Imaging con spettrometria di massa a singola cella utilizzando ionizzazione elettrospray da desorbiamento accortata agli spettrometri di massa Orbitrap

Sommario

Questo protocollo descrive l'imaging di spettrometria di massa a singola cella delle celle OVCAR-8 utilizzando ionizzazione elettrospray a desorbo accoppiata a spettrometri di massa Orbitrap per analisi metabolomiche ad alta risoluzione spaziale.

Abstract

Ionizzazione elettrospray a disorbio – imaging di spettrometria di massa (DESI–MSI) consente l'imaging molecolare ambientale, privo di matrice, con una preparazione minima del campione. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro per l'MSI a singola cella delle celle OVCAR-8 utilizzando DESI accoppiato a spettrometri di massa Orbitrap. Il sistema integra uno spruzzatore DESI, un'interfaccia modificata dello spettrometro di massa, uno stadio XYZ motorizzato e una scheda ottica per l'imaging ad alta risoluzione spaziale. Le cellule vengono coltivate su coperture di vetro a griglia, lavate con soluzione di formatiato ammoniaco per ridurre l'interferenza salina, essiccate e analizzate in condizioni ambientali. Il solvente viene somministrato continuamente tramite un sistema di nanocromatografia liquida e la nebulizzazione del gas azoto viene regolata per mantenere la stabilità dello spruzzo. Il protocollo descrive anche l'imaging raster, il controllo dei pixel e la registrazione delle immagini ottico-spettrometria di massa per la localizzazione a singola cella. L'elevata risoluzione di massa e la precisione di massa fornite dalla rilevazione Orbitrap permettono la differenziazione di specie molecolari strettamente correlate e supportano l'analisi metabolomica a singola cellula. Questo protocollo fornisce una strategia adattabile per implementare MSI a cella singola ad alta risoluzione spaziale utilizzando molteplici piattaforme di spettrometri di massa Orbitrap.

Introduzione

La metabolomica mira a caratterizzare in modo completo i metaboliti di piccole molecole che riflettono lo stato funzionale dei sistemi^biologici 1,2,3,4,5. Poiché i metaboliti sono prodotti diretti dell'attività enzimatica, forniscono una lettura dinamica del fenotipo cellulare e della regolazione biochimica. Tuttavia, i flussi di lavoro metabolomici convenzionali si basano tipicamente su metodi di estrazione in massa che mediano i segnali su migliaia o milioni di cellule, oscurando così l'eterogeneità^{cellulare 6,7,8}.

La metabolomica a singola cellula affronta questa limitazione consentendo il profiling molecolare a livello delle singole cellule, rivelando la diversità metabolica all'interno di popolazioni complesse e migliorando la comprensione meccanicistica della progressione della malattia, della risposta farmacologica e della differenziazione cellulare. La spettrometria di massa (MS) è uno strumento indispensabile per l'analisi molecolare di campioni biologici. I recenti progressi nelle tecniche di SM, inclusa la preparazione del campione, la strumentazione e l'analisi dei dati, permettono di eseguire studi di metabolomica sulla SM a livello di singola^cellula 9,10,11,12.

L'imaging MS (MSI), che consente l'analisi molecolare risolta spazialmente di campioni biologici, integra un movimento preciso del campione, campionamento minimizzato, ionizzazione efficiente e visualizzazione dei dati acquisendo uno spettro di massa completo a ciascuna coordinate spaziale definite su una superficie^campionaria 12,13,14. Le immagini MS vengono ricostruite tracciando l'intensità dei valori selezionati tra rapporto massa/carica (m/z) su coordinate x–y, preservando così l'informazione spaziale chimica all'interno di sistemi biologici^complessi 12,13,15,16,17,18. Raggiungere una metabolomica a singola cellula con risoluzione spaziale richiede piattaforme analitiche in grado di preservare la localizzazione molecolare mantenendo al contempo sufficiente sensibilità e risoluzione di massa per rilevare specie a bassa^abbondanza 9,12,19,20.

La MSI a singola cellula presenta ulteriori sfide perché le singole cellule tipicamente hanno^{un diametro 8,21} tra 5 e 20 μm. A questa scala spaziale, l'abbondanza degli analiti per evento campionario è estremamente limitata. Pertanto, molteplici fattori, tra cui un controllo accurato del movimento del campione, una riduzione del campionamento, un'elevata efficienza di ionizzazione ed efficiente trasmissione ionica, sono altrettanto essenziali per ottenere informazioni molecolari interpretabili dalle singole^{cellule 14,22}. La desorbizione/ionizzazione laser assistita da matrici (MALDI)–MSI, una tecnica basata sul vuoto usata regolarmente per studi MSI ad alta risoluzione spaziale, richiede deposizione matriciale e funzionamento nel vuoto; tuttavia, la cristallizzazione matriciale in MALDI può introdurre la delocalizzazione e la variabilità degli analiti sulla scala di singola^cella 23,24,25,26,27. Al contrario, gli approcci MSI ambientali operano in condizioni ambientali, e i campioni mantengono stati chimici quasi nativi perché è richiesta poca o nessuna preparazione del campione. Tra i metodi MSI ambientali, DESI²⁸, nano-DESI²¹, nano-DESI²⁹ assistito pneumaticamente e Single-probe 8,30,31,32,33,34,35, sono stati precedentemente utilizzati per studi MSI a cellula singola. Sebbene le tecniche basate sull'estrazione micro-liquida, tra cui nano-DESI, nano-DESI assistito pneumaticamente e Single-probe, offrano un'elevata efficienza di campionamento e ionizzazione, esse si basano sul mantenimento di un ponte liquido stabile alla punta della sonda, mentre la perturbazione del ponte liquido, come cambiamenti nella morfologia superficiale o l'ostruzione della sonda, può influire sulla qualità degli esperimenti^{MSI 5,8, 21, 30, 35}.

