Flusso di lavoro per la citomorfologia digitale automatizzata del sangue periferico e del midollo osseo, tenendo conto delle critiche errate di classificazioni cellulari

Sommario

Viene descritto il flusso di lavoro della citomorfologia digitale automatizzata del sangue periferico e del midollo osseo. Dopo la preparazione e la colorazione standardizzate dello smear, uno scanner cattura immagini dei campioni. Il software basato sull'IA individua, registra e classifica preliminarmente le cellule nucleate, seguito da una revisione degli esperti. L'attenzione è rivolta alle critiche errate classificazioni cellulari con potenziale di diagnosi errate.

Abstract

Crescenti evidenze supportano la capacità della citomorfologia digitale automatizzata (ADM) alimentata dall'IA del sangue periferico (PB) e del midollo osseo (BM) di assistere le decisioni da esperti. Viene descritto il flusso di lavoro ADM per i PB e BM smear. I componenti fondamentali della tecnologia ADM includono meccanica di precisione, sistemi di imaging avanzati, intelligenza artificiale (IA) e un'interfaccia intuitiva. Il processo inizia con la preparazione e la colorazione standardizzate dello smear utilizzando protocolli adattati per l'automazione e la digitalizzazione. Un microscopio automatico dotato di un obiettivo a immersione e di una fotocamera digitale cattura immagini ad alta risoluzione del campione a più ingrandimenti. Il software basato su IA localizza, registra e classifica preliminarmente le cellule nucleate, inclusi i megacariociti quando applicabile. A questo segue una revisione obbligatoria degli esperti e, se necessario, una riclassificazione. Immagini digitali e report vengono successivamente memorizzati su un server locale ad alta capacità. I principali vantaggi dell'ADM includono maggiore velocità, gestione efficiente dei dati, supporto educativo, accesso remoto per valutazioni e consulenze, archiviazione digitale e integrazione multimodale dei dati. La limitazione più significativa dell'ADM è il rischio di errata classificazione cellulare critica, che può avere un impatto clinico significativo. Le classificazioni errate irrilevanti sono tollerabili e diagnosticamente neutre, mentre le classificazioni errate rilevanti sono inaccettabili e possono portare a gravi conseguenze diagnostiche e cliniche. La classificazione critica errata di linfociti neoplastici, piccoli linfoblasti/mieloblasti, monoblasti granulari, promonociti e monociti displastici, plasmablasti e plasmocellule immature—tutti con morfologia atipica—comporta un rischio di diagnosi errate. Sono necessari ulteriori progressi per ottenere prestazioni diagnostiche affidabili. Dati di addestramento estesi e di alta qualità, combinati con una validazione regolare, sono essenziali per garantire che l'IA funzioni come uno strumento di supporto efficace per il giudizio diagnostico.

Introduzione

La corretta valutazione citomorfologica dei test di sangue periferico (PB) e midollo osseo (BM) rimane una pietra angolare della diagnostica multidisciplinare in emato-oncologia, influenzando i punti critici di decisione^clinica 1,2,3,4. Vi sono evidenze di una variabilità sostanziale tra e intra-esperti nell'analisi manuale del pap e del frottis BM, con effetti a valle sulla diagnosi^{del paziente} 2,5,6,7,8,9. I recenti progressi nell'analisi delle immagini, nell'apprendimento automatico e nella patologia computazionale hanno permesso la valutazione automatica dei test di PB e BM a un livello che può integrare la revisione citomorfologica^{degli esperti} 1,2,3,4,10,11,12,13,14 . La citomorfologia digitale automatizzata (ADM) alimentata dall'intelligenza artificiale (IA) di PB e BM può supportare la microscopia ottica laboriosa e dispendiosa in termini di tempo e il processo decisionale da esperti 1,2,3,4,11,12.

Gli elementi fondamentali della tecnologia ADM includono la preparazione e la colorazione standardizzate dello smear, uno scanner con capacità avanzate di imaging, IA e un'interfaccia efficiente e user-friendly. La meccanica di precisione dell'ADM funziona ad alta velocità a livello micrometrico, mentre le soluzioni di imaging avanzate garantiscono un'alta qualità dell'immagine¹⁴. Un'interfaccia intuitiva rende questa tecnologia sofisticata accessibile in modo intuitivo e snello¹⁴.

L'ADM è da tempo utilizzato per le valutazioni PB, dove è altamente sviluppato ed è diventato parte integrante dei flussi di lavoro standard di laboratorio. Nelle valutazioni BM, tuttavia, l'ADM presenta sfide dovute a pattern citomorfologici complessi e intricati, a un alto numero di tipi cellulari distinti e alla somiglianza morfologica delle cellule^{precursori 2}. La capacità di classificazione dell'IA si basa sull'addestramento con grandi e completi dataset di immagini contenenti fino a diversi milioni di cellule. Tutte le cellule incluse in questi dataset di addestramento sono revisionate e annotate dagli esperti. Questo contributo esperto, tra gli altri fattori, ha un impatto diretto sulla qualità della classificazione.

Tuttavia, alcune cellule PB e BM rimangono particolarmente difficili da classificare per l'ADM, il che può influenzare significativamente la diagnosi^{citomorfologica 2,12,15}. Le errate classificazioni cellulari critiche restano il principale limitamento dell'ADM e possono avere gravi conseguenze cliniche, compromettendo così l'affidabilità del metodo².

Il nostro obiettivo è presentare un flusso di lavoro pratico per l'ADM, includendo i suoi passaggi specifici e il processo di revisione degli esperti. Una rendicontazione dettagliata del processo ADM utilizzando due piattaforme analitiche come esempi permetterà agli utenti di sfruttare appieno le capacità e i benefici del metodo. L'elevata accuratezza della classificazione dell'ADM per PB è stata dimostrata in numerosi studi 12,15,16. Pertanto, nella nostra ricerca, ci siamo concentrati esclusivamente sull'ADM per BM, dove i dati affidabili di validazione di questo tipo sono limitati. I risultati di validazione quantitativa si basano sull'analisi BM. Inoltre, sottolineiamo un limite chiave del metodo, ovvero le classificazioni critiche errate. Proponiamo inoltre una categorizzazione delle errate classificazioni e evidenziiamo i tipi più comuni di errata classificazioni critiche.

