Fabbricazione di un dispositivo Organ-on-a-Chip di un complesso dentinale-pulpare impilato verticalmente utilizzando un disco di dentina umana

Sommario

Descrivere la fabbricazione e l'assemblaggio di un dispositivo a chip di complesso dentina-pulpa in configurazione verticale, contenente un disco di dentina umana e microcanali realizzati mediante fotolitografia, seguiti dalla semina e coltura di cellule staminali della polpa dentale.

Abstract

I modelli preclinici convenzionali utilizzati nella ricerca odontoiatrica, inclusi i modelli animali e le colture cellulari statiche, presentano importanti limitazioni nel riprodurre le condizioni fisiologiche dell'interfaccia dentina-polpa e nel prevedere le risposte biologiche umane ai biomateriali dentali. La tecnologia organo-su-un-chip (OoC) offre un approccio alternativo consentendo la ricreazione di microambienti specifici per tessuto all'interno di sistemi microfluidici controllati. Questo manoscritto descrive un protocollo passo dopo passo per la fabbricazione e l'assemblaggio di un dispositivo OoC del complesso dentina-polpa che incorpora un disco di dentina umana in una piattaforma microfluidica in polidimetilsilossano (PDMS) a tre strati. Il protocollo comprende la preparazione del disco di dentina, la fabbricazione di stampi microstrutturati mediante fotolitografia, la colata e la reticolazione del PDMS, il legame assistito da plasma tra strati, l'assemblaggio del dispositivo, il test di tenuta e la semina di cellule staminali della polpa dentale in condizioni di coltura statica. Vengono discussi parametri critici di fabbricazione che influenzano le prestazioni del dispositivo, tra cui il controllo dello spessore degli strati di PDMS, il trattamento superficiale al plasma e l'integrazione del disco di dentina all'interno del dispositivo per minimizzare le perdite. L'adesione cellulare e la vitalità all'interno del dispositivo sono state valutate mediante microscopia elettronica a scansione e colorazione confocale vitale/morta. I risultati rappresentativi dimostrano l'integrazione riuscita del disco di dentina all'interno dell'assemblaggio microfluidico, il mantenimento di condizioni prive di perdite e l'adesione di cellule staminali della polpa dentale vitali alla superficie della dentina. Questo protocollo fornisce un approccio riproducibile per la fabbricazione di una piattaforma OoC del complesso dentina-polpa che potrebbe supportare futuri studi volti a indagare le risposte cellulari ai biomateriali dentali e agli stimoli microambientali.

Introduzione

L'sperimentazione animale ha da tempo svolto un ruolo fondamentale nel progresso della comprensione dei processi patologici e fisiologici ed è stata centrale nelle fasi iniziali dello sviluppo farmacologico¹. Nel corso del XX secolo, l'aspettativa di vita umana è aumentata notevolmente e, sebbene non sia possibile quantificare con precisione in che misura questo miglioramento sia attribuibile esclusivamente alla ricerca sugli animali, è ampiamente riconosciuto che molti trattamenti medici attuali sono stati sviluppati o convalidati mediante modelli animali². Esempi notevoli includono lo sviluppo di vaccini contro la poliomielite, il morbillo e l'epatite B, la valutazione della sicurezza e dell'efficacia della penicillina e la produzione dell'insulina. Nel campo della ricerca odontoiatrica e sui biomateriali, tali modelli si sono rivelati fondamentali per lo studio del processo carioso, della biologia e della rigenerazione del complesso dentina-pulpite e della fisiopatologia dei tessuti parodontali^3,4.

Nonostante l'ampio utilizzo di queste metodologie, l'attuale processo di sviluppo farmaceutico continua a mostrare elevati tassi di fallimento, con molti candidati farmaci che non superano le sperimentazioni cliniche nonostante abbiano dimostrato efficacia e sicurezza in contesti preclinici di laboratorio e in modelli animali⁵. Tale discrepanza è stata associata a differenze interspecifiche che possono limitare la prevedibilità traducibile dei modelli animali a causa di differenze anatomiche, genetiche e fisiologiche tra le specie⁶. Inoltre, lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici rimane un processo lungo e costoso⁷. In aggiunta, i modelli convenzionali in vitro impiegano prevalentemente colture monocellulari semplici in due dimensioni (2D) su substrati plastici non fisiologici, risultando incapaci di riprodurre gli stimoli biochimici e fisici, le interazioni cellula-cellula e la segnalazione della matrice extracellulare (ECM) presenti nella cavità orale umana^8,9. Sebbene i modelli 2D offrano alcuni vantaggi sperimentali, sono intrinsecamente incapaci di riprodurre le interazioni complesse che avvengono simultaneamente tra diversi componenti, come biofilm, biomateriali, dentina e cellule della polpa¹⁰. Di conseguenza, cresce l'interesse verso lo sviluppo di piattaforme sperimentali alternative in grado di riprodurre in modo più accurato le risposte biologiche umane. Nel 2022, il FDA Modernization Act 2.0 ha eliminato il requisito obbligatorio della sperimentazione animale nel processo di approvazione dei farmaci e ha riconosciuto il potenziale utilizzo di piattaforme alternative, inclusa la tecnologia organo-su-un-chip (OoC), nella ricerca preclinica¹¹.

Un OoC è un dispositivo microfluidico progettato per riprodurre la struttura, la funzione e il microambiente di un organo o di un componente tessutale specifico¹². Questi dispositivi sono popolati da cellule e tessuti viventi coltivati all'interno di microcanali ingegnerizzati che riproducono aspetti chiave del microambiente fisiologico a cui le cellule sono naturalmente esposte. Oltre alla mimica strutturale, i microcanali permettono un controllo spaziotemporale sull'ambiente cellulare e supportano il mantenimento di funzioni specifiche del tessuto, fornendo così condizioni sperimentali che possono avvicinarsi maggiormente alla fisiologia in vivo rispetto ai sistemi di coltura convenzionali¹². Di particolare rilevanza, i microcanali nei dispositivi OoC facilitano il flusso controllato del mezzo di coltura, che esercita uno stress di taglio sulle cellule residenti¹³. Questi stimoli meccanici influenzano le risposte cellulari, tra cui adesione, proliferazione, migrazione, espressione genica e interazioni cellula-cellula^14,15. Inoltre, il flusso continuo del mezzo contribuisce al mantenimento del microambiente mediante l'approvvigionamento di nutrienti e la rimozione dei prodotti di scarto metabolici¹⁶. Inoltre, rispetto alle colture convenzionali in 2D, alcuni piattaforme OoC hanno dimostrato un miglior controllo degli indicatori legati allo stress ossidativo, inclusi le specie reattive dell'ossigeno intracellulari e la vitalità cellulare, in modelli tridimensionali (3D) su chip¹⁷. I sistemi OoC si sono quindi affermati come piattaforme promettenti per lo studio della fisiologia tissutale, delle interazioni con biomateriali e dei processi patologici in condizioni sperimentali controllate¹⁸. Nella ricerca odontoiatrica, la tecnologia OoC è stata progressivamente applicata per modellare interfacce tissutali orali di crescente complessità¹⁹. Le prime piattaforme "dente-su-un-chip" riproducevano l'interfaccia biomateriale-dentina-polpa²⁰, mentre versioni più avanzate hanno successivamente incorporato vascolarizzazione e innervazione trigeminale per replicare in modo più fedele la complessità strutturale e funzionale del complesso polpa-dentina²¹. Al di là della polpa, modelli 3D di canali radicolari immaturi hanno permesso la valutazione di irriganti endodontici e della formazione di neoangiogenesi su cellule staminali della papilla apicale^22,23. A livello parodontale, piattaforme "gengiva-su-un-chip" sono state utilizzate per studiare le interazioni ospite-microbo e per valutare il potenziale immunomodulante dei probiotici come agenti terapeutici²⁴, mentre dispositivi "legamento parodontale-su-chip" hanno dimostrato come il flusso del liquido interstiziale moduli la formazione della rete vascolare e la differenziazione osteogenica degli sferoidi di cellule staminali del legamento parodontale^25,26. Completando questi modelli, sistemi specializzati di mucosa orale-su-un-chip e impianto dentale-su-un-chip hanno ulteriormente ampliato l'ambito della ricerca microfluidica odontoiatrica caratterizzando le interazioni ospite-materiale e la citotossicità dei monomeri dentali in condizioni fisiologicamente rilevanti^27,28.

