Preparazione di vescicole unilamelari unilamellari grandi e giganti ibride proteina-membrana e polimero/lipidico

Sommario

Questo protocollo dimostra la ricostituzione mediata dal detersivo di una proteina di membrana, il citocromo bo3 ubiquinolo ossidasi, in grandi vescicole unilamelari composte da PDMS-g-PEO e la loro conversione in vescicole giganti tramite fusione-elettroformazione. I compartimenti funzionali a base di polimeri risultanti sono adatti a studi biochimici e biofisici avanzati.

Abstract

Le vescicole formate da copolimeri anfifilili, da sole o miscelate con fosfolipidi, offrono una stabilità meccanica e chimica superiore rispetto alle vescicole lipidiche convenzionali. Questo li rende un telaio attraente, che può essere ulteriormente sviluppato ed ampliato per consentire applicazioni specifiche, come la somministrazione di farmaci, il biosensing diagnostico, la costruzione di cellule artificiali e micro e nanoreattori bioispirati. In particolare, la funzionalizzazione tramite l'incorporazione di proteine di membrana è essenziale per molte di queste applicazioni. Qui presentiamo un protocollo per preparare le grandi vescicole unilamelari funzionalizzate dalle proteine di membrana (LUVs) dal copolimero di innesto PDMS-g-PEO tramite ricostituzione mediata da detergente. Inoltre, descriviamo come queste grandi vescicole possano essere convertite in vescicole unilamellari giganti (GUV) utilizzando un approccio fusione-elettroformazione. Il protocollo copre la marcatura a fluorescenza delle proteine di membrana, la preparazione di LUV polimerici e ibridi, la ricostituzione delle proteine di membrana, l'analisi della distribuzione delle dimensioni tramite scattering dinamico della luce (DLS), la valutazione dell'attività proteica tramite misurazioni del consumo di ossigeno, la preparazione di GUV funzionalizzati proteicamente e l'analisi dell'inserimento proteico e dell'attività di pompaggio protonico nei GUV tramite microscopia confocale. I risultati rappresentativi dimostrano la formazione di proteo-LUV monodispersi con un indice di polidispersione (PDI) inferiore a 0,2, e la generazione di proteino-GUV con diametri compresi tra 5 e 35 μm. L'attività proteica è confermata dalle misurazioni del consumo di ossigeno sia nei LUV polimerici (18,2 nmol/min/mL) sia negli LUV ibridi (26,9 nmol/min/mL). L'inserimento proteico nei GUV viene quantificato tramite intensità di fluorescenza, ottenendo 20,6 ± 3,7 u.a. per i GUV polimerici e 26,2 ± 5,0 u.a. per gli GUV ibridi. L'attività di pompaggio protonico nei GUV, monitorata tramite un colorante incapsulato sensibile al pH, è coerente con la funzionalità proteica, con il pompaggio protonico in direzione interna predominante. La morbidezza meccanica del copolimero e lo spessore di due strati lipidici (~5,3 nm) supportano un'inserzione efficiente delle proteine e la conservazione della loro funzionalità.

Introduzione

I copolimeri a blocchi anfifilici possono auto-assemblarsi in soluzione acquosa formando membrane, che si curvano e si chiudono spontaneamente su se stesse formando compartimenti sferici racchiusi nella membrana noti come polimeromi (vescicole polimeriche). Rispetto alle membrane lipidiche, i compartimenti a base di polimeri offrono una maggiore versatilità chimica e una maggiore stabilità^{chimica 1} e^{meccanica 2}, rendendoli altamente attraenti per applicazioni come la somministrazione di farmaci, nanoreattori e microreattori, e la costruzione di cellule artificiali resistenti. Sia il nostro gruppo che altri hanno funzionalizzato membrane polimeriche inserendo proteine della membrana per creare organelli e cellule^artificiali 1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . I polimeri contenenti un nucleo idrofobo poli(dimetilsossiano) (PDMS) sono particolarmente adatti all'incorporazione di proteine di membrana grazie all'elevata flessibilità della catena e alla possibilità di adattare meglio lo spessore idrofobo della membrana per adattarlo meglio al dominio^{transmembrana 5} della proteina. Sebbene il nostro laboratorio si sia concentrato principalmente sul copolimero di innesto poli(dimetilsilossano)-innesto poli(ossido di etilene) (PDMS-g-PEO), che forma membrane^{altamente dinamiche 4,16,17} più morbide rispetto ai tradizionali bilayer lipidici e con uno spessore di circa 5,3^{nm 1}, altri gruppi hanno impiegato con successo copolimeri triblocco basati su PDMS come PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA^5,6,7,8,9,10,11 e PEtOz-b-PDMS-b-PEtOz¹² per la ricostituzione delle proteine di membrana. Anche copolimeri diblocchi relativamente rigidi come PBD-b-PEO, in particolare in sistemi ibridi mescolati con lipidi, sono stati utilizzati per l'incorporazione efficace di^{proteine 13}. Questi esempi evidenziano la versatilità delle membrane a base polimerica come piattaforme di ricostituzione, che possono inoltre fornire una maggiore stabilità chimica¹ e una vita funzionale^{prolungata 14} per le proteine di membrana incorporate. Sebbene le membrane ibride polimero/lipidico possano non sempre eguagliare la stabilità chimica dei sistemi polimerici^puri, offrono un compromesso interessante combinando la robustezza meccanica dei polimeri con la rilevanza biologica dei lipidi. Questo si traduce in un ambiente a membrana che imita più da vicino le membrane biologiche native, preservando al contempo i principali vantaggi dei materiali sintetici. Tali architetture ibride possono offrire vantaggi aggiuntivi, tra cui la riduzione della permeabilità dei protoni derivante dalla riorganizzazione su scala^{nanometrica 1} e la formazione di domini all'interno della^{membrana 15}.

Esistono diverse tecniche per ricostituire le proteine di membrana in vescicole nanodimensionate (LUVs), tra cui la ricostituzione mediata da solvente organico (ad esempio, evaporazione in fase inversa, reidratazione di film lipidici-proteici), approcci meccanici (ad esempio, sonicazione, French press, congelamento-disgelo) e ricostituzione mediata dal detersivo (tramite rimozione, diluizione o incorporazione diretta del detergente⁾¹⁸, oltre a strategie più recenti come il trasferimento diretto da nanodischi di copolimeri di copolimero stirene-maleico¹⁹. Mentre le porine sono state incorporate con successo nei LUV polimerici tramite inserzione diretta, ad esempio aggiungendo la proteina al film polimerico durante la^{reidratazione 8}. Questo approccio generalmente porta a una bassa efficienza di inserzione per proteine di membrana più grandi o complesse e spesso porta a un'orientazione casuale delle proteine. Di conseguenza, la ricostituzione mediata dal detersivo, che prevede l'aggiunta controllata del detersivo seguita dalla sua rimozione, rimane il metodo più utilizzato. È anche la strategia preferita per incorporare proteine di membrana più grandi nei LUV a base di polimeri, in particolare per proteine asimmetriche dove l'orientamento controllato è cruciale per la funzione. In questo approccio, le membrane delle vescicole vengono prima saturate con il detergente preferito (la concentrazione saturante del detersivo è indicata come_{R saturato}), parzialmente solubilizzate (coesistenza di vescicole e micelle) o completamente solubili, cioè scomposte in micelle (la concentrazione del detersivo è indicata come_{R sol}). Questo trattamento iniziale con la membrana è seguito dall'aggiunta di proteine, incubazione e rimozione del^{detersivo 18}. Quest'ultima può essere ottenuta tramite dialisi, cromatografia di esclusione di dimensione o adsorbimento su perle di polistirene idrofobiche (ad esempio, Bio-Sfere). La scelta del detersivo, la sua concentrazione e il metodo di rimozione sono ottimizzati per ogni tipo di membrana e proteina per massimizzare l'efficienza di incorporazione e controllare l'orientamento^{delle proteine 20}.