DESI è una tecnica di ionizzazione ambientale in cui goccioline di solvente cariche colpiscono una superficie, estraggono analiti e generano gocce secondarie contenenti la specie^{ionizzata 36}. DESI fornisce campionamento senza contatto e senza intasamento con compatibilità per flussi di lavoro di imaging basati su raster, rendendolo particolarmente adatto per la mappatura molecolare ad alta risoluzione e multi-ionico di singole cellule identificate otticamente quando accoppiate a piattaforme Orbitrap ad alta risoluzione 20,37,38,39,40. DESI è ampiamente utilizzato per l'imaging tissutale ma è stato raramente applicato agli MSI a singola cellula, principalmente a causa di sfide tecniche^20,28. Studi recenti condotti con un impianto commerciale composto da un Waters DESI XS accoppiato a uno spettrometro di massa IMS CYCLIC SERIES SELECT hanno dimostrato che la risoluzione di singola cella può essere raggiunta per più linee cellulari. Raggiungere un'elevata risoluzione spaziale in DESI–MSI richiede un controllo coordinato dell'efficienza di ionizzazione, della trasmissione ionica, del tasso di acquisizione e dell'allineamento degli spruzzatori^{12, 20, 28}. In particolare, i progressi nella progettazione di nuove generazioni di spruzzatori DESI, inclusi DESI XS e l'ionizzazione a focalizzazione elettro-flusso di disorbimento (DEFFI), hanno ridotto significativamente l'area di^{campionamento 41,42}. Inoltre, ridurre i flussi dei solventi, come i flussi di nanolitri al minuto forniti dalle pompe di cromatografia nano-liquida (LC), può migliorare sostanzialmente il confinamento spaziale per ottenere la delineazione molecolare a singola^{cellula 28}. Sebbene questo approccio abbia raggiunto la risoluzione MSI a singola cella, si basa su strumentazione di un fornitore specifico (Waters). Un'implementazione più ampia del DESI–MSI a singola cella richiede quindi strategie che possano essere integrate con spettrometri di massa ad alta risoluzione ampiamente disponibili, come i sistemi Orbitrap, per fornire alta sensibilità, accuratezza di massa e potenza di risoluzione. La combinazione di DESI con gli spettrometri di massa Orbitrap offre nuove opportunità negli studi MSI a singola cellula, inclusa la differenziazione di specie ravvicinate e isobariche in estratti cellulari^complessi 20,43,44.

Questo protocollo descrive una strategia modulare per integrare uno spruzzatore Waters DESI XS con spettrometri di massa Orbitrap per studi MSI a singola cella. Il flusso di lavoro integra coperture a griglia per l'attacco delle celle e la correlazione ottica, uno stadio XYZ motorizzato per la scansione raster controllata, la consegna di solventi su scala nanometrica per una formazione stabile di spruzzi e la rilevazione ad alta risoluzione Orbitrap. Sebbene sia stato selezionato come piattaforma uno spettrometro di massa Thermo Orbitrap Tribrid Lumos, molti altri modelli di spettrometro di massa Orbitrap dotati di geometrie di interfaccia sorgente compatibili potrebbero potenzialmente essere accoppiati con configurazioni DESI XS personalizzate simili dopo adeguata adattamento meccanico e ottimizzazione.

Protocollo

Le cellule OVCAR-8 sono state ottenute dall'American Type Culture Collection (ATCC). Tutte le procedure di coltura cellulare sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali per la biosicurezza. Le cellule venivano testate regolarmente per la contaminazione da micoplasmi utilizzando un kit di rilevamento di micoplasmi secondo le istruzioni del produttore.

NOTA: Eseguire tutte le procedure in conformità con le linee guida istituzionali sulla biosicurezza. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata. Maneggiare solventi organici in una cappa chimica.

1. Coltura e preparazione delle celle OVCAR-8 su copertine a griglia

1. Preparare il mezzo completo integrando il medium RPMI-1640 con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina–estreptomicina. Riscalda la temperatura media a 37°C.
2. Mantenere le cellule OVCAR-8 in vasi di coltura cellulare da 10 cm contenenti 10 mL di mezzo completo. Incubare le cellule a 37°C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂.
3. Far passare le cellule quando circa l'80% della superficie della coltura è visivamente occupata da cellule aderenti, tipicamente ogni 2 giorni nelle condizioni descritte della coltura.
   1. Aspirare il mezzo dalla tavola di coltura da 10 cm e risciacquare le cellule una volta con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato a 1×.
   2. Aggiungere 2 mL di tripsina–etilendediamina, acido tetraacetico allo 0,25% al vaso di coltura. Incubare le cellule a 37°C per circa 3 minuti, o finché la maggior parte delle cellule non si stacca visibilmente dalla superficie della coltura quando viene esaminata al microscopio.
   3. Aggiungi 8 mL di mezzo completo preriscaldato alla piastra per neutralizzare la tripsina. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, si pipetta delicatamente la sospensione cellulare su e giù circa 15–20 volte per disperdere le cellule.
   4. Trasferire 1 mL della sospensione in 9 mL di mezzo fresco e completo.
   5. Conta le celle usando un contatore automatico. Carica 10 μL della sospensione della cella sosspesa direttamente nel vetrino di conteggio senza diluizione aggiuntiva ed esegui il conteggio delle celle secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: I coloranti di vitalità cellulare come il blu di tripano non sono stati utilizzati in questo protocollo. Valutare visivamente le condizioni cellulari monitorando la morfologia e l'attacco cellulare prima della tripsinizzazione.
4. Semina le cellule sulle coperture.
   1. Diluire le cellule a una concentrazione finale di ~1 × 10⁶ cellule/mL utilizzando un mezzo intero. Calcola il volume richiesto di sospensione cellulare usando C₁V₁ = C₂V₂, dove C₁ è la concentrazione della cella contata, V₁ è il volume di sospensione della cella richiesto, C₂ è la concentrazione target e V₂ è il volume finale desiderato.
   2. Inserire singoli veglietti di vetro grigliato da 28 mm con una distanza a griglia di 50 μm nei pozzi di una lastra a 6 pozzi.
      NOTA: Autoclave i vetri coprivano prima dell'uso per la coltura cellulare. Posiziona il lato della griglia rivolto verso il basso per minimizzare le interferenze con la crescita cellulare.
   3. Aggiungere 2 mL di mezzo completo e 200 μL di sospensione a celle (~2 × 10⁵ celle/pozzo) a ciascun pozzo. Muovi delicatamente la piastra a 6 pozzi in forma di "X" per distribuire uniformemente le celle sulla superficie del coperchio.
   4. Incubare le cellule per circa 15–20 ore per permettere l'attacco cellulare.
      NOTA: Monitorare regolarmente la morfologia cellulare utilizzando un microscopio per garantire una crescita cellulare normale. Esaminare la possibile contaminazione da micoplasmi utilizzando un kit di rilevamento di micoplasmi se le cellule crescono male.