Sebbene i sistemi Organo-su-un-Chip (OoC) siano stati applicati con crescente frequenza alla ricerca odontoiatrica, orale e craniofacciale, rimangono fondamentali ulteriori sforzi volti alla standardizzazione e alla riproducibilità dei flussi di lavoro di fabbricazione. Diversi modelli di dente-su-un-chip sono stati descritti in letteratura^20,29,30,31, che mostrano differenti configurazioni del dispositivo e applicazioni sperimentali. Tuttavia, le variazioni nella struttura del dispositivo, nei metodi di fabbricazione, nell'inclusione della dentina e nella descrizione dei parametri sperimentali potrebbero limitare la riproducibilità e il confronto diretto tra studi. In particolare, differenze nella geometria dei microcanali, nelle strategie di integrazione della dentina e negli approcci di fabbricazione possono influenzare il microambiente biologico e meccanico all'interno del dispositivo. Alcuni modelli descritti incorporano la dentina per riprodurre aspetti dell'interfaccia dentina-pulpite^20,29,30, mentre altri utilizzano configurazioni alternative³¹. Inoltre, metodi di fabbricazione come la fotolitografia, il taglio laser, la micromacinazione e la stampa 3D presentano ciascuno vantaggi e limitazioni specifici, a seconda della progettazione e dell'applicazione prevista del dispositivo. Un fattore determinante per l'utilità biologica è inoltre l'orientamento architettonico del dispositivo, in particolare se i canali e la sezione di dentina siano disposti in configurazione orizzontale o verticale^19,32. Nelle configurazioni impilate orizzontalmente, i compartimenti disposti affiancati facilitano la compartimentazione laterale e la visualizzazione in tempo reale delle cellule, risultando particolarmente adatti per modellare tessuti con un'organizzazione spaziale intrinsecamente laterale, come il complesso parodontale^24,32. Tuttavia, questa progettazione presenta una limitazione intrinseca nella capacità di ricreare interfacce biologiche perpendicolari, come il complesso biomateriale-dentina-pulpite, poiché la disposizione laterale dei compartimenti non replica fedelmente l'orientamento in vivo della barriera dentinale tra la cavità e la polpa^20,32. Le configurazioni impilate verticalmente superano queste limitazioni sovrapponendo due compartimenti lungo l'asse y, separati da una sezione di dentina nativa, consentendo la quantificazione simultanea del trasporto molecolare attraverso la dentina integra e il monitoraggio in tempo reale delle risposte delle cellule della polpa misurate nel mezzo in uscita³⁰. Tuttavia, una limitazione riconosciuta di questa orientazione riguarda l'imaging in sezione trasversale dell'interfaccia dentina-cellule, poiché l'acquisizione di immagini in sezione trasversale dell'interfaccia dentina-cellule nello stesso piano focale rimane tecnicamente più complessa rispetto alle configurazioni impilate orizzontalmente, dove cellule e matrici extracellulari sono disposte lateralmente. Sebbene siano stati descritti in letteratura diversi modelli di complesso dentina-pulpite-su-un-chip, la maggior parte adotta una configurazione impilata orizzontalmente in cui i compartimenti sono disposti affiancati nello stesso piano^10,20,21,29, mentre pochi modelli hanno integrato una sezione di dentina nativa in una configurazione impilata verticalmente³⁰. Tuttavia, le differenze nei metodi di fabbricazione e nella descrizione dei parametri tra questi modelli continuano a limitare la riproducibilità e i confronti tra studi³³. Il presente manoscritto mira a migliorare la riproducibilità metodologica fornendo un protocollo dettagliato per la fabbricazione di un dispositivo dente-su-un-chip con configurazione impilata verticalmente, facilitando così un'adozione più ampia della piattaforma all'interno della comunità scientifica odontoiatrica.

Questo manoscritto descrive un protocollo passo dopo passo per la fabbricazione e l'assemblaggio di un dispositivo OoC (organo-su-un-circuito) per complesso dentina-polpa dentale in configurazione verticale a strati, che incorpora un disco di dentina umana all'interno di una piattaforma microfluidica in polidimetilsilossano (PDMS) a tre strati, realizzata mediante uno stampo prodotto con fotolitografia. Il protocollo descrive inoltre la semina e la coltura di cellule staminali della polpa dentale all'interno del dispositivo in condizioni statiche.

Protocollo

Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki ed approvato dal Comitato Etico dell'Universidad de La Frontera per studi che coinvolgono campioni umani.

1. Ottenimento del disco di dentina

NOTA: Preparare il progetto del dispositivo prima di iniziare il protocollo (Figura 1A–1C).

1. Raccolta e conservazione dei denti
   1. Raccogliere molari o premolari umani sani dopo aver ottenuto il consenso informato del paziente.
   2. Mantenere tutti i campioni in soluzione di cloramina allo 0,5% a 4°C per prevenire la disidratazione della dentina e la denaturazione delle proteine.
   3. Sostituire la soluzione di cloramina una volta alla settimana durante la conservazione.
2. Preparazione dei dischi di dentina
   1. Tagliare orizzontalmente ciascun dente nel terzo medio della corona utilizzando una micromotrice ad alta velocità che opera a 350.000 giri/min e dotata di una fresa diamantata cilindrica (diametro di 1 mm; granulometria da 100 a 150 µm).
   2. Eseguire il taglio con irrigazione continua di acqua a circa 50 mL/min.
   3. Posizionare il taglio nel terzo medio della corona per evitare la camera pulpare e l'email presente nei solchi e nelle fessure occlusali, ottenendo così un disco composto prevalentemente da tessuto di dentina.
      ATTENZIONE: Eseguire il taglio dei denti con irrigazione continua e indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi guanti, mascherina e occhiali protettivi.
3. Finitura dei dischi di dentina
   1. Lucidare il disco di dentina utilizzando dischi abrasivi con granulometria progressivamente decrescente.
   2. Continuare la lucidatura fino a raggiungere uno spessore finale della dentina di circa 0,8 mm (±± 0,3 mm) e dimensioni laterali di circa 5 mm × 5 mm (±± 0,3 mm) (Figura 1D).
4. Conservazione dei dischi di dentina
   1. Conservare i dischi di dentina preparati in soluzione di cloramina allo 0,5% a 4°C fino al montaggio del dispositivo OoC.

