Articolo metodologico

Immagini 3D con microCT di noduli radicali di Medicago sativa

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DOI:

10.3791/71686

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28 agosto 2026

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1Stowers Institute for Medical Research

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Le leguminose si associano con i batteri del suolo batteri, formando noduli radicali all'interno dei quali i batteri fissano l'azoto atmosferico a beneficio della pianta. La microTC consente un'acquisizione tridimensionale non distruttiva dell'organizzazione del tessuto, delle zone di batteroidi e dei fasci vascolari di questo tessuto radicale opaco e duro, offrendo vantaggi rispetto alle tecniche di imaging tradizionali che richiedono la sezione dei noduli.

Abstract

La relazione simbiotica tra la leguminosa Medicago sativa e il batterio del suolo Sinorhizobium meliloti porta alla formazione di noduli radicali fissatori di azoto. Metodi distruttivi tradizionali, tra cui la sezione in paraffina, la sezione al vibratomo e la crio-sezione, sono stati utilizzati per visualizzare come i batteri colonizzino il nodulo, rendendo estremamente difficile ottenere informazioni tridimensionali affidabili. Questi approcci sono spesso combinati con marcatura fluorescente o colorazioni, che possono introdurre ulteriori stress influenzando la crescita della pianta e la formazione dei noduli. La microTC si è affermata come uno strumento relativamente rapido, semplice e robusto per la biologia vegetale, in grado di visualizzare in modo non distruttivo le caratteristiche istologiche delle piante in tre dimensioni (3D), evitando così artefatti legati alla preparazione del campione e garantendo una ricostruzione 3D ad alta fedeltà. Sebbene la microTC sia stata applicata ai noduli radicali delle leguminose, manca un protocollo dettagliato e ben stabilito che documenti l'intero processo, dalla raccolta delle piante e dalla preparazione del campione fino alla scansione e alla visualizzazione tramite software.

In questo studio, mostriamo un flusso di lavoro microCT passo dopo passo utilizzando Medicago sativa come modello. Il protocollo include l'escissione dei noduli dalle radici, la fissazione, il miglioramento del contrasto, il montaggio, la scansione e la ricostruzione tridimensionale. Vengono evidenziati i parametri critici che influenzano elementi come la qualità dell'immagine, la conservazione del tessuto e il contrasto. Utilizzando questo approccio, è possibile visualizzare in tre dimensioni l'organizzazione generale del tessuto, le cellule infette da batteroidi e i fasci vascolari, senza dover sezionare fisicamente i noduli. La procedura descritta qui fornisce un metodo riproducibile per l'acquisizione di immagini non distruttive ad alta risoluzione di noduli radicali nativi ed è probabilmente adattabile ad altre specie di leguminose, offrendo ai ricercatori uno strumento pratico per lo studio della struttura dei noduli e dell'organizzazione batterica all'interno di essi in 3D.

Introduzione

Le piante della famiglia Leguminosae (o Fabaceae), come Medicago sativa (erba medica), stabiliscono una relazione simbiotica con batteri del suolo fissatori di azoto appartenenti alla famiglia Rhizobiaceae, come Sinorhizobium meliloti, portando alla formazione di noduli radicali. La pianta rilascia flavonoidi per attirare i batteri in condizioni di carenza di azoto. Questo stimola l'espressione dei fattori Nod nei batteri simbiotici, innescando l'arrotolamento dei peli radicali e la successiva formazione di una camera d'infezione attorno ai batteri1,2,3,4. Un tubo di infezione si forma a partire da una zona indebolita della parete della camera, creando un tubo allungato che trasporta i batteri attraverso la cellula del pelo radicale5. Quando il tubo di infezione raggiunge il cortice interno, una serie di divisioni cellulari avvia la formazione di un organo radicale specializzato chiamato nodulo radicale1,2,5. I batteri quindi infettano la cellula del nodulo e vivono all'interno delle cellule, circondati dalla membrana del simbioma all'interno della cellula. In questo ambiente, la pianta fornisce ai batteri carbonio e altri nutrienti. In cambio, i batteri fissano l'azoto per la pianta, convertendo l'azoto atmosferico non utilizzabile in ammoniaca, una forma utilizzabile dalla pianta2,3,4. Pertanto, il nodulo radicale funziona come una fondamentale fabbrica biologica per la fissazione dell'azoto, sostenendo la crescita della pianta anche in assenza di fertilizzanti azotati sintetici. Questo processo di fissazione biologica dell'azoto è importante dal punto di vista economico e ambientale poiché consente alle leguminose di crescere senza l'uso di fertilizzanti sintetici6. Inoltre, alcune leguminose formano noduli indeterminati che presentano zone distinte in cui i batteri si differenziano e fissano l'azoto in modo più efficiente4. È quindi fondamentale visualizzare sia l'esterno che l'interno del nodulo (dove i batteri occupano fisicamente le cellule vegetali all'interno del nodulo) per studiare nel dettaglio la fissazione biologica dell'azoto. Tuttavia, si tratta di un organo opaco, pieno della proteina vegetale di colore rosso chiamata legoemoglobina, il che rende difficoltosi i metodi tradizionali di imaging.

