Implementazione di un saggio reporter per STAT6 per lo screening di tossicanti ambientali che influenzano l'infiammazione allergica delle vie aeree

Aekkacha Moonwiriyakit; Phattarin Pothipan; Dhanpisit Toyingsirikul; Pawit Santiwong; Sirapop Lusawat

doi:10.3791/71694

Articolo metodologico

Implementazione di un saggio reporter per STAT6 per lo screening di tossicanti ambientali che influenzano l'infiammazione allergica delle vie aeree

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DOI:

10.3791/71694

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25 agosto 2026

Aekkacha Moonwiriyakit¹ , Phattarin Pothipan¹ , Dhanpisit Toyingsirikul¹ , Pawit Santiwong¹ , Sirapop Lusawat¹

¹Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la generazione e la validazione di un saggio reporter stabile con luciferasi per STAT6 in cellule epiteliali delle vie aeree umane. Il metodo consente lo screening efficiente di agenti tossici ambientali e componenti dell'inquinamento atmosferico che modulano l'attività di STAT6 in condizioni in vitro controllate.

Abstract

L'infiammazione delle vie aeree allergica associata all'inquinamento atmosferico è una preoccupazione crescente per la salute pubblica. L'interleuchina-4 (IL-4) e l'interleuchina-13 (IL-13), che attivano la via di segnalazione del fattore di trascrizione e attivatore della trasduzione del segnale 6 (STAT6), un mediatore centrale dell'infiammazione allergica delle vie aeree, potrebbero modulare la tossicità respiratoria degli inquinanti. Lo studio attuale descrive la generazione e la validazione di un saggio stabile di reporter luciferasico per STAT6 in cellule epiteliali delle vie aeree umane, utile per valutare gli agenti tossici ambientali che modulano la segnalazione di STAT6. Le cellule epiteliali bronchiali umane 16HBE14o⁻ sono state trasdotte con un reporter luciferasico sensibile a STAT6 mediante un vettore lentivirale, seguito dall'ottimizzazione della selezione con puromicina e della molteplicità di infezione, e dall'isolamento monoclonale tramite diluizione limite. È stata selezionata una linea stabile con induzione forte e riproducibile attraverso passaggi seriali. La risposta del reporter è stata validata mediante stimolazione con IL-4/IL-13, e la dipendenza da STAT6 è stata confermata utilizzando inibitori selettivi di STAT6, STAT5 e STAT3. Le prestazioni del saggio sono state quantificate mediante analisi del fattore Z′, che ha indicato una separazione del segnale riproducibile. Inoltre, il saggio è stato applicato a singoli costituenti dell'inquinamento atmosferico, e il benzo[b]fluorantene e le particelle in sospensione hanno aumentato significativamente l'attività del reporter STAT6. Questo metodo fornisce un approccio scalabile per misurare l'attività di STAT6 nelle cellule epiteliali delle vie aeree e per identificare priorità tra gli agenti tossici ambientali che modulano la segnalazione allergica delle vie aeree.

Introduzione

L'inquinamento atmosferico rappresenta una delle sfide più urgenti per la salute pubblica a livello globale, con profondi effetti sulla salute e impatti socioeconomici. Al momento è classificato come il secondo fattore di rischio principale per la mortalità, responsabile di 8,1 milioni di decessi ogni anno¹^,²^,³. Tra gli inquinanti atmosferici, le particelle fini con diametro inferiore a 2,5 micrometri (PM2,5) presentano il rischio per la salute maggiore a causa della loro capacità di penetrare in profondità nel tratto respiratorio⁴^,⁵. Un'esposizione elevata a PM2,5 è stata costantemente associata a un ridotto funzionamento polmonare e a tassi più alti di ricovero ospedaliero per malattie respiratorie⁶. La prevalenza di malattie infiammatorie allergiche, tra cui asma, rinite allergica e dermatite atopica, è in aumento a livello mondiale ed è particolarmente elevata nelle grandi città ad alto inquinamento⁴.

Le malattie allergiche delle vie aeree, come l'asma atopico, sono principalmente mediate da una risposta infiammatoria di tipo 2, caratterizzata da livelli elevati delle citochine interleuchina-4 (IL-4) e interleuchina-13 (IL-13) e dall'attivazione della via di segnalazione del fattore di trascrizione Signal Transducer and Activator of Transcription 6 (STAT6)⁷. Nelle cellule epiteliali delle vie aeree, la fosforilazione di STAT6 indotta da IL-4 e IL-13 promuove l'ipersecrezione di muco e il danno alla barriera epiteliale, identificando STAT6 come un mediatore centrale della patologia allergica delle vie aeree e come un bersaglio terapeutico rilevante⁸^,⁹. Evidenze sperimentali ottenute da modelli murini indicano che l'esposizione a PM2,5 e biossido di zolfo potenzia la segnalazione di STAT6 e aggrava l'infiammazione allergica delle vie aeree¹⁰^,¹¹. Tuttavia, non è stato ancora valutato sistematicamente se i singoli costituenti dell'inquinamento atmosferico modulino direttamente l'attività trascrizionale di STAT6 nelle cellule epiteliali umane delle vie aeree.