Figura 1: Flusso di progettazione e fabbricazione del dispositivo organo-su-un-chip (OoC) del complesso dentina-pulpite. (A) Progettazione tridimensionale del dispositivo che mostra l'architettura a tre strati. (B) Vista dall'alto della progettazione del dispositivo con le dimensioni principali. (C) Vista laterale della configurazione del dispositivo a tre strati. (D) Disco rappresentativo di dentina preparato con uno spessore approssimativo di 0,8 mm e dimensioni laterali di circa 5 mm × 5 mm. (E) Stampo master in silicio fabbricato mediante fotolitografia e utilizzato per la realizzazione degli strati superiore e inferiore di polidimetilsilossano (PDMS). (F) Rimozione di uno strato di PDMS polimerizzato dallo stampo in silicio dopo la polimerizzazione termica. (G) Trattamento al plasma della superficie del PDMS prima dell'unione degli strati. (H) Dispositivo OoC finale del complesso dentina-pulpite a tre strati assemblato mediante legame al plasma e contenente l'interfaccia di dentina. (I) Dispositivo assemblato collegato a tubicini per il test di perdite e la preparazione per esperimenti microfluidici. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Fabbricazione del dispositivo OoC per il complesso dentina-pulpite

1. Preparazione dell'area di lavoro e dei materiali
   1. Preparazione dei materiali e dell'attrezzatura
      1. Preparare tutti i materiali e l'attrezzatura elencati nella Tabella dei Materiali prima di iniziare la fabbricazione del dispositivo.
      2. Preparare i punch per biopsia prima del montaggio del dispositivo.
      3. Eseguire tutte le procedure di fabbricazione in un ambiente pulito e privo di polvere.
      4. Indossare guanti, occhiali protettivi e l'equipaggiamento di protezione personale appropriato durante tutta la fabbricazione e l'assemblaggio del dispositivo.
         NOTA: Preparare il modello prodotto mediante fotolitografia prima di iniziare il protocollo (Figura 1E).
2. Fabbricazione del modello microstrutturato
   1. Preparazione della wafer di silicio
      1. Fabbricare il modello su una wafer di silicio da 4 pollici, lucidata su un solo lato (tipo N, drogato con arsenico, metodo di crescita CZ, orientamento <100>, spessore 500 ±± 25 µm, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, resistività 0,001–0,005 Ω·cm).
      2. Pulire la wafer in sequenza con acetone, isopropanolo e acqua ultrapura per 10 minuti ciascuno mediante ultrasuoni.
      3. Asciugare la wafer con aria compressa.
      4. Scaldare la wafer a 200°C per 10 minuti su una piastra riscaldante per rimuovere l'umidità residua.
      5. Lasciare raffreddare la wafer a temperatura ambiente (RT; 20°C–25°C).
   2. Attivazione della superficie e rivestimento con fotoresina
      1. Attivare la superficie della wafer di silicio utilizzando un pulitore al plasma sotto vuoto, operando con plasma d'aria al livello 7 per 120 secondi.
      2. Applicare la fotoresina negativa a base di epossidica GM 1060 mediante spin coating a 300 giri/min per 10 secondi.
      3. Continuare lo spin coating a 565 giri/min per 100 secondi e a 965 giri/min per 1 secondo, utilizzando un'accelerazione di 200 giri/min/s.
      4. Lasciare riposare la wafer rivestita per 10 minuti.
      5. Eseguire una pre-cottura a 65°C per 10 minuti.
      6. Continuare la pre-cottura a 95°C per 1 ora.
      7. Lasciare raffreddare la wafer a temperatura ambiente.
   3. Esposizione e sviluppo
      1. Esposizione della fotoresina mediante un sistema di litografia laser diretta a una dose di 1.950 mJ/cm².
      2. Eseguire una post-cottura a 65°C per 10 minuti.
      3. Continuare la post-cottura a 95°C per 30 minuti.
      4. Lasciare raffreddare la wafer a temperatura ambiente.
      5. Lasciare riposare la wafer per 10 minuti.
      6. Sviluppare il pattern in PGMEA per 4 minuti.
      7. Estendere lo sviluppo a intervalli di 30 secondi se residui di fotoresina sono ancora presenti.
      8. Interrompere lo sviluppo risciacquando con isopropanolo.
      9. Asciugare la wafer con aria compressa.
   4. Cottura finale
      1. Eseguire una cottura finale a 135°C per 2 ore.
      2. Ottenere un modello master microstrutturato contenente microcanali di 1 mm di larghezza e 50 µm di altezza.
3. Preparazione e sfiato della miscela di PDMS
   1. Preparazione della miscela di PDMS
      1. Mescolare la base di PDMS e l'agente indurente in un rapporto ponderale di 10:1.
      2. Mescolare manualmente la miscela con una bacchetta di vetro in un becher di plastica per circa 5 minuti.
      3. Mantenere movimenti circolari lenti e continui durante il mescolamento.
         NOTA: Evitare di introdurre bolle d'aria durante il mescolamento.
   2. Sfiato
      1. Posizionare la miscela di PDMS in un essiccatore sotto vuoto collegato a una pompa per vuoto.
      2. Sfiatare la miscela a circa 700 mmHg per 5 minuti.
      3. Rilasciare brevemente il vuoto per permettere alle bolle superficiali di scoppiare.
      4. Riapplicare il vuoto.
      5. Ripetere il ciclo finché non sono più visibili bolle.
         NOTA: Il tempo totale di sfiato è tipicamente di circa 30 minuti.
4. Colata del PDMS sul modello
   1. Preparazione del modello
      1. Posizionare il modello su una superficie piana.
      2. Pulire il modello con aria compressa.
      3. Evitare il contatto diretto con la superficie strutturata.
      4. Verificare che il modello sia privo di polvere e contaminanti.
   2. Distribuzione del PDMS
      1. Distribuire circa 8 g di PDMS attorno al disco di dentina per fabbricare lo strato di incapsulamento della dentina.
      2. Regolare l'altezza del PDMS in modo da corrispondere allo spessore del disco di dentina (0,8 ±± 0,3 mm).
      3. Evitare che il PDMS copra la superficie della dentina.
      4. Distribuire circa 0,26 g di PDMS per ogni unità del modello per fabbricare ogni strato di microcanale.
      5. Battere delicatamente sul modello o applicare vibrazioni per facilitare il riempimento delle microstrutture.
      6. Lasciare che il PDMS penetri nelle strutture più piccole.
      7. Coprire il modello con un coperchio o una lastra piana senza toccare la superficie del PDMS.
         NOTA: Lo strato di incapsulamento della dentina ha uno spessore di circa 0,8 mm e ogni strato di microcanale di circa 0,4 mm, per uno spessore totale del dispositivo di circa 1,6 mm.
         NOTA: Regolare lo spessore degli strati in base alla distanza di lavoro dell'obiettivo confocale quando si prevede l'uso di immagini confocali.
5. Polimerizzazione
   1. Posizionare i modelli in un forno a 50°C.
   2. Polimerizzare il PDMS per 4 ore.
6. Rimozione degli strati di PDMS
   1. Rimozione del PDMS polimerizzato
      1. Staccare con attenzione gli strati di PDMS polimerizzato dal modello (Figura 1F).