Sebbene i LUV siano particolarmente adatti per le misurazioni di attività di massa, gli studi a vescicole singole e le analisi basate su microscopia ottica richiedono la ricostituzione delle proteine di membrana in vescicole unilamelari giganti (GUV). Cinque approcci principali sono utilizzati per l'incorporazione di proteine nei GUVs: co-formazione in presenza di proteina e solvente^{organico 21}, co-formazione in presenza di un^{detergente 22}, inserimento nei GUV preformati tramite diluizione^{del detergente 23}, inserimento tramite fusione a membrana con proteo-LUV^16,24 e fusione-elettroformazione²⁵. Sebbene questi approcci siano stati applicati con successo ai GUV lipidici, il loro trasferimento ai GUV polimeri o ibridi polimero/lipidici è spesso una sfida. In particolare, i metodi di co-formazione e diluizione detergente spesso portano a basse efficienze di inserimento nelle membrane polimeriche o sono incompatibili con alcune composizioni^{polimeriche 15}. Le strategie basate sulla^fusione 4,16,24,26,27 che si basano su agenti fusogenici aggiuntivi possono essere problematiche, poiché lipidi/polimeri cationici sintetici o peptidi fusogenici possono compromettere la stabilità delle proteine di membrana, alterare le proprietà della membrana o ridurre l'efficienza di incorporazione della proteina bersaglio. La fusione-elettroformazione supera molte di queste limitazioni e si è dimostrata un metodo robusto ed efficiente per incorporare proteine di membrana nei GUV polimeri e ibridi polimero/^{lipidici 1,5,15}. Questo approccio consente l'incorporazione controllata di proteine preservando l'integrità della membrana e la funzionalità proteica, rendendolo particolarmente adatto alla generazione di polimeri GUV funzionalizzati proteicamente.

La ricostituzione delle pompe di protoni in vescicole polimeriche è essenziale per costruire cellule artificiali resistenti, poiché consente la generazione di gradienti protonici transmembrana—la fondamentale valuta energetica dei sistemi viventi. Ricreando la conversione dell'energia chemiosmotica in un ambiente a membrana minima^{controllata 28}, queste vescicole possono guidare la sintesi dell'ATP, il trasporto attivo e le reazioni metaboliche, stabilendo la base energetica necessaria per una funzionalità autonoma e realistica. Una pompa protonica rappresentativa utilizzata in tali sistemi è la citocromo bo₃ ossidasi di E. coli, un enzima respiratorio terminale che accoppia la riduzione dell'ossigeno alla traslocazione protonica attraverso la membrana. Poiché il trasferimento di elettroni e il pompaggio di protoni sono strettamente accoppiati, la loro attività nelle vescicole sintetiche può essere monitorata quantitativamente sia tramite il consumo di ossigeno ^1,20 sia tracciando la formazione del gradiente^{protonico 1}.

In questo protocollo, presentiamo un flusso di lavoro dettagliato per la preparazione di LUV basati su PDMS-g-PEO, inclusi membrane polimeriche pure e ibride polimero/lipidico, la loro funzionalizzazione con proteine di membrana, l'espansione a GUV e le misurazioni di attività della pompa protonica ricostituita citocromo bo₃ ossidasi tramite saggi di consumo di ossigeno sfusi e misurazioni di pompaggio protonico a vescicola singola.

Protocollo

NOTA: Tutti i rifiuti chimici pericolosi generati durante questo protocollo devono essere smaltiti in conformità con le normative istituzionali e locali.

1. Preparazione per Bio-Beads SM-2

NOTA: Le Bio-Sfere SM-2 vengono prelavate con metanolo per rimuovere conservanti e contaminanti organici prima dell'adsorbimento del detersivo.

1. Metti la carta filtrante in un imbuto di vetro posizionato sopra un becher o una fiaschetta di vetro pulita.
2. Aggiungi almeno 600 mg di Bio-Beads SM-2 all'imbuto (sufficiente per 3 ripetizioni di ricostituzione sia per LUV ibridi che polimerici).
   NOTA: È richiesto un minimo di 90 mg di Bio-Beads SM-2 per ogni ricostituzione, come specificato nel passo 4.4.1. Una quantità maggiore può essere preparata se si pianificano ulteriori ricostituzioni.
3. Lava le perline tre volte con metanolo puro, utilizzando un volume sufficiente per immergerle completamente ogni volta.
   ATTENZIONE: Esegui tutti i passaggi di maneggiamento del metanolo in una cappa chimica.
4. Lava immediatamente le perline tre volte con acqua Milli-Q per rimuovere il metanolo residuo.
   NOTA: Non lasciare che le perline si asciughino durante la procedura di lavaggio. Quando rimuovi le soluzioni di lavaggio, assicurati che le perline rimangano umide e non si asciughino completamente.
5. Trasferire le perline lavate in un contenitore adatto (ad esempio, un tubo o una bottiglia di vetro sterile in polipropilene da 50 mL con un tappo ben sigillato), aggiungere acqua Milli-Q finché le perline non sono completamente sommerse e conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.

2. Marcatura a fluorescenza delle proteine di membrana

1. Diluizione delle proteine
   1. Dissolvere la citocromo bo₃ ossidasi a 2,2 mg/mL in un buffer HEPES da 20 mM contenente 0,05% di n-dodecil β-D-maltoside (DDM) (w/v), pH 8,3. Questo pH garantisce una frazione sufficiente di amine primarie non protone (reattive) per una marcatura efficiente.
      NOTA: Per una marcatura ottimale con coloranti ATTO N-idrossisuccinimidile (NHS), mantenere il pH del tampone tra 8,3 e 8,5. Per altri coloranti, segui le istruzioni del produttore per la coniugazione delle proteine, incluse le condizioni di etichettatura raccomandate.
2. Aggiunta di coloranti
   1. Aggiungere un eccesso otto molari di estere N-idrossisuccinidil (NHS) reattivo ad amina, sciolto a 2 mg/mL in DMSO anidro, alla soluzione proteica.
      NOTA: Per altri coloranti, segui le istruzioni del produttore per la coniugazione proteica, inclusa l'eccesso molare raccomandato da colorante a proteina.
   2. Mescola delicatamente battendo tre volte il tubo della microcentrifuga per garantire una distribuzione omogenea del colorante.
3. Incubazione
   1. Incubare la miscela di reazione a temperatura ambiente (20–25 °C) per 1,5 ore sotto una delicata agitazione (250 rpm) in un termomiscelatore, al buio, per prevenire lo sbiancamento fotoelettrico.
4. Rimozione del colorante non legato
   1. Bilanciare la colonna Superdex 200 10/300 GL (CV: 23,562 mL) con almeno 2 volumi di colonna (circa 48 mL) di tampone di eluzione proteica a membrana (20 mM HEPES, pH 7,5, 200 mM KCl, 0,05% DDM (p/v)) a una portata di 0,3 mL/min utilizzando un sistema di purificazione ÄKTA.
      NOTA: Per la rimozione di coloranti fluorescenti in eccesso, colonne di filtrazione in gel più corte (lunghezza del letto da 10–20 cm) sono generalmente sufficienti, in particolare per coloranti meno idrofili. Il produttore del colorante raccomanda la desalinizzazione utilizzando una matrice Sephadex G-25. In questo studio è stata utilizzata una colonna Superdex 200 10/300 GL grazie alla disponibilità dello strumento.
   2. Carica fino a 500 μL della proteina marcata usando un anello capillare da 1 mL ed eludi con lo stesso tampone a 0,3 mL/min.
   3. Monitorare l'eluzione misurando l'assorbanza a 280 nm per le proteine e a 643 nm per il colorante ATTO 643.
   4. Raccogli frazioni di 0,5 mL su 1,5 volumi di colonna. Identifica le frazioni contenenti sia proteine che coloranti. Usare direttamente se concentrato sufficientemente, oppure concentrarsi utilizzando unità di filtro centrifugo Amicon. Per la concentrazione usando filtri Amicon, utilizzare un filtro centrifugo con un limite di 30 kDa di peso molecolare e centrifugare a 14.000 × g per 30 minuti a 4 °C.
5. Determinazione della concentrazione proteica e del grado di marcatura (DOL)
   1. Misurare gli spettri di assorbenza del coniugato purificato.
   2. Calcola la concentrazione proteica e il numero medio di molecole di colorante per enzima utilizzando:
      
      dove A_max rappresenta l'assorbenza del coniugato al massimo di assorbimento del colorante (λ_abs; ATTO 643, λ = 643 nm), A₂₈₀ è l'assorbanza a 280 nm (massimo di assorbimento delle proteine), ε_prot è il coefficiente molare di estinzione della citocromo _bo3 ossidasi denaturata (184.720 M⁻¹cm⁻¹), ε_colorante è il coefficiente molare di estinzione del colorante (150.000 M⁻¹cm⁻¹), e CF₂₈₀ è il fattore di correzione per l'assorbanza ATTO 643 a 280 nm (0,04).