L'inquinamento atmosferico comprende una miscela chimicamente complessa di costituenti, tra cui materiale particolato, idrocarburi policiclici aromatici (IPA), metalli pesanti e sali inorganici, i cui contributi individuali all'attivazione di STAT6 nelle vie aeree rimangono poco definiti¹²^,¹³. Le metodologie attuali per misurare l'attività di STAT6 nelle cellule epiteliali delle vie aeree, come saggi di fosforilazione a punto finale o sistemi reporter basati su trasfezione transitoria, non sono adatte a schermature chimiche su larga scala. Una piattaforma reporter stabile per STAT6 in cellule epiteliali delle vie aeree umane fornirebbe quindi uno strumento scalabile per identificare composti derivati dall'inquinamento che modulano il segnale allergico nelle vie aeree. Questo protocollo descrive lo sviluppo e la validazione di un saggio reporter stabile per STAT6 basato sulla luciferasi in cellule epiteliali delle vie aeree 16HBE14o⁻, consentendo una valutazione quantitativa dell'attivazione di STAT6 per lo screening sistematico di campioni ambientali e singoli tossici chimici.

Protocollo

L'approvazione etica per soggetti umani non è applicabile poiché questo studio ha utilizzato la linea cellulare epiteliale bronchiale umana 16HBE14o⁻ già stabilita.

1. Generazione di cellule 16HBE14o⁻ che esprimono stabilmente un reporter dell'attività di STAT6

NOTA: Figura 1 fornisce una panoramica del flusso di lavoro.

Coltura cellulare
NOTA: Eseguire tutte le procedure utilizzando una tecnica asettica all'interno di un armadio di sicurezza biologica di Classe II. Verificare che le cellule siano prive di contaminazione da micoplasma prima dell'uso.
1. Mantenere le cellule 16HBE14o⁻ in mezzo minimo essenziale integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina. Incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂ e sostituire il mezzo di coltura ogni due giorni.
2. Lasciare che le cellule raggiungano una confluenza di circa l'80%. Aspirare il mezzo di coltura e risciacquare il monostrato cellulare una volta con soluzione salina tamponata al fosfato.
3. Aggiungere soluzione salina tamponata al fosfato in quantità sufficiente a coprire il monostrato cellulare e incubare le cellule per 20 min a 37 °C. Aspirare completamente la soluzione salina tamponata al fosfato.
  NOTA: Utilizzare l'incubazione di 20 min con soluzione salina tamponata al fosfato per facilitare la rottura delle giunzioni intercellulari strette formate da questa linea cellulare. Questa durata rappresenta una modifica ottimizzata internamente.
4. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di tripsina 0,25%–acido etilendiamminotetraacetico per coprire il monostrato cellulare. Incubare le cellule per 10 min a 37 °C.
  NOTA: Monitorare il distacco cellulare utilizzando un microscopio ottico invertito. Toccare delicatamente il contenitore di coltura quando necessario per facilitare il distacco.
5. Aggiungere circa cinque volumi di mezzo di coltura completo rispetto al volume della soluzione di tripsina–acido etilendiamminotetraacetico per arrestare l'attività enzimatica. Pipettare delicatamente la sospensione per ottenere una sospensione monocellulare.
6. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da centrifuga da 15 mL. Centrifugare la sospensione a 300 × g per 5 min a 25 °C.
7. Aspirare con attenzione il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo di coltura fresco. Triturare delicatamente la sospensione e verificare la presenza di una sospensione monocellulare al microscopio ottico invertito.
8. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare alla densità richiesta per l'esperimento successivo. Utilizzare un rapporto di suddivisione abituale di 1:8.
  NOTA: Fare riferimento alla Tabella Supplementare 1 e alla Tabella Supplementare 2 per le aree di crescita dei contenitori di coltura e i volumi corrispondenti di soluzione salina tamponata al fosfato e soluzione di tripsina–acido etilendiamminotetraacetico.
Determinazione della citotossicità indotta da puromicina
NOTA: Selezionare l'antibiotico in base al gene di resistenza codificato dal costrutto lentivirale.
1. Sezionare le cellule 16HBE14o⁻ a 2 × 10⁴ cellule per pozzetto in una piastra di coltura a 96 pozzetti contenente 100 µL di mezzo di coltura completo per pozzetto. Incubare le cellule per tutta la notte.
2. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco contenente puromicina a concentrazioni finali di 0,5, 1, 2 o 4 µg/mL. Preparare piastre separate per i tempi di 24, 48 e 72 ore.
3. Aggiungere 5 µL di reagente per il conteggio cellulare in ogni pozzetto. Incubare la piastra per 1 h a 37 °C.
  NOTA: Evitare di introdurre bolle d'aria nei pozzetti, poiché potrebbero interferire con le misurazioni di assorbanza.
4. Misurare l'assorbanza a 450 nm utilizzando 650 nm come lunghezza d'onda di riferimento. Agitare la piastra per 15 s immediatamente prima di registrare l'assorbanza in modalità endpoint.
5. Calcolare la vitalità cellulare¹⁴ utilizzando l'Equazione 1.
  
  dove:
  
  NOTA: Definire il controllo come cellule non trattate e il bianco come mezzo privo di cellule contenente il reagente del saggio. Selezionare la concentrazione minima di puromicina che elimina completamente le cellule non transdotte entro 48–72 h.
Determinazione della multiplicità di infezione ottimale
ATTENZIONE: Manipolare le particelle lentivirali in condizioni di Livello di Sicurezza Biologica 2, in un impianto registrato di Livello di Sicurezza Biologica 2 e in conformità con le normative istituzionali sulla sicurezza biologica. Eseguire tutte le manipolazioni virali all'interno di un armadio di sicurezza biologica di Classe II. Coprire i materiali monouso contaminati dal virus e le eventuali fuoriuscite con una soluzione di candeggina al 10% per almeno 1 h prima dello smaltimento come rifiuto biologico pericoloso.
NOTA: Ottimizzare la multiplicità di infezione poiché influisce direttamente sull'efficienza di trasduzione.
1. Calcolare il volume richiesto di stock lentivirale¹⁵ utilizzando l'Equazione 2.
  
  dove:
  