      2. Maneggiare gli strati di PDMS con cura per evitare danni alle microstrutture.
7. Legatura degli strati di PDMS e fabbricazione dei porti di ingresso e uscita
   1. Fabbricazione dei porti di ingresso e uscita
      1. Creare perforazioni nelle posizioni designate per ingresso e uscita utilizzando un punch per biopsia da 1 mm.
      2. Posizionare il lato microcanale rivolto verso l'alto durante la perforazione.
         NOTA: Posizionare lo strato di PDMS su un tappetino da taglio per evitare danni strutturali.
      3. Creare due perforazioni nello strato superiore corrispondenti al microcanale superiore.
   2. Pulizia degli strati di PDMS
      1. Pulire gli strati di PDMS con alcol isopropilico o etanolo.
      2. Rimuovere le particelle di polvere residue con nastro adesivo sterile.
      3. Verificare che tutte le superfici da legare siano prive di contaminanti prima del montaggio.
   3. Attivazione al plasma delle superfici di PDMS
      1. Posizionare gli strati superiore e intermedio di PDMS per il trattamento al plasma (Figura 1G).
      2. Attivare le superfici utilizzando un trattatore al plasma a corona portatile operante a circa 25 W con aria ambiente come gas di lavoro.
      3. Mantenere una distanza di lavoro di circa 1 mm tra la sorgente di plasma e la superficie di PDMS.
         ATTENZIONE: Eseguire il trattamento al plasma in un'area adeguatamente ventilata ed evitare l'esposizione diretta all'ozono generato dal plasma.
      4. Accendere il dispositivo di trattamento al plasma e attendere 5 secondi per la stabilizzazione.
      5. Verificare la generazione di un fascio di plasma uniforme prima del trattamento.
      6. Trattare lo strato superiore di PDMS per 10 secondi con un movimento continuo avanti e indietro a circa 5 mm/s.
      7. Trattare lo strato intermedio di PDMS per 10 secondi con lo stesso movimento e distanza.
      8. Applicare un trattamento al plasma aggiuntivo di 1 secondo allo strato superiore immediatamente prima della legatura.
   4. Legatura degli strati superiore e intermedio
      1. Allineare il microcanale superiore con il disco di dentina immediatamente dopo il trattamento al plasma.
      2. Legare insieme gli strati superiore e intermedio.
      3. Posizionare l'insieme legato in un forno a 75°C per 5 minuti.
      4. Consolidare la legatura durante l'incubazione.
         NOTA: Il disco di dentina e il microcanale sono visibili ad occhio nudo e possono essere allineati senza strumenti aggiuntivi.
   5. Fabbricazione dei porti del microcanale inferiore
      1. Perforare due aperture corrispondenti al microcanale inferiore attraverso gli strati superiore e intermedio legati.
      2. Eseguire la perforazione attraverso entrambi gli strati contemporaneamente per garantire l'allineamento.
         NOTA: Questa procedura genera quattro perforazioni nello strato superiore e due perforazioni nello strato intermedio.
      3. Posizionare l'insieme legato su un tappetino da taglio rigido prima della perforazione.
      4. Applicare una pressione costante verso il basso in un'unica movimentazione.
         NOTA: Evitare forze rotazionali o laterali per ridurre al minimo il rischio di delaminazione.
      5. Rimuovere i detriti dai siti di perforazione con garza sterile senza lanugine inumidita con alcol isopropilico.
      6. Ispezionare le perforazioni e le aree legate circostanti con illuminazione adeguata.
      7. Verificare l'assenza di delaminazione, strappi o perforazioni incomplete prima di procedere.
   6. Legatura dello strato inferiore
      1. Trattare al plasma lo strato inferiore come descritto nel Passo 2.7.4.
      2. Allineare i porti di ingresso e uscita del microcanale inferiore con le perforazioni negli strati superiore e intermedio.
      3. Legare lo strato inferiore per completare l'assemblaggio del dispositivo.
         NOTA: Contrassegnare le posizioni di ingresso e uscita sulla superficie esterna dello strato inferiore prima della legatura per facilitare l'allineamento.
         NOTA: Le camere al plasma possono fornire una legatura più resistente rispetto alle penne al plasma, come riportato in letteratura³⁶.
         NOTA: Il dispositivo completato consiste in una piattaforma microfluidica a tre strati che incorpora un'interfaccia di dentina (Figura 1H). La superficie inferiore della dentina rappresenta il lato polpale del modello, mentre la superficie superiore della dentina rappresenta il lato coronale per l'esposizione a biomateriali dentali o preparati batterici.
8. Prova di tenuta del dispositivo microfluidico
   1. Ispezione del dispositivo assemblato
      1. Ispezionare il dispositivo assemblato per verificare eventuali errori di allineamento.
      2. Ispezionare l'assemblaggio per verificare una legatura incompleta e perdite visibili.
   2. Prova di tenuta
      1. Collegare aghi Luer-lock da 19G ai porti di ingresso (Figura 1E).
      2. Collegare gli aghi ai tubi della pompa microfluidica.
      3. Inserire delicatamente i connettori degli aghi nei porti perforati per ottenere una tenuta ermetica.
      4. Iniettare PBS sterile o mezzo di coltura a una portata di 10 µL/min.
      5. Mantenere il flusso del liquido per almeno 5 minuti.
      6. Ispezionare tutte le interfacce legate, i margini dei canali e i bordi del disco di dentina durante il flusso.
      7. Osservare il dispositivo con illuminazione adeguata durante e dopo l'iniezione.
      8. Verificare l'assenza di accumulo di liquido, umidità o formazione di gocce.
      9. Classificare il dispositivo come privo di perdite se non viene rilevata alcuna fuoriuscita.
      10. Scartare i dispositivi che presentano perdite.
          NOTA: Eseguire la prova di tenuta su ogni dispositivo fabbricato prima della semina cellulare o dell'uso sperimentale.
9. Sterilizzazione e conservazione del dispositivo microfluidico
   1. Sterilizzazione
      1. Esposizione della superficie superiore del dispositivo assemblato alla luce UV (254 nm) per 30 minuti all'interno di una cappa a flusso laminare.
      2. Esposizione della superficie inferiore alla luce UV per ulteriori 30 minuti.
      3. Sciacquare i microcanali con etanolo al 70% per 20 minuti.
      4. Lavare i microcanali tre volte con PBS sterile per rimuovere l'etanolo residuo.
   2. Conservazione
      1. Utilizzare immediatamente il dispositivo sterilizzato per esperimenti di coltura cellulare.
      2. In alternativa, conservare il dispositivo immerso in PBS sterile a 4°C all'interno di un contenitore sterile fino all'uso.
         ​ATTENZIONE: Non utilizzare clorammina o altre soluzioni disinfettanti dopo l'assemblaggio del dispositivo poiché il PDMS potrebbe assorbire questi composti compromettendo la vitalità cellulare.