Le tecniche di imaging utilizzate in passato erano distruttive. Per produrre sezioni di tessuto sono state impiegate la microtomia in paraffina, la microtomia al vibratomo e la crio-microtomia, ma queste alterano lo stato nativo del tessuto e introducono artefatti che complicano la ricostruzione tridimensionale (3D)6,7,8,9,10. È stata completata con successo la ricostruzione a partire da sezioni di tessuto nodulare inclusi in paraffina, ma tale metodo utilizza campioni disidratati e richiede oltre 200 sezioni individuali8. In singole sezioni è possibile osservare porzioni del sistema vascolare, ma non come i fasci si dividano e si avvolgano attorno al nodulo. Sono state eseguite varie tecniche di marcatura e colorazione fluorescente su sezioni di tessuto prima della microscopia confocale, ma queste tendono a presentare i seguenti problemi8,9,10: (i) il tessuto nodulare vegetale è altamente autofluorescente, (ii) molti metodi richiedono una chiarificazione del tessuto prima dell’imaging, (iii) la colorazione fluorescente può danneggiare il tessuto nodulare, (iv) l’inoculazione delle piante con batteri marcati con proteina verde fluorescente (GFP) introduce uno stress che influisce sia sulla crescita della pianta sia sulla formazione dei noduli, e (v) i noduli nativi sono troppo grandi per consentire con facilità la sezione dell’intero campione5,11.

Comunemente impiegata in ambito medico, l'immagine mediante tomografia computerizzata (CT) è utilizzata a scopi sia diagnostici che terapeutici12,13. Una versione ridotta di questa tecnica, la microtomografia a raggi X (MicroCT), è un metodo di imaging che consente la visualizzazione tridimensionale (3D) non distruttiva di piccoli campioni. Mentre nella CT la macchina ruota attorno a un soggetto di dimensioni maggiori, nella microCT il soggetto più piccolo ruota vicino alla sorgente di raggi X. Ciò permette di ottenere una risoluzione molto più elevata. La microCT è stata applicata alla biologia dello sviluppo animale, ma si è affermata anche come strumento promettente in biologia vegetale6,10,14,15,16,17,18,19. In particolare, la microCT e la tomografia a raggi X basata su sincrotrone sono state ampiamente utilizzate in fisiologia vegetale per studiare l'embolia del xilema e per confrontare le stime basate sull'imaging con misurazioni idrauliche convenzionali20,21,22. Poiché consente di immaginare organi integri su scale senza ricorrere a sezioni fisiche, la microCT preserva le relazioni spaziali all'interno dell'intero nodulo. Con opportuni agenti di contrasto, è in grado di risolvere strutture a livello tissutale come i fasci vascolari e le zone di infezione, e può penetrare oltre i limiti imposti dalla dispersione della luce nei metodi ottici convenzionali, risultando particolarmente utile per noduli opachi e autofluorescenti. I campioni possono inoltre essere riesaminati, integrati in flussi di lavoro correlativi successivi all'elaborazione mediante microscopia ottica o elettronica, oppure archiviati per analisi future. Sebbene alcuni studi abbiano utilizzato la microCT e la CT a raggi X basata su sincrotrone per analizzare i noduli radicali della soia, non esiste una documentazione dettagliata che copra l'intero processo, dalla raccolta e colorazione dei noduli fino all'imaging e alla ricostruzione, specialmente per noduli di piccole dimensioni come quelli del trifoglio6,14. Il contrasto ai raggi X dipende dalla densità del tessuto, e la maggior parte dei tessuti vegetali ha una densità bassa e attenua poco i raggi X. Senza un agente di contrasto, i noduli non possono essere distinti dallo sfondo in una microCT convenzionale da banco. Abbiamo utilizzato l'acido fosfotungstico (PTA), un colorante non specifico che si lega a proteine e altre biomolecole ed è stato dimostrato produrre un elevato contrasto nei tessuti vegetali14.