Protocollo

Il nostro studio, pubblicato nel 2025^, ha utilizzato materiale d'archivio ed è stato condotto in conformità con i principi aggiornati della Dichiarazione di Helsinki. I pazienti fornivano un consenso informato scritto per l'esame di laboratorio, la raccolta e l'analisi anonima dei dati e l'uso della ricerca, inclusa la pubblicazione di dati immagini anonimizzate. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico Locale dell'Ospedale Havířov (approvazione IGS_2023_HEM_PAT).

NOTA: Il protocollo ADM per PB e BM, dopo la colorazione automatica, viene riportato.

1. Preparazione e colorazione di frotti periferici di sangue e midollo osseo utilizzando uno strumento automatico

1. Prima di accendere lo strumento, esegui i seguenti controlli: condizioni del tubo, connessione alla rete, stato del contenitore dei rifiuti, reagenti sufficienti e una fornitura adeguata di vetrine microscopiche.
   NOTA: I contenitori dei reagenti non devono essere vuoti e tutti i reagenti devono essere entro la scadenza.
2. Accendi lo strumento.
3. L'unità principale effettua automaticamente un autocontrollo.
4. Accedi al software usando un nome utente e una password validi.
5. Usa lo strumento utilizzando le versioni software attuali. Segui le raccomandazioni del produttore e il manuale utente (schermata principale—Figura 1).
6. Usa il Menu per selezionare le operazioni, la Worklist per gestire le richieste di preparazione delle slide e dello smear, il Browser per rivedere i dati nelle richieste e la scheda Stato per controllare lo stato dello smear in preparazione.
7. Scarica una nuova richiesta di preparazione delle diapositive dal computer ospitante o crea una nuova richiesta.
   NOTA: Utilizzare vetrine con bordi smussati e arrotondati di misura 24,7–26,3 mm per 74,7–76,3 mm, con larghezza 0,9–1,2 mm e bordo opaco di 15–20 mm.
8. Modifica o elimina le richieste di preparazione delle slide secondo necessità.
9. Prepara la squash:
   1. Usa sempre guanti in lattice o nitrilo quando maneggia campioni e froti di PB e BM.
   2. Seleziona la modalità di preparazione dello smear.
   3. Metti il portacampioni nel campionatore.
      NOTA: Usa solo tubi campione appositamente approvati dal produttore del tintore.
   4. Controlla che il vetro spreader sia integro, completamente pulito e posizionato in modo sicuro nel supporto.
   5. Inizia la preparazione dello smear e la colorazione usando la finestra di dialogo.
   6. Controlla lo stato del pap in preparazione.
10. Esamina i dettagli delle richieste di preparazione delle diapositive.
11. Rimuovi il portacampioni.
12. Rimuovi le vetrine preparate e colorate.
    Checkpoint: la qualità dello smear all'ispezione visiva (post-output) soddisfa i criteri di accettazione definiti? Deve essere presente una zona minima monostrato di lunghezza e densità cellulare adeguate.
13. Esegui ispezioni e pulizie degli strumenti prima dello spegnimento.
14. Spegni lo strumento.
    NOTA:
    Protocollo di colorazione per il sangue periferico-
    Tinta 1: colorazione May–Grünwald; Tinta 2: Colorazione di Giemsa–Romanowski. Tinta non diluita 1 (73 mL) 2:48 min; Colorazione diluita 1 (73 mL, diluente pH 7,0 tampone fosfato, rapporto di diluizione 1:10) 3:36 min. Colorazione diluita 2 (26 mL, diluente pH 7,0 tampone fosfato, rapporto di diluizione 1:10) 4:00 min. Conteggio del risciacquo (439 mL, processo automatizzato)
    1. Essiccazione (processo automatizzato) 3:36 min.
    
    Protocollo di colorazione per il midollo osseo -
    Tinta 1: colorazione May–Grünwald; Tinta 2: Colorazione di Giemsa–Romanowski. Tinta non diluita 1 (73 mL) 3:36 min; Colorazione diluita 1 (73 mL, diluente pH 7,0 tampone fosfato, rapporto di diluizione 1:10) 2:48 min. Colorazione diluita 2 (26 mL, diluente pH 7,0 tampone fosfato, rapporto diluizione 1:10) 10:00 min. Conteggio del risciacquo (439 mL, processo automatizzato)
    1. Essiccazione (processo automatizzato) 3:36 min.
    
    ATTENZIONE: Quando si maneggiano sostanze chimiche in laboratorio, segui le istruzioni contenute nelle loro schede dati ufficiali di sicurezza, che includono composizione, simboli di pericolo, istruzioni di primo soccorso, procedure di risposta d'emergenza per perdite accidentali e incendi, linee guida per la gestione e lo stoccaggio, requisiti per le attrezzature di protezione individuale, informazioni tossicologiche e ambientali, e istruzioni per il trasporto e lo smaltimento. Smaltire liquidi, reagenti e materiali di consumo come rifiuti infettivi medici e/o industriali in conformità con le leggi e i regolamenti locali. Se possibile, utilizza un sistema centrale di smaltimento dei rifiuti.