3. Valutazione dell'adesione e della vitalità delle cellule staminali della polpa dentale

1. Precondizionamento della superficie dentinale
   1. Iniettare il 10% di EDTA nel dispositivo.
   2. Mantenere il contatto tra la soluzione di EDTA e la superficie dentinale per 15 min.
   3. Iniettare 0,5 mL di EDTA ogni 3 min per mantenere il movimento del fluido all'interno del microcanale.
   4. Lavare il disco di dentina tre volte con acqua ultrapura.
   5. Mantenere ogni lavaggio per 5 min.
      NOTA: Il trattamento con EDTA rimuove lo strato di detriti e espone le proteine della matrice dentinale.
      ATTENZIONE: Manipolare le soluzioni di EDTA indossando guanti e protezioni oculari per evitare irritazioni cutanee e oculari.
2. Seeding delle cellule staminali della polpa dentale
   1. Amplificazione delle cellule staminali della polpa dentale
      1. Sezionare le cellule staminali della polpa dentale in una fiasca T75 a una densità di 1 × 10⁶ cellule per fiasca.
      2. Incubare le cellule a 37°C e 5% CO₂ fino al raggiungimento di una confluenza di circa l'80%.
      3. Staccare le cellule utilizzando tripsina.
      4. Neutralizzare la tripsina utilizzando mezzo di coltura completo.
      5. Centrifugare la sospensione cellulare per ottenere un pellet cellulare.
      6. Valutare la vitalità cellulare utilizzando il blu di tripano.
      7. Utilizzare sospensioni cellulari con vitalità ≥90%.
   2. Preparazione della sospensione cellulare
      1. Preparare una sospensione cellulare preriscaldata a 37°C.
      2. Regolare la concentrazione cellulare a 100.000 cellule/mL in mezzo di coltura completo.
      3. Preparare un volume finale di sospensione di 1–2 mL.
         NOTA: Nel presente studio sono state utilizzate cellule al passaggio 5.
   3. Seeding cellulare
      1. Iniettare la sospensione cellulare nel porto di ingresso del microcanale inferiore.
      2. Rovesciare il dispositivo dopo il seeding cellulare
         NOTA: Il rovesciamento del dispositivo favorisce la sedimentazione cellulare verso la superficie dentinale e migliora l'adesione cellulare.
   4. Incubazione
      1. Posizionare il dispositivo rovesciato all'interno di una piastra di Petri.
      2. Aggiungere 1 mL di mezzo di coltura alla piastra di Petri per minimizzare l'evaporazione.
      3. Incubare il dispositivo a 37°C e 5% CO₂ per 24 h.
      4. Mantenere condizioni di coltura statica per tutta la durata del periodo di incubazione.
         NOTA: Nel presente studio non è stata effettuata la validazione con flusso dinamico.
         NOTA: Il presente protocollo descrive condizioni di coltura statica per la validazione iniziale del dispositivo e la valutazione dell'adesione cellulare.
   5. Validazione iniziale del dispositivo
      1. Valutare l'adesione cellulare mediante microscopia elettronica a scansione.
      2. Recuperare il disco di dentina smontando il dispositivo prima dell'analisi.
3. Preparazione dei campioni per la microscopia elettronica a scansione
   1. Recupero e lavaggio del campione
      1. Smontare il dispositivo dopo 24 h di incubazione.
      2. Recuperare il disco di dentina e trasferirlo in una piastra per colture o in una piastra di Petri.
      3. Posizionare la superficie dentinale con le cellule verso l'alto.
      4. Lavare il disco di dentina due volte utilizzando 1 mL di PBS.
   2. Fissazione
      1. Aggiungere 2 mL di glutaraldeide al 2,5% in tampone fosfato di Sorensen 0,1 M.
      2. Incubare il campione per 30 min a temperatura ambiente (RT).
         ATTENZIONE: La glutaraldeide è tossica e può causare irritazione della pelle, degli occhi e delle vie respiratorie. Eseguire le procedure di fissazione all'interno di una cappa chimica indossando dispositivi di protezione individuale adeguati.
   3. Lavaggio dopo la fissazione
      1. Rimuovere la soluzione di glutaraldeide.
      2. Lavare il disco di dentina tre volte con acqua distillata ultrapura a temperatura ambiente (RT).
   4. Analisi al SEM
      1. Analizzare i campioni utilizzando un microscopio elettronico a scansione ambientale.
      2. Utilizzare il microscopio in condizioni di basso vuoto (25 Pa).
      3. Impostare una tensione di accelerazione di 10,0 kV e una distanza di lavoro di 7,0 mm.
      4. Acquisire le immagini utilizzando la modalità di rilevamento 3D a elettroni retrodiffusi (BSE-3D).
      5. Acquisire immagini a un ingrandimento di ×200 (Figura 2A).
4. Valutazione della vitalità cellulare mediante microscopia confocale
   1. Preparazione del campione
      1. Sezionare e coltivare le cellule come descritto al punto 3.2.
      2. Incubare il dispositivo per 24 h a 37°C e 5% CO₂.
      3. Smontare il dispositivo ed esporre la superficie dentinale.
      4. Trasferire il disco di dentina in una piastra a pozzetti contenente HBSS⁺/+ supplementato con Ca²⁺ e Mg²⁺ preriscaldato.
   2. Lavaggio del campione
      1. Lavare il disco di dentina due volte con HBSS⁺/⁺.
      2. Rimuovere il siero residuo e il rosso fenolo prima della colorazione.
         NOTA: Il siero residuo e il rosso fenolo possono aumentare l'autofluorescenza di fondo.
   3. Colorazione delle cellule vive
      1. Preparare una soluzione lavorativa fresca di Calcein AM a 2 µM in HBSS⁺/⁺.
      2. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di colorazione per coprire completamente la superficie dentinale.
      3. Incubare il campione per 20 min a 37°C al buio.
      4. Rimuovere la soluzione di colorazione dopo l'incubazione.
   4. Colorazione delle cellule morte
      1. Aggiungere la soluzione lavorativa di ioduro di propidio (1–2 µg/mL in HBSS⁺/⁺).
      2. Incubare il campione per 5–8 min a 37°C al buio.
      3. Non superare i 10 min di incubazione.
      4. Lavare il campione due volte con HBSS⁺/⁺.
      5. Mantenere il campione immerso nel tampone fino all'acquisizione delle immagini.
   5. Acquisizione delle immagini confocali
      1. Acquisire le immagini confocali entro 30 min dalla colorazione.
      2. Acquisire le immagini in modo sequenziale nei canali verde e rosso.
      3. Utilizzare λ_ex 490 nm e λ_em 515 nm per l'imaging delle cellule vive.
      4. Utilizzare λ_ex 535 nm e λ_em 617 nm per l'imaging delle cellule morte.
         ​NOTA: Proteggere le soluzioni di colorazione fluorescenti e i campioni colorati dall'esposizione alla luce durante le procedure di incubazione e acquisizione delle immagini (Figura 2B).