  NOTA: Il titolo funzionale dello stock lentivirale reporter per luciferasi STAT6 utilizzato in questo protocollo era di 5 × 10⁷ unità trasducenti/mL. Per 2 × 10⁴ cellule bersaglio, un MOI di 20 corrisponde a 8 µL di stock lentivirale per pozzetto. Il volume del virus deve essere ricalcolato per preparazioni virali con titoli diversi.
2. Sezionare le cellule 16HBE14o⁻ a 2 × 10⁴ cellule per pozzetto in una piastra bianca a 96 pozzetti con fondo trasparente contenente 100 µL di mezzo di coltura completo per pozzetto. Incubare le cellule per tutta la notte fino a raggiungere una confluenza di circa l'80%.
3. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco contenente 5 µg/mL di polibrene e lentivirus reporter per luciferasi STAT6 a MOI di 1, 5, 10 e 20. Includere un pozzetto di controllo mock non transdotto senza lentivirus.
  NOTA: Calcolare il volume di lentivirus necessario per ciascun MOI in base al titolo funzionale dello stock.
4. Incubare le cellule con le particelle lentivirali per 48 h. Sostituire il mezzo di trasduzione con mezzo di coltura fresco e incubare le cellule per ulteriori 24 h.
5. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco contenente interleuchina-4 e interleuchina-13 a 10 ng/mL ciascuna. Incubare le cellule per 24 h.
6. Aggiungere 25 µL di reagente per il saggio della luciferasi in ogni pozzetto¹⁶. Proteggere la piastra dalla luce e incubarla per 20 min a temperatura ambiente.
7. Agitare la piastra linearmente per 20 s. Misurare la luminiscenza in modalità endpoint utilizzando una lettura completa della piastra e un guadagno impostato a 120.
  ATTENZIONE: Registrare la luminiscenza entro 1 h dall'aggiunta del reagente per il saggio della luciferasi per catturare il segnale massimo. Seguire le istruzioni del produttore relative alla sicurezza e alla manipolazione del reagente.
  NOTA: Utilizzare lo stesso lettore multimodale per micropiastre e le stesse impostazioni di acquisizione per tutte le misurazioni di assorbanza e luminiscenza.
Selezione delle cellule transdotte
1. Sezionare le cellule 16HBE14o⁻ a 2 × 10⁵ cellule/mL in una piastra di coltura a 24 pozzetti. Incubare le cellule per tutta la notte.
2. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco contenente il lentivirus reporter per luciferasi STAT6 a un MOI di 20 e 5 µg/mL di polibrene. Incubare le cellule per 48 h.
3. Sostituire il mezzo di trasduzione con mezzo di coltura fresco. Incubare le cellule per ulteriori 24 h.
4. Aspirare il mezzo di coltura e aggiungere mezzo fresco contenente 1 µg/mL di puromicina. Incubare le cellule per 5 giorni, sostituendo il mezzo di selezione ogni 2 giorni.
5. Continuare la selezione con puromicina fino a quando tutte le cellule nel pozzetto di controllo mock non transdotto sono eliminate.
  NOTA: Attendere almeno 24 h dopo la trasduzione prima di applicare la selezione antibiotica, per consentire l'espressione del gene di resistenza.
Isolamento di cloni monocellulari mediante diluizione limite
1. Staccare e contare le cellule reporter STAT6 selezionate con puromicina. Preparare una sospensione monocellulare a 5 cellule/mL mediante diluizione seriale.
  NOTA: Evitare l'aggregazione cellulare durante la diluizione. Far passare la sospensione attraverso un filtro cellulare quando necessario.
2. Distribuire 200 µL della sospensione cellulare in ogni pozzetto di una piastra di coltura a 96 pozzetti per ottenere una densità media di circa una cellula per pozzetto.
3. Esaminare ogni pozzetto utilizzando un microscopio invertito entro 24 h e identificare i pozzetti contenenti una singola cellula. Escludere i pozzetti contenenti più di una cellula o più focolai cellulari spazialmente separati.
4. Monitorare i pozzetti selezionati durante la prima settimana per confermare la crescita clonale. Sostituire il mezzo di coltura ogni 3 giorni.
5. Ampliare ciascun clone nella piastra a 96 pozzetti originale per circa 20 giorni o fino a quando le cellule raggiungono la confluenza. Trasferire ciascun clone in sequenza in una piastra a 6 pozzetti e successivamente in un fiasco di coltura T-25.
  NOTA: Coltivare le cellule nella piastra a 6 pozzetti per circa 6 giorni prima di trasferirle nel fiasco T-25, oppure trasferirle quando raggiungono la confluenza appropriata.
  PUNTO DI PAUSA: Continuare ad ampliare i cloni o criopreservarli a 1 × 10⁶ cellule per provetta in 1 mL di mezzo di criopreservazione contenente il 90% di siero fetale bovino e il 10% di dimetilsulfossido.
6. Sezionare ciascun clone ampliato a 2 × 10⁵ cellule/mL in una piastra bianca a 96 pozzetti con fondo trasparente. Incubare le cellule per tutta la notte.
7. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco contenente IL-4 e IL-13 a 10 ng/mL ciascuna. Incubare le cellule per 24 h.
8. Misurare l'attività della luciferasi come descritto nei passaggi 1.3.6–1.3.7. Confrontare l'attività del reporter indotta tra i singoli cloni.
9. Ripetere il saggio della luciferasi con numeri crescenti di passaggi cellulari. Selezionare i cloni che mantengono un'attività del reporter indotta da citochine costante tra i diversi passaggi.
  NOTA: Il clone 3 è stato selezionato per la sua bassa luminiscenza di base e per la capacità di mantenere un segnale di attivazione indotto da citochine costante attraverso passaggi seriali.