2. Citomorfologia digitale automatizzata del PB

1. Utilizzare l'applicazione per il conteggio differenziale dei globuli bianchi (GBC), la valutazione della morfologia dei globuli rossi (RBC) e la stima del conteggio piastrinico (PLT). Verifica la classificazione proposta per ciascun tipo di cellula.
   NOTA: L'operatore è un tecnico di laboratorio certificato esperto con almeno cinque anni di esperienza o uno scienziato di laboratorio certificato.
2. Avvia l'analizzatore.
3. Accedi al software usando un nome utente e una password validi.
4. Usa lo strumento utilizzando le versioni software attuali. Segui le raccomandazioni del produttore e il manuale utente.
5. Usa la scheda Vista di Controllo di Sistema per la procedura di controllo qualità (QC) e per l'elaborazione degli ordini.
6. Eseguire il controllo qualità interno giornaliero utilizzando un vetrino di controllo (test di routine PB con conteggio di globuli bianco superiore a 10 × 10⁹/L). Esegui il test di rilevamento delle celle almeno una volta al giorno, che riconosce 100 celle.
   NOTA: Il test di rilevamento cellulare valida il processo di preparazione delle vetrine e verifica la capacità dell'analizzatore di rilevare le cellule. Il vetrino deve essere di qualità sufficiente affinché l'analizzatore possa rilevare le celle necessarie per l'analisi. Per l'accettazione del QC, il 97% delle cellule deve essere rilevato con successo.
7. Usa una pasta di spalmatura preparata con lo strumento per la creazione e la tintura.
8. Metti la macchia macchiata nel cassetto di caricamento dell'analizzatore di carico.
9. Inserire manualmente l'identificazione del test o tramite scanner di codici a barre; La richiesta dal sistema informativo del laboratorio viene caricata automaticamente.
10. Chiudi la porta di ingresso dell'analizzatore.
11. Elabora la macchia.
    NOTA: L'analizzatore sposta automaticamente la macchia sotto il microscopio, la scansiona e cattura immagini dei globuli globulari, oltre a un'immagine monostrato dei globuli rossi. L'analizzatore effettua una classificazione preliminare di tutti i globuli globulari individuati e valuta la morfologia dei globuli rossi.
12. Rivedere i risultati preliminari e riclassificare se necessario, direttamente sull'analizzatore o utilizzando software di revisione remota. Considera le tre opzioni di classificazione proposte, incluse le percentuali di probabilità.
    NOTA: La classifica preliminare automatica richiede solo pochi secondi. Nei casi di classificazioni cellulari ambigue o borderline, è necessaria una doppia lettura. Per le celle con classificazioni diverse, deve essere raggiunto un consenso tra osservatori. La cella riclassificata è etichettata con un segno di spunta nell'angolo in alto a destra dell'immagine.
13. In modalità WBC, rivedere la classificazione preliminare delle cellule nucleate.
    NOTA: I segnalatori di qualità che richiedono morfologia digitale e revisione obbligatoria da esperti includono blasto, granulociti immaturi, linfociti atipici, linfociti reattivi, linfociti neoplastici, monocitosi sopra 1,0 ×^{10 9}/L, linfocitosi superiore a 4,0 × 10⁹/L e conteggio differenziale inaffidabile. Qualsiasi riclassificazione manuale da parte dell'operatore o del patologo deve essere registrata con l'ID utente e il timestamp.
14. Se viene identificata una classificazione errata, riassegnare la cella alla categoria corretta trascinando la sua immagine con il mouse.
    NOTA: Per esempi di errate classificazioni delle cellule PB, vedi la Figura 2.
15. In modalità RBC, si riesamina la valutazione dei cambiamenti morfologici dei RBC e correggi eventuali valutazioni imprecise o aggiungi risultati selezionando caratteristiche patologiche aggiuntive (ad esempio, cellule bersaglio, schistociti, ovalociti).
16. In modalità PLT, rivedere la valutazione PLT.
17. Aggiungi commenti manualmente o seleziona tra opzioni di testo predefinite.
    NOTA: Le regole di auto-verifica devono essere formalmente validate, documentate e revisionate almeno una volta all'anno.
18. Confermare il risultato finale, che viene poi inviato automaticamente al sistema informativo del laboratorio.
    NOTA: Il risultato finale viene esportato come conteggio differenziale numerico insieme a commenti aggiuntivi, se presenti. Per campioni con bassa cellularità (globuli globuli sotto 2,0 × 10⁹/L), due test vengono preparati, scansionati e valutati individualmente.
19. Esci e spegni l'analizzatore.
    NOTA: Viene applicato un conteggio di 100 cellule per ogni campione di PB, seguendo le raccomandazioni^{ICSH 17}. Le categorie di classificazione dei WBC includono blasto, promielocito, mielociti, metamielocito, neutrofilo a banda, neutrofilo segmentato, eosinofilo, basofilo, monocito, linfociti, linfociti varianti e cellule plasmatiche. Le categorie di classificazione non WBC includono cellula sfumge, artefatto, piastrina gigante, gruppo piastrino ed eritrotrotto. Le categorie di classificazione morfologica dei globuli rossi (classi) includono i globuli rossi policromatici, i globuli rossi ipocromici, l'anisocitosi, la macrocitosi, la microcitosi e la poikilocitosi. Začátek formuláře
    
    ATTENZIONE: Quando si maneggiano sostanze chimiche in laboratorio, segui le istruzioni contenute nelle loro schede dati ufficiali di sicurezza, che includono composizione, simboli di pericolo, istruzioni di primo soccorso, procedure di risposta d'emergenza per perdite accidentali e incendi, linee guida per la gestione e lo stoccaggio, requisiti per le attrezzature di protezione individuale, informazioni tossicologiche e ambientali, e istruzioni per il trasporto e lo smaltimento. Smaltire liquidi, reagenti e materiali di consumo come rifiuti infettivi medici e/o industriali in conformità con le leggi e i regolamenti locali. Se possibile, utilizza un sistema centrale di smaltimento dei rifiuti.