3. Preparazione di grandi vescicole unilamellari (LUV)

1. Preparazione di film polimerici sottili o polimeri/lipidici
   1. Utilizzare pipette a spostamento positivo con punte resistenti ai solventi o siringhe di vetro ermeche ai gas per trasferire soluzioni di polimero, lipidi e coloranti fluorescenti disciolte in cloroformio:metanolo (2:1, v/v) in una fiala di vetro pulita secondo le composizioni elencate nella Tabella 1.
      ATTENZIONE: Esegui tutta la gestione dei solventi sotto una cappa fumi indossando guanti protettivi e occhiali di sicurezza.
   2. Mescola la soluzione accuratamente con un vortice delicato mantenendo la fiala in posizione verticale per garantire l'omogeneità.
      ATTENZIONE: Regola con attenzione la velocità del vortice per evitare che il liquido schizzi o spruzzi dalla fiala sulle tue mani.
   3. Evaporare i solventi organici sotto un flusso delicato di azoto nella cappa per circa 1 ora, finché non si forma un film uniforme sottile sulla parete della fiala (Figura 1).
      NOTA: Regola il flusso di azoto in modo che il liquido si muova dolcemente senza schizzi; Un flusso troppo alto può causare formazione irregolare della pellicola. Dopo 5–10 minuti, il flusso può essere leggermente aumentato per garantire una completa asciugatura e una distribuzione uniforme della miscela vescicola lungo il fondo della fiala.
2. Reidratazione della pellicola
   1. Reidratare la pellicola essiccata con 1 mL di tampone di reidratazione (1 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM saccarosio) per ottenere una concentrazione finale di anfifili di 5 mg/mL (corrispondente a 1,67 mM per i polimeromi e 2,14 mM per le vescicole ibride). Se i polimersomi vengono utilizzati per la ricostituzione, integrare il tampone di reidratazione con colato di sodio allo 0,1%.
      ATTENZIONE: Il colato di sodio è un lieve irritante. Evita il contatto prolungato con la pelle e l'inalazione di polvere. Maneggiare secondo la scheda dati di sicurezza (SDS) del produttore.
   2. Vortice vigorosamente finché la pellicola non viene completamente staccata e sospesa, formando vescicole multilamelari (MLV).
3. Cicli di congelamento-disgelo (solo vescicole ibride)
   1. Soggetta le sospensioni ibride MLV a cinque cicli di congelamento-scongelamento come segue: congelare i campioni in azoto liquido per 1 minuto, scongelarli in un bagno d'acqua a 35 °C fino a fonderli completamente, e vortice a 2500–3000 giri/min per 30 secondi usando un agitatore a tubo. Ripeti questa procedura per un totale di cinque cicli.
      NOTA: Saltare questo passaggio per i polimersomi puri.
      ATTENZIONE: L'azoto liquido (−196 °C) può causare gravi ustioni criogeniche. Maneggiare in un'area ben ventilata indossando i DPI appropriati (guanti criogenici, occhiali di sicurezza e camice da laboratorio). Evita il contatto con pelle e occhi.
4. Estrusione
   1. Trasferire la sospensione della vescicola su un mini-estrusore dotato di una membrana in policarbonato di 100 nm di poro.
   2. Estrudere la sospensione 21 volte per ottenere LUV omogenei in termini di dimensioni.
      NOTA: Assicurarsi che l'ultimo passaggio di estrusione lasci la sospensione LUV nella siringa, in opposizione alla siringa di caricamento iniziale. Questo minimizza la contaminazione del campione finale con vescicole più grandi o materiale residuo che potrebbe non essere completamente passato attraverso la membrana.
5. Stoccaggio
   1. Conservare la sospensione di LUV a 4 °C e utilizzarla entro una settimana per mantenere la distribuzione delle dimensioni della vescicola e prevenire aggregazione o crescita microbica nel tampone contenente saccarosio.
   2. Prima dell'uso, omogeneizza delicatamente la sospensione LUV tramite vortex.

4. Ricostituzione della proteina di membrana in LUV

1. Pretrattamento delle vescicole con detersivo
   1. Trasferire 200 μL di LUV in un tubo microcentrifuga da 2 mL (Figura 1). Se si utilizzano LUV ibridi, aggiungere 1 μL di colato di sodio al 20% (p/v) per ottenere una concentrazione finale di detersivo dello 0,1% (p/v). Se si usano LOV polimerici, non è necessario alcun detersivo aggiuntivo poiché il colato di sodio è già presente.
      NOTA: Prepara il detersivo nello stesso tampone utilizzato per gli esperimenti per garantire la compatibilità con le vescicole elettriche.
   2. Mescola delicatamente battendo leggermente il tubo della microcentrifuga tre volte. Evita agitazioni vigorose o vortice, che possono creare schiuma e introdurre bolle d'aria.
2. Introduzione delle proteine nelle vescicole trattate con detersivo
   1. Aggiungere citocromo bo₃ ossidasi (per le misurazioni dell'attività) o citocromo bo₃ ossidasi – ATTO 643 (per immagini fluorescenti) alle vescicole destabilizzate dal detergente per ottenere le seguenti concentrazioni finali proteiche: per i polimeromi, 0,556 μM per gli esperimenti LUV e 1,112 μM per gli esperimenti GUV; per le vescicole ibride, 0,714 μM per gli esperimenti LUV e 1,428 μM per gli esperimenti GUV.
      NOTA: Queste concentrazioni corrispondono a un rapporto molare proteina-polimero di 1:3.000 per i LUV e 1:1.500 per i GUV.
   2. Aggiungi la proteina lentamente mentre mescola delicatamente, con l'obiettivo di distribuirla uniformemente nella soluzione ed evitare una sovraconcentrazione locale.
      NOTA: Il volume di proteine aggiunte può variare tra frazioni a causa delle differenze nella concentrazione di stock proteico.
3. Assemblaggio di complessi proteina–detergente–polimero
   1. Incubare la miscela a 4 °C per 30 minuti con una lieve agitazione (400 rpm) in un termomiscelatore per permettere la formazione di assemblaggi misti proteina–detersivo–polimero prima della rimozione del detersivo.
4. Rimozione del detersivo
   1. Rimuovere il detersivo tramite aggiunta sequenziale di Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad). Rimuovi 30 mg di Bio-Beads dalla soluzione di conservazione, assicurandoti che rimangano umidi (umidi ma senza eccesso di liquido). Aggiungi le sfere al campione e incuba per 30 minuti a 4 °C con una delicata agitazione a 600 giri al minuto in un termomiscelatore. Ripeti questo passaggio altre due volte, per un totale di 90 mg di Bio-Sfere e un tempo di incubazione totale di 1,5 ore.
      NOTA: Usa solo bio-perle completamente idratate. Non trasferire perline secche, perle che aderiscono alle pareti del tubo di rifornimento Bio-Beads o perle che galleggiano in superficie. Se le sfere aderiscono alla parete del tubo di reazione di ricostituzione sopra il livello del liquido dopo l'aggiunta, centrifuga brevemente il tubo (ad esempio, 3–5 secondi in una minicentrifuga da banco) per raccogliere le sfere sul fondo prima dell'incubazione.
   2. Pelleta le Bio-Sfere centrifugando a 2.000 × g per 2 minuti usando una mini centrifuga da banco. Raccogli con cura il surnante senza disturbare la pallina di perline.
      NOTA: Come alternativa alla centrifugazione, lascia che le sfere si depositino per gravità per circa 5 minuti, poi rimuovi con cura il soprantantante.
5. Stoccaggio
   1. Conserva i_bo-3-LUV ricostituiti a 4 °C e usali lo stesso giorno per le misurazioni dell'attività proteica.

5. Dimensione e dispersione dei LUV tramite scattering dinamico della luce (DLS)

1. Caricamento dei LUV per misurazioni DLS
   1. Trasferire 45 μL di sospensione LUV o proteo-LUV non diluita in una cuvetta al quarzo pulita. Assicurati che la cuvetta sia priva di polvere, impronte digitali o altri residui per minimizzare gli artefatti che diffondono la luce.
      NOTA: Evita di introdurre bolle d'aria, poiché possono interferire con le misurazioni DLS. Per evitare bolle, pipetta lentamente il campione lungo la parete della cuvetta e non espellere con forza l'ultima goccia. Se si formano piccole bolle, lasciale salire e dissiparsi prima della misurazione.
2. Determinazione della dimensione e della dispersione del LUV tramite DLS
   1. Misurare il diametro idrodinamico e l'indice di polidispersione (PDI) utilizzando uno strumento DLS dotato di laser elio-neon da 633 nm e rilevamento di retro-scattering a un angolo fisso di 173°.
   2. Effettuare almeno tre misurazioni indipendenti per campione per garantire la riproducibilità.
   3. Analizza i dati utilizzando il modello general-purpose (distribuzione normale) per ottenere la dimensione media e il PDI.