2. Stabilimento e validazione del saggio reporter dell'attività di STAT6

NOTA: Figura 2 fornisce una panoramica del flusso di lavoro.

Convalida del saggio reporter dell'attività di STAT6
1. Sezionare le cellule reporter di STAT6 a 2 × 10⁵ cellule/mL in una piastra bianca trasparente a 96 pozzetti utilizzando 100 µL di mezzo di coltura completo per pozzetto. Incubare le cellule per tutta la notte.
2. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco contenente IL-4 e IL-13 a concentrazioni finali di 10 ng/mL ciascuno. Aggiungere contemporaneamente gli inibitori selettivi come segue: 100 nM AS1517499 (inibitore di STAT6), 2,5 µM AC-4-130 (inibitore di STAT5) o 2,5 µM Stattic (inibitore di STAT3).
3. Includere un controllo veicolo contenente lo 0,1% di dimetilsulfossido (DMSO). Incubare le cellule per 24 h.
4. Determinare la vitalità cellulare utilizzando il saggio di conteggio cellulare descritto nei passaggi 1.2.3–1.2.5.
5. Misurare l'attività della luciferasi come descritto nei passaggi 1.3.6–1.3.7.
6. Normalizzare il segnale di luminescenza di ogni pozzetto rispetto alla corrispondente vitalità cellulare. Esprimere i valori normalizzati in rapporto al gruppo di controllo trattato con citochine.
  NOTA: Una ridotta vitalità cellulare può diminuire il segnale della luciferasi indipendentemente dall'attività di STAT6. Interpretare l'attività del reporter solo dopo aver confermato una vitalità cellulare accettabile.
Valutazione della robustezza del saggio
1. Valutare la robustezza del saggio calcolando il fattore Z′ utilizzando 21 pozzetti replicati sia per i gruppi di controllo positivo che negativo.
2. Calcolare il fattore Z′ utilizzando l'Equazione 3.
  
  dove:
  
  NOTA: Un fattore Z′ compreso tra 0,5 e 1,0 indica che il saggio è adatto per lo screening ad alto rendimento.

3. Applicazione del saggio reporter STAT6 per lo screening di tossici ambientali

ATTENZIONE: Trattare gli idrocarburi aromatici policiclici e i sali di metalli pesanti come materiali tossici e potenzialmente cancerogeni. Utilizzare idonei dispositivi di protezione individuale, eseguire tutte le manipolazioni in una cappa chimica certificata e smaltire i materiali contaminati secondo le procedure istituzionali per i rifiuti pericolosi.

Screening di tossici ambientali
1. Seminare le cellule reporter STAT6 a 2 × 10⁵ cellule/mL in una piastra bianca trasparente a 96 pozzetti utilizzando 100 µL di mezzo di coltura completo per pozzetto. Incubare le cellule per tutta la notte.
2. Sostituire il mezzo di coltura con mezzo fresco contenente ciascun composto in esame alla concentrazione finale desiderata, pari a 10 µM per questo protocollo, e trattare le cellule in assenza di IL-4 e IL-13.
3. Includere un gruppo di controllo negativo contenente il 0,1% di dimetilsulfossido e un gruppo di controllo positivo contenente IL-4 e IL-13 a 10 ng/mL ciascuno. Incubare le cellule per 24 h.
4. Determinare la vitalità cellulare utilizzando il saggio di conteggio cellulare come descritto nei passaggi 1.2.3–1.2.5.
5. Misurare l'attività della luciferasi come descritto nei passaggi 1.3.6–1.3.7.
6. Normalizzare il segnale di luminescenza di ogni pozzetto rispetto al corrispondente valore di vitalità cellulare. Esprimere il risultato normalizzato in rapporto al gruppo di controllo negativo.
7. Escludere i composti che riducono la vitalità cellulare al di sotto dell'80% dall'interpretazione dell'attività del reporter STAT6.
  NOTA: Considerare i segnali del reporter ottenuti in condizioni citotossiche come non affidabili, poiché la ridotta vitalità cellulare può alterare la luminescenza indipendentemente dall'attività della via di segnalazione STAT6.

Risultati

Per determinare la concentrazione ottimale di puromicina per la selezione stabile, le cellule parentali 16HBE14o⁻ sono state trattate con concentrazioni crescenti di puromicina (0,5–4 µg/mL) e la vitalità cellulare è stata valutata dopo 24, 48 e 72 ore mediante un saggio di vitalità cellulare. La puromicina ha ridotto la vitalità cellulare in modo dose- e tempo-dipendente, con tutte le concentrazioni che hanno portato la vitalità al di sotto del 20% dopo 48–72 ore (Figura 3). Una concentrazione di 1 µg/mL si è rivelata la più bassa in grado di eliminare completamente le cellule non transdotte, riducendo il segnale di vitalità residua a circa il 4,5% entro 48 ore (p < 0,0001). L'aumento della concentrazione di puromicina non ha determinato ulteriori riduzioni della vitalità cellulare. Pertanto, è stata scelta una concentrazione di 1 µg/mL di puromicina per la successiva selezione delle cellule transdotte.

Per ottimizzare l'efficienza della trasduzione lentivirale, le cellule 16HBE14o⁻ sono state trasdotte con il lentivirus reporter del luciferasio STAT6 a molteplicità di infezione (MOI) di 1, 5, 10 e 20 per 48 h, seguite da stimolazione con IL-4 e IL-13 (10 ng/mL ciascuna) per 24 h per attivare la segnalazione STAT6. Come mostrato in Figura 4, le unità di luminescenza relative (RLUs) sono aumentate in maniera dipendente dall'MOI. Un MOI di 20 ha prodotto l'induzione del reporter maggiore, determinando un aumento di circa 50 volte della luminescenza rispetto al controllo non stimolato (p < 0,0001). Sulla base di questi risultati, è stato scelto un MOI di 20 per esperimenti successivi.