2. Lavaggio cellulare con soluzione di formatio di ammonio (AF)

NOTA: Prepara una soluzione AF fresca prima di ogni utilizzo.

1. Prepara il buffer di lavaggio isotonico AF immediatamente prima dell'uso. Pesare 0,45 g di FA e scioglierlo in 50 mL di acqua di grado LC/MS per preparare una concentrazione finale di AF di 0,14 M (0,9% a mano/a). Non regolare il pH ^5,45.
   NOTA: Usa la soluzione AF appena preparata lo stesso giorno della preparazione. Conserva la soluzione fredda (0°C–4°C) fino all'uso.
2. Aspirare il mezzo di coltura da ogni pozzetto della piastra a 6 pozzi. Aggiungi immediatamente 2 mL di soluzione cold AF in ogni pozzo.
3. Utilizzando pinze sterili, solleva delicatamente ogni copertura contenente cellule aderenti dal pozzo mantenendo la superficie rivestita di cellule rivolta verso l'alto. Inserire brevemente il copertore per 2–3 secondi in un pozzo separato pre-riempito con 2 mL di soluzione fredda allo 0,9% AF.
4. Ripeti il processo di risciacquo per un totale di due risciacqui usando una soluzione AF fresca per ogni risciacquo. Dopo il risciacquo finale, rimuovere il copertino dalla soluzione AF e lasciarlo asciugare all'aria a temperatura ambiente in una cappa chimica per circa 20–30 minuti prima dell'analisi DESI–MSI.
   NOTA: Risciacquare delicatamente le cellule per evitare di disturbarle durante la fase di lavaggio.

3. Fabbricazione di un'interfaccia MS basata su FAIMS modificata

1. Smonta l'adattatore della sorgente ionica FAIMS Pro per accedere alla regione interna degli elettrodi. Conferma che l'adattatore sia compatibile con gli spettrometri di massa Thermo Orbitrap dotati della configurazione dell'interfaccia FAIMS Pro.
2. Rimuovere i componenti degli elettrodi FAIMS, inclusi i fili interni, gli assemblaggi elettrodi, gli O-ring e le strutture interne di supporto. Mantenere il guscio esterno della custodia, le flange di montaggio e il perno di rilevamento dell'interfaccia necessario per il riconoscimento dello spettrometro di massa dell'adattatore.
3. Modificare l'apertura circolare utilizzando le procedure standard di lavorazione meccanica. Ingrandire l'apertura finché non fornisce sufficiente spazio attorno all'assemblaggio sporgente dell'ingresso/imbuto ionico Orbitrap.
4. Leviga e sbava il bordo lavorato dopo il taglio. Confermare che l'apertura modificata consenta un posizionamento libero dell'adattatore alloggiato sullo spettrometro di massa.
5. Modifica la lunghezza di due gambe dell'adattatore della carcassa usando una sega. Ritaglia le gambe a una lunghezza finale di circa 2 1/4 in per permettere il collegamento con la scheda ottica.
   NOTA: Utilizzare strumenti meccanici appropriati ed evitare di danneggiare l'integrità strutturale della restante carcassa.
6. Prepara una scheda ottica in alluminio (10 in × 12 in × fori filati da 0,5 in, 1/4"-20). Posiziona la scheda orizzontalmente sotto l'adattatore FAIMS modificato.
7. Usa due staffe di montaggio per collegare l'adattatore FAIMS modificato alla scheda ottica del pro. Rifinare le staffe secondo necessità per ridurre il peso e permettere un corretto posizionamento della breadboard rispetto all'ingresso Orbitrap.
8. Fissare l'interfaccia FAIMS modificata sulla scheda ottica utilizzando hardware di montaggio meccanicamente compatibile, allineato con il diagramma dei fori prefilati da 1/4"-20 della scheda pro. Garantire una posizione stabile durante gli esperimenti di immagini.
   NOTA: Assicurarsi che l'interfaccia sia rigidamente fissata per minimizzare le vibrazioni durante il movimento dello stadio e l'acquisizione dati.
9. Lavorare o tagliare una scanalatura poco profonda nella scheda ottica direttamente sotto la zona di contatto del FAIMS alloggiato. Dimensione e posizionamento della scanalatura per garantire sufficiente spazio per stabilire i sedili e l'allineamento dell'alloggiamento modificato del FAIMS rispetto all'ingresso Orbitrap.
   NOTA: Dimensionare la scanalatura per adattarsi alla base dell'adattatore di alloggiamento FAIMS e migliorare la riproducibilità posizionale.
10. Allinea l'interfaccia montata con l'ingresso dello spettrometro di massa. Conferma che le flange di montaggio mantenute si incastrino correttamente sullo strumento e che la scheda ottica rimanga in linea sotto l'interfaccia.
11. Verifica che l'apertura circolare modificata offra spazio libero attorno all'assemblaggio dell'ingresso/imbuto ionico Orbitrap prima di installare lo spruzzatore DESI.