6. Analisi del consumo di ossigeno dei LUV

1. Impostazione della temperatura
   1. Impostare la camera di misura di un sistema di elettrodi a ossigeno di tipo Clark a 22 °C e lasciare che il sistema si equilibri.
2. Aggiunta del buffer
   1. Aggiungere 1 mM di Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM di tampone di saccarosio alla camera di misura fino a un volume totale di 1.000 μL. Regolare il volume del tampone in base al tipo di campione: 942,9 μL per polimeri bo_3-LUV e 953,7 μL per ibridi bo 3-LUVs.
      NOTA: Il volume rimanente sarà occupato dai LUV e dalla miscela DTT/Q₁ per raggiungere il volume di misurazione finale.
3. Aggiunta dei LUV
   1. Aggiungi _bo-3-LUV nella camera di misura e inizia a mescolare delicatamente usando il mizzatore magnetico a 100 giri/min e 22 °C. Regolare il volume dei bo_3-LUV per ottenere una concentrazione teorica di bo₃ ossidasi di circa 27 nM: 48,6 μL per i polimeri bo_3-LUV e 37,8 μL per ibridi bo 3-LUVs.
      NOTA: Per il controllo negativo, sostituire i bo 3-LUV con un volume equivalente di LUV privi di proteine della stessa composizione e concentrazione lipidi/polimerica. Tutti i passaggi successivi rimangono identici.
4. Misurazione di base
   1. Lasciare stabilizzare la concentrazione di ossigeno e misurare per 3 minuti sotto una mescolata costante a 22 °C per ottenere una base stabile.
5. Preparazione della miscela di riduzione e quinone
   1. Preparare frescamente la miscela DTT/Q₁ immediatamente prima dell'uso, mescolando 9,6 μL di 1 M di DTT in acqua Milli-Q con 0,6 μL di 80 mM di ubichinone-1 (Q₁) in DMSO, poi si formerà accuratamente il vortice per garantire l'omogeneità.
6. Attivazione enzimatica
   1. Attivare la bo₃ ossidasi aggiungendo 8,5 μL della miscela DTT/Q₁ appena preparata alla camera di misura, ottenendo concentrazioni finali di 8 mM DTT e 40 μM Q₁.
7. Repliche
   1. Misura ogni campione tre volte per garantirne la riproducibilità.
8. Analisi dei dati
   1. Traccia la concentrazione di ossigeno in funzione del tempo. Determinare la pendenza della porzione lineare della curva, che corrisponde al tasso di consumo di ossigeno.
9. Reportage
   1. Riporta il tasso di consumo di ossigeno come media di tre misurazioni, con la deviazione standard.

7. Preparazione di GUV funzionalizzati proteicamente

1. Pulizia al plasma di vetrini rivestiti con ITO
   1. Inserire le lamelle di vetro rivestite con ossido di indio-stagno (ITO) nel detergente al plasma con il lato conduttivo (rivestito con ITO) rivolto verso l'alto. Il plasma li pulisce per 1 minuto a potenza elevata ("HI") (230 V, potenza RF massima 18 W) e a una pressione di circa 0,5 mbar.
      NOTA: L'accensione al plasma riuscita può essere confermata visivamente dalla comparsa di un bagliore rosa/viola all'interno della camera.
2. Disidratazione parziale dei proteo-LUV
   1. Mescolare 20 μL di LUV privi di proteine con 20 μL di proteo-LUV contenenti bo-3 ossidasi ricostituita-ATTO 643. Vortice delicato per garantire una miscelazione omogenea.
   2. Depositare sette gocce da 2 μL della sospensione risultante da 5 mg/mL di LUV/proteo-LUV sulla superficie conduttiva (rivestita con ITO) di ciascuna lamina utilizzata per l'elettroformazione (Figura 2A). Distribuire le gocce uniformemente sulla superficie di 160,6^{mm 2} , mantenendole separate per favorire una formazione uniforme della pellicola.
      NOTA: Per altri sistemi polimerici, la concentrazione di LUV e il volume delle gocce possono richiedere ottimizzazione (intervallo tipico: 5–100 mg/mL LV; gocce 0,2–2 μL).
   3. Lasciare che le goccioline si disidratino parzialmente a temperatura ambiente (∼22 °C) e a ∼20% di umidità per circa 40 minuti, oppure finché non si forma un anello bianco al perimetro delle gocce (Figura 2B).
      NOTA: La disidratazione dipende dall'umidità ambientale. Se l'umidità relativa è superiore al 40%, prolunga il tempo di disidratazione se necessario (fino a 20 minuti). Determinare il punto finale in base all'aspetto di un anello bianco al perimetro delle gocce piuttosto che a un tempo fisso. In condizioni ambientali costanti (temperatura e umidità), il tempo di disidratazione richiesto è riproducibile. Evitare l'eccessiva seccazione, che si manifesta come gocce completamente piatte e uniformi, poiché può causare precipitazione proteica.
3. Assemblaggio della camera di elettroformazione
   1. Assemblare la camera dell'elettroformazione sovrapponendo due vetrine rivestite con ITO (lati rivestiti verso l'interno) separate da un distanziatore in silicone spesso 1,81 mm con un taglio su un lato, che consente di aggiungere o rimuovere il tampone durante il riempimento e la raccolta.
   2. Riempi la camera con tampone di reidratazione (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM saccarosio).
      Per esperimenti sensibili al pH, aggiungere piranina da 10 μM (8-idrossipirene-1,3,6-sale trisolfonico trisodico di acido, HPTS) al tampone.
4. Elettroformazione
   1. Applicare un campo elettrico alternato sinusoidale usando il seguente programma: 50 Hz a 50, 100, 200, 300, 500, 700 e 900 mV per 6 minuti ciascuno; 50 Hz a 1,1 V per 2 ore.
      NOTA: Per promuovere la formazione di proteo-GUV più grandi, questo passaggio può essere esteso a 12 ore e a 4 Hz a 2 V per 30 minuti per il passaggio di distacco. Quando il buffer contiene piranina da 10 μM, si aumenta la frequenza a 500 Hz durante i primi due passaggi di ramping della tensione.
5. Collezione di GUV
   1. Apri con cura la camera con una pinzetta e raccogli i GUV usando le pipette FineTip Ultra-Micro Pastette (o equivalenti pipette a trasferimento a basso taglio) per minimizzare lo stress meccanico.
      NOTA: Evitare di usare punte standard a basso volume sotto i 200 μL, poiché possono rompere GUV più grandi. In alternativa, si possono tagliare punte standard all'estremità per allargare l'apertura e ridurre il taglio durante la raccolta.
6. Stoccaggio
   1. Conservare i proteo-GUV a 4 °C e usarli entro 48 ore per preservare l'attività proteica.
      NOTA: La velocità di perdita di attività dipende dal tipo e dalla stabilità della proteina di membrana ricostituita, così come dalla composizione della membrana.