Figura 2: Valutazione rappresentativa dell'adesione e della vitalità delle cellule staminali del midollo dentale all'interno del dispositivo OoC complesso dentina-pulpite. (A) Immagine di microscopia elettronica a scansione che mostra cellule staminali del midollo dentale aderenti (asterisco bianco) sulla superficie della dentina dopo 24 h di coltura statica all'interno del dispositivo OoC. Dopo 24 h di coltura, le cellule aderenti coprivano il 54,35 ± 0,92% della superficie della dentina esposta al microcanale. Nessuna cellula è osservata nella regione della dentina coperta da PDMS (asterisco nero), indicando un sigillaggio efficace tra gli strati del dispositivo. Barra della scala = 200 µm. (B) Immagine di microscopia confocale che mostra cellule staminali del midollo dentale vitali colorate in verde e aderenti alla superficie della dentina (frecce bianche) dopo 24 h di coltura statica. Sono inoltre osservate cellule non vitali colorate in rosso (frecce blu). Barra della scala = 50 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati

La corretta realizzazione del dispositivo tooth-on-a-chip ha seguito il flusso di lavoro illustrato in Figura 1A–1I, compresa la preparazione del disco di dentina (Figura 1D), la fabbricazione dello stampo ottenuto mediante fotolitografia (Figura 1E), la rimozione degli strati di PDMS polimerizzati (Figura 1F), l'attivazione al plasma prima dell'incollaggio (Figura 1G), l'assemblaggio del dispositivo finale (Figura 1H) e il collegamento del dispositivo al sistema microfluidico (Figura 1I). Il dispositivo risultante era costituito da un assemblaggio in tre strati di PDMS in cui il disco di dentina era completamente integrato nello strato centrale, con i microcanali superiore e inferiore posizionati su ciascun lato della superficie della dentina (Figura 1H).

Un risultato positivo in questa fase era caratterizzato dall'assenza di bolle d'aria visibili o delaminazione e dal passaggio del fluido senza perdite dopo l'iniezione di PBS o mezzo di coltura attraverso i porti di ingresso (Figura 1I). L'allineamento errato dei porti del microcanale, un legame al plasma incompleto o perdite all'interfaccia dentina-PDMS indicavano un assemblaggio fallito e richiedevano la ripetizione della procedura di fabbricazione.

Sono stati realizzati complessivamente 30 dispositivi, dei quali circa il 20% ha subito un malfunzionamento durante la fabbricazione o i test. I malfunzionamenti erano principalmente associati a perdite di fluido al di fuori dei confini del microcanale a causa di un legame al plasma incompleto, mentre una percentuale minore di guasti è stata causata da delaminazione in altre regioni del dispositivo. Nessun malfunzionamento è stato attribuito a perdite all'interfaccia dentina–PDMS o a un allineamento errato dei porti di ingresso e di uscita del microcanale.

Dopo 24 h di coltura statica, l'avvenuto seeding cellulare è stato confermato dalla presenza di cellule staminali della polpa dentale aderenti che mostravano una morfologia fibroblastica sulla superficie del dente. La microscopia elettronica a scansione ha permesso di valutare sia l'adesione cellulare che l'integrità del dispositivo (Figura 2A). Utilizzando il presente protocollo, le cellule aderenti hanno ricoperto il 54,35 ± 0,92% della superficie dentale esposta al microcanale dopo 24 h di coltura. Un risultato positivo è stato indicato dalla presenza di cellule aderenti esclusivamente all'interno dell'area del microcanale, mentre la superficie dentale coperta da PDMS è rimasta priva di adesione cellulare (Figura 2A). Questa distribuzione spaziale ha confermato un'efficace sigillatura tra gli strati del dispositivo e un corretto assemblaggio dello stesso. Al contrario, la presenza di cellule al di fuori dei confini del microcanale ha indicato una fuoriuscita del contenuto e deve essere considerata un esito negativo.

La microscopia confocale con colorazione vitale/non vitale ha permesso una valutazione non distruttiva della vitalità cellulare all'interno del dispositivo. Un risultato positivo era caratterizzato da una predominanza di cellule vitali che mostravano fluorescenza verde e morfologia fibroblastica, con solo occasionali cellule non vitali colorate in rosso (Figura 2B). Al contrario, una elevata proporzione di cellule non vitali indicherebbe un precondizionamento del dentino subottimale, un lavaggio inadeguato o condizioni di coltura non adatte.

Durante l'ottimizzazione del protocollo, è stata valutata una strategia iniziale di fabbricazione in cui un modello fisso, dotato di una cavità predefinita, veniva utilizzato per posizionare il disco di dentina all'interno dello strato centrale di PDMS (Figura 3A). Sebbene questo approccio fosse finalizzato a standardizzare il posizionamento del disco e ridurre le perdite all'interfaccia disco-PDMS, si è rivelato inefficiente nella pratica. Poiché la regione corrispondente alla cavità del disco di dentina doveva essere rimossa manualmente dallo strato di PDMS polimerizzato, non era possibile ottenere in modo affidabile un adattamento preciso tra i margini del disco e i bordi tagliati del PDMS, con conseguenti spazi interfaciali che causavano perdite in circa il 50% dei dispositivi fabbricati (Figura 3A).

Figura 3: Immagini rappresentative che illustrano approcci di fabbricazione non riusciti identificati durante l'ottimizzazione del dispositivo OoC per il complesso dentina-polpa. (A) Stampo in silicio contenente recessi fissi progettati per il posizionamento standardizzato dei dischi di dentina (frecce bianche). A causa della variabilità intrinseca nelle dimensioni dei dischi di dentina derivante dalla preparazione manuale dei campioni, non è stato possibile ottenere un adattamento affidabile alla geometria fissa dello stampo, causando lacune interfaciali e perdite in circa il 50% dei dispositivi realizzati. (B) Immagine di microscopia elettronica a scansione della superficie della dentina dopo l'applicazione di un materiale sigillante all'interfaccia disco-PDMS. Sono indicati la dentina esposta (asterisco nero) e i depositi del materiale sigillante (asterisco bianco). La diffusione non intenzionale del materiale sigillante sulla superficie della dentina ha compromesso l'adesione cellulare e ridotto la superficie disponibile per la colonizzazione cellulare. Barra della scala = 100 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Per risolvere questa limitazione, è stato applicato un materiale sigillante all'interfaccia tra il disco e il PDMS. Tuttavia, questo approccio ha introdotto un ulteriore svantaggio, poiché il materiale sigillante si è diffuso sulla superficie della dentina impedendo l'adesione cellulare nelle aree coperte, come dimostrato dalla microscopia elettronica a scansione (Figura 3B). Questi risultati non ottimali hanno evidenziato due limitazioni fondamentali della strategia iniziale di fabbricazione: un'adeguata adattabilità tra la cavità in PDMS tagliata manualmente e il disco di dentina, e una ridotta adesione cellulare associata al materiale sigillante.

