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Articolo metodologico

Implementazione di un saggio reporter per STAT6 per lo screening di tossicanti ambientali che influenzano l'infiammazione allergica delle vie aeree

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DOI:

10.3791/71694

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25 agosto 2026

 ,  ,  ,  , 
1Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la generazione e la validazione di un saggio reporter stabile con luciferasi per STAT6 in cellule epiteliali delle vie aeree umane. Il metodo consente lo screening efficiente di agenti tossici ambientali e componenti dell'inquinamento atmosferico che modulano l'attività di STAT6 in condizioni in vitro controllate.

Abstract

L'infiammazione delle vie aeree allergica associata all'inquinamento atmosferico è una preoccupazione crescente per la salute pubblica. L'interleuchina-4 (IL-4) e l'interleuchina-13 (IL-13), che attivano la via di segnalazione del fattore di trascrizione e attivatore della trasduzione del segnale 6 (STAT6), un mediatore centrale dell'infiammazione allergica delle vie aeree, potrebbero modulare la tossicità respiratoria degli inquinanti. Lo studio attuale descrive la generazione e la validazione di un saggio stabile di reporter luciferasico per STAT6 in cellule epiteliali delle vie aeree umane, utile per valutare gli agenti tossici ambientali che modulano la segnalazione di STAT6. Le cellule epiteliali bronchiali umane 16HBE14o− sono state trasdotte con un reporter luciferasico sensibile a STAT6 mediante un vettore lentivirale, seguito dall'ottimizzazione della selezione con puromicina e della molteplicità di infezione, e dall'isolamento monoclonale tramite diluizione limite. È stata selezionata una linea stabile con induzione forte e riproducibile attraverso passaggi seriali. La risposta del reporter è stata validata mediante stimolazione con IL-4/IL-13, e la dipendenza da STAT6 è stata confermata utilizzando inibitori selettivi di STAT6, STAT5 e STAT3. Le prestazioni del saggio sono state quantificate mediante analisi del fattore Z′, che ha indicato una separazione del segnale riproducibile. Inoltre, il saggio è stato applicato a singoli costituenti dell'inquinamento atmosferico, e il benzo[b]fluorantene e le particelle in sospensione hanno aumentato significativamente l'attività del reporter STAT6. Questo metodo fornisce un approccio scalabile per misurare l'attività di STAT6 nelle cellule epiteliali delle vie aeree e per identificare priorità tra gli agenti tossici ambientali che modulano la segnalazione allergica delle vie aeree.

Introduzione

L'inquinamento atmosferico rappresenta una delle sfide più urgenti per la salute pubblica a livello globale, con profondi effetti sulla salute e impatti socioeconomici. Al momento è classificato come il secondo fattore di rischio principale per la mortalità, responsabile di 8,1 milioni di decessi ogni anno1,2,3. Tra gli inquinanti atmosferici, le particelle fini con diametro inferiore a 2,5 micrometri (PM2,5) presentano il rischio per la salute maggiore a causa della loro capacità di penetrare in profondità nel tratto respiratorio4,5. Un'esposizione elevata a PM2,5 è stata costantemente associata a un ridotto funzionamento polmonare e a tassi più alti di ricovero ospedaliero per malattie respiratorie6. La prevalenza di malattie infiammatorie allergiche, tra cui asma, rinite allergica e dermatite atopica, è in aumento a livello mondiale ed è particolarmente elevata nelle grandi città ad alto inquinamento4.

Le malattie allergiche delle vie aeree, come l'asma atopico, sono principalmente mediate da una risposta infiammatoria di tipo 2, caratterizzata da livelli elevati delle citochine interleuchina-4 (IL-4) e interleuchina-13 (IL-13) e dall'attivazione della via di segnalazione del fattore di trascrizione Signal Transducer and Activator of Transcription 6 (STAT6)7. Nelle cellule epiteliali delle vie aeree, la fosforilazione di STAT6 indotta da IL-4 e IL-13 promuove l'ipersecrezione di muco e il danno alla barriera epiteliale, identificando STAT6 come un mediatore centrale della patologia allergica delle vie aeree e come un bersaglio terapeutico rilevante8,9. Evidenze sperimentali ottenute da modelli murini indicano che l'esposizione a PM2,5 e biossido di zolfo potenzia la segnalazione di STAT6 e aggrava l'infiammazione allergica delle vie aeree10,11. Tuttavia, non è stato ancora valutato sistematicamente se i singoli costituenti dell'inquinamento atmosferico modulino direttamente l'attività trascrizionale di STAT6 nelle cellule epiteliali umane delle vie aeree.