8. Microscopia di GUV funzionalizzati proteicamente

1. Installazione del microscopio
   1. Accendi il microscopio confocale. Se usi il sistema Leica, avvia il software LAS X. Per altri marchi di microscopi, utilizza il software di acquisizione consigliato dal produttore.
   2. Seleziona un obiettivo di immersione in olio del 63× (NA 1.40); Regola su un ingrandimento più alto o più basso se necessario, a seconda della dimensione del GUV.
   3. Aprite due canali di imaging corrispondenti ai fluorofori: Rhodamine Red (membrana) e ATTO 643 (proteina ricostituita).
      NOTA: Per i fluorofori con spettri parzialmente sovrapposti, selezionare linee laser appropriate e finestre di rilevamento ristrette per minimizzare la diafonia spettrale. Acquisire ogni canale in sequenza per prevenire il passaggio del segnale e garantire una quantificazione accurata della fluorescenza.
2. Sedimentazione dei GUV
   1. Posizionare un isolatore in silicone press-to-seal su un coperto di vetro pulito No. 1.5 (spessore 0,17 mm).
      NOTA: Per microscopi verticali (non invertiti), possono essere utilizzate vetrine di vetro più spesse.
   2. Pipetta 60 μL di tampone (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM glucosio) al centro dello distanziatore.
   3. Aggiungi delicatamente 20 μL della sospensione GUV sopra il buffer.
   4. Copri immediatamente la camera con una seconda lama di vetro per evitare l'evaporazione.
   5. Lascia sedimentare i GUV per ~5 minuti prima dell'immagini.
3. Acquisizione dell'immagine
   1. Concentrati sul fondo della camera per catturare le sezioni trasversali dei GUV.
   2. Acquisire immagini di diversi GUV in tutta la camera scansionando sistematicamente dall'angolo in alto a sinistra fino a quello in basso a destra (pattern "serpente") per ottenere una popolazione rappresentativa (~100 GUV). Visualizza tutte le vescicole incontrate durante la scansione senza preselezione, indipendentemente dalla dimensione o dall'intensità di fluorescenza, per evitare bias di selezione e garantirne la riproducibilità.
      NOTA: Evitare immagini ripetute dello stesso GUV per prevenire il fotosbiancamento.
4. Analisi delle immagini
   1. Quantificare l'intensità di fluorescenza della proteina ricostituita marcata con ATTO 643 tracciando una polilinea lungo la membrana di singoli GUV. Quando si utilizza il software LAS X, seleziona Quantify → Line Profile, poi scegli lo strumento poliline e traccia la membrana di ogni GUV. Per ottenere l'intensità media di fluorescenza, apri Statistica e registra il valore medio. Analizza solo i GUV puliti e unilamellari; Escludere vescicole multivescicolari e vescicole aggregate dall'analisi.
      NOTA: Se le misurazioni vengono acquisite in giorni diversi, le intensità di fluorescenza dovrebbero essere normalizzate alla potenza laser, misurata con impostazioni di imaging identiche (lunghezza d'onda e potenza nominale). Per tenere conto delle variazioni quotidiane nella potenza laser, si applica la seguente normalizzazione: , dove F_a.u. è l'intensità di fluorescenza misurata in unità arbitrarie, _{P di riferimento} è la potenza laser misurata nel giorno di riferimento ed è la potenza laser misurata il giorno di acquisizione. Questa correzione assume una relazione lineare tra potenza del laser e intensità di fluorescenza in condizioni di illuminazione non saturante. Nel presente studio, tutte le immagini sono state acquisite lo stesso giorno e quindi la normalizzazione non era necessaria.
   2. Riportare l'intensità di fluorescenza come una media di 100 GUV con la corrispondente deviazione standard.

9. Analisi del pompaggio protonico nei proteo-GUV

1. Installazione del microscopio
   1. Accendi il microscopio confocale e avvia il software di acquisizione appropriato (ad esempio, LAS X per i sistemi Leica).
   2. Seleziona un obiettivo di immersione in olio del 63× (NA 1,40). Regola su un ingrandimento più alto o più basso se necessario, a seconda della dimensione del GUV.
   3. Configura tre canali di imaging corrispondenti ai fluorofori. Per il rosso di Rhodamine (marcatore di membrana), si utilizza un'eccitazione di 561 nm e un intervallo di emissione di 570–620 nm. Per la piranina (colorante incapsulato sensibile al pH), utilizzare eccitazioni a 448 nm e 405 nm, e raccogliere le emissioni tra 499 e 551 nm.
      NOTA: Se è disponibile un laser da 458 nm, usalo invece dei 448 nm per eccitare la forma deprotonata (di base) della piranina.
   4. Regola la potenza del laser e il guadagno del rilevatore per evitare la saturazione dei pixel e minimizzare il fotosbiancamento. Mantieni costanti le impostazioni di acquisizione durante tutto l'esperimento.
2. Sedimentazione dei GUV
   1. Aggiungere 280 μL di tampone (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM di glucosio) in un pozzetto di una vetrata a 8 pozzi (volume totale del pozzo: ~874 μL).
      NOTA: Non utilizzare meno di 200 μL, poiché i volumi inferiori a 200 μL aumentano l'evaporazione e la deriva del pH. Non superare i 400 μL per evitare fuoriuscite e garantire una pipettura confortevole. Se usi un formato di camera diverso, regola il volume di conseguenza. Per i microscopi invertiti, utilizzare vetrine da camera compatibili con lo spessore del coperperciglio #1.5H.
   2. Aggiungi delicatamente 20 μL della sospensione _{BO 3-GUV} sopra il buffer senza introdurre bolle d'aria.
      NOTA: Per il controllo negativo, sostituire la sospensione bo_3-GUV con un volume equivalente (20 μL) di GUV privi di proteine della stessa composizione lipidica/polimerica, preparati e sedimentati in condizioni identiche. Questo controllo tiene conto di eventuali effetti non specifici di DTT e_Q1 sul rapporto di fluorescenza della piranina, indipendenti dall'attività della bo₃ ossidasi.
   3. Lascia sedimentare i GUV per circa 5 minuti prima dell'imaging (imaging).
3. Acquisizione di base
   1. Concentrati sul piano inferiore della camera dove i GUV si sono sedimentati.
   2. Regola lo zoom per ottenere 3–6 GUV nel campo visivo.
   3. Registra la fluorescenza di base in tutti i canali per 5 minuti prima dell'attivazione.
4. Attivazione del pompaggio protonico
   1. Prepara una miscela fresca DTT–Q₁ immediatamente prima dell'uso mescolando 4,8 μL di 1 M DTT con 0,3 μL di 80 mM Q₁ in DMSO, quindi mescolare accuratamente tramite vortex.
   2. Attivare la citocromo bo₃ ossidasi aggiungendo delicatamente 2,6 μL della miscela DTT–Q₁ sulla superficie della soluzione senza inserire la punta della pipetta nel tampon, ottenendo concentrazioni finali di circa 8 mM DTT e 40 μM Q₁ nella camera.
   3. Monitorare la fluorescenza della piranina intravesicolare per 30 minuti sotto acquisizione continua.
5. Analisi della fluorescenza della piranina intravesicolare
   1. Per ogni GUV, si definisce una regione di interesse (ROI) all'interno del lume della vescicola. Nel software LAS X, vai su Quantify → Stack Profile, seleziona Draw Elisse e disegna un ROI circolare all'interno di ogni GUV.
   2. Per determinare l'intensità media di fluorescenza a 499–551 nm per entrambe le lunghezze d'onda di eccitazione (448 nm e 405 nm), apri Statistica nel software e registra il valore medio.
   3. Calcola il rapporto di fluorescenza come R = I₄₄₈/I₄₀₅.
   4. Tracciare il rapporto nel tempo per ottenere tracce cinetiche del cambiamento di pH intravesicolare.

Risultati

La citocromo bo₃ ossidasi di E. coli è stata espressa dal plasmide pETcyo nel ceppo di E. coli C43 (DE3) ΔcyoABCDE e purificata come descritto^{in precedenza nel 29}. La bo₃ ossidasi purificata veniva utilizzata direttamente per la ricostituzione e le misurazioni dell'attività, oppure marcata con coloranti fluorescenti, come ATTO 643 (questo studio) o altri coloranti^{ATTO 1,15}. Per coloranti altamente idrofili come ATTO 643, è stata utilizzata una colonna di 30 cm per ottenere una separazione efficiente del colorante non legato dalla proteina marcata (Figura 3A). Il grado di marcatura (DOL), calcolato dagli spettri di assorbenza, variava tipicamente da 1,1 a 1,3 molecole di colorante per enzima, a seconda del colorante ATTO utilizzato. Per la_bo-3 ossidasi marcata con ATTO 643, il DOL era 1,16 (Figura 3B).

Per la ricostituzione proteica, i LUV venivano prima preparati tramite reidratazione a film sottili, seguiti da cicli di congelamento-disgelo e estrusione per ottenere dimensioni uniformi delle vescicole. Per i polimeromi, il tampone di reidratazione veniva integrato con detersivo. Le distribuzioni delle dimensioni delle vescicole sono state analizzate tramite scattering dinamico della luce prima della ricostituzione (Figura 4, Tabella 2). Sia i LUV ibridi che quelli polimerici mostravano tipicamente diametri medi di 85–95 nm con distribuzioni di dimensioni ridotte (PDI < 0,2). Si prevede che le vescicole basate a PDMS-g-PEO siano leggermente più piccole della dimensione nominale dei pori della membrana di estrusione. I polimersomi tipici mostravano dimensioni altamente uniformi, con valori PDI inferiori a 0,1, mentre le vescicole ibride formavano popolazioni ragionevolmente uniformi con valori PDI talvolta superiori a 0,1 ma costantemente inferiori a 0,2.