4. Assemblare lo spruzzatore DESI e l'interfaccia Orbitrap

1. Montare lo spruzzatore DESI sull'impianto integrato composto dal telaio FAIMS personalizzato, dallo stadio motorizzato XYZ, dal regolatore gas e dalla scheda ottica. Usa uno stage motorizzato controllato da un controller CONEX-MFACC.
2. Definisci l'asse x come la direzione di scansione raster da sinistra a destra e definisci l'asse y come la direzione del passo di linea dall'alto verso il basso. Imposta la posizione dell'asse z prima dell'acquisizione e mantienilo fisso durante l'imaging.
3. Utilizzare un intervallo di corsa dello stadio di circa 1 mm nella direzione x e 1 mm nella direzione y. Non applicare il movimento sull'asse z durante l'acquisizione.
4. Posizionare lo spruzzatore DESI con un angolo di circa 70° rispetto alla superficie del campione. Posiziona il campione direttamente sotto lo spruzzatore e posiziona la punta dello spruzzatore il più vicino possibile all'ingresso Orbitrap senza contatto fisico.
5. Collega il metallo di messa a terra DESI a una sorgente terrestre sotto lo spettrometro di massa. Controlla il movimento raster utilizzando il software di controllo dello stadio (Figura 1).
   NOTA: Lo spruzzatore DESI utilizzato in questo studio è disponibile solo per gli utenti con strumenti DESI–MSI.
6. Usa un controller motorizzato XYZ per il movimento e il posizionamento del palco. Collega la linea di tensione, la linea di azoto gas, la linea del solvente e la linea di messa a terra prima dell'uso.
7. Installare un tubo di trasferimento ionico in acciaio inossidabile su misura (1/16 in diametro esterno × 0,033 in diametro diametrale) progettato per corrispondere all'ingresso della sorgente ionica Orbitrap. Posizionare il tubo di trasferimento ionico in modo che si allinei direttamente con l'ingresso Orbitrap, estendendosi abbastanza verso l'esterno da permettere un accesso libero alla pennaca DESI.
   NOTA: Personalizza il tubo di trasferimento ionico in base alla configurazione dello spettrometro di massa. Fabbricare il tubo di trasferimento ionico utilizzando procedure di lavorazione adeguate.
8. Utilizza un tubo di trasferimento ionico con geometria piegata per migliorare il posizionamento dello spruzzatore DESI rispetto alla superficie del campione e all'ingresso Orbitrap.
9. Allineare lo spruzzatore a un angolo di circa 70° rispetto alla superficie del campione in modo che la colonna di spruzzo DESI interseci la regione di ingresso Orbitrap senza entrare in contatto con la superficie del campione.
10. Definire una colonna di spruzzo stabile in base alla presenza di spettri di massa stabili e valori di livello normalizzato (NL) coerenti durante l'acquisizione. Regola la posizione dello spruzzatore finché non si osserva un segnale ionico stabile.
11. Imposta la distanza tra spruzzatore e superficie a circa 1,0–1,5 mm come condizione iniziale. Regolare manualmente la posizione dello spruzzatore mentre si monitorano i valori NL per ottenere il segnale ionico più stabile possibile.

Figura 1. Configurazione integrata di ionizzazione elettrospray a disorbimento (DESI) – imaging di massa (MSI) abbinata a uno spettrometro di massa Orbitrap. Lo spruzzatore DESI è montato su una piattaforma integrata composta da un adattatore modificato per spettrometria di mobilità ionica asimmetrica ad alto campo (FAIMS),  uno stadio XYZ motorizzato, un regolatore di gas e una scheda ottica del pro. Il solvente viene somministrato tramite un sistema di cromatografia nano-liquida e il gas azoto viene fornito a circa 12 psi per la stabilizzazione a spruzzo. La figura mostra anche la connessione della tensione di ionizzazione, la linea del solvente e la posizione dello spruzzatore rispetto all'ingresso Orbitrap. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Configurare le condizioni di somministrazione del solvente e di spruzzare

1. Preparare un solvente spray fresco composto da metanolo/acqua/acido formico (98:2:0.1, v/v/v) prima dell'analisi DESI–MSI.
   NOTA: Altri sistemi solventi compatibili con DESI, inclusi solventi a base di acetonitrile e diversi rapporti metanolo/acqua, possono essere utilizzati dopo l'ottimizzazione. Metanolo/acqua/acido formico (98:2:0.1, v/v/v) è stato utilizzato come condizione iniziale standard in questo protocollo perché forniva una formazione stabile di pennacchi, riduzione della diffusione del solvente e segnali lipidici in modalità ionica positiva riproducibili durante esperimenti DESI–MSI a cellula singola.
   ATTENZIONE: Il metanolo è infiammabile e tossico. L'acido formico è corrosivo. Maneggia i solventi in una cappa chimica.
2. Somministrare il solvente utilizzando un sistema nano-LC Ultimate 3000 operato come pompa isocratica a 750 nL/min per gli esperimenti riportati. Collega la presa nano-LC allo spruzzatore DESI usando tubo PEEK (1/16 in diametro esterno × 0,005 in diametro interno).
3. Installare una colonna C18 (ad esempio, nanoEase M/Z Peptide BEH; 130 Å, 1,7 μm, 300 μm × 150 mm) in linea per fornire una contropressione sufficiente per una formazione stabile di spruzzi a bassi portati.
4. Imposta il metodo dello spettrometro di massa in modalità ionica positiva con rilevamento Orbitrap, una tensione di spruzzatura di 0,85 kV, risoluzione Orbitrap di 120.000 a m/z 200 e un intervallo m/z di 150–1200.
5. Imposta l'obiettivo AGC normalizzato al 100%, il tempo massimo di iniezione a 100 ms, l'obiettivo RF al 45% e le microscansioni a 1. Disabilita l'isolamento dei quadrupoli e la frammentazione della sorgente.
6. Fornire gas di guaina di azoto da un generatore di azoto o da una fonte di azoto liquido a circa 12 psi per stabilizzare la colonna di spruzzo DESI. Utilizzare 12 psi come pressione di esercizio iniziale e effettuare piccole regolazioni manuali solo se necessario per migliorare i valori NL e mantenere uno spettro di massa stabile.

6. Eseguire imaging raster e controllo dei pixel

1. Identificare una regione di interesse che contiene celle singole otticamente visibili usando come riferimento le coperture a griglia. Seleziona cellule isolate con chiara separazione visiva dalle cellule vicine, morfologia aderente intatta e senza evidente sovrapposizione con detriti o gruppi cellulari.
2. Definisci la regione raster usando il software Fance Stage^{Controller 46}. Imposta la dimensione del passo raster a 0,01 mm, la velocità dello stadio a 0,01 mm/s e il tempo di permanenza a 20 s.
3. Usa la scansione raster da sinistra a destra su ogni linea seguita da uno spostamento verso la linea successiva nella direzione y. Imposta la dimensione ortogonale del passo tra le linee raster a 10 μm.
4. Regolare la velocità dello stadio in base alla velocità di acquisizione di Orbitrap per ottenere la dimensione desiderata del pixel nella direzione di scansione (ad esempio, circa 2,5–6,5 μm). Calcola la dimensione del pixel della direzione di scansione usando la seguente relazione: dimensione del pixel della direzione di scansione = velocità dello stadio × tempo di acquisizione per scansione.
5. Utilizzando una velocità dello stadio di 0,01 mm/s (10 μm/s), acquisire 376 scansioni in 102 secondi per ottenere un tempo di acquisizione di 0,271 s per scansione e una corrispondente dimensione del pixel nella direzione di scansione di circa 2,7 μm. Sincronizza il movimento dello stadio e l'acquisizione dello spettro di massa impostando il tempo di acquisizione Orbitrap leggermente più corto rispetto ai parametri combinati di movimento dello stadio e di permanenza.
   NOTA: La dimensione del pixel ortogonale è determinata dalla dimensione programmata del passo e dalle limitazioni fisiche e meccaniche dello stadio, mentre la dimensione della direzione di scansione è governata dalla velocità dello stadio e dal tasso di acquisizione spettrale.
6. Acquisire dati di imaging sull'intervallo di massa selezionato fino al completamento della regione raster predefinita. Per una regione di imaging da 1 mm × 1 mm acquisita utilizzando un passo di linea di 0,01 mm e una velocità di stadio di 0,01 mm/s, il tempo totale di acquisizione è di circa 4–5 ore.
7. Generare file dati RAW durante l'acquisizione e fermare l'acquisizione dopo il completamento delle coordinate raster x–y specificate e della corrispondente durata del metodo strumentale. Nelle condizioni di modalità ionica positiva descritte qui, ogni linea raster genera tipicamente un file RAW di circa 50 MB, risultando in circa 5 GB di dati totali per 101 linee raster.