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3. Citomorfologia digitale automatizzata della BM

1. Usa il sistema per il conteggio differenziale delle cellule PB e BM. Verifica la classificazione proposta per ciascun tipo di cellula.
   NOTA: Viene descritto l'uso dell'analisi BM. L'operatore è un tecnico di laboratorio certificato esperto con almeno cinque anni di attività, oppure uno scienziato di laboratorio certificato, o un medico certificato.
2. Avvia l'analizzatore.
3. Accedi al software usando un nome utente e una password validi.
4. Usa lo strumento utilizzando le versioni software attuali. Segui le raccomandazioni del produttore e il manuale utente.
5. Usa Project per l'elaborazione degli ordini e la gestione delle diapositive, Modifica per la configurazione delle regole di classificazione e della strategia pre-classificazione, Report per le impostazioni del formato del report e la generazione del report, e la scheda Gestione per le impostazioni dell'account e le regole di firma.
6. Usa una macchia di macchia con lo strumento di colorazione.
7. Inserire manualmente l'identificazione del test o tramite scanner di codici QR (codice a barre); La richiesta dal sistema informativo del laboratorio viene caricata automaticamente.
8. Metti le macchie macchiate nel cassetto di carico dell'analizzatrice.
9. Chiudi la porta di ingresso dell'analizzatore.
10. Elabora la macchia.
    NOTA: L'analizzatore sposta automaticamente la macchia sotto il microscopio, la scansiona e cattura immagini delle cellule nucleate, inclusi i megacariociti. Effettua una classificazione preliminare di tutte le cellule nucleate rilevate, inclusi i megacariociti, in pochi secondi.
11. Rivedere i risultati preliminari e riclassificare se necessario, direttamente sull'analizzatore o utilizzando software di revisione remota.
    NOTA: Il sistema offre una visuale chiara dell'intera diapositiva con un ingrandimento del 400× (imaging a vetrina intera) e mostra tutte le cellule nucleate e i megacariociti; Le cellule nucleate (e possibilmente i megacariociti) vengono catturate a un ingrandimento del 1000× utilizzando un obiettivo di immersione. Il tempo medio per una scansione completa di un test normocellulare è di <10 minuti per vetrina. Per i test ipocellulari, il tempo di scansione è di >20 minuti per vetrina.
12. In caso di classificazione errate, riassegnare la cella alla categoria corretta trascinando la sua immagine con il mouse.
    NOTA: Per un esempio di errata classificazione delle cellule BM, vedi Figura 3. Nei casi di classificazioni cellulari ambigue o borderline, è necessaria una doppia lettura. Per le celle con classificazioni diverse, deve essere raggiunto un consenso tra osservatori. Qualsiasi riclassificazione manuale da parte dell'operatore o del patologo deve essere registrata con l'ID utente e il timestamp.
13. Aggiungi commenti e descrizioni citomorfologiche manualmente o selezionando tra opzioni di testo predefinite.
14. Completa il rapporto preliminare.
15. Confermare il risultato finale, che viene poi inviato automaticamente al sistema informativo del laboratorio.
    NOTA: Il risultato finale viene esportato come conteggio differenziale numerico (mielogramma) insieme a ulteriori commenti e descrizioni citomorfologiche.
16. Esci e spegni l'analizzatore.
    NOTA: Viene applicato un conteggio di 500 cellule per ogni campione BM, seguendo le raccomandazioni^{ICSH 17}.
    Le categorie di classificazione includono proeritrotrotta, eritroblasto precoce (incluso megaloblastico), eritrotrotto intermedio (incluso megaloblastico), eritrotrotto tardivo (incluso megaloblastico), mieloblasto, promielocitito, mielocita neutrofilo, metamielocita neutrofilo, neutrofilo a banda, neutrofilo segmentato, mielocita eosinofilo, metamielocita eosinofilo, eosinofilo banda, eosinofilo segmentato, basofilo, monoblasto, promonocito, monocito, linfoblasto, prolinfocito, maturo linfociti (inclusi atipici e reattivi), plasmablast, plasmocellule immature, plasmoci e altri (cellule sfumate, istiocita, fagociti, mastociti e mitosi).
    
    ATTENZIONE: Smaltire liquidi, reagenti e materiali di consumo come rifiuti infettivi medici e/o industriali in conformità con le leggi e i regolamenti locali. Se possibile, utilizza un sistema centrale di smaltimento dei rifiuti.

Risultati

Studio di validazione – metodi
In questo studio di validazione, riproduciamo i risultati del nostro lavoro precedente pubblicato su Clinical and^{Translational Medicine 2}. Sono state eseguite microscopie ottica convenzionale e ADM su 328 frotti BM. I dati per l'analisi includevano informazioni d'immagine per tutte le cellule analizzate e i risultati di classificazione, inclusi casi morfologici rari e atipici. I casi erano suddivisi in sei gruppi diagnostici: neoplasie mielodisplastiche (MDN: 15%), mieloma multiplo (MM: 14%), neoplasie mature di cellule B/T (linfoma B/T: 13%), leucemia acuta e leucemia mielomonocitotica cronica (AL+CMML: 9%), neoplasie mieloproliferative (MPN: 8%) ed ematopoiesi reattiva (reattiva: 41%). Le capacità di riconoscimento (classificazione) delle cellule ADM sono state valutate valutando la loro capacità di classificare correttamente le cellule in una delle 25 categorie, rispetto all'annotazione consensuale indipendente di esperti con doppia lettura².

Ogni caso è stato esaminato da due esperti, con classificazione corrispondente (annotazione) nel >99% delle cellule. Gli esperti erano molto esperti, partecipando regolarmente a valutazioni di qualità esterne di successo. Per le cellule con classificazioni diverse (<1%), è stato raggiunto un consenso tra osservatori. Il principio dell'analisi di coerenza era un confronto tra la pre-classificazione automatica di ogni cella e la classificazione esperta finale di ciascuna cella; La classificazione consensuale degli esperti è stata considerata il vero riferimento di classificazione (verità di base)².

È stata valutata la coerenza delle classificazioni cellulari e cliniche e sono state identificate classificazioni critiche errate. La consistenza della classificazione cellulare è stata determinata dalla matrice di confusione, basandosi sull'accordo di classificazione per i singoli tipi cellulari. Sono stati applicati metodi statistici standard e il visual data mining. Il coefficiente di correlazione di Matthews (MCC) è stato calcolato per ogni tipo di cella e come valore medio, ed è stato interpretato in modo standard. Un valore MCC di 0,400 e oltre è stato considerato^{soddisfacente 2,18}.

Per ogni paziente, la consistenza della classificazione clinica è stata determinata come la percentuale di elementi correttamente preclassificati tra tutte le cellule valutate nel caso, dopo l'eliminazione delle cellule non classificabili. La classificazione degli esperti è stata considerata il vero riferimento (verità di base)².