L'inquinamento atmosferico comprende una miscela chimicamente complessa di costituenti, tra cui materiale particolato, idrocarburi policiclici aromatici (IPA), metalli pesanti e sali inorganici, i cui contributi individuali all'attivazione di STAT6 nelle vie aeree rimangono poco definiti12,13. Le metodologie attuali per misurare l'attività di STAT6 nelle cellule epiteliali delle vie aeree, come saggi di fosforilazione a punto finale o sistemi reporter basati su trasfezione transitoria, non sono adatte a schermature chimiche su larga scala. Una piattaforma reporter stabile per STAT6 in cellule epiteliali delle vie aeree umane fornirebbe quindi uno strumento scalabile per identificare composti derivati dall'inquinamento che modulano il segnale allergico nelle vie aeree. Questo protocollo descrive lo sviluppo e la validazione di un saggio reporter stabile per STAT6 basato sulla luciferasi in cellule epiteliali delle vie aeree 16HBE14o−, consentendo una valutazione quantitativa dell'attivazione di STAT6 per lo screening sistematico di campioni ambientali e singoli tossici chimici.

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Protocollo

L'approvazione etica per soggetti umani non è applicabile poiché questo studio ha utilizzato la linea cellulare epiteliale bronchiale umana 16HBE14o− già stabilita.

1. Generazione di cellule 16HBE14o− che esprimono stabilmente un reporter dell'attività di STAT6

NOTA: Figura 1 fornisce una panoramica del flusso di lavoro.