Discussione

Questo studio descrive un protocollo passo dopo passo per la fabbricazione di un dispositivo di tipo tooth-on-a-chip (dente-su-un-chip) a strati verticali, che incorpora cellule staminali della polpa dentale e dentina, dimostrandone l'adesione cellulare e la vitalità rappresentativa all'interno del dispositivo in condizioni di coltura statica. Il protocollo è stato sviluppato per fornire un flusso di lavoro riproducibile per la fabbricazione e l'assemblaggio di una piattaforma OoC (organ-on-a-chip) per il complesso dentina-polpa, adatta a studi in vitro dell'interfaccia dentinale. L'istituzione di un tale flusso di lavoro è particolarmente significativa perché la nostra recente revisione sistematica ha evidenziato che il campo dei modelli microfluidici per il complesso dentina-polpa si trova ancora in una fase emergente, caratterizzata da un'elevata eterogeneità metodologica nelle architetture e nei materiali dei dispositivi, il che compromette gravemente la riproducibilità e la standardizzazione dei modelli attuali di tooth-on-a-chip³⁴. Fornendo un protocollo dettagliato e riproducibile, questo studio affronta tali limitazioni e contribuisce allo sviluppo di modelli biologici meglio definiti. Nel contesto più ampio dello sviluppo di OoC applicato alla biologia orale, França et al.¹⁵ hanno aperto la strada con un modello microfluidico di tooth-on-a-chip che incorpora dischi di dentina e cellule simili agli odontoblasti, dimostrando la fattibilità di ricreare l'interfaccia dentina-polpa in un ambiente microfluidico dinamico e valutando la risposta citotossica ai materiali dentali. Da questo contributo innovativo, un numero crescente di piattaforme OoC orali è stato descritto in letteratura³⁴, affrontando diversi aspetti della biologia dei tessuti dentali, delle interazioni con i biomateriali e della microbiologia orale, consolidando questo approccio come un settore di ricerca attivo e in rapida espansione. Il presente protocollo contribuisce a questo scenario fornendo un flusso di lavoro dettagliato e riproducibile per la fabbricazione di una piattaforma tooth-on-a-chip a strati verticali accessibile a gruppi di ricerca dotati di capacità microfluidiche standard.

Diversi passaggi del protocollo sono fondamentali per la corretta fabbricazione e il buon funzionamento del dispositivo. In particolare, il versamento del PDMS sullo stampo richiede un controllo accurato per ottenere uno strato uniforme e una corretta formazione dei microcanali. Lo spessore degli strati di PDMS deve essere scelto in base all'applicazione finale prevista. Ad esempio, la microscopia confocale richiede strati di PDMS sufficientemente sottili da permettere la visualizzazione ottica delle cellule aderenti alla superficie della dentina. Tuttavia, strati più sottili possono risultare più difficili da manipolare durante le fasi di fabbricazione e assemblaggio. Di conseguenza, l'ottimizzazione dello spessore del PDMS rappresenta un compromesso importante tra accessibilità all'immagine e praticità di manipolazione durante la fabbricazione del dispositivo. Inoltre, nel presente studio, la microscopia confocale su dispositivi integri non è stata fattibile perché lo strato di PDMS sovrastante le cellule aveva uno spessore di 0,4 mm, superiore alla profondità di penetrazione del microscopio confocale disponibile (0,2 mm). Di conseguenza, l'acquisizione di immagini confocali è stata effettuata dopo lo smontaggio del dispositivo ed esposizione diretta della superficie della dentina. Inoltre, la microscopia a fluorescenza non è risultata applicabile in questo dispositivo poiché l'opacità intrinseca della dentina impediva la visualizzazione ottica diretta delle cellule aderenti alla sua superficie.

Questa limitazione è particolarmente rilevante per le configurazioni OoC impilate verticalmente, in cui il microcanale contenente le cellule è posizionato al di sotto del disco di dentina, ostacolando l'accesso ottico sia a causa dello strato sovrastante di PDMS sia per l'opacità della dentina stessa. Tale limitazione non si verifica nelle configurazioni di chip impilate orizzontalmente, in cui i microcanali si sviluppano lateralmente accanto alla dentina anziché al di sotto di essa, consentendo così un accesso ottico diretto alla superficie seminata con cellule senza interferenze dovute all'opacità della dentina o allo spessore del PDMS. La scelta tra configurazioni impilate verticalmente o orizzontalmente deve quindi tenere in considerazione non soltanto i requisiti fluidici e biologici, ma anche le modalità di imaging disponibili in laboratorio. In un sistema OoC, il design del dispositivo riveste un ruolo significativo e il microambiente deve essere mantenuto il più possibile simile alle condizioni in vivo. Come la maggior parte dei tessuti, il dente è soggetto a stimoli meccanici e presenta un comportamento anisotropo³⁵, il che significa che le sue proprietà variano a seconda della direzione dello stimolo applicato. Inoltre, esistono differenze istologiche tra la porzione coronale del complesso dentina-pulpite, dove dentina e odontoblasti sono disposti verticalmente, e la porzione laterale, dove gli odontoblasti si trovano adiacenti alla dentina, con differenze notevoli nel numero, nell'organizzazione cellulare e nell'orientamento dei tubuli dentinali. Una configurazione di chip impilata verticalmente fornisce quindi una rappresentazione anatomica più fedele delle lesioni cariose e dei materiali restaurativi che interessano l'aspetto coronale del complesso dentina-pulpite.

Un trattamento superficiale preciso del plasma è essenziale per un assemblaggio di successo dei dispositivi ed è tuttora una delle principali sfide nella produzione di chip³⁶. In questo studio, si è verificata delaminazione nel 20% dei dispositivi realizzati. Questo risultato non è inaspettato poiché il legame PDMS–PDMS ottenuto con una penna al plasma manuale, come quella utilizzata nel presente studio, genera una concentrazione inferiore di specie reattive dell'ossigeno rispetto ai sistemi a camera di plasma basati su vuoto, che permettono concentrazioni di ossigeno superiori a quelle atmosferiche e producono di conseguenza un numero maggiore di gruppi superficiali covalenti disponibili per il legame³⁶. Di conseguenza, la resistenza del legame ottenuta con una penna al plasma è intrinsecamente inferiore e meno riproducibile rispetto a quella ottenuta con una camera di plasma dedicata, il che ha probabilmente contribuito al tasso di delaminazione osservato. L'ottimizzazione della strategia di integrazione della dentina ha richiesto anche numerose iterazioni di fabbricazione per ottenere un contatto stretto tra il disco di dentina e lo strato intermedio di PDMS, minimizzando al contempo le perdite. Un approccio iniziale prevedeva la fabbricazione di una cavità predefinita all'interno dello strato intermedio per il posizionamento della dentina; tuttavia, il sezionamento manuale della cavità ha impedito un adattamento costante tra il disco di dentina e i margini del PDMS, causando perdite durante l'iniezione del mezzo di coltura e determinando un tasso di successo complessivo della fabbricazione di circa il 50%.

Un adesivo per protesi è stato successivamente valutato per migliorare la sigillatura all'interfaccia dentina-PDMS, ma la microscopia elettronica a scansione ha dimostrato un'interferenza con l'adesione cellulare e una ridotta visualizzazione delle cellule sulla superficie della dentina. Il protocollo finale è stato quindi ottimizzato posizionando direttamente il disco di dentina all'interno dello stampo prima di colare con attenzione il PDMS intorno al campione, migliorando così l'integrazione del disco di dentina nel dispositivo e riducendo la necessità di materiali aggiuntivi per la sigillatura. Questo approccio ha eliminato efficacemente le perdite all'interfaccia dentina-PDMS assicurando un contatto stretto e conformale tra i margini del disco di dentina e il PDMS circostante, senza ricorrere ad agenti di sigillatura secondari che potrebbero interferire con l'adesione cellulare alla superficie della dentina. Vanno inoltre considerati diversi limiti del presente metodo. La fabbricazione dei dispositivi microfluidici rimane parzialmente dipendente da procedure manuali, che possono introdurre variabilità tra i dispositivi e tra gli operatori. Sebbene la fotolitografia offra elevata precisione e riproducibilità nella realizzazione delle geometrie dei microcanali, il processo può richiedere attrezzature specializzate e competenze tecniche specifiche. Approcci alternativi di fabbricazione, inclusa la stampa tridimensionale, potrebbero facilitare la prototipazione e l'accessibilità del dispositivo per alcuni laboratori; tuttavia, fattori come la risoluzione di stampa, i monomeri residui e la biocompatibilità dei materiali richiedono un'attenta ottimizzazione³⁷.