Le errate classificazioni sono considerate irrilevanti quando sono diagnosticamente neutrali e non influenzano la diagnosi finale. Queste includono classificazioni reciproche errate tra linfoblasto, mieloblasto e monoblasto; promielociti/mielociti neutrofili, eosinofili e basofili; mielociti/metamielociti; metamielociti/banda; neutrofilo a bande/segmentato; proeritrotrotti/eritrotta precoce; eritrotrotto precoce/intermedio e intermedio/tardo; promonocito/monocito; prolinfociti/linfociti; plasmablast/plasma immaturo; e plasmacellule immature/plasmacellule mature. Tutte le altre classificazioni errate sono considerate rilevanti, poiché diagnosticamente inaccettabili e possono portare a gravi conseguenze cliniche (Figura 4)².

La coerenza complessiva della classificazione clinica è stata calcolata come mediana dei singoli valori dei casi, considerando solo le classificazioni errate cellulari rilevanti. La classificazione critica errata è stata definita come un caso in cui il valore di coerenza della classificazione clinica individuale era inferiore all'80%. Questo limite arbitrario è stato fissato dal consenso degli esperti, considerando i requisiti minimi di valutazione esterna della qualità nei^{round di citomorfologia 2}.

Le differenze chiave specifiche per piattaforma includono un flusso di lavoro BM in due fasi (obiettivo 40× e 100×), l'apporto di complessità aggiuntiva assente dal protocollo PB, obiettivi distinti per il conteggio delle celle (100 celle in PB, 500 celle in BM) e categorie di classificazione variabili. Il determinante condiviso più critico della comparabilità interpiattaforma e inter-campione è la procedura di preparazione dello smear.

Le metriche quantitative di performance riportate sono chiaramente collegate alla coorte di validazione descritta nei Metodi (n = 328 frotte BM). La percentuale di cellule rilevanti correttamente classificate su tutte le cellule classificate (coerenza della classificazione cellulare) era del 95,4%. I valori di correlazione soddisfacenti, come indicato dal MCC, erano ≥0,400 per 22 dei 25 (88,0%) tipi cellulari, mentre i valori insoddisfacenti del MCC (<0,400) sono stati osservati per 3 dei 25 (12,0%) tipi cellulari (linfoblasti, prolinfociti e promonociti). La coerenza clinica complessivamente rilevante era del 97,1% (mediana), con il 94,5% dei casi che mostrava tassi di coerenza compresi tra l'80% e il 100%. Nel 5,5% dei pazienti, è stata osservata una classificazione critica errata con valori di consistenza clinica rilevanti che variavano dal 36% al 79%, a causa del mancato riconoscimento delle cellule^{neoplastiche 2}.

La classificazione errata cellulare compromette l'affidabilità dell'ADM nell'analisi BM e rappresenta una limitazione importante del metodo nell'emato-oncologia diagnostica (Tabella 1). Nei casi che coinvolgevano una classificazione errata rilevante, veniva esaminata la morfologia delle cellule classificate correttamente e erroneamente. Le cellule correttamente classificate generalmente mostrano caratteristiche citomorfologiche tipiche. Al contrario, le errate classificazioni si verificano più spesso quando si distinguono tra cellule morfologicamente simili o atipiche, in particolare linfociti e blasti atipici; mieloblasti e linfociti; linfoblasti e linfociti; monoblasti o promonociti e promielociti; e plasmocellule immature e blasti. Le cellule classificate erroneamente mostrano frequentemente una citomorfologia atipica. Nelle neoplasie linfocitari, i linfociti neoplastici classificati erroneamente, come quelli osservati nei linfomi della zona marginale e nella leucemia a cellule pelose, tendono ad essere di medie dimensioni, con abbondante citoplasma basofilo o pallido, proiezioni citoplasmatiche e cromatina più fine con nucleolo. Queste caratteristiche differiscono da quelle delle cellule neoplastiche correttamente classificate. Nel linfoma a cellule del mantello, i linfociti atipici possono mostrare un aspetto blastoide, aumentando la probabilità di classificazione errata (errata classificazione). Analogamente, nella variante pleomorfa della leucemia linfocitaria cronica, i linfociti neoplastici possono essere erroneamente identificati come blasti. Dimostriamo esempi qualitativi rappresentativi nella Figura 4 e nella Figura 5.

Nella leucemia acuta e nella leucemia mielomonocitaria cronica (CMML), i linfoblasti e i mieloblasti classificati erroneamente sono piccoli, con un alto rapporto nucleare/citoplasmatico, cromatina e nucleoli più grossolani. Numerosi monoblasti granulari possono essere erroneamente classificati come promielociti. Nel CMML, la classificazione errata è frequentemente associata a cellule monocitiche displastiche. Nel mieloma multiplo, si verificano errate classificazioni all'interno della linea delle cellule plasmatiche, in particolare coinvolgendo plasmablasti e plasmacellule immature. Dimostriamo esempi qualitativi rappresentativi nella Figura 5.

Classificazioni critiche errate di linfociti neoplastici, piccoli linfoblasti/mieloblasti, monoblasti granulari, promonociti e monociti displastici, plasmablasti e plasmocellule immature—tutti con morfologia atipica—rappresentano un rischio di diagnosi errate. Confondere il linfoma con leucemia acuta e viceversa può avere conseguenze gravi o addirittura fatali per la gestione del paziente. Risultati falsi negativi, come il mancato riconoscimento della leucemia mieloide acuta (in particolare la leucemia promielocita acuta) o la diagnosi errata di CMML o mieloma multiplo, possono portare a decisioni terapeutiche inappropriate o a ritardi nella terapia.

