Preparazione di vescicole unilamelari unilamellari grandi e giganti ibride proteina-membrana e polimero/lipidico

Nika Otrin; Chee Seng Man; Wenqi Huang; Kai Sundmacher; Lado Otrin

doi:10.3791/71699

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Articolo metodologico

Preparazione di vescicole unilamelari unilamellari grandi e giganti ibride proteina-membrana e polimero/lipidico

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DOI:

10.3791/71699

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7 agosto 2026

Nika Otrin¹ , Chee Seng Man¹^,² , Wenqi Huang¹ , Kai Sundmacher¹^,²^,³ , Lado Otrin¹

¹Process Systems Engineering, Max Planck Institute for Dynamics of Complex Technical Systems, ²Max Planck School Matter to Life, ³Process Systems Engineering, Otto von Guericke University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo dimostra la ricostituzione mediata dal detersivo di una proteina di membrana, il citocromo bo3 ubiquinolo ossidasi, in grandi vescicole unilamelari composte da PDMS-g-PEO e la loro conversione in vescicole giganti tramite fusione-elettroformazione. I compartimenti funzionali a base di polimeri risultanti sono adatti a studi biochimici e biofisici avanzati.

Abstract

Le vescicole formate da copolimeri anfifilili, da sole o miscelate con fosfolipidi, offrono una stabilità meccanica e chimica superiore rispetto alle vescicole lipidiche convenzionali. Questo li rende un telaio attraente, che può essere ulteriormente sviluppato ed ampliato per consentire applicazioni specifiche, come la somministrazione di farmaci, il biosensing diagnostico, la costruzione di cellule artificiali e micro e nanoreattori bioispirati. In particolare, la funzionalizzazione tramite l'incorporazione di proteine di membrana è essenziale per molte di queste applicazioni. Qui presentiamo un protocollo per preparare le grandi vescicole unilamelari funzionalizzate dalle proteine di membrana (LUVs) dal copolimero di innesto PDMS-g-PEO tramite ricostituzione mediata da detergente. Inoltre, descriviamo come queste grandi vescicole possano essere convertite in vescicole unilamellari giganti (GUV) utilizzando un approccio fusione-elettroformazione. Il protocollo copre la marcatura a fluorescenza delle proteine di membrana, la preparazione di LUV polimerici e ibridi, la ricostituzione delle proteine di membrana, l'analisi della distribuzione delle dimensioni tramite scattering dinamico della luce (DLS), la valutazione dell'attività proteica tramite misurazioni del consumo di ossigeno, la preparazione di GUV funzionalizzati proteicamente e l'analisi dell'inserimento proteico e dell'attività di pompaggio protonico nei GUV tramite microscopia confocale. I risultati rappresentativi dimostrano la formazione di proteo-LUV monodispersi con un indice di polidispersione (PDI) inferiore a 0,2, e la generazione di proteino-GUV con diametri compresi tra 5 e 35 μm. L'attività proteica è confermata dalle misurazioni del consumo di ossigeno sia nei LUV polimerici (18,2 nmol/min/mL) sia negli LUV ibridi (26,9 nmol/min/mL). L'inserimento proteico nei GUV viene quantificato tramite intensità di fluorescenza, ottenendo 20,6 ± 3,7 u.a. per i GUV polimerici e 26,2 ± 5,0 u.a. per gli GUV ibridi. L'attività di pompaggio protonico nei GUV, monitorata tramite un colorante incapsulato sensibile al pH, è coerente con la funzionalità proteica, con il pompaggio protonico in direzione interna predominante. La morbidezza meccanica del copolimero e lo spessore di due strati lipidici (~5,3 nm) supportano un'inserzione efficiente delle proteine e la conservazione della loro funzionalità.

Introduzione

I copolimeri a blocchi anfifilici possono auto-assemblarsi in soluzione acquosa formando membrane, che si curvano e si chiudono spontaneamente su se stesse formando compartimenti sferici racchiusi nella membrana noti come polimeromi (vescicole polimeriche). Rispetto alle membrane lipidiche, i compartimenti a base di polimeri offrono una maggiore versatilità chimica e una maggiore stabilità^{chimica 1} e^{meccanica 2}, rendendoli altamente attraenti per applicazioni come la somministrazione di farmaci, nanoreattori e microreattori, e la costruzione di cellule artificiali resistenti. Sia il nost....