  1. Coltura cellulare
    NOTA: Eseguire tutte le procedure utilizzando una tecnica asettica all'interno di un armadio di sicurezza biologica di Classe II. Verificare che le cellule siano prive di contaminazione da micoplasma prima dell'uso.
    1. Mantenere le cellule 16HBE14o− in mezzo minimo essenziale integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina. Incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 e sostituire il mezzo di coltura ogni due giorni.
    2. Lasciare che le cellule raggiungano una confluenza di circa l'80%. Aspirare il mezzo di coltura e risciacquare il monostrato cellulare una volta con soluzione salina tamponata al fosfato.
    3. Aggiungere soluzione salina tamponata al fosfato in quantità sufficiente a coprire il monostrato cellulare e incubare le cellule per 20 min a 37 °C. Aspirare completamente la soluzione salina tamponata al fosfato.
      NOTA: Utilizzare l'incubazione di 20 min con soluzione salina tamponata al fosfato per facilitare la rottura delle giunzioni intercellulari strette formate da questa linea cellulare. Questa durata rappresenta una modifica ottimizzata internamente.
    4. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di tripsina 0,25%–acido etilendiamminotetraacetico per coprire il monostrato cellulare. Incubare le cellule per 10 min a 37 °C.
      NOTA: Monitorare il distacco cellulare utilizzando un microscopio ottico invertito. Toccare delicatamente il contenitore di coltura quando necessario per facilitare il distacco.
    5. Aggiungere circa cinque volumi di mezzo di coltura completo rispetto al volume della soluzione di tripsina–acido etilendiamminotetraacetico per arrestare l'attività enzimatica. Pipettare delicatamente la sospensione per ottenere una sospensione monocellulare.
    6. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da centrifuga da 15 mL. Centrifugare la sospensione a 300 × g per 5 min a 25 °C.
    7. Aspirare con attenzione il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo di coltura fresco. Triturare delicatamente la sospensione e verificare la presenza di una sospensione monocellulare al microscopio ottico invertito.
    8. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare alla densità richiesta per l'esperimento successivo. Utilizzare un rapporto di suddivisione abituale di 1:8.
      NOTA: Fare riferimento alla Tabella Supplementare 1 e alla Tabella Supplementare 2 per le aree di crescita dei contenitori di coltura e i volumi corrispondenti di soluzione salina tamponata al fosfato e soluzione di tripsina–acido etilendiamminotetraacetico.
  2. Determinazione della citotossicità indotta da puromicina
    ​NOTA: Selezionare l'antibiotico in base al gene di resistenza codificato dal costrutto lentivirale.
    1. Sezionare le cellule 16HBE14o− a 2 × 104 cellule per pozzetto in una piastra di coltura a 96 pozzetti contenente 100 µL di mezzo di coltura completo per pozzetto. Incubare le cellule per tutta la notte.
    2. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco contenente puromicina a concentrazioni finali di 0,5, 1, 2 o 4 µg/mL. Preparare piastre separate per i tempi di 24, 48 e 72 ore.
    3. Aggiungere 5 µL di reagente per il conteggio cellulare in ogni pozzetto. Incubare la piastra per 1 h a 37 °C.
      NOTA: Evitare di introdurre bolle d'aria nei pozzetti, poiché potrebbero interferire con le misurazioni di assorbanza.
    4. Misurare l'assorbanza a 450 nm utilizzando 650 nm come lunghezza d'onda di riferimento. Agitare la piastra per 15 s immediatamente prima di registrare l'assorbanza in modalità endpoint.
    5. Calcolare la vitalità cellulare14 utilizzando l'Equazione 1.
      Equazione della vitalità cellulare, OD450-650 per campioni, controllo, bianco; formula per l'analisi di bioassay.
      dove:
      Equazione di assorbanza OD450-650, metodo di sottrazione, utilizzato in spettrofotometria, formula.
      Formula della densità ottica (OD450-650) per l'analisi di assorbimento in esperimenti di spettroscopia.
      Equazione della densità ottica, OD450-650bianco=OD450bianco-OD650bianco, per l'analisi di dati spettroscopici.
      NOTA: Definire il controllo come cellule non trattate e il bianco come mezzo privo di cellule contenente il reagente del saggio. Selezionare la concentrazione minima di puromicina che elimina completamente le cellule non transdotte entro 48–72 h.
  3. Determinazione della multiplicità di infezione ottimale
    ATTENZIONE: Manipolare le particelle lentivirali in condizioni di Livello di Sicurezza Biologica 2, in un impianto registrato di Livello di Sicurezza Biologica 2 e in conformità con le normative istituzionali sulla sicurezza biologica. Eseguire tutte le manipolazioni virali all'interno di un armadio di sicurezza biologica di Classe II. Coprire i materiali monouso contaminati dal virus e le eventuali fuoriuscite con una soluzione di candeggina al 10% per almeno 1 h prima dello smaltimento come rifiuto biologico pericoloso.
    ​NOTA: Ottimizzare la multiplicità di infezione poiché influisce direttamente sull'efficienza di trasduzione.
    1. Calcolare il volume richiesto di stock lentivirale15 utilizzando l'Equazione 2.
      Formula di calcolo del MOI, rapporto tra particelle virali e cellule bersaglio, equazione di biologia molecolare.
      dove:
      Formula del titolo funzionale del virus, T_virus = UT/mL, equazione per l'analisi di dati nella ricerca virologica.
      Equazione del volume del virus, V_virus=volume del virus in mL, formula, studio virologico, metodo di calcolo