Questo studio fornisce un protocollo dettagliato, passo dopo passo, per l'immagine microCT dei noduli radicali delle leguminose, utilizzando la medicazione come modello, su un sistema convenzionale basato su laboratorio che rappresenta un'alternativa più accessibile alla microscopia a raggi X (XRM) e alle piattaforme basate su sincrotrone6,14. Questo flusso di lavoro include istruzioni specifiche per il raccolto dei noduli dalla radice, fissazione, colorazione, miglioramento del contrasto, montaggio, scansione, ricostruzione tridimensionale e analisi (Figura 1). Tra questi passaggi, forniamo parametri dettagliati per garantire un montaggio stabile, la ritenzione dell'umidità e un buon contrasto. In definitiva, questa procedura microCT costituisce un metodo riproducibile che permette la visualizzazione non distruttiva ad alta risoluzione di caratteristiche istologiche tridimensionali, compresa l'organizzazione generale del tessuto, l'occupazione batterica delle cellule vegetali, le distinte zone di fissazione dell'azoto e i fasci vascolari dei noduli radicali interi di medicazione nel loro stato naturale. Riteniamo che questo protocollo sarà adattabile ad altre specie di leguminose, offrendo ai ricercatori un metodo pratico per visualizzare in forma integra la struttura e l'organizzazione tridimensionale di questo organo radicale di grande importanza.

Protocollo

1. Raccolta e fissazione dei noduli

  1. Usare un bisturi (vedere Tabella dei Materiali) per effettuare un taglio dritto attraverso la radice su entrambi i lati della nodosità di interesse, lasciando la nodosità attaccata alla radice (Figura 2).
  2. Trasferire da otto a dodici nodosità in un vial di vetro da 20 mL contenente 10 mL di etanolo al 70% (v/v) (vedere Tabella dei Materiali).

2. Colorazione dei noduli

  1. Preparare una soluzione al 1% (p/v) di PTA in etanolo al 70% aggiungendo 2 g di polvere di PTA in 200 mL di etanolo al 70% in un flacone quadrato da 200 mL con bocca larga (vedere Tabella dei Materiali). Agitare fino a completa dissoluzione, quindi conservare a 4 °C. Preparare la soluzione colorante un giorno prima dell'uso.
  2. Rimuovere l'etanolo al 70% utilizzato durante la fissazione e sostituirlo con 10 mL di soluzione al 1% di PTA (vedere Tabella dei Materiali).
  3. Posizionare il vial di vetro su un agitatore orbitale a temperatura ambiente a 80 rpm per 4 settimane. Sostituire la soluzione colorante con 10 mL di soluzione fresca al 1% di PTA ogni settimana (vedere Tabella dei Materiali, Figura 2).

3. Montaggio del nodulo

  1. Fondere la paraffina utilizzando una piastra riscaldante a 100 °C in un becher di vetro da 100 mL aperto (Vedere Tabella dei Materiali).
  2. Selezionare le punte per pipetta da 200 µL per l'inclusione del campione. Sigillare le punte all'estremità stretta immergendole leggermente (1–2 mm) nella paraffina fusa (Vedere Tabella dei Materiali).
  3. Lavare il campione in 2 mL di etanolo al 70% in una piastra micropozzetti da 35 mm per 5 minuti (Vedere Tabella dei Materiali).
  4. Aggiungere 0,2 g di agarosio a basso punto di fusione in un matraccio Erlenmeyer da 25 mL e mescolare con 20 mL di acqua demineralizzata per ottenere un agarosio al 1% (p/v) a basso punto di fusione. Riscaldare su una piastra riscaldante a 50 °C e agitare alcune volte fino a completa dissoluzione. Successivamente, posizionare il matraccio in un bagno termico regolato a 40 °C (Vedere Tabella dei Materiali).
  5. Aggiungere circa 25 µL di agarosio al 1% a basso punto di fusione nelle punte per pipetta capovolte sigillate e attendere 1 minuto per il raffreddamento (Vedere Tabella dei Materiali).
  6. Prelevare un nodulo e trasferirlo nella punta per pipetta utilizzando pinzette fini per immobilizzarlo nell'agarosio al 1% a basso punto di fusione. Utilizzare una punta per carico gel per posizionare il nodulo il più vicino possibile al lato sigillato con paraffina della punta per pipetta, senza danneggiare il nodulo radicale (Vedere Tabella dei Materiali).
  7. Posizionare le punte con i noduli radicali su un portapunte per consentire la solidificazione dell'agarosio a basso punto di fusione. Una volta solidificato, sigillare l'estremità aperta delle punte per pipetta con Parafilm per mantenere l'umidità (Vedere Tabella dei Materiali). Conservare il campione in frigorifero a 4 °C ed eseguire la scansione dei campioni inclusi entro una settimana.