L’approvvigionamento continuo di mezzo fornisce alle cellule un ambiente stabile e le protegge dall’accumulo di rifiuti o da squilibri calcio/fosfato¹⁶. Diversi studi hanno dimostrato che lo stress di taglio indotto da un flusso costante può simulare processi di meccanotrasduzione simili ai segnali in vivo, che sono determinanti chiave del comportamento cellulare^38,39, contribuendo alla differenziazione e maturazione cellulare e inducendo cambiamenti significativi nella morfologia cellulare, nell’espressione genica e nella funzione³⁹. Il presente studio descrive la realizzazione e la prima validazione del dispositivo, dimostrando l’adesione cellulare e la vitalità dopo 24 h in condizioni di coltura statica; pertanto, gli effetti del flusso dinamico non sono stati valutati. L’introduzione di condizioni di flusso dinamico rappresenta una direzione importante per la ricerca futura e sarà affrontata in indagini successive. Il presente protocollo fornisce un flusso di lavoro riproducibile per la fabbricazione di un dispositivo OoC a complesso dentina-pulpite impilato verticalmente, che incorpora la dentina in una piattaforma microfluidica in PDMS a tre strati. Le possibili applicazioni del modello includono lo studio delle interazioni tra dentina e biomateriali, le risposte cellulari ai materiali dentali e la valutazione in vitro dell’interfaccia dentina-pulpite in condizioni sperimentali controllate.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiali biologici e chimici
Acetone	ExpertQ	SOLV 8	Pulizia del wafer di silicio
Mezzo di coltura Alpha MEM	Cytiva	SH30265.02	Mezzo di coltura per cellule staminali della polpa dentale
Cloramina (0,5%)	Merck	7080-50-4	Soluzione di conservazione per dischi di dentina
Cellule staminali della polpa dentale	Non applicabile	Non applicabile	Coltura primaria di cellule. Vedere i passaggi 3.2.1 e 3.2.2
EDTA (10%)	Winkler	N2222158E	Rimozione dello strato di detriti
Fotoresist negativo a base di epossidica	Gersteltec	GM1060	Fabbricazione dello stampo mediante fotolitografia
Glutaraldeide (2,5%) in Sorensen 0,1 M’solfato tampone fosfato	Sigma-Aldrich	210908-06	Fissazione per SEM
Denti umani sani (molari o premolari)	Non applicabile	Non applicabile	Campione umano
Isopropanolo	ExpertQ	SOLV 16	Pulizia del wafer, arresto dello sviluppo e pulizia del PDMS
Kit di vitalità LIVE/DEAD	Sigma-Aldrich	451	Colorazione di vitalità mediante fluorescenza.
PBS (soluzione salina tamponata al fosfato)	Corning	46-013-CM	Lavaggio e prova di tenuta
Base di PDMS e agente indurente (polidimetilsilossano)	Dow	Sylgard 184	Fabbricazione del dispositivo
PGMEA	Sigma Aldrich	484431	Sviluppo del fotoresist
Trypan blue	Sigma Aldrich	T8154-100ml	Valutazione della vitalità cellulare
Tripsina	Corning	25-053-CI	Distacco cellulare
Acqua ultrapura	Cytiva	SH30529.01	Soluzione di lavaggio
Materiali di consumo e attrezzature di laboratorio
Aghi per siringhe 19G	Vmatic	VCB19050	Collegamento del dispositivo con micropompa o siringa
Punzone per biopsia (diametro: 1 mm)	Harris Unicore	WHAWB100073	Fabbricazione dei porti di ingresso e uscita
Tappetino da taglio	Nicecool	Non applicabile	Protezione della superficie durante la perforazione
Dischi per la finitura dentale (ad es. Sof-Lex)	3M	Sof-Lex	Lucidatura della dentina
Adattatori femmina Luer a barbetta	Runze Fluidics	RH-M016	Collegamento del tubo
Bastone di miscelazione in vetro o plastica	Duran	Non applicabile	Miscelazione del PDMS
Siringhe ipodermiche	Cranberry	pc-12246	Seeding cellulare e test di perdita
Garza sterile senza pelucchi	Linderson	Non applicabile	Rimozione dei residui di perforazione
Adattatori maschio Luer	Runze Fluidics	RH-G016	Collegamento del tubo
Vaso di miscelazione	Duran	Non applicabile	Preparazione del PDMS
piatto di Petri (140 mm) × 20 mm	Deltalab	2000219	Coltura cellulare/incubazione
Base in politetrafluoroetilene	CCTVal	Non applicabile	Fabbricazione dello strato di dentina intermedia
Wafer di silicio	Jiaozuo Commercial FineWin	Non applicabile	Fabbricazione dello stampo
Tubo di silicone	Runze Fluidics	96421	Connessione fluidica
flacone T75	Corning	353136	Espansione delle cellule staminali della polpa dentale
Piastra multi-pozzetti	SPL Life Sciences	30006	Preparazione della colorazione e dell'immagine confocale
Attrezzature e strumenti
Essiccatore ad aria	METALPLAN	TITAN-040	Essiccazione dell'aria compressa
Sorgente di aria compressa	SCHULZ	CSD-18.1	Pulizia di muffe e superfici
Microscopio confocale	Olympus	Non applicabile	Modello: FV1000
Sistema di litografia laser diretta	Heidelberg	uPG 101	Esposizione del fotoresist
Microscopio elettronico a scansione ambientale	Hitachi	Non applicabile	Modello: Quanta 400
Manipolo ad alta velocità	Nakanishi	Non applicabile	Modello: Pana-max2
Piastra riscaldante	LabTech	EH20A Plus	Cottura del wafer e cottura del photoresist
Cappa a flusso laminare	BioBase	BBS8V1708313D	Sterilizzazione del dispositivo
Pompa microfluidica	Nuova Era	Non applicabile	Modello: 1002X-ES. Prova di tenuta a 10 µL/min
Stampo microstrutturato (realizzato mediante fotolitografia)	CCTVal	Non applicabile	Vedere il passaggio 2.2 per le specifiche di fabbricazione dello stampo
Forno o incubatrice	Memmert	UN110	Polimerizzazione del PDMS a 50 °C°C e consolidamento del legame a 75°C
Camera di Pulizia a Plasma sotto Vuoto	Fari al plasma	GD-5	Attivazione al plasma del wafer
Plasma corona portatile	Aurora Pro Scientific	APS-CD-20AC	Attivazione al plasma del PDMS
Ultrasonificatore	Elma Sonic	S 10 (H)	Pulizia del wafer
Camera a vuoto o desiccatore (250 mm)	Winglass	Non applicabile	Degasaggio del PDMS
Pompa a vuoto	ROCKER	300	Degasaggio del PDMS