La proteina di membrana bo₃ ossidasi è stata poi inserita nei LUV in presenza di detersivo (colato di sodio in questo studio). Il detersivo veniva successivamente rimosso utilizzando Bio-Beads. Dopo la ricostituzione, la dimensione del polimersoma è aumentata solo leggermente (Figura 4A), mentre la dimensione della vescicola ibrida è rimasta invariata (Figura 4B). In entrambi i sistemi è stato osservato un piccolo aumento della PDI (Tabella 2). Tali cambiamenti minori di dimensione sono prevediti, poiché la solubilizzazione e la rimozione mediate dal detergente possono riorganizzare le catene polimeriche nella membrana. L'attività proteica è stata valutata misurando il consumo di ossigeno, che indica se la proteina ha mantenuto l'attività funzionale (Figura 5A). L'assenza di consumo di ossigeno nel controllo LUV negativo senza proteine conferma che il segnale osservato deriva specificamente dall'attività della bo₃ ossidasi. Con la ricostituzione mediata dal colato di sodio alle concentrazioni utilizzate qui, l'attività proteica era tipicamente leggermente superiore nelle vescicole ibride rispetto ai polimersomi (Figura 5B). È stata osservata una certa variabilità nell'attività proteica tra i lotti di purificazione e persino tra le frazioni all'interno dello stesso lotto. Pertanto, per studi comparativi—come il confronto dell'attività proteica tra diversi sistemi di membrana—dovrebbe essere utilizzata la stessa frazione di proteina purificata per garantire la coerenza.

Per generare PDMS-g-PEO e PDMS-g-PEO/SOY PC GUV funzionalizzati proteico, è stato utilizzato un approccio fusione-elettroformazione. In questo metodo, i proteo-LUV venivano miscelati con LUV privi di proteine e depositati su vetrine di vetro rivestiti con ITO, seguiti da una disidratazione parziale per favorire la fusione delle vescicole e la formazione di un film polimero/proteina o polimero/lipidi/proteina. Una disidratazione insufficiente ha portato a una bassa resa di proteo-GUV, dimensioni più piccole del GUV e la presenza di (proteo-)LUV non fusi.

L'incorporazione riuscita della proteina marcata, bo₃ ossidasi–ATTO 643, nella membrana è stata confermata tramite microscopia confocale dopo la sedimentazione dei GUV in un gradiente di densità di saccarosio/glucosio (Figura 6A, B). La quantificazione della fluorescenza associata alla membrana usando un semplice profilo lineare può essere distorta, poiché l'intensità misurata dipende dall'angolo con cui la linea viene tracciata. Per minimizzare questo effetto, l'intensità della fluorescenza è stata valutata utilizzando una polilinea tracciata lungo l'intero contorno della membrana di ciascun GUV.

Per valutare possibili correlazioni tra la dimensione della vescicola e l'incorporazione delle proteine, il diametro del GUV è stato analizzato in parallelo (Figura 6C, D). I GUV più grandi (sopra i 20 μm) mostravano tipicamente una fluorescenza proteica associata alla membrana più bassa rispetto alle vescicole più piccole. Questa osservazione può essere attribuita al meccanismo fusione-elettroformazione: vescicole più piccole si formano prima e possono incorporare proteine in modo più efficiente, mentre vescicole più grandi sorgono da eventi di fusione successivi e dalla crescita della membrana, potenzialmente portando alla diluizione con materiale povero di proteine.

L'incorporazione complessiva delle proteine è determinata principalmente nella fase iniziale della ricostituzione in LUV, in particolare dal tipo di detersivo, dalla concentrazione e dalla fase in cui viene aggiunta. Per i LUV polimerici, si è osservata un'incorporazione leggermente inferiore quando il detergente è stato aggiunto alle vescicole preformate rispetto all'aggiunta durante la formazione della vescicola (fase di reidratazione), ottenendo intensità di fluorescenza rispettivamente di 18,9 ± 3,9 u. e 20,6 ± 3,7 u. (Figura 6C, D, a sinistra). Per i sistemi ibridi, in cui il detersivo viene aggiunto dopo la formazione della vescicola, la concentrazione di detersivo gioca un ruolo rilevante: l'aumento del colato di sodio dallo 0,015% allo 0,1% ha portato a un marcato aumento dell'incorporazione proteica (22,1 ± 5,2 u.a. vs. 26,2 ± 5,0 u.a., Figura 6C, D, a destra). Confrontando sistemi polimerici e ibridi, è stata generalmente osservata una leggermente maggiore incorporazione membrana di bo₃ ossidasi negli ibridi GUV. Ciò è probabilmente dovuto alla presenza di difetti di imballaggio alle interfacce polimero–lipidi che, oltre ai difetti indotti dal detergente, forniscono siti di inserzione favorevoli per le proteine di membrana.

Utilizzando un secondo passo di elettroformazione di 2 ore, il diametro medio dei GUV funzionalizzati con bo₃ ossidasi era di circa 14–15 μm (13,5 ± 3,7 μm per i GUV polimerici e 15,4 ± 6,3 μm per gli GUV ibridi), anche se erano presenti vescicole notevolmente più grandi (Figura 6C, D). L'aumento della durata del secondo passo di elettroformazione a 12 ore ha portato a un aumento complessivo della dimensione del^{GUV 1,27}.

Il protocollo fusione-elettroformazione consente inoltre l'incapsulamento di specie solubili in acqua, come coloranti sensibili al pH (ad esempio, piranina), aggiungendo il colorante al tampone di reidratazione durante l'elettroformazione (Figura 7A). La dimensione del GUV generalmente diminuisce quando le vescicole si formano in presenza di coloranti solubili in acqua. Per compensare questo effetto, la frequenza durante i primi passaggi di elettroformazione dovrebbe essere aumentata da 50–500 Hz.

L'incapsulamento di un colorante sensibile al pH proporzionato, come la piranina, consente il monitoraggio a vescicola singola del pompaggio del protone e fornisce informazioni sull'orientamento delle pompe di protoni. Con l'acidificazione del lumen della vescicola, il rapporto di fluorescenza della piranina eccitata a 448 nm e 405 nm diminuisce. Questo rapporto riflette lo stato di protonatura della piranina e quindi è correlato al pH. Le misurazioni ratiometriche sono vantaggiose, poiché sono in gran parte insensibili alle variazioni nell'efficienza dell'incapsulamento del colorante e nel fotosbiancamento. Un esempio di attività di pompaggio protonico è mostrato nella Figura 7B, dove si osserva una diminuzione del rapporto di fluorescenza della piralina intravesicolare (I₄₄₈/I₄₀₅) nei GUV ibridi contenenti bo3 ossidasi ricostituita dopo l'aggiunta del donatore di elettroni DTT e del mediatore elettronico Q₁. Il rapporto di fluorescenza inizia a diminuire bruscamente circa 1 minuto dopo l'attivazione e continua a diminuire rapidamente per circa 1 minuto, per poi rallentare nei successivi ~18 minuti. Questo comportamento indica che la maggior parte delle molecole di bo₃ ossidasi è orientata in modo tale che il pompaggio di protoni avvenga verso l'interno dei GUV. I GUV privi di proteine sottoposti a condizioni identiche hanno mostrato una diminuzione minore del rapporto di fluorescenza, fungendo da controllo negativo e confermando che la diminuzione maggiore osservata nei BO_3-GUV deriva specificamente dall'attività di pompaggio del protone della bo₃ ossidasi piuttosto che dagli effetti non specifici di DTT e Q₁ sul rapporto di fluorescenza della piranina.