4. Imaging mediante microCT

  1. Montare i puntali della pipetta a testa in giù su un portacampioni di dimensioni adeguate per consentire il posizionamento più vicino possibile alla sorgente a raggi X e garantire un corretto allineamento del campione (vedere Tabella dei Materiali).
  2. Aprire il software di tomografia computerizzata. Avvitare saldamente il campione sul portacampioni e quindi sullo stadio rotante del microCT (vedere Tabella dei Materiali, Figura 3, Figura Suppletiva 1).
  3. Accendere la videocamera e la sorgente a raggi X, quindi attivare lo schermo di visualizzazione continua dei raggi X (Figura Suppletiva 1).
  4. Regolare verticalmente l'altezza del campione per posizionare la regione di interesse al centro dello schermo di visualizzazione continua dei raggi X. Annotare questa altezza per un uso successivo al passaggio 4.10 (Figura Suppletiva 1).
  5. Con un binning di 512 × 512, regolare la dimensione del pixel (vedere Tabella Suppletiva 1) in modo che il campione occupi la maggior parte del campo visivo della visualizzazione continua a raggi X, lasciando un po' di spazio vuoto su ciascun lato (Figura Suppletiva 1).
  6. Centrare il campione sullo schermo di visualizzazione continua a raggi X ruotandolo ogni 45° e regolandone la posizione al centro (Figura Suppletiva 1).
  7. Modificare il binning a 2048 × 2048 (vedere Tabella Suppletiva 1, Figura Suppletiva 1).
  8. Nel menu Modalità di Scansione, selezionare nessun filtro e impostare la tensione a 50 kV e la corrente a 40 µA (vedere Tabella Suppletiva 1, Figura Suppletiva 1).
  9. Eseguire una correzione del campo piatto spostando il campione verso il basso a 68 mm in modo che non sia visibile nel campo di vista dello schermo di visualizzazione continua a raggi X. Disattivare Correzione del Campo Piatto e impostare il Tempo di Esposizione in modo che la trasmissione media dei raggi X sia del 55%. Riattivare Correzione del Campo Piatto (vedere Tabella Suppletiva 1, Figura Suppletiva 1).
  10. Riportare il campione all'altezza determinata al passaggio 4.4 (Figura Suppletiva 1).
  11. Nelle Opzioni di Scansione, impostare il nome del file e la cartella di destinazione (Figura Suppletiva 1).
  12. Impostare l'incremento di rotazione a 0,200°. Impostare la Media dei Fotogrammi a 3 e il Movimento Casuale a 30. Selezionare la scansione a 360° (vedere Tabella Suppletiva 1, Figura Suppletiva 1).
  13. Se desiderato, regolare la Larghezza Parziale per escludere spazi vuoti eccessivi e ridurre le dimensioni dei dati (Figura Suppletiva 1).
  14. Cliccare su Scansione per avviare l'acquisizione (Figura Suppletiva 1).

5. Ricostruzione dell'immagine

  1. Aprire il software di ricostruzione delle immagini e caricare tutte le proiezioni 2D provenienti dalla scansione (vedere Tabella dei Materiali, Fig. 4).
  2. Fare clic su Anteprima per visualizzare i risultati della ricostruzione nella posizione della linea verde (Figura Supplementare 2).
  3. Regolare l'istogramma nella scheda Output. Eliminare l'area piatta sulla destra e mantenere il valore a 0 o leggermente inferiore a 0 sulla sinistra (Figura Supplementare 2).
  4. Nella scheda Inizio, fare clic su Ottimizzazione per l'allineamento post-operatorio. Iniziare con il passo Parametro pari a uno e il Numero di prove pari a cinque. Fare clic su Avvia e OK. Quando i risultati appariranno nella scheda Output, fare clic sulla finestra prv e scorrere i risultati per scegliere l'allineamento migliore. Lasciare l'immagine sul risultato ottimale (Figura Supplementare 2).
  5. Attivare l'area di interesse (ROI) nella scheda Output facendo clic sulla casella accanto a Usa ROI. Scegliere cerchio come forma della ROI. Regolare le dimensioni della ROI in base alle dimensioni del campione lungo il volume dei dati ritornando alla scheda Inizio e spostando la linea verde per visualizzare in anteprima diverse posizioni. Lasciare uno spazio vuoto intorno al campione (Figura Supplementare 2).
  6. Ritornare alla scheda Inizio. Spostare le linee rosse in alto e in basso per eliminare le aree non necessarie nei dati di ricostruzione. Verificare che non siano stati esclusi dati importanti spostando la linea verde vicino alle linee rosse e visualizzando in anteprima le ricostruzioni nella scheda Output (Figura Supplementare 2).
  7. Nella scheda Output, salvare la ricostruzione come immagini TIFF (16 bit) nella posizione desiderata (Figura Supplementare 2).
  8. Ritornare alla scheda Inizio e fare clic su Avvia (Figura Supplementare 2).