7. Registrazione dell'immagine ottico a MS

1. Acquisire immagini in campo chiaro delle celle nella regione della griglia selezionata dopo il lavaggio e l'asciugatura AF e prima dell'acquisizione DESI utilizzando un microscopio a campo luminoso dotato di un obiettivo 10×.
2. Converti file RAW in file mzML usando msConvert da ProteoWizard⁴⁸. Converti i file mzML in formato imzML usando imzML Converter⁴⁹.
3. Usa impostazioni di conversione centroide/profilo coerenti con il formato dati acquisito. Carica i file imzML direttamente su METASPACE (https://metaspace2020.eu)⁵⁰ per la visualizzazione delle immagini.
4. Non applicare normalizzazioni, rimozione hotspot o correzioni aggiuntive di elaborazione dell'immagine prima della visualizzazione. Allinea manualmente le immagini ottiche e MS usando i punti di riferimento della griglia come riferimenti posizionali.
5. Scala l'immagine ottica usando le dimensioni note dell'immagine e la spaziatura della griglia. Sovrappongi manualmente l'immagine MS per valutare la corrispondenza tra le posizioni delle celle otticamente visibili e i segnali ionici localizzati.
6. Confermare la localizzazione della singola cella tramite accordo visivo tra le celle isolate nell'immagine del campo chiaro e le corrispondenti distribuzioni ioniche MS.

Risultati

L'esecuzione efficace di questo protocollo produce dataset DESI–MSI in cui singole cellule identificate otticamente corrispondono spazialmente a segnali ionici molecolari localizzati (Figura 2). Le immagini microscopiche a campo chiaro acquisite prima dell'analisi DESI–MSI permettono l'identificazione visiva delle singole celle OVCAR-8 e facilitano la registrazione dell'immagine ottico a MS utilizzando il copertino a griglia come riferimento posizionale. Le immagini rappresentative di ioni DESI–MSI mostrano distribuzioni ioniche localizzate che si correlano spazialmente con singole cellule identificate nell'immagine corrispondente del campo chiaro (Figura 2A–2D).

Figura 2. Confronto tra microscopia a campo chiaro e MSI delle cellule OVCAR-8. (A) Immagine microscopica a campo chiaro delle cellule OVCAR-8 acquisite a un ingrandimento del 10×. (B–D) Immagini MS acquisite utilizzando DESI–MSI con una dimensione di pixel di 5,5 μm × 10 μm. Le distribuzioni rappresentative degli ioni sono mostrate per (B) m/z 317.111, (C) m/z 808.562 e (D) m/z 788.616. Barra della scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le singole cellule generano spettri di massa completi contenenti molteplici ioni lipidici e piccole molecole. Invece di affidarsi a un singolo marcatore molecolare, ogni cellula presenta un profilo molecolare multi-ionico che funziona come un'impronta chimica. Le immagini rappresentative degli ioni a m/z 317.111, m/z 808.562 e m/z 788.616 mostrano distribuzioni molecolari eterogenee tra le cellule vicine, indicando eterogeneità metabolica misurabile a livello di singola cellula (Figura 2B–2D). Le annotazioni basate sul METASPAZIO suggerivano che gli ioni rilevati a m/z 808.562 e m/z 788.616 fossero principalmente associati a specie lipidiche fosfatidilcoline e fosfatidiletanolaminici, mentre m/z 317.111 corrispondeva a diverse piccole molecole candidate e specie correlate al dipeptide. Questi risultati dimostrano che la piattaforma consente la rilevazione di caratteristiche molecolari localizzate spazialmente da singole cellule identificate otticamente in condizioni ambientali. Risultati aggiuntivi, inclusi specie annotate provvisoriamente, specie identificate MS/MS, immagini rappresentative MS e spettri di massa, sono forniti in studi^{precedenti 20}.

La piattaforma DESI–MSI integrata consiste in uno spruzzatore DESI, un adattatore FAIMS modificato, uno stadio XYZ motorizzato e una scheda ottica montata adiacente all'ingresso Orbitrap (Figura 1). L'installazione consente una consegna stabile del solvente, un movimento controllato dello stadio e l'allineamento della colonna di spruzzo DESI con l'ingresso dello spettrometro di massa per esperimenti di imaging a cellula singola ambientale. Il tubo di trasferimento ionico personalizzato mostrato nella Figura 3 consente la trasmissione ionica tra la regione sorgente DESI e l'ingresso Orbitrap. La geometria capillare piegata facilita il posizionamento dello spruzzatore DESI rispetto alla superficie del campione e alla regione di ingresso, mantenendo al contempo un trasferimento ionico senza ostacoli.

Figura 3. Tubo di trasferimento ionico personalizzato per Orbitrap MSI. Fotografia del tubo di trasferimento ionico costruito su misura usato per accoppiare lo spruzzatore DESI allo spettrometro di massa Orbitrap Fusion Lumos. La figura mostra la geometria dei capillari di trasferimento piegati e l'assemblaggio di montaggio utilizzati per la trasmissione ionica durante esperimenti MSI a singola cella ambientale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La Figura 4 mostra l'adattatore FAIMS modificato integrato con la scheda ottica e lo stadio motorizzato XYZ. La vista superiore (Figura 4A) illustra la posizione dello stadio campione e dell'adattatore modificato rispetto all'ingresso Orbitrap, mentre la vista inferiore (Figura 4B) mostra le staffe di montaggio e l'assemblaggio dello stadio utilizzati per sostenere la piattaforma di imaging. La stabilità meccanica dell'insieme integrato è importante per mantenere un movimento raster costante e minimizzare la deriva posizionale durante l'acquisizione dell'immagini.