Dopo la trasduzione e la selezione con puromicina in condizioni ottimizzate, le cellule non trasdotte hanno subito una morte cellulare estesa, mentre le cellule trasdotte hanno mantenuto una morfologia e vitalità normali (Figura 5). Le cellule sopravvissute sono state successivamente sottoposte a diluizione limite per stabilire linee cellulari monoclonali reporter di STAT6.

Tre linee cellulari clonali reporter derivate da singole cellule sono state valutate per l'attività del reporter STAT6. Tutti i cloni hanno mostrato una luminescenza basale bassa (<1.000 RLU). La stimolazione con IL-4 e IL-13 ha indotto un'attività reporter robusta nei cloni 2 e 3, con luminescenza superiore a 20.000 RLU e corrispondente a un'induzione maggiore di 20 volte (Figura 6A). Il clone 3 ha mostrato la luminescenza basale più bassa ed è stato pertanto selezionato per ulteriori caratterizzazioni. L'attività del reporter nel clone 3 è stata valutata in successivi passaggi (P9–P21) per verificare la stabilità a lungo termine. Come mostrato nella Figura 6B, l'induzione del reporter dipendente da STAT6 è rimasta stabile nell'intervallo di passaggi valutato. Un clone è stato considerato idoneo per esperimenti successivi quando ha mostrato un tasso di crescita normale, una luminescenza basale inferiore a circa 1.000 RLU e un'induzione superiore a 20 volte dopo stimolazione con citochine.

Poiché l'IL-4 e l'IL-13 possono attivare ulteriori membri della famiglia STAT, inclusi STAT3 e STAT5, la specificità del saggio del reporter è stata ulteriormente valutata¹⁷^,¹⁸. Le cellule reporter STAT6 sono state stimolate con IL-4 e IL-13 in presenza o assenza di inibitori selettivi rivolti a STAT6, STAT5 o STAT3 per 24 h¹⁹^,²⁰^,²¹. La vitalità cellulare è rimasta superiore al 90% in tutte le condizioni di trattamento (inibitore di STAT6 AS1517499, 100 nM: 98,4%; inibitore di STAT5 AC-4-130, 2,5 µM: 97,4%; inibitore di STAT3 Stattic, 2,5 µM: 96,2%; Figura 7A). L'inibizione di STAT6 ha ridotto in modo significativo l'attività della luciferasi (p < 0,0001), mentre l'inibizione di STAT5 o STAT3 non ha prodotto alcun effetto significativo sull'attività del reporter (p = 0,2593 e p = 0,8857, rispettivamente; Figura 7B). Questi risultati hanno confermato che l'attivazione del reporter era prevalentemente dipendente da STAT6.

La robustezza del saggio è stata valutata calcolando il fattore Z′ utilizzando cellule stimolate con IL-4 e IL-13 come controllo ad alto segnale e cellule trattate con inibitore di STAT6 come controllo a basso segnale. Il saggio ha prodotto un fattore Z′ di 0,703 ± 0,097, indicando un'eccellente prestazione del saggio, una finestra di segnale ampia e idoneità per lo screening ad alto rendimento.

Infine, il saggio del reporter STAT6 è stato applicato per analizzare alcuni costituenti ambientali delle particelle in sospensione, valutandone la capacità di modulare la segnalazione di STAT6. Dopo 24 ore di trattamento, il benzo[b]fluorantene (10 µM) ha aumentato significativamente l'attività del reporter STAT6 di circa 1,75 volte (p = 0,0006), mentre le particelle in sospensione (100 µg/mL) hanno aumentato l'attività del reporter di circa 1,5 volte (p = 0,0398; Figura 8). Al contrario, gli altri idrocarburi policiclici aromatici e i composti di metalli pesanti, inclusi CdCl₂, HgCl₂ e NiSO₄ (ciascuno a 10 µM), non hanno modificato in modo significativo l'attività del reporter. Nel complesso, questi risultati dimostrano che il saggio del reporter STAT6 è stabile, specifico, robusto e adatto allo screening ad alto rendimento di composti ambientali in grado di modulare la segnalazione di STAT6.