6. Visualizzazione 3D

  1. Aprire il software Dragonfly (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: Per ulteriori informazioni su Dragonfly e sulle sue funzionalità, consultare il sito https://dragonfly.comet.tech/
  2. Importare le immagini TIFF ricostruite.
  3. Selezionare tutte le immagini e verificare che la spaziatura delle immagini corrisponda alla Dimensione del pixel dell'immagine ridimensionata nel file di testo della scansione (Figura supplementare 3).
  4. Regolare il livellamento della finestra per ottenere una vista 3D con un buon contrasto (Figura supplementare 3).
  5. Scorrere attraverso i diversi piani di sezione 2D (XY, trasversale; XZ, coronale; YZ, sagittale) (Figura supplementare 3).
  6. Fare clic con il tasto destro sull'immagine ed esportare una schermata della vista per salvare le sezioni desiderate (Figura 4).

Risultati

Abbiamo raccolto due noduli radicali ciascuno da tre piante di M. sativa. Due noduli sono stati utilizzati per confrontare la durata della colorazione, e quattro sono stati sottoposti a imaging dopo la completa colorazione di 28 giorni con PTA al 1% in etanolo al 70% per il miglioramento del contrasto. Utilizzando agarosio al punto di fusione basso all'1% come mezzo di montaggio all'interno delle punte di pipetta, abbiamo ottenuto un ambiente di montaggio con bassa densità ai raggi X attorno al campione. La soluzione di colorazione ha aumentato con successo il contrasto del tessuto vegetale (Figura 5A,B, Figura supplementare 4). Il segnale proveniente dal campione è stato facilmente separato dal fondo e dalla punta della pipetta mediante l'istogramma dei dati, consentendo una visualizzazione tridimensionale priva di ostacoli della struttura esterna e interna dell'intero nodulo radicale (Figura 5A,B).

L'epidermide esterna è visibile, ma mostra un contrasto inferiore rispetto agli altri tessuti (Figura 5C–E). D'altra parte, i fasci vascolari sono chiari e ben connessi dalla base alla sommità del campione (Figura 5A,B). In sezioni trasversali, è possibile osservare chiaramente il numero e la ramificazione di questi fasci (Figura 5C). Inoltre, il tessuto interno presenta un buon contrasto, che permette l'identificazione della corteccia e delle vacuole vegetali (Figura 5C–E). L'elevato contrasto facilita anche il riconoscimento delle cellule infette e non infette (Figura 5C–E). Le sezioni coronali e sagittali rivelano la distribuzione delle zone meristematica, di infezione e di differenziazione (Figura 5D). Video Supplementare 1 mostra una vista a 360° di un nodulo ricostruito in 3D.

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Figura 1: Flusso del protocollo. Panoramica del flusso di lavoro per l'utilizzo della microCT nell'immagine dei noduli radicali delle leguminose e dei tempi necessari per ciascun passaggio. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Noduli radicali di M. sativa per questo protocollo. (A) Pianta di M. sativa a 28 giorni dall'inoculo con batteri S. meliloti (28 dpi). Le linee tratteggiate nere indicano i tagli consigliati per l'asportazione dei noduli mostrati. Per ogni pianta sono stati asportati due noduli, per un totale di tre piante, e sono stati analizzati quattro campioni. (B) Nodo di M. sativa a 28 dpi dopo 4 settimane di colorazione con PTA. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: Panoramica del set-up del campione per microCT. Il nodulo radicale colorato con un agente di contrasto viene stabilizzato in agarosio a basso punto di fusione all'interno della punta di una micropipetta. La punta della micropipetta è sigillata su un'estremità con cera paraffinica e fissata sullo stadio di rotazione all'interno della macchina microCT. La sorgente a raggi X (senza filtro) si trova su un lato della macchina e i raggi attraversano il campione per raggiungere il rivelatore di raggi X sull'altro lato. L'analisi produce una proiezione 2D basata sulla densità del tessuto. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Esempio di ricostruzione dell'immagine e visualizzazione 3D. (Sinistra) Proiezione 2D. (Centro) Sezione ricostruita. A1, B1 e C1 mostrano sezioni trasversali ricostruite nelle posizioni A, B e C della proiezione 2D microCT. (Destra) Una visualizzazione 3D del nodulo radicale ottenuta a partire dalle immagini ricostruite. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 5: Immagini rappresentative annotate. (AAnnotato Visualizzazione 3D di M. sativa nodulo radicale.B) Contorni rossi, blu e verdi su un'immagine 3D che mostrano la sezione trasversale (C), coronale (D) e sagittale (E) rispettivamente. Sezioni trasversali annotate (C), coronale (D) e sagittale (Esezioni di M. sativa nodo radicale. Abbreviazioni: c – corteccia; e – epidermide; ic – cellula infettata; r – radice; uc – cellula non infettata; v – vacuolo; vb – fascio vascolare; ZI – Zona I (meristematica); ZII – Zona II (di infezione); ZIII – Zona III (di differenziazione). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1. Schermate del software per l'imaging microCT. (A1) Aprire e chiudere la porta della camera. (A2) Attivare la vista della telecamera. (A3) Accendere la sorgente a raggi X. (A4) Attivare la vista continua ai raggi X. (A5) Regolare l'altezza del campione. (A6) Regolare la dimensione del pixel. (A7) Ruotare il campione. (A8) Modificare il binning. (A9) Cambiare il filtro. (A10) Opzioni per accedere alle modalità di scansione. (A11) Impostare la tensione e la corrente della sorgente a raggi X. (A12) Fare doppio clic per disattivare la correzione del campo piatto. (A13) Opzioni di scansione. (B1) Correzione del campo piatto disattivata. (B2) Opzioni per accedere alle modalità di scansione. (B3) Trasmissione media dei raggi X. (B4) Regolare il tempo di esposizione. (B5) Aggiornare i campi piatti. (C1) Assegnare un nome al file e scegliere dove salvare i dati. (C2) Impostare l'incremento angolare, la media dei fotogrammi, il movimento casuale e la scansione a 360 gradi. (C3) Regolare l'ampiezza parziale. (C4) Avviare la scansione.Cliccare qui per scaricare il file.