Figura 4. Adattatore modificato per la spettrometria della mobilità ionica asimmetrica ad alto campo (FAIMS) integrato con la scheda ottica e lo stadio motorizzato XYZ. (A) Vista dall'alto dell'adattatore modificato montato adiacente all'ingresso Orbitrap e allo stadio di campionamento. (B) Vista inferiore che mostra le staffe modificate, la scheda ottica e l'assemblaggio motorizzato dello stadio XYZ utilizzato per supportare e allineare la piattaforma di immagini. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'elevata risoluzione di massa fornita dalla rilevazione Orbitrap consente la differenziazione di specie lipidiche ravvicinate e isobariche, migliorando così la specificità molecolare e il contrasto dell'immagine rispetto ai sistemi a risoluzione di massa inferiore. Le dimensioni dei pixel piccoli possono essere ottenute attraverso la sincronizzazione della velocità dello stadio e della velocità di acquisizione spettrale. Ad esempio, dimensioni di pixel di 2,7 μm × 10 μm sono state raggiunte utilizzando piattaforme Orbitrap ad acquisizione rapida e parametri raster^{ottimizzati 42}. L'imaging ad alta risoluzione spaziale consente la delineazione molecolare di cellule vicine minimizzando la sovrapposizione dei segnali tra le regioni cellulari vicine.

Gli esperimenti DESI–MSI riusciti sono caratterizzati da condizioni di spruzzatura stabili, intensità ionica costante attraverso le linee raster e localizzazione spaziale dei segnali molecolari che corrispondono alle singole cellule nell'immagine ottica. Esperimenti subottimali possono produrre distribuzioni ioniche diffuse, bassa intensità del segnale, pattern raster incoerenti o perdita di localizzazione cellulare dovuta a formazione instabile dello spruzzo, allineamento imcorretto dello spruzzatore, diffusione eccessiva del solvente o movimento del campione durante l'acquisizione. Un'attenta ottimizzazione dell'allineamento degli spruzzi, della portata del solvente, della velocità dello stadio e della posizione del campione migliora la fedeltà spaziale e la stabilità del segnale ionico durante gli esperimenti di imaging a singola cella.

Discussione

Questo protocollo consente il DESI–MSI a singola cella ambientale utilizzando spettrometri di massa Orbitrap ad alta risoluzione di massa grazie all'integrazione di controllo preciso dello stadio, consegna di solventi su scala nanometrica, targeting ottico e analisi di massa ad alta risoluzione spaziale. La combinazione di questi elementi affronta molteplici barriere tecniche che storicamente hanno limitato l'applicazione di DESI–MSI a livello di singola cella. In particolare, il controllo coordinato della stabilità dello spruzzo, della trasmissione ionica e del tempismo di acquisizione consente una rilevazione affidabile dei segnali molecolari da volumi di campionamento estremamente piccoli corrispondenti a singole cellule. Un fattore centrale che regola le prestazioni in questo flusso di lavoro è la stabilità e il confinamento della colonna di spruzzatura DESI. A risoluzioni spaziali su scala micrometrica, piccole perturbazioni nella portata del solvente, nella pressione del gas o nel posizionamento dello spruzzatore possono alterare significativamente l'area di campionamento effettiva. L'uso di una somministrazione di solventi su scala nanometrica combinata con una corretta contropressione migliora la stabilità dello spruzzo e riduce la diffusione del solvente, migliorando così la fedeltà spaziale. Inoltre, mantenere una distanza e un angolo costanti tra spruzzatore e superficie è fondamentale per l'efficienza di ionizzazione riproducibile. Anche piccole deviazioni nella geometria possono portare a una variazione sostanziale dell'intensità del segnale, in particolare nell'analisi di campioni cellulari eterogenei. In pratica, l'ottimizzazione delle condizioni di spruzzatura DESI è stata effettuata empiricamente monitorando la corrente totale degli ioni, la stabilità spettrale e i valori di NL (tipicamente intorno a 10⁵–10⁶) durante l'acquisizione. La qualità del segnale riproducibile è stata ottenuta tramite la regolazione iterativa della posizione dello spruzzatore, della stabilità del flusso di solventi, della pressione del gas e dell'allineamento della colonna DESI rispetto all'ingresso Orbitrap.

L'efficienza della trasmissione ionica rappresenta un altro limitamento chiave sulla scala della singola cella perché l'abbondanza degli analiti è intrinsecamente bassa all'interno delle singole cellule. A queste scale spaziali, la trasmissione efficiente degli ioni può diventare una limitazione pratica maggiore rispetto all'efficienza di ionizzazione in alcune implementazioni, perché solo una frazione molto piccola degli ioni disorbiti raggiunge infine l'ingresso dello spettrometro di massa. È quindi essenziale un trasferimento efficiente degli ioni dalla regione di campionamento all'ingresso dello spettrometro di massa. L'adattatore modificato FAIMS utilizzato in questo protocollo fornisce un'interfaccia tra la sorgente di spruzzo DESI e uno spettrometro di massa termodinamico, permettendo la compatibilità con molteplici modelli di strumenti, incluse le piattaforme Orbitrap Tribrid, Exploris e Astral. L'integrazione dell'adattatore FAIMS modificato con una scheda ottica fornisce anche stabilità meccanica, minimizzando così il disallineamento durante esperimenti di imaging estesi. La sincronizzazione tra il moto dello stadio e l'acquisizione dello spettro di massa è altrettanto critica per ottenere un'elevata risoluzione spaziale. In DESI–MSI, la dimensione del pixel nella direzione di scansione è governata dalla relazione tra velocità dello stadio e velocità di acquisizione, mentre la dimensione ortogonale è definita dalla dimensione del passo programmata. Un controllo accurato di questi parametri consente un campionamento preciso. Poiché molte cellule di mammiferi hanno tipicamente un diametro compreso tra circa 5 e 20 μm, sono necessarie dimensioni dei pixel che si avvicinano a pochi micrometri per minimizzare la sovrapposizione dei segnali tra cellule adiacenti e migliorare la localizzazione delle caratteristiche molecolari nelle singole regioni cellulari. Tuttavia, la dimensione nominale del pixel non corrisponde necessariamente all'impronta reale del campionamento perché l'interazione della colonna di solvente con la superficie del campione può introdurre una diffusione laterale e una parziale sovrapposizione del segnale tra pixel adiacenti. Le dimensioni dei pixel riportate dovrebbero quindi essere interpretate nel contesto della risoluzione spaziale effettiva piuttosto che in definizioni strettamente geometriche. Il tubo di trasferimento ionico personalizzato utilizzato in questo studio è stato progettato secondo la geometria del tubo di trasferimento ionico standard per preservare le caratteristiche di trasmissione ionica consentendo l'integrazione con la configurazione sorgente DESI.