      Equilibrio statico, equazione: N_cells = numero di cellule bersaglio, diagramma per uso didattico e di ricerca.
      NOTA: Il titolo funzionale dello stock lentivirale reporter per luciferasi STAT6 utilizzato in questo protocollo era di 5 × 107 unità trasducenti/mL. Per 2 × 104 cellule bersaglio, un MOI di 20 corrisponde a 8 µL di stock lentivirale per pozzetto. Il volume del virus deve essere ricalcolato per preparazioni virali con titoli diversi.
    2. Sezionare le cellule 16HBE14o− a 2 × 104 cellule per pozzetto in una piastra bianca a 96 pozzetti con fondo trasparente contenente 100 µL di mezzo di coltura completo per pozzetto. Incubare le cellule per tutta la notte fino a raggiungere una confluenza di circa l'80%.
    3. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco contenente 5 µg/mL di polibrene e lentivirus reporter per luciferasi STAT6 a MOI di 1, 5, 10 e 20. Includere un pozzetto di controllo mock non transdotto senza lentivirus.
      NOTA: Calcolare il volume di lentivirus necessario per ciascun MOI in base al titolo funzionale dello stock.
    4. Incubare le cellule con le particelle lentivirali per 48 h. Sostituire il mezzo di trasduzione con mezzo di coltura fresco e incubare le cellule per ulteriori 24 h.
    5. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco contenente interleuchina-4 e interleuchina-13 a 10 ng/mL ciascuna. Incubare le cellule per 24 h.
    6. Aggiungere 25 µL di reagente per il saggio della luciferasi in ogni pozzetto16. Proteggere la piastra dalla luce e incubarla per 20 min a temperatura ambiente.
    7. Agitare la piastra linearmente per 20 s. Misurare la luminiscenza in modalità endpoint utilizzando una lettura completa della piastra e un guadagno impostato a 120.
      ATTENZIONE: Registrare la luminiscenza entro 1 h dall'aggiunta del reagente per il saggio della luciferasi per catturare il segnale massimo. Seguire le istruzioni del produttore relative alla sicurezza e alla manipolazione del reagente.
      NOTA: Utilizzare lo stesso lettore multimodale per micropiastre e le stesse impostazioni di acquisizione per tutte le misurazioni di assorbanza e luminiscenza.
  4. Selezione delle cellule transdotte
    1. Sezionare le cellule 16HBE14o− a 2 × 105 cellule/mL in una piastra di coltura a 24 pozzetti. Incubare le cellule per tutta la notte.
    2. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco contenente il lentivirus reporter per luciferasi STAT6 a un MOI di 20 e 5 µg/mL di polibrene. Incubare le cellule per 48 h.
    3. Sostituire il mezzo di trasduzione con mezzo di coltura fresco. Incubare le cellule per ulteriori 24 h.
    4. Aspirare il mezzo di coltura e aggiungere mezzo fresco contenente 1 µg/mL di puromicina. Incubare le cellule per 5 giorni, sostituendo il mezzo di selezione ogni 2 giorni.
    5. Continuare la selezione con puromicina fino a quando tutte le cellule nel pozzetto di controllo mock non transdotto sono eliminate.
      ​NOTA: Attendere almeno 24 h dopo la trasduzione prima di applicare la selezione antibiotica, per consentire l'espressione del gene di resistenza.
  5. Isolamento di cloni monocellulari mediante diluizione limite
    1. Staccare e contare le cellule reporter STAT6 selezionate con puromicina. Preparare una sospensione monocellulare a 5 cellule/mL mediante diluizione seriale.
      ​NOTA: Evitare l'aggregazione cellulare durante la diluizione. Far passare la sospensione attraverso un filtro cellulare quando necessario.
    2. Distribuire 200 µL della sospensione cellulare in ogni pozzetto di una piastra di coltura a 96 pozzetti per ottenere una densità media di circa una cellula per pozzetto.
    3. Esaminare ogni pozzetto utilizzando un microscopio invertito entro 24 h e identificare i pozzetti contenenti una singola cellula. Escludere i pozzetti contenenti più di una cellula o più focolai cellulari spazialmente separati.
    4. Monitorare i pozzetti selezionati durante la prima settimana per confermare la crescita clonale. Sostituire il mezzo di coltura ogni 3 giorni.
    5. Ampliare ciascun clone nella piastra a 96 pozzetti originale per circa 20 giorni o fino a quando le cellule raggiungono la confluenza. Trasferire ciascun clone in sequenza in una piastra a 6 pozzetti e successivamente in un fiasco di coltura T-25.
      NOTA: Coltivare le cellule nella piastra a 6 pozzetti per circa 6 giorni prima di trasferirle nel fiasco T-25, oppure trasferirle quando raggiungono la confluenza appropriata.
      ​PUNTO DI PAUSA: Continuare ad ampliare i cloni o criopreservarli a 1 × 106 cellule per provetta in 1 mL di mezzo di criopreservazione contenente il 90% di siero fetale bovino e il 10% di dimetilsulfossido.
    6. Sezionare ciascun clone ampliato a 2 × 105 cellule/mL in una piastra bianca a 96 pozzetti con fondo trasparente. Incubare le cellule per tutta la notte.
    7. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco contenente IL-4 e IL-13 a 10 ng/mL ciascuna. Incubare le cellule per 24 h.
    8. Misurare l'attività della luciferasi come descritto nei passaggi 1.3.6–1.3.7. Confrontare l'attività del reporter indotta tra i singoli cloni.
    9. Ripetere il saggio della luciferasi con numeri crescenti di passaggi cellulari. Selezionare i cloni che mantengono un'attività del reporter indotta da citochine costante tra i diversi passaggi.
      NOTA: Il clone 3 è stato selezionato per la sua bassa luminiscenza di base e per la capacità di mantenere un segnale di attivazione indotto da citochine costante attraverso passaggi seriali.

