerente con la configurazione di calibrazione. Anche piccole variazioni nella distanza o nell'allineamento tra bobina e campione possono alterare le condizioni effettive di stimolazione.

La piattaforma può essere modificata in base alla domanda biologica in esame. Quando un caricamento magnetico generale e la consegna di forza sono sufficienti, le superparticelle fluorescenti rivestite con PDA (SPIONs) possono essere utilizzate senza funzionalizzazione mirata all'actina. Quando si desidera una localizzazione subcellulare vicino a regioni ricche di actina, può essere utilizzata invece la formulazione funzionalizzata con falloidina (f-SPIONs). Questa modularità rappresenta un vantaggio pratico della piattaforma.

L'attuale tecnica presenta diversi limiti. Innanzitutto, il numero calcolato di particelle magnetiche assorbite per cellula rappresenta un valore medio della popolazione, mentre il carico di particelle a livello singola cellula mostra inevitabilmente un'eterogeneità. In secondo luogo, i valori della forza magnetica riportati in questo studio sono stime basate su modelli piuttosto che misurazioni dirette dei carichi meccanici intracellulari. In terzo luogo, questo protocollo è stato progettato e sviluppato principalmente per cellule di Schwann coltivate in condizioni di imaging in vitro. Nei sistemi di coltura cellulare tridimensionali densi e nei tessuti, potrebbe essere richiesta un'ottimizzazione sostanziale poiché l'assorbimento delle nanoparticelle, la distribuzione intracellulare, l'accessibilità ottica e l'accoppiamento meccanico potrebbero differire rispetto a quelli osservati nelle colture bidimensionali. Infine, la strategia opzionale di targeting dell'actina aumenta la probabilità di localizzazione delle particelle in regioni associate all'actina, ma non garantisce un targeting uniforme o specifico di tutte le strutture ricche di actina all'interno delle cellule vive.

Nonostante questi limiti, l'attuale piattaforma di nanoattuazione magnetica offre diversi vantaggi metodologici distinti rispetto alle tecniche esistenti di applicazione della forza. Ad esempio, la microscopia a forza atomica (AFM) consente un'applicazione precisa e localizzata della forza, ma richiede un contatto meccanico diretto con la cellula bersaglio ed è difficile da integrare con l'acquisizione di immagini a lungo termine su cellule vive⁸. I sistemi basati su stiramento e i substrati ingegnerizzati possono fornire stimoli meccanici a livello di popolazione cellulare, ma dipendono da interfacce materiali predefinite e non sono adatti per l'applicazione remota di forze intracellulari¹⁰. Le pinzette ottiche offrono un'elevata risoluzione spaziale nell'applicazione della forza, ma comportano il rischio di danni tissutali indotti dal laser⁸. I metodi basati su micropipette sono relativamente semplici da utilizzare, ma presentano una bassa produttività e una risoluzione della forza limitata¹². I sistemi microfluidici sono vantaggiosi per generare specifici microambienti meccanici, come lo sforzo di taglio e la pressione del fluido, ma incontrano difficoltà tecniche nel riprodurre ambienti cellulari complessi e nell'integrare più modalità di stimolazione meccanica¹¹. Al contrario, la piattaforma qui descritta integra, in un unico flusso di lavoro, stimolazione remota senza contatto, attuazione magnetica controllabile, tracciamento delle particelle basato sulla fluorescenza e compatibilità diretta con l'acquisizione in tempo reale di immagini confocali.