Figura supplementare 2. Screenshot del software per la ricostruzione dell'immagine. (A1) Scegliere dove anteprima il campione. (A2) Anteprima del campione. (A3) Regolazione fine dei parametri. (A4) Impostare il numero di prove e il passo del parametro per l'allineamento post-operatorio. (A5-6) Parte superiore e inferiore dell'area di ricostruzione. (A7) Avviare la ricostruzione. (B1) Regolare il contrasto. (B2) Visualizzare e scorrere i risultati dell'allineamento post-operatorio. (B3) Creare un'area di interesse circolare (ROI). (B4) Scegliere il formato del file e dove salvare i dati.Cliccare qui per scaricare il file.

Figura supplementare 3. Screenshot del software per la visualizzazione 3D. (A) Informazioni sulla spaziatura dell'immagine. (B) Strumenti per selezione, rotazione e zoom (in alto). Regolazione del livello della finestra per il contrasto (in basso). (C) Visualizzazione della barra di scala (in alto). Modifica del colore di sfondo (in basso). Cliccare qui per scaricare il file.

Figura supplementare 4. Ricostruzione con microCT dopo colorazione con PTA per 14, 17 e 28 giorni. (A) Sezione ricostruita di M. sativa dopo 14 d di colorazione con PTA mostra rumore nel livello esterno (n = 1). (B) Sezione ricostruita di M. sativa dopo 17 d di colorazione con PTA mostra un contrasto maggiore nel livello esterno ma una minore chiarezza nell'interior rispetto a (A) (n = 1). (C) Sezione ricostruita di M. sativa dopo 28 d di colorazione con PTA mostra un contrasto maggiore sia nei livelli esterni che interni rispetto a (A) e (B) (n = 4).Cliccare qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: Parametri per l'imaging microCT.Cliccare qui per scaricare il file.

Video supplementare 1: Video del nodulo in 3D.Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