2. Stabilimento e validazione del saggio reporter dell'attività di STAT6

NOTA: Figura 2 fornisce una panoramica del flusso di lavoro.

  1. Convalida del saggio reporter dell'attività di STAT6
    1. Sezionare le cellule reporter di STAT6 a 2 × 105 cellule/mL in una piastra bianca trasparente a 96 pozzetti utilizzando 100 µL di mezzo di coltura completo per pozzetto. Incubare le cellule per tutta la notte.
    2. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco contenente IL-4 e IL-13 a concentrazioni finali di 10 ng/mL ciascuno. Aggiungere contemporaneamente gli inibitori selettivi come segue: 100 nM AS1517499 (inibitore di STAT6), 2,5 µM AC-4-130 (inibitore di STAT5) o 2,5 µM Stattic (inibitore di STAT3).
    3. Includere un controllo veicolo contenente lo 0,1% di dimetilsulfossido (DMSO). Incubare le cellule per 24 h.
    4. Determinare la vitalità cellulare utilizzando il saggio di conteggio cellulare descritto nei passaggi 1.2.3–1.2.5.
    5. Misurare l'attività della luciferasi come descritto nei passaggi 1.3.6–1.3.7.
    6. Normalizzare il segnale di luminescenza di ogni pozzetto rispetto alla corrispondente vitalità cellulare. Esprimere i valori normalizzati in rapporto al gruppo di controllo trattato con citochine.
      NOTA: Una ridotta vitalità cellulare può diminuire il segnale della luciferasi indipendentemente dall'attività di STAT6. Interpretare l'attività del reporter solo dopo aver confermato una vitalità cellulare accettabile.
  2. Valutazione della robustezza del saggio
    1. Valutare la robustezza del saggio calcolando il fattore Z′ utilizzando 21 pozzetti replicati sia per i gruppi di controllo positivo che negativo.
    2. Calcolare il fattore Z′ utilizzando l'Equazione 3.
      Equazione di equilibrio statico, formula del fattore Z, espressione matematica per il controllo qualità del saggio.
      dove:
      Equazione di equilibrio statico, σₚ indica la deviazione standard nel controllo, illustrazione didattica della formula.
      Equazione della deviazione standard, σn, utilizzata nell'analisi statistica per l'accuratezza del controllo negativo.
      Equazione μ<sub>p</sub>=segnale medio del controllo positivo; concetto di analisi dati statistici.
      Equilibrio statico, equazione μn= segnale medio del controllo negativo, analisi didattica.
      NOTA: Un fattore Z′ compreso tra 0,5 e 1,0 indica che il saggio è adatto per lo screening ad alto rendimento.