Figura 1. Coloratore automatico, icone della schermata principale. Per gentile concessione di Sysmex; Materiali informativi del produttore (manuale operativo di base). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Errate classificazioni dei globuli bianchi PB. Negli screenshot del software, le celle classificate erroneamente sono evidenziate in riquadri rosse. Nell'infezione da EBV, i linfociti reattivi sono stati erroneamente classificati come monociti (A, scatola rossa). Nella leucemia linfocitaria cronica, alcuni linfociti sono stati erroneamente classificati come blasti (B, scatola rossa). Nel CMML, i monociti displastici sono stati erroneamente classificati come neutrofili segmentati (C, scatola rossa), e un monoblasto è stato erroneamente classificato come mielocita displastico (D, scatola rossa). PB, CellaVision DC-1, Software di revisione, colorazione automatica May–Grünwald e Giemsa–Romanowski con il tintore Sysmex SP-50, ingrandimento 1000×, esperto: tecnico certificato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Errata classificazione dei linfociti neoplastici nella BM. Screenshot del software. I linfociti neoplastici nei linfomi a cellule B di alto grado nella fascia biologica sono stati erroneamente classificati come mieloblasti. La classificazione alternativa proposta con le cinque opzioni più probabili (la "top five"), incluse le probabilità percentuali, è contrassegnata con una freccia gialla. Per la cellula nella scatola gialla, l'etichetta mostra probabilità percentuali di mieloblasto, monoblasto, linfoblasto, proeritrotblasto ed eritrotrotto precoce, senza opzione per linfociti. BM, Morphogo, Review Software, colorazione automatica May–Grünwald e Giemsa–Romanowski con il tintore Sysmex SP-50, ingrandimento 1000×, esperto: scienziato certificato, medico certificato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Classificazioni errate delle cellule irrilevanti e rilevanti. (A) Esempi di classificazioni errate irrilevanti nelle linee mieloidi ed eritroidi sono mostrati in un confronto tra classificazione degli esperti e pre-classificazione ADM. (B) Esempi di classificazioni errate rilevanti nelle linee linfoide, plasmocellulari e monocitiche sono mostrati in un confronto tra classificazione degli esperti e pre-classificazione ADM. La categorizzazione di alcuni elementi era difficile anche per un esperto. Le immagini cellulari venivano estratte dal software. BM, Morphogo, Review Software, colorazione automatica May–Grünwald e Giemsa–Romanowski con il tintore Sysmex SP-50, ingrandimento 1000×, esperto: scienziato certificato, medico certificato. A ogni cella veniva aggiunta una barra di bilancia. Le barre di scala rappresentano 10 μm. Calibrazione basata sulla fotocamera ToupCam (dimensione pixel 1,85 μm) con obiettivo Olympus Plan N del 100×.
Modificato da: Supplementary Material, Starostka D, Dolezilek R, Kvasnicka HM, Kudelka M, Miczkova P, Kriegova E, et al. L'utilità della citomorfologia digitale automatizzata assistita da intelligenza artificiale per l'analisi del midollo osseo nell'emato-oncologia diagnostica. Clin Transl Med. 2025; 15:e70364. https://doi.org/10.1002/ctm2.70364. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Esempi rappresentativi delle più frequenti errate classificazioni delle cellule BM nei pazienti con neoplasie ematologiche. Linfociti neoplastici, mieloblasti, linfoblasti, monoblasti e plasmocellule neoplastici classificati erroneamente sono evidenziati in alcuni casi selezionati di linfoma della zona marginale (MZL), linfoma a cellule del mantello (MCL), leucemia a cellule pilose (HCL), leucemia linfocitaria cronica (LLC), leucemia mieloide acuta (LMA), leucemia linfoblastica T acuta (T-ALL) e mieloma multiplo (MM). La classificazione errata dei linfociti/blasti atipici è stata l'errore più frequente. Le principali caratteristiche citomorfologiche dei linfociti neoplastici mal classificati includevano dimensioni medie, cromatina più fine (frecce rosse), nucleoli (frecce blu), abbondante citoplasma basofilo o pallido con proiezioni (frecce verdi) e aspetto blastoide (freccia arancione). I linfoblasti e i mieloblasti classificati erroneamente erano piccoli, con un alto rapporto nucleare-citoplasmatico e cromatina più grossolana con nucleoli (frecce grigie). I plasmablasti e le plasmocellule immature sono stati erroneamente classificati come linfociti o non sono stati riconosciuti come appartenenti alla linea delle cellule plasmatiche (classificati come "blast, non specificati"). Le immagini cellulari venivano estratte dal software. Software di recensione BM Morphogo, colorazione automatizzata May–Grünwald e Giemsa–Romanowski con il tintore Sysmex SP-50, ingrandimento 1000×, esperto: scienziato certificato, medico certificato. A ogni cella veniva aggiunta una barra di bilancia. Le barre di scala rappresentano 10 μm. Calibrazione basata sulla fotocamera ToupCam (dimensione pixel 1,85 μm) con obiettivo Olympus Plan N del 100×.
L'immagine è stata modificata da: Supplementary Material, Starostka D, Dolezilek R, Kvasnicka HM, Kudelka M, Miczkova P, Kriegova E, et al. L'utilità della citomorfologia digitale automatizzata assistita da intelligenza artificiale per l'analisi del midollo osseo nell'emato-oncologia diagnostica. Clin Transl Med. 2025; 15:e70364. https://doi.org/10.1002/ctm2.70364. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Diagnosi	Numero di casi	Celle classificate erroneamente
		Classificazione degli esperti	Classificazione ADM
Neoplasie mature delle cellule B	9/43
Linfoma della zona marginale	4/8	Linfociti atipici	Esplosione, NOC
Linfoma a cellule del mantello	2/5	Linfociti atipici	Esplosione, NOC
CLL	1/14	Linfociti atipici	Esplosione, NOC
Leucemia a cellule pelose	2/2	Linfociti atipici	Blast, NOC / Monociti
Mieloma multiplo	5/46	Plasma	Esplosione, NOC
AML	3/16	Mieloblasto / Monoblasto	Linfociti / Promielociti
T-ALL	1/1	Linfoblasti	Linfociti

Tabella 1: Classificazioni critiche errate per ADM. In 18 su 328 (5,5%) dei pazienti, è stata osservata una classificazione critica errata (critica). Il gruppo clinico delle classificazioni critiche errate da parte dell'ADM includeva nove pazienti su 43 con neoplasie mature a cellule B, cinque su 46 pazienti con MM, tre su 16 pazienti con LMA e un (su uno) paziente con T-ALL. La classificazione errata dei linfociti/blastogeni atipici è stata la più frequente. NOC: nessun altro classificato. 
Riprodotto da: Supplementary Material, Starostka D, Dolezilek R, Kvasnicka HM, Kudelka M, Miczkova P, Kriegova E, et al. L'utilità della citomorfologia digitale automatizzata assistita da intelligenza artificiale per l'analisi del midollo osseo nell'emato-oncologia diagnostica. Clin Transl Med. 2025; 15:e70364. https://doi.org/10.1002/ctm2.70364.