Di seguito sono riportate alcune raccomandazioni sulla preparazione del campione e sulla colorazione. Durante la preparazione del campione per l'analisi microCT, l'escissione accurata dei noduli è essenziale per preservare l'integrità strutturale. Si raccomanda di mantenere un breve segmento della radice su entrambi i lati del punto di attacco del nodulo per conservare il contesto spaziale e ridurre al minimo i danni ai tessuti. L'uso di un agente di contrasto è fondamentale per aumentare l'attenuazione ai raggi X e visualizzare le caratteristiche anatomiche interne14. Uno studio precedente che ha utilizzato la colorazione con PTA ha dimostrato che è necessario un periodo minimo di colorazione di 14 giorni per ottenere un contrasto sufficiente tra diverse specie vegetali e tipi di tessuto, senza evidenza di sovra-colorazione14. In tale studio, i noduli radicali della soia indotti da Bradyrhizobium (fissati a 14 dpi) sono stati colorati per 35 giorni14. Utilizzando questo intervallo (14–35 giorni) come riferimento, abbiamo effettuato prove preliminari di colorazione sui nostri campioni di noduli in diversi punti temporali (14, 17 e 28 giorni) e abbiamo confrontato il contrasto delle immagini ottenute. Per questo protocollo è stato scelto un periodo di colorazione di 28 giorni, poiché ha fornito un contrasto migliore, contorni cellulari più nitidi e una colorazione più uniforme rispetto ai tempi più brevi (Supplementary Figure 4). Si precisa che le ricostruzioni a 14 e 17 giorni derivano da un singolo nodulo e non da uno studio replicato sistematicamente, mentre la condizione a 28 giorni include tutti e quattro i noduli scansionati, e la durata della colorazione dovrebbe essere adattata in base alla risoluzione richiesta per lo studio. Un periodo di 28 giorni non è comunque breve. Come suggerito in studi precedenti, la colorazione assistita da microonde potrebbe favorire una penetrazione più rapida del PTA e quindi ridurre la durata necessaria della colorazione14. Agenti a base di iodio, come la soluzione di Lugol, vengono inoltre utilizzati per aumentare il contrasto nei tessuti vegetali23,24. Abbiamo scelto il PTA sulla base delle sue prestazioni dimostrate nel tessuto nodulare e non abbiamo confrontato diversi agenti di colorazione, poiché l'obiettivo principale di questo studio era stabilire un singolo protocollo riproducibile14. Studi futuri dovrebbero testare altri coloranti su diverse specie vegetali e tipi di tessuto.

Anche un'incubazione corretta è di uguale importanza. Il campione deve rimanere completamente ricoperto da agarosio a basso punto di fusione per evitare la disidratazione e mantenere la sua morfologia naturale. Dopo l'incubazione, i campioni devono essere conservati tutta la notte a 4 °C per garantire la solidificazione dell'agarosio e mantenere la stabilità durante la scansione. Il campione montato deve essere fissato in modo sicuro alla piattaforma di scansione per prevenire artefatti dovuti a spostamenti o vibrazioni durante l'acquisizione dei dati.

La microCT consente una visualizzazione tridimensionale non distruttiva dell'intero tessuto del nodulo con una risoluzione più grossolana rispetto alla microscopia ottica ed elettronica. Sia la microscopia a raggi X (XRM) sia la tomografia computerizzata a raggi X basata su sincrotrone forniscono generalmente immagini di qualità e risoluzione superiori rispetto alla microCT convenzionale. La tomografia a raggi X basata su sincrotrone permette inoltre di scansionare direttamente campioni freschi e non colorati, poiché l'elevato flusso di fotoni e la coerenza del fascio consentono un'acquisizione rapida e un contrasto sufficiente senza l'uso di agenti di contrasto6. Il confronto diretto con Duncan et al. (2022)14 e Nakhforoosh et al. (2024)6 è limitato dalle differenze nel disegno dello studio: specie (soia vs Medicago sativa), tipo di nodulo (determinato vs indeterminato) e modalità di imaging (XRM e tomografia a raggi X basata su sincrotrone vs microCT convenzionale). Tuttavia, la dimensione nominale del pixel delle nostre ricostruzioni del nodulo è di circa 1,75 µm, più fine rispetto alla scansione del nodulo in Duncan et al. (2022)14 (2,2 µm, Figura 4A), anche se le loro ricostruzioni mostrano ancora una chiarezza maggiore rispetto alle nostre. Ciò probabilmente riflette il fatto che la risoluzione effettiva dipende da più fattori rispetto alla dimensione nominale del pixel; la magnificazione ottica delle lenti obiettivo dell'XRM, la sensibilità del rivelatore, la stabilità della sorgente, la qualità della telecamera e i metodi di ricostruzione contribuiscono tutti al risultato. Sebbene caratteristiche grandi e a bassa densità come le vacuole siano facilmente distinguibili, come mostrato qui, non è possibile distinguere l'occupazione delle singole cellule da parte di batteroidi e di organelli più piccoli o meno densi, né catturare in tempo reale processi biologici dinamici. Gli agenti di contrasto a base di PTA e iodio sono non specifici e non possono rivelare l'identità molecolare. Le domande a livello subcellulare richiederanno comunque microscopia a fluorescenza o microscopia elettronica. Questi approcci di imaging sono complementari: la microCT è particolarmente adatta allo studio della morfologia dell'organo intero e dell'architettura tissutale tridimensionale, fornendo un contesto per la microscopia ottica ed elettronica, che invece analizzano dettagli strutturali e molecolari più fini.