L'elevata capacità risolutiva di massa e la precisione di massa fornite dagli spettrometri di massa Orbitrap sono essenziali per risolvere la complessa miscela di metaboliti e lipidi presenti nelle singole cellule. Molte caratteristiche molecolari rilevate sono state annotate provvisoriamente utilizzando misurazioni accurate di massa e analisi METASPACE. Poiché più assegnazioni candidate possono corrispondere a un singolo valore m/z misurato, ulteriori strategie di validazione MS/MS e di conferma molecolare ortogonale potrebbero rafforzare ulteriormente l'identificazione molecolare in studi futuri. In modalità ionica positiva, gli spettri DESI sono spesso dominati da specie fosfolipidiche con valori m/z ravvicinati o isobarica. La rilevazione ad alta risoluzione da Orbitrap consente la differenziazione di queste specie, migliorando così la specificità molecolare e riducendo l'ambiguità spettrale. Questa capacità è particolarmente importante per le analisi a singola cellula, dove la dipendenza da un numero limitato di ioni può portare a un'errata interpretazione dell'eterogeneità cellulare. Questa adattabilità suggerisce che strategie simili potrebbero essere applicabili ad altre piattaforme di spettrometria di massa utilizzando interfacce corrispondenti con modifiche appropriate. Nonostante questi vantaggi, dovrebbero essere considerate diverse limitazioni. Innanzitutto, la sorgente DESI utilizzata nel lavoro attuale è disponibile solo per gli utenti con sistemi DESI–MSI, e la costruzione di sistemi SPRUZZATORE/Orbitrap DESI potrebbe quindi essere limitata dalla disponibilità della sorgente DESI. Tuttavia, dispositivi DESI alternativi, incluso DEFFI, possono essere implementati anche per studi MSI ad alta risoluzione^{spaziale 42,47}. In secondo luogo, l'implementazione di questa piattaforma richiede una personalizzazione significativa, inclusa la lavorazione delle interfacce degli strumenti e la fabbricazione dei componenti di montaggio. Questi requisiti possono limitare l'accessibilità per laboratori senza esperienza nello sviluppo di strumenti o nella fabbricazione meccanica. Nell'attuale implementazione, l'alloggiamento dell'interfaccia FAIMS fungeva da comoda piattaforma meccanica per posizionare l'assemblaggio dello spruzzatore DESI rispetto all'ingresso Orbitrap. Di conseguenza, l'implementazione della configurazione descritta è più pratica per laboratori con accesso a sistemi Orbitrap compatibili con FAIMS e supporto di lavorazione di base. Tuttavia, il concetto più ampio di accoppiare meccanicamente sorgenti DESI alle prese Orbitrap può essere realizzato utilizzando progetti alternativi senza modificare l'hardware dell'interfaccia FAIMS. In terzo luogo, sebbene bassi flussi di solventi migliorino il confinamento spaziale, possono anche ridurre la resa complessiva degli ioni, richiedendo un'attenta ottimizzazione per bilanciare sensibilità e risoluzione spaziale.

Un'altra considerazione importante è il potenziale di delocalizzazione degli analiti durante il campionamento. Sebbene il DESI operi in condizioni ambientali e non richieda l'applicazione della matrice, l'interazione delle gocce del solvente con la superficie del campione può portare a una ridistribuzione degli analiti, in particolare per specie altamente solubili. Minimizzare il volume del solvente e ottimizzare le condizioni di spruzzatura sono quindi fondamentali per preservare l'integrità spaziale a livello di singola cella. Analogamente, la procedura di lavaggio utilizzando il formatiato di ammonio isotonico può ridurre la soppressione degli ioni associati al sale mantenendo l'integrità cellulare e preservando le specie cellulari, come precedentemente riportato nei flussi di lavoro di SM a cellule^{singole 5}.

Gli sviluppi futuri potrebbero migliorare ulteriormente le prestazioni e l'applicabilità di questa piattaforma. Ad esempio, l'integrazione con sistemi di acquisizione dati più veloci potrebbe consentire dimensioni di pixel effettive più piccole e esperimenti MSI ad alto throughput. L'implementazione di sistemi di allineamento automatico o di controllo a retroazione in tempo reale può ridurre la variabilità e migliorare la riproducibilità. Inoltre, combinare questo approccio con tecniche complementari, come l'imaging a fluorescenza o strategie di marcatura mirata, potrebbe migliorare l'identificazione del tipo cellulare e consentire analisi multimodali.