Figura 1. Rappresentazione schematica della preparazione di grandi vescicole unilamelari (LUV), ricostituzione della proteina di membrana citocromo bo₃ ossidasi in LUVs e formazione di vescicole unilamellari giganti funzionalizzate con bo₃ ossidasi (GUV) tramite l'approccio fusione-elettroformazione. I LUV sono preparati tramite reidratazione a film sottili, cicli di congelamento-scongelamento e estrusione attraverso una membrana di pori di 100 nm. La ricostituzione del citocromo bo₃ ossidasi avviene in presenza di detersivo, che viene successivamente rimosso tramite Bio-Beads. I bo_3-GUV si formano depositando _bo-3-LUV su vetrini rivestiti di ossido di indio-stagno (ITO), seguiti da una parziale disidratazione e reidratazione in presenza di corrente elettrica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Formazione di una grande vescicola unilamellare fusa (LUV) per disidratazione. Sette gocce da 2 μL di proteo-LUV e LUV misti sono state depositate su vetrini rivestiti di ossido di indio-stagno (ITO): (A) immediatamente dopo la deposizione e (B) dopo una disidratazione parziale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Marcatura fluorescente del citocromo bo 3 ossidasi. (A) Cromatogramma (profilo eluzionale) di bo 3 ossidasi-ATTO 643 purificato su una colonna Superdex 200 10/300 GL. Le frazioni evidenziate in grigio furono raccolte e successivamente concentrate. (B) Spettri di assorbanza della concentrazione di bo₃ ossidasi-ATTO 643, mostrando picchi a 280 nm (proteina), 400 nm (banda di Soret dei cofattori eme nella bo₃ ossidasi) e 643 nm (colorante). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Distribuzioni di dimensioni delle grandi vescicole unilamelari (LUVs) prima e dopo la ricostituzione proteica: (A) polimero poli(dimetilsilossano)-innesto (ossido di etilene) (PDMS-g-PEO) e (B) vescicole ibride PDMS-g-PEO/fosfatidilcolina di soia (PC). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Consumo di ossigeno da _bo-3 ossidasi ricostituita in grandi vescicole unilamelari (LUV). (A) Traccia rappresentativa della concentrazione di ossigeno nel tempo dopo l'attivazione della citocromo_bo3 ossidasi ricostituita tramite l'aggiunta di ditiotreitolo (DTT) e ubichinone-1 (Q₁). La traccia verde corrisponde ai LUV ricostituiti dalle proteine, mentre la traccia grigia al controllo negativo (LUV privi di proteine). (B) Tassi di consumo di ossigeno (OCR) della bo₃ ossidasi ricostituite in poli(dimetilsilossano)-innesto-poli (ossido di etilene) (PDMS-g-PEO) e PDMS-g-PEO/fosfatidilcolina di soia (PC). Le barre rappresentano la media ± deviazione standard (SD) di tre misurazioni indipendenti (n = 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6. Inserimento di _bo3 ossidasi marcata fluorescentmente in vescicole unilamelari giganti (GUV). Micrografie rappresentative di (A) poli(dimetilsilossano)-innesto-poli(ossido di etilene) (PDMS-g-PEO) e (B) PDMS-g-PEO/fosfatidilcolina di soia (PC) GUV (membrane marcate con fosfatidiletanolamina-Rhodamine (PE-Rho), rosso) contenenti citocromo _bo3 ossidasi ricostituito-ATTO 643 (magenta). Quantificazione dell'intensità di fluorescenza bo₃ ossidasi-ATTO 643 in funzione della dimensione del GUV (N = 100) per diverse condizioni di ricostituzione: (C) aggiunta dello 0,2% di colato di sodio (SC) alle vescicole unilamellari grandi (LUVs) del polimero preformati e dello 0,015% SC ai LUV ibridi preformati; (D) LUV polimerici formati in presenza di LUV allo 0,1% di SC e LUV ibridi trattati con 0,1% di SC dopo la formazione. I valori rappresentano l'intensità di fluorescenza dei singoli GUV (N = 100 per condizione). La media ± i valori della deviazione standard (SD) sono riportati nel testo. I confronti sono descrittivi; non sono stati effettuati test statistici formali. Unità arbitrarie (U.A.). Barra della scala = 20 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7. Pompaggio protonico tramite _bo-3 ossidasi ricostituito in vescicole unilamellari giganti (GUV). (A) Micrografia rappresentativa a fluorescenza di poli(dimetilsilossano)-innesto-poli (ossido di etilene) (PDMS-g-PEO)/fosfatidilcolina di soia (PC), con membrane marcate con fosfatidiletanolamina-Rhodamine allo 0,05% (PE-Rho, rosso), contenenti citocromo bo₃ ossidasi ricostituito e piranina colorata sensibile al pH (eccitazione a 405 e 448 nm; canali blu e verde), sedimentati in un vetrino di vetro a camera. (B) Variazione del rapporto di fluorescenza della piralina intravesicolare all'attivazione con ditiotreitolo (DTT) e ubichinone-1 (Q₁) nei GUV di PDMS-g-PEO/soia PC contenenti bo-3ossidasi ricostituita. La traccia verde corrisponde ai GUV ricostituiti dalla proteina, mentre la traccia grigia al controllo negativo (GUV privi di proteine). La traccia rappresenta la media ± deviazione standard (SD) (n = 3 vescicole). Barra della scala = 20 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

	Componente	Stock	Importo	Composizione finale della membrana
Polimeromi	PDMS-g-PEO in cloroformio:metanolo (2:1, v/v)	10 mg/mL	499,9 μL	99,95% mol%
	PE-Rhodamine in cloroformio	1 mg/mL	1,1 μL	0,05% mol%
Vescicole ibride	PDMS-g-PEO in cloroformio:metanolo (2:1, v/v)	10 mg/mL	450,1 μL	70 mol%
	Soia PC (95%) in cloroformio	10 mg/mL	49,8 μL	29,95 mol%
	PE-Rhodamine in cloroformio	1 mg/mL	1,4 μL	0,05% mol%

Tabella 1: Soluzioni e volumi di materiale utilizzati per la preparazione di film sottili per la formazione di grandi vescicole unilamelari (LUV). Le concentrazioni stock sono indicate in mg/mL. I volumi sono calcolati per una concentrazione totale di 5 mg/mL di anfifili. La composizione finale della membrana è espressa in mol%. PDMS-g-PEO: poli(dimetilsilossano)-innesto-poli (ossido di etilene); PE-Rhodamina: fosfatidiletanolamina-Rhodamina; soia PC: fosfatidilcolina; V/V: Volume/Volume.

	Condizione di ricostituzione	Diametro (nm)	PDI
Polimeromi	Pre-ricostituzione	84,34 ± 0,22	0.084
	Dopo la ricostituzione	100,73 ± 0,81	0.109
Ibridi	Pre-ricostituzione	89,21 ± 0,77	0.129
	Dopo la ricostituzione	85,01 ± 0,42	0.17

Tabella 2: Dimensione media della vescicola e indice di polidispersione (PDI) dei polimersomi (poli(dimetilsilossano)-innesto-poli (ossido di etilene), PDMS-g-PEO) e vescicole ibride (PDMS-g-PEO/fosfatidilcolina di soia (PC)) prima e dopo la ricostituzione. I dati rappresentano la media di tre misurazioni indipendenti.

Discussione

I polimersomi e le vescicole ibride polimero/lipidica mostrano una maggiore stabilità chimica e meccanica rispetto alle vescicole lipidiche convenzionali, rendendole altamente attraenti per applicazioni che vanno dalla somministrazione di farmaci e biosensing a nano- e microreattori e cellule artificiali. Tuttavia, la loro architettura a membrana distinta e le proprietà biofisiche spesso impediscono il trasferimento diretto di protocolli ottimizzati per vescicole lipidiche a sistemi a base di^polimeri 15,20,30. Il protocollo qui presentato affronta queste differenze e fornisce un flusso di lavoro ottimizzato per la ricostituzione delle proteine di membrana in LUV polimerici e ibridi a base di PDMS-g-PEO, seguito dalla scalabilità ai GUV tramite elettroformazione per fusione.

Un passaggio cruciale nel protocollo è la preparazione di LUV con una distribuzione di dimensioni ristretta e riproducibile. Come per i film lipidici, i film PDMS-g-PEO si auto-assemblano in vescicole dopo la reidratazione con un tampone acquoso. A differenza dei sistemi lipidici, che spesso producono una miscela di vescicole uni- e multilamellari, il PDMS-g-PEO forma preferenzialmente strutture unilamelari¹, eliminando la necessità di cicli di congelamento-discongelamento tipicamente utilizzati per ridurre la multilamellarità nelle preparazioni lipidiche. L'estrusione viene eseguita per standardizzare la distribuzione delle dimensioni della vescicola. A causa dell'aumento della morbidezza delle membrane PDMS-g-PEO rispetto ai bilayer^{lipidici 1}, pressioni di estrusione più basse sono sufficienti. Sebbene le 11 passate di estrusione raccomandate dal produttore siano generalmente sufficienti, aumentare il numero di passate di solito comporta una distribuzione delle dimensioni più ristretta e una migliore riproducibilità. Tuttavia, un'estrusione eccessiva può produrre vescicole leggermente più piccole della dimensione nominale dei pori della membrana. L'estrusione ripetuta può anche ridurre la resa delle vescicole a causa della perdita di materiale; abbiamo precedentemente determinato che circa il 31% del materiale di PDMS-g-PEO e il 25% del materiale vescicolo di PDMS-G-PEO/PC-vescicole di soia sono stati persi dopo 21 passaggi attraverso una^{membrana 1} da 100 nm. Pertanto, il numero di passaggi di estrusione dovrebbe essere ottimizzato per bilanciare l'uniformità delle dimensioni con l'integrità e la resa della vescicola.