Abbiamo replicato con successo questo protocollo utilizzando noduli raccolti in tempi simili e a stadi di sviluppo comparabili da M. sativa inoculata con altri ceppi di S. meliloti, e da M. truncatula e Trigonella foenum-graecum inoculate con diversi ceppi di S. meliloti (dati non pubblicati). Non abbiamo testato noduli a stadi di sviluppo diversi, poiché il nostro obiettivo era caratterizzare e fornire un protocollo riproducibile per noduli maturi capaci di fissare l'azoto. Tuttavia, il protocollo dovrebbe essere applicabile anche a noduli a diversi stadi di sviluppo, poiché il limite più rilevante è rappresentato dalle dimensioni del nodulo. I noduli analizzati avevano una lunghezza di circa 2,5 mm (Tabella Supplementare 1). Nel microCT utilizzato in questo studio, la dimensione minima raccomandata è di 1 mm di lunghezza. Le dimensioni massime che possono essere immaginate dipendono dallo strumento impiegato, poiché i livelli di ingrandimento possono variare.

Recenti evidenze suggeriscono che l'occupazione all'interno del nodulo è un parametro importante che correla direttamente con l'efficienza della fissazione dell'azoto. I noduli con una maggiore proporzione di cellule infette hanno dimostrato di fissare meglio l'azoto rispetto a quelli in cui un numero minore di cellule è occupato dai batteri25. Inoltre, la salute del nodulo dipende dall'estensione della vascolarizzazione, e una vascolarizzazione alterata o limitata indica noduli difettosi e una ridotta salute della pianta26. Considerando la possibilità di visualizzare l'occupazione cellulare e l'architettura vascolare, la microTC colma un'importante lacuna nel campo della fissazione dell'azoto. Questo flusso di lavoro rende accessibile in modo non distruttivo la visualizzazione delle strutture interne ed esterne dei noduli radicali, strutture che costituiscono determinanti diretti dell'efficienza di fissazione alla base dell'approvvigionamento simbiotico di azoto per le colture.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Desideriamo ringraziare Stephanie Sage per l'aiuto nella preparazione delle piante. Xia Zhao ha contribuito all'inclusione dei campioni. Siamo grati a Madi Mitchell per la discussione iniziale del progetto. Desideriamo ringraziare Tom Kleist e Kexi Yi per i consigli nell'interpretazione dei dati. Ringraziamo inoltre Keith Duncan (Donald Danforth Plant Science Center) per i consigli relativi al protocollo. Questo progetto è finanziato dallo Stowers Institute for Medical Research.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vial di vetro da 20 mLSigma-AldrichZ190527Utilizzato per contenere i noduli durante la fissazione e la colorazione.
Punte per pipetta da 200 µLFisherbrand02-717-144Utilizzate per contenere i noduli durante l'acquisizione delle immagini.
Piatto con micropozzi da 35 mmFisher Scientific507532924Utilizzato per lavare i noduli dopo la colorazione.
Software DragonflyComet Technologies Canada Inc.V2022.2Utilizzato per visualizzare e manipolare le ricostruzioni 2D in una vista 3D.
EtileneDecon LabsV1001Utilizzato per fissare e lavare i noduli.
Pinzette finiDumontAA-Inox-EUtilizzate per posizionare i noduli all'interno della punta della pipetta.
Punta per caricamento gelCorning (Costar)4853Utilizzata per manipolare il nodulo all'interno dell'agarosio presente nella punta della pipetta.
Piastra riscaldanteMirakSP72725Utilizzata per sciogliere la paraffina e l'agarosio a basso punto di fusione.
Agarosio a basso punto di fusioneGeneMate490001-602Utilizzato per l'inclusione dei noduli radicali al fine di mantenere l'orientamento e l'umidità.
MicroCTBrukerBruker SkyScan 1272Utilizzato per la scansione del nodulo.
Software NReconBrukerV2.2.0.6Utilizzato per la ricostruzione delle proiezioni 2D.
Agitatore orbitaleVWR77591-858Utilizzato per agitare il nodulo radicale ed accelerare la penetrazione del colorante.
ParaffinaMcCormick Scientific39503002Utilizzata per sigillare l'estremità stretta della punta della pipetta.
ParafilmAlkali ScientificPM996Utilizzato per sigillare le punte della pipetta e prevenire l'essiccazione del campione.
Acido fosfotungsticoElectron Microscopy Science (EMS)19500Utilizzato per la colorazione dei noduli.
Portacampioni - L 3,4 cm D 0,63 mmBrukerSet da Bruker con macchinaUtilizzato per tenere la punta della pipetta e il campione durante l'acquisizione delle immagini.
Lama chirurgicaFisher ScientificS07890Utilizzata per il prelievo dei noduli radicali.
Software SkyscanBrukerv1.5.1.0Utilizzato per controllare il MicroCT.
Bagno termicoBoekel Grant640013001Utilizzato per mantenere l'agarosio liquido durante l'inclusione dei noduli.

Riferimenti

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