La stessa strategia generale può essere adattata ad altri tipi cellulari meccanicamente responsivi e a modelli biologici più complessi. Potrebbe inoltre essere estesa a sistemi multicellulari più densi, come organoidi neurali, cisti epiteliali o epitelio simile al Madin-Darby canine kidney (MDCK). In tali contesti, sarebbe necessaria un'ulteriore ottimizzazione per quanto riguarda la penetrazione delle particelle, la distribuzione delle particelle e la stima delle forze in campioni tridimensionali meccanicamente accoppiati. Nonostante queste sfide, il flusso di lavoro attuale fornisce una base pratica per lo sviluppo più ampio di strategie di stimolazione magnetomeccanica in sistemi viventi.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in conflitto.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation of China (numeri di concessione 82571677 e 82001304 a Y.W.), dal Special Program for Medical and Health Care Talents in Jilin Province (numero di concessione JLSRCZX2025-134 a Y.W.) e dal Bethune Program Project di Jilin University (numero di concessione 2024B19 a Y.W.). Gli autori ringraziano il College of Chemistry di Jilin University (State Key Laboratory of Supramolecular Structure and Materials) e l'Istituto di Chimica Applicata di Changchun, Accademia Cinese delle Scienze, per l'assistenza nella progettazione, sintesi e caratterizzazione dei nanomateriali. Gli autori ringraziano inoltre l'Istituto di Medicina Traslazionale del Primo Ospedale di Jilin University per l'assistenza nelle immagini CLSM.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1,2-esadecandiolo	Sigma-Aldrich	213748	Grado tecnico, 90%; utilizzato nella sintesi per decomposizione termica
35 mm ibidi µ-piastre	ibidi	80156	Utilizzato per la coltura cellulare e l'immagine delle cellule di Schwann
Etere benzilico	Sigma-Aldrich	108014	98%; solvente per Fe₃O₄ sintesi di nanoparticelle
Microscopio confocale a scansione laser	Nikon	AXR (Ti2-E)	Utilizzato per l'immagine di cellule vive e l'immunofluorescenza
Elettromagnete personalizzato	Personalizzato	N/A	Elettromagnete unipolare compatto per la generazione di campi magnetici gradienti in vitro
Acido cianina3.5 carbossilico	Duofluor Inc.	D10128	Colorante fluorescente utilizzato per Fe₃O₄·Assemblaggio di superparticelle Cy3.5; PM 593,20; conservare a -20 °C, protetto dalla luce
Sale di mesilato di deferoxamina	Sigma-Aldrich	D9533	Agente chelante del ferro utilizzato per rimuovere il ferro non internalizzato e associato alla membrana
Gaussmetro digitale	CAMPO MAGNETICO AMPIO	WT103	Utilizzato per misurare la densità di flusso magnetico e calibrare il campo magnetico gradiente generato dall'elettromagnete personalizzato
Cloridrato di dopamina	Sigma-Aldrich	H8502	≥98% (TLC); utilizzato per il rivestimento di polidopamina
Strumento per la diffusione dinamica della luce	Malvern Instruments	Zetasizer Nano-ZS	Utilizzato per la misurazione del diametro idrodinamico e del PDI
Fluo-4 AM	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	F14201	Indicatore del calcio utilizzato per la rilevazione del calcio in cellule vive²⁺ imaging
Spettrofotometro a fluorescenza	Shimadzu	RF-6000	Utilizzato per la caratterizzazione della fotoluminescenza
Microscopio elettronico a trasmissione ad alta risoluzione	JEOL	JEM-F200	Utilizzato per l'immagine HRTEM della morfologia delle nanoparticelle e del nucleo–struttura a guscio
Spettrometro atomico ad emissione con plasma accoppiato induttivamente	PerkinElmer	Optima 3300 DV	Utilizzato per la quantificazione del ferro intracellulare
Acetilacetonato di ferro(III), Fe(acac)₃	Sigma-Aldrich	F300	97%; precursore per Fe₃O₄ sintesi di nanoparticelle
Incubatore per cellule vive da posizionare sul palchetto del microscopio	TOKAI HIT	TENP&CO₂	Utilizzato per l'immagine confocale di cellule vive durante la stimolazione magnetica
Acido oleico	Sigma-Aldrich	O1008	≥99% (GC); ligando di superficie per Fe₃O₄ sintesi di nanoparticelle
Oleylamine	Sigma-Aldrich	O7805	Grado tecnico, 70%; ligando per la sintesi di nanoparticelle
Falloidina–Alexa Fluor 350	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	A22281	Reagente opzionale per la funzionalizzazione mirata all'actina
Pluronic F-127	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	P3000MP	Utilizzato per facilitare il caricamento di Fluo-4 AM per la rilevazione del calcio in cellule vive²⁺ imaging
Alimentatore programmabile in corrente continua regolato	Tongmen	eTM-L605SPL (60 V, 5 A)	Utilizzato per alimentare l'elettromagnete personalizzato per la generazione di un campo magnetico a gradiente in vitro
Cellule di Schwann RSC96	Banca cellulare dell'Accademia cinese delle scienze	N/A	Linea cellulare di cellule di Schwann derivata da ratto
Dodecilsolfato di sodio (SDS)	Sigma-Aldrich	436143	reagente ACS, ≥99,0%; tensioattivo per microemulsione olio-in-acqua
magnetometro SQUID	Quantum Design Inc.	MPMS-XL	Utilizzato per la misura dell'isteresi magnetica a 300 K
Toluene	Sigma-Aldrich	244511	Anidro, 99,8%; solvente per l'assemblaggio di superparticelle
Microscopio elettronico a trasmissione	FEI	EP 5018/40, Tecnai Spirit Biotwin	Utilizzato per l'osservazione dell'ultrastruttura di tessuti cellulari e nervosi

Riferimenti

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