3. Applicazione del saggio reporter STAT6 per lo screening di tossici ambientali

ATTENZIONE: Trattare gli idrocarburi aromatici policiclici e i sali di metalli pesanti come materiali tossici e potenzialmente cancerogeni. Utilizzare idonei dispositivi di protezione individuale, eseguire tutte le manipolazioni in una cappa chimica certificata e smaltire i materiali contaminati secondo le procedure istituzionali per i rifiuti pericolosi.

  1. Screening di tossici ambientali
    1. Seminare le cellule reporter STAT6 a 2 × 105 cellule/mL in una piastra bianca trasparente a 96 pozzetti utilizzando 100 µL di mezzo di coltura completo per pozzetto. Incubare le cellule per tutta la notte.
    2. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco contenente ciascun composto in esame alla concentrazione finale desiderata, pari a 10 µM per questo protocollo, e trattare le cellule in assenza di IL-4 e IL-13.
    3. Includere un gruppo di controllo negativo contenente il 0,1% di dimetilsulfossido e un gruppo di controllo positivo contenente IL-4 e IL-13 a 10 ng/mL ciascuno. Incubare le cellule per 24 h.
    4. Determinare la vitalità cellulare utilizzando il saggio di conteggio cellulare come descritto nei passaggi 1.2.3–1.2.5.
    5. Misurare l'attività della luciferasi come descritto nei passaggi 1.3.6–1.3.7.
    6. Normalizzare il segnale di luminescenza di ogni pozzetto rispetto al corrispondente valore di vitalità cellulare. Esprimere il risultato normalizzato in rapporto al gruppo di controllo negativo.
    7. Escludere i composti che riducono la vitalità cellulare al di sotto dell'80% dall'interpretazione dell'attività del reporter STAT6.
      NOTA: Considerare i segnali del reporter ottenuti in condizioni citotossiche come non affidabili, poiché la ridotta vitalità cellulare può alterare la luminescenza indipendentemente dall'attività della via di segnalazione STAT6.

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Risultati

Per determinare la concentrazione ottimale di puromicina per la selezione stabile, le cellule parentali 16HBE14o− sono state trattate con concentrazioni crescenti di puromicina (0,5–4 µg/mL) e la vitalità cellulare è stata valutata dopo 24, 48 e 72 ore mediante un saggio di vitalità cellulare. La puromicina ha ridotto la vitalità cellulare in modo dose- e tempo-dipendente, con tutte le concentrazioni che hanno portato la vitalità al di sotto del 20% dopo 48–72 ore (Figura 3). Una ...