Diagramma di trasduzione cellulare; reporter luciferasico STAT6; selezione antibiotica; ottimizzazione del MOI.
Figura 1: Flusso di lavoro per la generazione di cellule reporter STAT6 da 16HBE14o⁻ . Schema riassuntivo del protocollo per la generazione di cellule 16HBE14o⁻ che esprimono stabilmente un reporter luciferasico STAT6. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Diagramma del processo del saggio con cellule reporter STAT6; stimolazione con IL4/13, CCK8, aggiunta di luciferasi, risultati.
Figura 2: Flusso di lavoro per l'allestimento e l'applicazione del saggio reporter STAT6. Schema riassuntivo del saggio reporter STAT6 per la validazione del test e lo screening di tossici ambientali. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafico a barre della vitalità cellulare che mostra gli effetti della puromicina a 0,5-4 µg/mL per 24-72 h; analisi statistica.
Figura 3: Determinazione della concentrazione ottimale di puromicina per la selezione stabile delle cellule. Le cellule parental 16HBE14o⁻ sono state trattate con puromicina (0,5, 1, 2 o 4 µg/mL) per 24, 48 o 72 h. Le cellule di controllo del veicolo hanno ricevuto il 0,1% di dimetilsulfossido (DMSO). La vitalità cellulare è stata determinata mediante un saggio di vitalità cellulare. La vitalità cellulare è stata calcolata dalla differenza di assorbanza tra 450 e 650 nm dopo la sottrazione del bianco e la normalizzazione al controllo del veicolo. I dati sono espressi come media ± DS di tre replicati biologici indipendenti con duplicati tecnici (n = 3). La significatività statistica è stata determinata mediante ANOVA a un fattore seguita dal test di confronti multipli di Dunnett. I valori di p per i confronti con il controllo del veicolo sono indicati. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafici a barre della luminescenza rispetto al MOI; analisi dei dati del fold change di RLU e dei valori p statistici.
Figura 4Ottimizzazione dell'efficienza di trasduzione lentivirale 16HBE14o⁻ le cellule sono state trasdotte con un lentivirus reporter di STAT6 contenente la luciferasi a diverse multiplicità di infezione (MOI) pari a 1, 5, 10 o 20 per 48 h. Dopo un periodo di recupero di 24 h, le cellule sono state stimolate con IL-4 e IL-13 (10 ng/mL ciascuna) per 24 h. (AUnità di luminescenza relative (RLUs) in cellule transdotte con controllo negativo e cellule transdotte con il reporter a MOI indicati. L'analisi statistica è stata eseguita mediante ANOVA ad un fattore, seguita dal test di confronti multipli di Dunnett.BInduzione del fold rispetto al controllo non stimolato a MOI 20 dopo stimolazione con citochine. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un test t di Student non appaiato t-test. I dati sono presentati come media ± DS di tre replicati biologici indipendenti (n = 3). p-i valori sono indicati. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Morfologia cellulare in seguito all'esposizione alla puromicina; immagine al microscopio che mostra variazioni su scala di 50 μm.
Figura 5: Immagini rappresentative di cellule dopo la selezione con puromicina. Le cellule 16HBE14o⁻ sono state transdotte o meno con il lentivirus reporter per STAT6 (MOI = 20) e successivamente trattate con 1 µg/mL di puromicina per 5 giorni. Le immagini sono state acquisite mediante un microscopio invertito a contrasto di fase a un ingrandimento di 100×, in condizioni di acquisizione identiche. Le cellule parentali non trattate hanno formato un normale monostrato epiteliale (a sinistra). Le cellule non transdotte trattate con puromicina hanno mostrato una marcata morte cellulare e distacco (al centro), mentre le cellule transdotte sottoposte a selezione con puromicina sono rimaste vitali e hanno mantenuto una morfologia normale (a destra). Barra della scala = 50 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati del saggio di luminescenza; grafico a barre che confronta le condizioni di controllo e IL in cloni cellulari e passaggi.
Figura 6: Identificazione dei cloni reporter di STAT6 e valutazione della stabilità del reporter. Dopo diluizione limite, tre linee cellulari monoclonali reporter di STAT6 sono state espanse e stimolate con IL-4 e IL-13 (10 ng/mL ciascuna) per 24 h. (A) Attività della luciferasi nei singoli cloni reporter dopo stimolazione con citochine, confrontata con controlli non stimolati. (B) Stabilità dell'attività del reporter di STAT6 nel clone 3 attraverso passaggi seriali (P9–P21). I dati sono presentati come media ± DS di duplicati tecnici. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafici a barre che confrontano la % di vitalità cellulare e la luminescenza normalizzata nei saggi su cellule trattate con farmaci.
Figura 7: Inibizione selettiva dell'attività del reporter STAT6 senza effetti sulla vitalità cellulare. Le cellule reporter STAT6 sono state stimolate con IL-4 e IL-13 (10 ng/mL ciascuna) per 24 h in presenza dell'inibitore di STAT6 AS1517499 (100 nM), dell'inibitore di STAT5 AC-4-130 (2,5 µM) o dell'inibitore di STAT3 Stattic (2,5 µM). Il gruppo di controllo stimolato con citochine e trattato con veicolo ha ricevuto DMSO allo 0,1%. (A) La vitalità cellulare è stata determinata mediante un saggio di vitalità cellulare. (B) Attività della luciferasi dipendente da STAT6, normalizzata rispetto al controllo stimolato con citochine. I dati sono espressi come media ± DS di tre replicati biologici indipendenti (n = 3). Sono indicati i valori di p. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafico a barre dei risultati del saggio di luminescenza normalizzati, che confronta i trattamenti chimici con i campioni di controllo.
Figura 8: Valutazione degli effetti modulatori dei tossicanti ambientali su STAT6. Le cellule reporter di STAT6 sono state trattate per 24 h con materiale particolato (100 µg/mL) o con i tossicanti ambientali indicati, inclusi gli idrocarburi policiclici aromatici (IPA) e i metalli pesanti (10 µM ciascuno). L'attività della luciferasi dipendente da STAT6 è stata normalizzata rispetto al controllo con veicolo (DMSO 0,1%). I dati sono espressi come media ± DS di tre replicati biologici indipendenti (n = 3). La significatività statistica è stata determinata confrontando con il controllo con veicolo e i valori di p sono indicati. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella supplementare 1: Specifiche del contenitore di coltura e parametri di passaggio per 16HBE14o⁻ coltura cellulareFare clic qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: Confronto tra metodi per la misurazione dell'attività di STAT6.Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

La segnalazione IL-4/IL-13–JAK–STAT6 non è solo un importante bersaglio terapeutico, ma anche un fattore chiave nella patogenesi delle malattie allergiche, tra cui asma e rinite allergica²². Questo protocollo descrive un saggio reporter semplice, basato su linee cellulari stabili, per l'identificazione di modulatori dell'attività di STAT6. Il saggio può essere utilizzato per valutare gli effetti modulatori su STAT6 di un'ampia gamma di composti ambientali ed è facilmente adattabile a schermature ad alto rendimento, come dimostrato nello studio pilota di prova di concetto (Figura 8). Combinando un reporter luciferasico con un saggio parallelo di vitalità cellulare, il metodo consente una valutazione quantitativa della modulazione della via di STAT6 riducendo al minimo gli effetti confondenti derivanti dalla citotossicità indotta dai composti.