Oltre alle considerazioni tecniche, questa piattaforma ha ampie implicazioni per la ricerca biologica e biomedica. La capacità di caratterizzare profili molecolari a livello di singole cellule in condizioni ambientali offre nuove opportunità per studiare l'eterogeneità cellulare nei sistemi complessi. DESI–MSI è già stato applicato con successo a livello tissutale in studi sui microambienti tumorali, sulle malattie neurologiche, sulle interazioni ospite–patogeno e sulle popolazioni cellulari resistenti^{ai farmaci} 12,15,16,35. Estendere DESI–MSI al livello di singola cellula potrebbe ulteriormente migliorare la capacità di delineare l'eterogeneità chimica localizzata tra cellule vicine, identificare rare sottopopolazioni cellulari e scoprire marcatori molecolari che altrimenti potrebbero essere oscurati nelle misurazioni di tessuto di massa. Tuttavia, il presente studio è stato condotto utilizzando un modello semplificato di coltura cellulare monostrato, e sono necessari ulteriori studi per dimostrare la compatibilità con altri sistemi biologici complessi, inclusi diversi modelli cellulari, tessuti, organoidi e colture 3D. L'attuale flusso di lavoro potrebbe fornire una base per estendere le misurazioni DESI ad alta risoluzione spaziale verso ambienti biologici sempre più eterogenei dopo ulteriori validazioni e ottimizzazioni. Poiché questo metodo preserva il contesto spaziale fornendo informazioni molecolari dettagliate, può fungere da ponte tra gli approcci basati sull'imaging e gli omici. In sintesi, questo protocollo stabilisce un quadro flessibile e adattabile per ottenere la risoluzione DESI–MSI a singola cella sugli spettrometri di massa Orbitrap. Affrontando le principali sfide legate all'efficienza dell'ionizzazione, alla trasmissione ionica, al controllo spaziale e alla risoluzione di massa, questo approccio consente una caratterizzazione molecolare dettagliata delle singole cellule. Sebbene siano necessarie ulteriori ottimizzazioni e validazioni, la metodologia fornisce una base per ampliare l'uso dell'MSI ambientale negli studi di metabolomica a cellula singola e spaziale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
−80 °C freezer	Eppendorf New Brunswick	U700	Conservazione dei campioni biologici prima della preparazione.
6" vertical bracket for breadboards, 1/4"-20 holes (2 pieces)	Millipore Sigma	VB01A	Supporto meccanico e stabilizzazione dell'assieme personalizzato per il supporto dello spruzzatore
Acetonitrile	Fisher Chemical	240744	Solvente organico per la preparazione e l'ottimizzazione del solvente compatibile con DESI
Formato di ammonio	Thermo Fisher Scientific	401152500	Preparazione del buffer di lavaggio di formato di ammonio isotonico per il lavaggio delle cellule prima di DESI–MSI
Microscopio a campo luminoso	Fisher Scientific	12575252	Imaging ottico e visualizzazione delle cellule aderenti prima dell'acquisizione DESI–MSI
Colonna C18	Waters	186009259	Generazione della pressione di ritorno in linea per la formazione stabile dello spruzzo DESI a nano-flusso
Filo di rame	N/A	N/A	Connessione elettrica e messa a terra durante la fabbricazione del supporto dello spruzzatore
Spruzzatore DESI XS	Waters	700014033	Fonte di ionizzazione DESI ambiente per esperimenti DESI–MSI su singola cellula
Resina epossidica	Devcon	20945	Stabilizzazione meccanica e fissazione dei componenti personalizzati del supporto dello spruzzatore
Adattatore per alloggiamento sorgente ioni FAIMS Pro	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Modifica e fabbricazione dell'interfaccia DESI compatibile con Orbitrap personalizzata
Acido formico	Ward’s Science	470301-120	Modificatore acido per la preparazione del solvente per spruzzo DESI
Metanolo	Fisher Chemical	A456-4 Optima	Solvente organico per la preparazione del solvente per spruzzo DESI
Regolatore di gas	Millipore Sigma	23831-U	Regolazione della pressione del gas di rivestimento dell'azoto durante il funzionamento DESI
Coverslip di vetro grigliato	Ibidi	10817	Substrato per colture cellulari e riferimento di posizione per la registrazione delle immagini da ottica a MS
Filo di messa a terra	N/A	N/A	Connessione di messa a terra elettrica per lo spruzzatore DESI e l'assieme dell'interfaccia
Incubatore	HeraCell	51026282	Mantenimento delle colture cellulari di mammiferi in condizioni di temperatura e CO2 controllate
Acqua di grado LC/MS	Thermo Fisher Scientific	W6500	Preparazione del buffer di lavaggio di formato di ammonio e del solvente per spruzzo DESI
Piattaforma METASPACE	METASPACE	https://metaspace2020.eu	Visualizzazione di immagini MS basata su cloud e analisi dei dati di metabolomica spaziale
Interfaccia FAIMS modificata	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Interfaccia personalizzata per l'accoppiamento dello spruzzatore DESI con gli spettrometri di massa Orbitrap
Piano XYZ motorizzato	Newport Corporation	CONEX-MFACC	Movimento del piano raster controllato durante l'acquisizione DESI–MSI
Kit di rilevamento del micoplasma MycoAlert PLUS	Lonza	LT07-703	Monitoraggio di routine dell'infezione da micoplasma nelle cellule in coltura
Sistema di cromatografia nano-liquida	Thermo Fisher Scientific	5200.0355	Sistema di erogazione del solvente a nano-flusso per la generazione dello spruzzo DESI
Breadboard ottica	Thorlabs	MB1012	Piattaforma di supporto meccanico per lo spruzzatore DESI e l'assieme dell'interfaccia modificato
Spettrometro di massa Orbitrap Fusion Lumos	Thermo Fisher Scientific	UVPD	Spettrometro di massa Orbitrap ad alta risoluzione per l'acquisizione dei dati DESI–MSI
Tubi in PEEK	IDEX	1535	Connessione della linea del solvente tra il sistema nano-LC e lo spruzzatore DESI
Penicillina–streptomicina	Gibco	15140-122	Supplemento antibiotico per il terreno di coltura cellulare dei mammiferi
Soluzione salina tamponata a fosfati (PBS)	VWR	0780-50L	Soluzione di lavaggio per le cellule in coltura durante il passaggio
Terreno RPMI-1640	Gibco	11875093	Terreno di coltura cellulare dei mammiferi per il mantenimento delle cellule OVCAR-8
Software di controllo del piano	Lasken Group	Versione 6	Controllo software del raster scan, del movimento del piano e dei parametri di acquisizione delle immagini
Tubi in acciaio inossidabile	MicroGroup	316H16H	Tubi di trasferimento di ioni personalizzati (1/16" OD, 0,033" ID) per l'integrazione dell'interfaccia Orbitrap
Siringa, 250 µL	Hamilton	1725LTN250UL	Caricamento del solvente e consegna del solvente a nano-flusso
Siero fetale bovino sintetico (FBS)	HyClone	SH3006603	Supplemento di siero per la preparazione del terreno di coltura cellulare completo dei mammiferi
Contatore cellulare automatizzato TC20	Bio-Rad Laboratories	1450102EDU	Conteggio automatizzato delle cellule in coltura prima della semina sui coverslip
Piatto per coltura tissutale, 100 mm	Fisher Scientific	FB012924	Espansione e mantenimento delle colture cellulari OVCAR-8 aderenti
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072	Distacco enzimatico delle cellule aderenti durante il passaggio
Resina UV-curante	Prime Dental	6.03	Fabbricazione e stabilizzazione dei componenti personalizzati del supporto dello spruzzatore DESI
Software Xcalibur	Thermo Fisher Scientific	4.7	Controllo dell'strumentazione, configurazione del metodo Orbitrap e acquisizione dei dati spettrometrici di massa