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Discussione

La segnalazione IL-4/IL-13–JAK–STAT6 non è solo un importante bersaglio terapeutico, ma anche un fattore chiave nella patogenesi delle malattie allergiche, tra cui asma e rinite allergica22. Questo protocollo descrive un saggio reporter semplice, basato su linee cellulari stabili, per l'identificazione di modulatori dell'attività di STAT6. Il saggio può essere utilizzato per valutare gli effetti modulatori su STAT6 di un'ampia gamma di composti ambientali ed è facilmente adattabile a schermature a...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Research Council della Thailandia (NRCT) (concessione n. N42A680388) e dal progetto di ricerca sostenuto dall'Università di Mahidol (Fondo per la Ricerca Strategica: 2025) (concessione n. 35). Le figure 1 e 2 sono state create utilizzando BioRender.com (Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tripsina-EDTA allo 0,25%Gibco25200072Reagente per la dissociazione cellulare
Provetta conica da 15 mL per centrifugaCorningCLS430791Provetta sterile in polipropilene per centrifuga
Linea cellulare epiteliale bronchiale umana 16HBE14o-In dono dal Dott. Nawiya Huipao (Prince of Songkla University, Thailandia) e dal Prof. Dr. Dieter C. Gruenert (University of California San Francisco, USA)RRID:CVCL_0112Linea cellulare epiteliale bronchiale umana (passaggi 35–40); confermata priva di micoplasmi e mantiene morfologia epiteliale differenziata delle vie aeree e proprietà di barriera. Riferimento: Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47.
Piastra da coltura tissutale trasparente a fondo piatto da 24 pozzettiCorning3527Piastra per coltura cellulare
Piastra da coltura tissutale trasparente a fondo piatto da 6 pozzettiCorning3516Piastra per coltura cellulare
Microtitolazione in polistirene trasparente a fondo piatto da 96 pozzetti, trattata per coltura tissutaleCorning3599Piastra per saggio di vitalità cellulare
Microtitolazione in polistirene bianca con fondo trasparente da 96 pozzetti, trattata per coltura tissutaleCorning3610Piastra per saggio di luminescenza
AC-4-130 (inibitore di STAT5)MedChemExpressHY-124500Inibitore selettivo di STAT5
AS1517499 (inibitore di STAT6)MedChemExpressHY-100614Inibitore selettivo di STAT6
Benzo[b]fluoranteneAccuStandardH-128NIdrocarburo aromatico policiclico
Cappa di sicurezza biologica, Classe IINuaireNU-543-400EPer procedure asettiche di coltura cellulare
Cloruro di cadmio (CdCl2)Sigma202908Composto di metallo pesante
Kit per il conteggio cellulare-8 (CCK-8)MedChemExpressHY-K0301Saggio di vitalità cellulare
Flacone per coltura cellulare, 25 cm² (T-25)Corning430639Flacone per coltura tissutale
Incubatore a CO2NuaireNU-5710EMantenuto a 37 °C, 5% CO2, atmosfera umidificata
Dietilsolfossido (DMSO)SigmaD2650Solvente (concentrazione finale 0,1%) e crioprotettante (10%)
Suero bovino fetale (FBS)SigmaF7524Supplemento per mezzo (10%) e mezzo per criopreservazione (10%)
EmocitometroBOECOBOE14Conteggio cellulare manuale
Microscopio ottico a contrasto di fase invertitoZEISSPrimovertOsservazione della morfologia cellulare
Sistema per saggio della luciferasi (ONE-Step)BPS Bioscience60690Saggio del reporter della luciferasi
Cloruro di mercurio (HgCl2)Sigma215465Composto di metallo pesante
Lettore per microtitolazioneBioTekSynergy Neo2Lettore multimodale per microtitolazione/luminometro controllato dal software Gen5 (v3.08.01). Assorbanza misurata a 450 nm con riferimento a 650 nm dopo 15–20 s di agitazione lineare. Luminescenza misurata in modalità endpoint utilizzando un guadagno del detector di 120 dopo 20 s di agitazione lineare.
Mezzo essenziale minimo di Eagle (MEM)Gibco11095-080Mezzo basale per coltura
Solfato di nichel (NiSO4)Tokyo Chemical IndustryN1203Composto di metallo pesante
Materiale particolato (PM)National Institute of Standards and TechnologySRM 2975Materiale di riferimento standard per materiale particolato
Penicillina-streptomicina (100×)Gibco15140122Supplemento antibiotico (concentrazione finale 1%)
Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS)Gibco18912014Tampone di lavaggio
PolybreneSigmaTR-1003-GPotenziatore della trasduzione lentivirale
PuromicinaMedChemExpressHY-B1743AAntibiotico per la selezione stabile delle cellule
IL-13 umana ricombinanteThermo Fisher ScientificA42526Citochina per stimolazione
IL-4 umana ricombinanteThermo Fisher ScientificA42602Citochina per stimolazione
Lentivirus reporter della luciferasi per STAT6BPS Bioscience78799Costrutto reporter lentivirale; titolo del lotto 5 × 107 UT/mL
Stattic (inibitore di STAT3)MedChemExpressHY-13818Inibitore selettivo di STAT3

Riferimenti

  1. Organisation for Economic Co-operation and Development. The Economic Consequences of Outdoor Air Pollution. OECD Publishing; Paris; 2016.
  2. Thailand Pollution Control Department. Air Quality Assessments for Health and Environment Policies in Thailand. Thailand Pollution Control Department; Bangkok; 2018.
  3. Health Effects Institute. State of Global Air Report 2024. Available at: https://www.stateofglobalair.org/resources/report/state-global-air-report-2024
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