Una caratteristica distintiva di questo metodo è l'uso di cellule epiteliali bronchiali umane 16HBE14o⁻ stabilmente trasdotte, un tipo cellulare fisiologicamente rilevante in cui il segnale indotto da inquinanti delle citochine IL-4/IL-13 contribuisce all'infiammazione allergica delle vie aeree. Gli approcci esistenti per la misurazione dell'attività di STAT6 presentano importanti limitazioni pratiche. La rilevazione della fosforilazione di STAT6 o delle proteine bersaglio downstream mediante Western blot o saggio immunoenzimatico (ELISA) è laboriosa e relativamente a bassa produttività. I saggi transitori con reporter di luciferasi misurano direttamente l'attività trascrizionale di STAT6, ma sono influenzati da efficienza variabile della trasfezione, variabilità tra diversi lotti e dalla necessità di ripetere la trasfezione per ogni esperimento, riducendo così riproducibilità e produttività.

La linea cellulare stabile con reporter descritta nello studio supera molte di queste limitazioni. Poiché il costrutto reporter è integrato a livello genomico e selezionato in modo clonale, l'espressione del reporter rimane uniforme all'interno della popolazione cellulare e riproducibile tra i diversi passaggi, eliminando la variabilità associata alla trasfezione transitoria. Il segnale di luminescenza viene misurato in cellule vive e può essere normalizzato rispetto a una misurazione parallela della vitalità cellulare, al fine di escludere artefatti citotossici. Inoltre, il saggio è facilmente compatibile con un formato a 96 pozzetti, adatto ad applicazioni da media ad alta produttività. Il saggio ha prodotto un fattore Z′ di 0,703, indicativo di un'eccellente separazione tra i controlli ad alto e basso segnale e confermando la sua idoneità per lo screening ad alta produttività. Un confronto tra gli approcci comunemente utilizzati per misurare l'attività di STAT6 è riportato nella Tabella Supplementare 2. Tuttavia, poiché il saggio rileva l'attivazione di un promotore sensibile a STAT6 e non l'espressione genica endogena dei geni bersaglio, rimane fondamentale una validazione ortogonale mediante l'analisi di geni bersaglio downstream di STAT6, come MUC5AC e CCL26.

Diversi passaggi sono fondamentali per l'efficace messa a punto e applicazione del saggio reporter STAT6. L'ottimizzazione della multiplicità di infezione lentivirale (MOI) è essenziale poiché un'insufficiente quantità di virus riduce l'efficienza di trasduzione, mentre un'eccessiva esposizione virale può indurre stress cellulare e compromettere la vitalità cellulare. Analogamente, è necessario ottimizzare la concentrazione di puromicina per eliminare le cellule non trasdotte preservando al contempo la vitalità delle cellule reporter resistenti. Poiché la suscettibilità alla trasduzione lentivirale e alla selezione antibiotica varia tra i diversi tipi cellulari, entrambi i parametri devono essere ottimizzati empiricamente prima di stabilire linee cellulari reporter stabili. La linea cellulare 16HBE14o⁻ è una linea di cellule epiteliali bronchiali umane immortalizzate ampiamente utilizzata per lo studio dell'infiammazione delle vie aeree, poiché forma giunzioni strette funzionali e produce muco⁸^,²³. Le cellule selezionate per la generazione del reporter devono esprimere recettori funzionali per IL-4 e IL-13 e mantenere intatto il segnale JAK–STAT a valle²⁴. Prima di stabilire linee reporter stabili, il costrutto reporter deve essere convalidato verificando la risposta alla stimolazione citochinica, l'inibizione da parte di inibitori specifici della via di segnalazione e l'assenza di effetti citotossici nelle condizioni sperimentali scelte. Questi passaggi di convalida contribuiscono a garantire che le variazioni dell'attività del reporter riflettano in modo accurato la segnalazione dipendente da STAT6 e non uno stress cellulare aspecifico.

Vanno considerati anche diversi limiti di questo metodo. I vettori lentivirali si integrano in modo casuale nel genoma dell'ospite, il che può determinare una variabilità tra clone e clone nell'attività basale del reporter, nell'inducibilità e nella stabilità dell'espressione a lungo termine. Inoltre, poiché il saggio misura l'attivazione di un promotore sensibile a STAT6, non valuta direttamente l'attivazione del recettore a monte o gli eventi di segnalazione endogeni a valle. Anche la coltura prolungata di cellule stabili con reporter può portare a silenziamento epigenetico o a riduzione dell'espressione del transgene. Per minimizzare questi effetti, è consigliabile stabilire banche master di cellule a basso numero di passaggi e verificare periodicamente la risposta del reporter entro un intervallo definito di passaggi. Inoltre, il saggio non è stato ancora convalidato in cellule epiteliali primarie delle vie aeree umane né in una piattaforma automatizzata completa per lo screening ad alto rendimento. Infine, gli agenti tossici ambientali valutati in questo studio rappresentano un pannello dimostrativo piuttosto che una libreria chimica esaustiva.