Discussione

I progressi tecnologici nell'elaborazione delle immagini ad alta risoluzione, nella classificazione digitale automatizzata delle immagini e nel processo decisionale supportato dall'IA utilizzando reti neurali convoluzionali hanno permesso miglioramenti sostanziali nell'ADM. Di conseguenza, l'ADM integra la microscopia ottica standard. L'identificazione corretta delle singole categorie citomorfologiche può essere impegnativa, in particolare tra gruppi di classificazione strettamente correlati che condividono somiglianze^morfologiche 2,11,12,14,15,19,20. Poiché i risultati degli esperti sono sempre influenzati da un certo grado di soggettività, potrebbero non essere considerati definitivi o gli unici risultati corretti possibili—specialmente nei casi di classificazione cellulare borderline o ambigua (ad esempio, elementi displastici o altamente atipici⁾². Questi schemi di classificazione errata sono stati riportati in PB, mostrando prestazioni più forti per tipi cellulari comuni ma una coerenza di classificazione più debole per alcuni sottoinsiemi clinicamente importanti, inclusi i blasti 12,15,19,20. Questo può influire in modo significativo sulla diagnosi citomorfologica PB e BM.

Rispetto al PB, solo pochi studi si sono concentrati sull'accuratezza della classificazione dell'ADM nell'analisi^BM 2,20,21,22,23. In uno studio cinese sulla classificazione ADM, la coerenza ha raggiunto il 99%, con la maggior parte dei tipi di cellule BM che ha mostrato una correlazione estremamente alta con l'esperienza^{ematopatologica 21}. Tuttavia, la proporzione di neoplasie ematologiche nella coorte dello studio era inferiore al ^30%. Altri studi comparativi che valutano le prestazioni tra i sistemi automatizzati PB e BM di smear e l'analisi manuale sono stati condotti in studi^{multicentrici 22,23}. In un confronto recente, sono stati analizzati 795 campioni di BM di pazienti con neoplastica e altre condizioni cliniche, ottenendo un accordo complessivo del 91,1% con^{microscopia ottica 23}.

Uno studio su una coorte reale di pazienti di ascendenza europea, con condizioni neoplastiche al 59%, ha confrontato l'ADM guidato dall'IA con la microscopia ottica esperta in sei gruppi^{diagnostici 2}. Le errate classificazioni critiche delle cellule neoplastiche con morfologia atipica avevano un potenziale di diagnosi^{errata 2}. Pertanto, questo studio ha identificato tipi di cellule candidate per l'addestramento e il test futuro delle prestazioni dell'IA². Tuttavia, questo studio presentava diverse limitazioni. Innanzitutto, lo studio ha incluso un numero limitato di pazienti e materiale archiviato, e alcuni rari disturbi della mestazione erano assenti, inclusi campioni pediatrici. In secondo luogo, la citomorfologia di alcune cellule neoplastiche era molto anomala, con un consenso discutibile nella classificazione anche tra esperti esperti. In terzo luogo, sono stati analizzati solo campioni di ascendenza europea. Quarto, non è stata effettuata alcuna validazione esterna delle classificazioni errate rilevanti^{e irrilevanti 2}.

Le errate classificazioni cellulari rappresentano la principale limitazione dell'ADM nell'emato-oncologia^{diagnostica 2}. Ci sono diverse ragioni per la classificazione errata. Oltre alla sovrapposizione citomorfologica, i fattori contributivi includono probabilmente la rarità di alcune condizioni e la variabilità nel consenso degli esperti riguardo ai tipi cellulari. Questo può portare a annotazioni incoerenti e a lacune nei dati di addestramento. La rilevazione dei cambiamenti displastici nell'ematopoiesi è inaffidabile, così come la valutazione dettagliata della citomorfologia dei^{megacariociti 2}. Sebbene gli esiti avversi siano in gran parte mitigati dalla supervisione obbligatoria di un esperto, rimangono limitazioni riguardo all'affidabilità assoluta dell'ADM, in particolare nelle leucemie, nei linfomi e nel mieloma^{multiplo 2}. L'annotazione esperta corretta delle celle per l'addestramento dell'IA è un prerequisito essenziale per le prestazioni ADM. Un'etichettatura accurata dei dati è fondamentale per costruire dataset affidabili e con precisione sul campo. In citomorfologia, definire la verità fondamentale può essere particolarmente difficile in casi ambigui o borderline, poiché un certo grado di soggettività persiste anche tra esperti esperti e ampiamente riconosciuti. Quando le opinioni degli esperti differiscono, la verità di base può essere accertata tramite consenso o accordo di maggioranza tra due o più revisori indipendenti di competenza comparabile, soprattutto quando i giudizi diagnostici sono suddivisi in componenti^{separati 2}. È essenziale perfezionare le capacità di classificazione focalizzate su specifici tipi di cellule candidate. Include un riaddestramento mirato su tipi cellulari difficili, strategie di classificazione gerarchica o l'incorporazione di dati multimodali per migliorare la discriminazione tra cellule morfologicamente simili. Dataset di addestramento estesi, diversificati e ben annotati, specialmente nelle neoplasie ematolinfoidi, devono includere una rappresentazione sufficiente della morfologia atipica, delle entità rare, dei casi borderline e delle cellule diagnosticamente ambigue.