La ricostituzione mediata dal detersivo rappresenta un altro fattore cruciale per il successo. Il tipo e la concentrazione ottimali di detersivo dipendono sia dalla specifica proteina della membrana sia dalla composizione della^{membrana 3,20}. Nel caso delle membrane polimeriche pure, quando le condizioni di saturazione sono ottimali, incorporare il detersivo durante la reidratazione del film garantisce efficienze di inserimento più elevate rispetto alle vescicole preformate saturanti. Le membrane polimeriche più rigide, come quelle formate da PBD-b-PEO, richiedono concentrazioni di detersivo sostanzialmente più elevate per la solubilizzazione a^{membrana 30}, sottolineando la necessità di ottimizzazione specifica per polimero. L'inserimento riuscito dovrebbe essere verificato non solo tramite misurazioni di attività—rispetto a micelle detergenti o vescicole lipidiche—ma anche tramite analisi strutturali, come crio-TEM, per valutare la profondità di inserimento e l'adattamento della membrana al disadattamento^{idrofobo 1}. L'orientamento proteico è altrettanto critico, in particolare per le pompe di protoni, poiché un gradiente funzionale di protoni richiede che la maggior parte delle pompe sia orientata uniformemente. Idealmente, le pompe dovrebbero trasportare protoni verso l'interno per consentire l'accoppiamento con processi che consumano gradiente, come la sintesi^{di ATP 3,15}. L'orientamento può essere verificato utilizzando etichette proteiche, ad esempio, raffreddando selettivamente coloranti esposti all'esterno della vescicola o spostando marcatori fluorescenti attaccati ai^{His-tag 20}. Questi approcci sono presentati come raccomandazioni generali per l'ottimizzazione dei protocolli e non sono stati eseguiti in questo studio.

La scala dai proteo-LUV ai proteo-GUV utilizzando l'elettroformazione per fusione richiede un attento controllo dei parametri di deposizione e disidratazione. La concentrazione di LUV e la dimensione delle goccioline influenzano criticamente la resa finale e la purezza del GUV. Concentrazioni eccessivamente elevate di LUV (≥10 mg/mL) possono portare alla permanenza di LUV non fusi nel campione finale, mentre concentrazioni troppo basse (<5 mg/mL) riducono la resa di GUV a causa di materiale depositato insufficiente. La disidratazione deve essere parziale piuttosto che completa—indicata dalla comparsa di un anello bianco al perimetro delle gocce piuttosto che di una goccia completamente bianca—poiché una disidratazione eccessiva può compromettere o abolire l'attività proteica della membrana, in particolare per le pompe di protoni. Umidità e temperatura controllate sono quindi essenziali per destabilizzare le membrane a sufficienza per la fusione, preservando al contempo la funzionalità proteica.

Carichi proteici elevati possono ridurre la dimensione del GUV, ma questo effetto può essere mitigato diluendo i LUV funzionalizzati proteico con LUV privi di proteine. In questo modo, la densità proteica all'interno delle membrane GUV può essere modulata con precisione prima della deposizione. Ad esempio, mescolando _bo-3-LUV altamente carichi con LUV vuoti (fino a 1:10, v/v) si ottengono GUV con diametri di 5–30 μm e un contenuto proteico sintonizzabile mantenendo una distribuzione uniforme della^{membrana 27}. Sebbene questa strategia porti a popolazioni di vescicole eterogenee in termini di densità proteica, le procedure di calibrazione permettono una valutazione quantitativa dei livelli di^{incorporazione 23,31}. È importante sottolineare che l'approccio di miscelazione consente un carico proteico complessivo più elevato senza una riduzione eccessiva della dimensione del^{GUV 27}.

L'analisi funzionale delle proteine ricostituite può essere effettuata incapsulando coloranti sensibili al pH come la piranina nel tampone di elettroformazione per monitorare i cambiamenti di pH intravesicolari. Per un'imaging live affidabile, le vescicole devono sedimentare o essere immobilizzate per prevenire il movimento, il che offuscerebbe i segnali di fluorescenza e ostacolerebbe una quantificazione accurata della dinamica del pH intravesicolare. L'immobilizzazione tramite accoppiamento biotina–streptavidina utilizzando lipidi biotinilati e superfici rivestite di^{streptavidina 32} fornisce un attacco stabile ma può alterare la composizione o la tensione della membrana. La semi-immobilizzazione nelle trappole microfluidiche offre un'alternativa che evita componenti aggiuntivi della membrana e minimizza la^{perturbazione 1,33}. Sebbene le misurazioni di fluorescenza in massa siano possibili dopo la rimozione del colorante esterno tramite sedimentazione ripetuta e scambio tampone, il colorante residuo associato alla membrana può interferire con la lettura; pertanto, la microscopia confocale di singolo GUV è generalmente preferita.

Rispetto ad approcci alternativi che tentano l'inserimento diretto di proteine nei GUV preformati, la strategia fusione-elettroformazione consente un'ottimizzazione indipendente delle condizioni di ricostituzione a livello di LUV prima di scalare ai GUV. Questo flusso di lavoro modulare migliora la riproducibilità e la resa funzionale, in particolare per membrane polimeriche e ibride meno adatte ai protocolli convenzionali a base di lipidi. Il metodo è compatibile con un'ampia gamma di proteine di^membrana, inclusi sistemi^{multiproteici 15}, e consente la funzionalizzazione della membrana e la co-incapsulazione di componenti aggiuntivi. In quanto tale, fornisce una piattaforma versatile per la costruzione di cellule artificiali durevoli, microreattori e sistemi modello per indagare le interazioni polimero-proteina in condizioni controllate.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ÄKTA pure™ chromatography system	Cytiva	29018224
18:1 Liss Rhod PE	Avanti Research	810150
8 well chambered coverglass	Cellvis	C8-1.5H-N
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters	Sigma Aldrich	UFC5030
ATTO 643 NHS ester	ATTO-TEC	AD 643-31
Bio-Beads SM-2	Bio-Rad	1523920
Cholic acid-Na-salt (sodium cholate)	Serva	361-09-1
Coenzyme Q1	TargetMol	TGM-T19594
Confocal microscope STELLARIS 5	Leica Microsystems	603810
DTT (Dithiothreitol)	Merck	10197777001
Fine Tip Ultra Micro Pastette	Pastette	LW4243
HPTS (pyranine, 8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid, Trisodium Salt)	Sigma Aldrich	6358-69-6
ITO-coated glass slides (25×75×1.1 mm, ≤20 Ohm/sq.)	pgo	CEC020S
LAS X software	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Mini centrifuge MCF-2360	LMS	24572
Mini-extruder	Avanti Research	610000
Oxytherm+P system	Hansatech Instruments	/
Plasma cleaner (benchtop)	Harrick Plasma	PDC-32G-2
Polycarbonate membranes 0.1 μm	Avanti Research	610005
Press-to-seal silicone isolator (round, 20 mm diameter, 1 mm depth)	Grace Bio-Labs	41161502
Silicone spacers (round, 24.2 mm outer diameter, 14.3 mm inner diameter, 1.8 mm depth)			laboratory-made, cut from silicone sheet
Soy PC (95%)	Avanti Research	441601
Specord 50 PLUS spectrophotometer	Analytik Jena	823-0200P-3
Superdex 200 10/300 GL column (column L × I.D. 30 cm × 10 mm)	Cytiva	28-9909-44
Test tube shaker (2800 rpm)	IKA Lab Dancer	3365000
Thermomixer comfort 5355	Eppendorf	5355000.011
Xiameter OFX-5329 (PDMS-g-PEO; MW 3000)	Dow Corning	000000000004109892
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical	ZEN3600