L'inquinamento atmosferico, in particolare le particelle fini (PM_2.5), comprende una miscela complessa di costituenti chimicamente e fisicamente diversi, tra cui carbonio nero, sali inorganici, idrocarburi aromatici policiclici e metalli pesanti¹²^,¹³. Le variazioni delle fonti di emissione e dei processi atmosferici producono differenze sostanziali nella composizione delle particelle, che potrebbero contribuire a effetti avversi sulla salute distinti. Di conseguenza, l'identificazione dei componenti specifici responsabili delle risposte allergiche rimane una sfida negli studi epidemiologici e in vivo. Il saggio con reporter STAT6 descritto nello studio fornisce una piattaforma in vitro pratica per analizzare l'attività modulatrice di STAT6 di singoli inquinanti aerodispersi, estratti di materiale particolato attribuibili a specifiche fonti o frazioni particellari chimicamente definite. Questo protocollo potrebbe facilitare la selezione di inquinanti candidati per studi meccanicistici e sostenere la valutazione orientata al rischio di miscele complesse di inquinamento atmosferico.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Research Council della Thailandia (NRCT) (concessione n. N42A680388) e dal progetto di ricerca sostenuto dall'Università di Mahidol (Fondo per la Ricerca Strategica: 2025) (concessione n. 35). Le figure 1 e 2 sono state create utilizzando BioRender.com (Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tripsina-EDTA allo 0,25%	Gibco	25200072	Reagente per la dissociazione cellulare
Provetta conica da 15 mL per centrifuga	Corning	CLS430791	Provetta sterile in polipropilene per centrifuga
Linea cellulare epiteliale bronchiale umana 16HBE14o-	In dono dal Dott. Nawiya Huipao (Prince of Songkla University, Thailandia) e dal Prof. Dr. Dieter C. Gruenert (University of California San Francisco, USA)	RRID:CVCL_0112	Linea cellulare epiteliale bronchiale umana (passaggi 35–40); confermata priva di micoplasmi e mantiene morfologia epiteliale differenziata delle vie aeree e proprietà di barriera. Riferimento: Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47.
Piastra da coltura tissutale trasparente a fondo piatto da 24 pozzetti	Corning	3527	Piastra per coltura cellulare
Piastra da coltura tissutale trasparente a fondo piatto da 6 pozzetti	Corning	3516	Piastra per coltura cellulare
Microtitolazione in polistirene trasparente a fondo piatto da 96 pozzetti, trattata per coltura tissutale	Corning	3599	Piastra per saggio di vitalità cellulare
Microtitolazione in polistirene bianca con fondo trasparente da 96 pozzetti, trattata per coltura tissutale	Corning	3610	Piastra per saggio di luminescenza
AC-4-130 (inibitore di STAT5)	MedChemExpress	HY-124500	Inibitore selettivo di STAT5
AS1517499 (inibitore di STAT6)	MedChemExpress	HY-100614	Inibitore selettivo di STAT6
Benzo[b]fluorantene	AccuStandard	H-128N	Idrocarburo aromatico policiclico
Cappa di sicurezza biologica, Classe II	Nuaire	NU-543-400E	Per procedure asettiche di coltura cellulare
Cloruro di cadmio (CdCl₂)	Sigma	202908	Composto di metallo pesante
Kit per il conteggio cellulare-8 (CCK-8)	MedChemExpress	HY-K0301	Saggio di vitalità cellulare
Flacone per coltura cellulare, 25 cm² (T-25)	Corning	430639	Flacone per coltura tissutale
Incubatore a CO₂	Nuaire	NU-5710E	Mantenuto a 37 °C, 5% CO₂, atmosfera umidificata
Dietilsolfossido (DMSO)	Sigma	D2650	Solvente (concentrazione finale 0,1%) e crioprotettante (10%)
Suero bovino fetale (FBS)	Sigma	F7524	Supplemento per mezzo (10%) e mezzo per criopreservazione (10%)
Emocitometro	BOECO	BOE14	Conteggio cellulare manuale
Microscopio ottico a contrasto di fase invertito	ZEISS	Primovert	Osservazione della morfologia cellulare
Sistema per saggio della luciferasi (ONE-Step)	BPS Bioscience	60690	Saggio del reporter della luciferasi
Cloruro di mercurio (HgCl₂)	Sigma	215465	Composto di metallo pesante
Lettore per microtitolazione	BioTek	Synergy Neo2	Lettore multimodale per microtitolazione/luminometro controllato dal software Gen5 (v3.08.01). Assorbanza misurata a 450 nm con riferimento a 650 nm dopo 15–20 s di agitazione lineare. Luminescenza misurata in modalità endpoint utilizzando un guadagno del detector di 120 dopo 20 s di agitazione lineare.
Mezzo essenziale minimo di Eagle (MEM)	Gibco	11095-080	Mezzo basale per coltura
Solfato di nichel (NiSO₄)	Tokyo Chemical Industry	N1203	Composto di metallo pesante
Materiale particolato (PM)	National Institute of Standards and Technology	SRM 2975	Materiale di riferimento standard per materiale particolato
Penicillina-streptomicina (100×)	Gibco	15140122	Supplemento antibiotico (concentrazione finale 1%)
Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS)	Gibco	18912014	Tampone di lavaggio
Polybrene	Sigma	TR-1003-G	Potenziatore della trasduzione lentivirale
Puromicina	MedChemExpress	HY-B1743A	Antibiotico per la selezione stabile delle cellule
IL-13 umana ricombinante	Thermo Fisher Scientific	A42526	Citochina per stimolazione
IL-4 umana ricombinante	Thermo Fisher Scientific	A42602	Citochina per stimolazione
Lentivirus reporter della luciferasi per STAT6	BPS Bioscience	78799	Costrutto reporter lentivirale; titolo del lotto 5 × 10⁷ UT/mL
Stattic (inibitore di STAT3)	MedChemExpress	HY-13818	Inibitore selettivo di STAT3

Riferimenti

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