Per quanto riguarda i passaggi critici del protocollo e la risoluzione dei problemi, le smear PB devono essere effettuate entro due ore dalla raccolta; l'aspirato di BM deve essere distribuito immediatamente dalla prima aspirazione. È necessario un protocollo di colorazione automatico e validato, mantenuto rigorosamente coerente tra i lotti. È obbligatorio un monolayer ben definito e privo di artefatti. È richiesta una scansione prolungata nei campioni leucopenici di PB e nei test ipocellulari di BM. Olio a immersione esaurito o sbavature sottili causano fallimento dell'autofocus e analisi di aborto. Nessuno dei due sistemi è approvato per la segnalazione autonoma, e un'ispezione della galleria di immagini per singole celle è obbligatoria. La validazione clinica locale è obbligatoria prima del dispiegamento; La piena responsabilità diagnostica e legale ricade sul morfologo che segnala.

Una futura validazione rigorosa e multi-istituzionale in diversi contesti clinici è essenziale per la generalizzazione del modello e la performance predittiva. Un approccio basato sull'IA alla citomorfologia dei megacariociti potrebbe ulteriormente affinare la diagnosi integrata delle neoplasie mieloproliferative e mielodisplastiche 24,25,26. Rimane anche una lacuna sostanziale nello sviluppo di un riconoscimento affidabile supportato dall'IA dei cambiamenti displastici specifici per linea^{di lignaggio 2,27}. Per l'ottimizzazione dei modelli, tecniche innovative come la regolazione degli iperparametri, la regolarizzazione, l'apprendimento degli ensemble e l'aumento dei dati possono contribuire a migliorare la robustezza e l'affidabilità della^{classificazione} 28,29,30. In particolare, le strategie di aumento dei dati – che vanno dalle trasformazioni geometriche^30,31 alla generazione di immagini di addestramento sintetiche tramite IA^{generativa 32,33} – sono recentemente emerse come approcci promettenti per ampliare dataset limitati e affrontare lo squilibrio di classe nella classificazione delle cellule BM. Il livello di istruzione e l'esperienza a lungo termine del personale di laboratorio sono essenziali per il processo di valutazione e decisione nei casi citomorfologici difficili. Formare la prossima generazione di citomorfologi nel contesto della digitalizzazione in corso rappresenta una sfida educativa. Da un lato, ADM offre un enorme potenziale educativo; D'altra parte, comporta il rischio che operatori meno esperti possano sopravvalutare le sue capacità.

Nonostante il promettente potenziale diagnostico dei sistemi ADM, devono essere riconosciute diverse limitazioni critiche e sfide di implementazione. Una preoccupazione fondamentale riguarda il bias nei dati di addestramento: la maggior parte delle piattaforme ADM commercialmente disponibili, incluse quelle valutate nel presente studio, sono state sviluppate utilizzando dataset derivati prevalentemente da specifiche regioni geografiche, protocolli di colorazione e popolazioni di pazienti, il che può limitarne la generalizzazione a coorti più etnicamente e clinicamente diverse o a laboratori che utilizzano tecniche di preparazione diverse. Altrettanto importante è la questione della trasparenza nel processo decisionale dell'IA. Gli attuali sistemi ADM funzionano in gran parte come modelli a scatola nera, il che ostacola la capacità dei clinici di valutare criticamente le assegnazioni cellulari individuali. Questo è direttamente collegato alla questione della responsabilità clinica, poiché i quadri normativi per la diagnostica assistita dall'IA continuano a evolversi. L'integrazione pratica dell'ADM nei flussi di lavoro diagnostici standard presenta notevoli barriere organizzative e tecniche, tra cui la necessità di un'infrastruttura di digitalizzazione delle diapositive di alta qualità, la formazione del personale, la validazione rispetto agli standard di riferimento locali e l'istituzione di protocolli di controllo qualità per monitorare le prestazioni del sistema nel tempo. Pertanto, il perfezionamento guidato da esperti e l'esplorazione del pieno potenziale dell'ADM nella valutazione PB e BM continueranno a migliorarne l'utilità come strumento di supporto nella pratica di laboratorio di routine.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Automated Hematology Slide Preparation Unit SP-50	Sysmex Corporation, Kobe, Japan	N/A	Automated slide maker and stainer
Barcode scanner for Sysmex SP-50	Datalogic Gryphon	S/N: G21M20996	Barcode scanner
CellaVision DC-1	CellaVision AB, Lund, Sweden	PM-10895-15	Automated digital morphology analyzer
CellaVision DM Software	CellaVision AB, Lund, Sweden	Version 7.1.1 build 8
Giemsa Solution for SP Automated Systems	RAL Diagnostics, Martillac, France	750305X1000	Component of panoptic staining for peripheral blood and bone marrow smears
Immersion Oil (CellaVision Immersion Oil 50 mL)	CellaVision AB, Lund, Sweden	XU-10319	Immersion oil
May-Grünwald for SP Automated Systems	RAL Diagnostics, Martillac, France	750105X2500	The component of panoptic staining for peripheral blood and bone marrow smears
Morphogo Bone Marrow Analyzer	Hangzhou ZhiWei Information Technology Co. Ltd., Hangzhou, China	N/A	Automated digital bone marrow morphology analyzer
Morphogo Review Software	Hangzhou ZhiWei Information Technology Co. Ltd., Hangzhou, China	Version 1.0.6	Bone marrow review software
pH 7.0 Buffer Solution for SP Automated Systems	RAL Diagnostics, Martillac, France	750505X5000	Buffer solution
QR scanner for CellaVision DC-1	Datalogic Gryphon	GD 4500	QR scanner
RAL Cleaning solution	RAL Diagnostics, Martillac, France	750725X5000	Cleaning solution
S-Monovette K3 EDTA tube	Sarstedt	05.1167.001	Tube for SP-50
SP-Rinse Solution	RAL Diagnostics, Martillac, France	37000305	Rinse solution
SP Slides	Sysmex Corporation, Kobe, Japan	ZE 001906	Slides  for peripheral blood and bone marrow smears
SP Slides	Sysmex Corporation, Kobe, Japan	ZE 001906	Slides  for QC
SP Spreader glass	Sysmex Corporation, Kobe, Japan	95102918	Glass for spreading the smear
Tube rack for Sysmex SP-50	Sysmex Corporation, Kobe, Japan	AU330213	Tube rack