SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology): Una piattaforma computazionale integrata per ottimizzare il flusso di lavoro della crio-microscopia elettronica

Sommario

Questo protocollo dimostra un flusso di lavoro passo dopo passo di criomicroscopia elettronica utilizzando una piattaforma software integrata (SMART) che collega acquisizione dati, ricostruzione tridimensionale e costruzione di modelli atomici in un'unica interfaccia basata su browser. Come esempio rappresentativo, la struttura umana TRPML1 è determinata a una risoluzione di 2,38 Å.

Abstract

La criomicroscopia elettronica (crio-EM) è diventata uno strumento centrale nella biologia strutturale, eppure i flussi di lavoro attuali richiedono tipicamente più pacchetti software specializzati per l'acquisizione dati, la ricostruzione tridimensionale (3D) e la costruzione di modelli atomici, portando a pipeline frammentate e a frequenti interventi manuali. Qui presentiamo SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology), una piattaforma software integrata che combina tre moduli—DataSmart per la raccolta automatica dei dati, CryoSmart per l'elaborazione delle immagini e la ricostruzione 3D, e ModelSmart per la costruzione di modelli atomici basati sul deep learning—all'interno di un'interfaccia unificata accessibile tramite browser. Questo protocollo fornisce istruzioni passo dopo passo per il funzionamento di tutti e tre i moduli. Il flusso di lavoro comprende la navigazione automatizzata dei campioni e l'acquisizione dei dati, la correzione del movimento, la stima della funzione di trasferimento di contrasto (CTF), la selezione delle particelle, la classificazione bidimensionale (2D), il raffinamento 3D, il miglioramento cartografico e la generazione di modelli atomici. Come esempio rappresentativo, abbiamo applicato l'intero flusso di lavoro per determinare la struttura di TRPML1 umano, un canale lisosomico cationico permeabile a Ca²⁺, raggiungendo una risoluzione globale di 2,38 Å tramite correlazione di gusci di Fourier (FSC) standard oro al criterio 0,143. Tutti e tre i moduli (DataSmart, CryoSmart e ModelSmart) sono stati applicati in sequenza allo stesso dataset TRPML1 all'interno di questo studio. Il protocollo è progettato per essere accessibile a utenti con diversi livelli di esperienza crio-EM.

Introduzione

Crio-microscopia elettronica: evoluzione tecnologica e impatto biologico. La determinazione della struttura proteica tridimensionale rimane una sfida centrale in biologia molecolare, poiché la funzione biologica è strettamente legata alla disposizione spaziale dei residui di amminoacidi. Chiarire queste configurazioni strutturali è fondamentale per decifrare meccanismi enzimatici, interazioni con i liganti e vie di segnalazione cellulare a risoluzione atomica. Questa necessità ha guidato sviluppi trasformativi nella crio-EM, che è emersa come una tecnica di biologia strutturale ampiamente^{adottata 1,2}.

L'analisi a singola particella crio-EM (SPA) rappresenta un approccio potente per ottenere intuizioni biologiche su diversi tipi di campioni risolvendo strutture ad alta risoluzione di complessi^{isolati 3}. Questi includono virus, proteine di membrana, assemblaggi elicoidali e altri complessi macromolecolari dinamici ed eterogenei, che coprono un'ampia gamma di dimensioni molecolari — da circa 50 kDa a decine di megadalton.

La Cryo-EM SPA è emersa come una tecnica fondamentale per risolvere le architetture tridimensionali (3D) delle macromolecole biologiche, comprendendo tre fasi computazionali interdipendenti: acquisizione dati, ricostruzione 3D e costruzione di modelli atomici (Figura 1).

Durante l'acquisizione dei dati, i campioni vitrificati vengono fotografiati in condizioni di bassa dose per generare filmati micrografici, catturando migliaia di proiezioni di particelle in stati vicini al nativo. Questi dataset grezzi vengono successivamente elaborati tramite algoritmi di allineamento iterativo e classificazione per ricostruire le mappe di densità volumetrica. Infine, vengono costruiti e raffinati modelli atomici per adattarsi alla densità, elucidando le interazioni molecolari a risoluzione quasi atomica.

L'analisi sopra dimostra che l'output della crio-EM rappresenta semplicemente il punto di partenza della pipeline strutturale. Trasformare questi dati grezzi in modelli atomici interpretabili richiede una cascata di strumenti software computazionali specializzati. Pertanto, il software funge da ponte critico che trasforma i dati grezzi in modelli atomici.

Ecosistema software crio-EM frammentato: strumenti attuali e limitazioni. I flussi di lavoro crio-EM moderni si basano su un mosaico di strumenti software specializzati, ciascuno dei quali affronta fasi distinte:

Acquisizione dati. Sebbene numerosi pacchetti software per l'acquisizione dati crio-EM siano disponibili pubblicamente—tra cui Leginon ^4,5,^{SerialEM 6}, UCSFImage4⁷, TFS EPU ^8,9, Gatan Latitude, JEOL JADAS¹⁰ e Auto-EMation¹¹—questi strumenti producono principalmente dati di film grezzi con capacità limitate di elaborazione post-acquisizione. Fasi critiche del flusso di lavoro, come l'impostazione dei parametri e la personalizzazione dei template, richiedono ancora operazioni manuali ad alta intensità di lavoro, spesso con troppi parametri per dataset. Questa dipendenza dall'intervento degli esperti introduce sfide di riproducibilità e inefficienze nei flussi di lavoro, in particolare in scenari ad alto rendimento.

Ricostruzione 3D. la cryo-EM ha registrato progressi significativi nel software di ricostruzione 3D, permettendo una risoluzione quasi atomica delle macromolecole biologiche. Tra gli strumenti più utilizzati ci sono RELION, cryoSPARC ed EMAN2, ognuno con vantaggi e limitazioni distinte. RELION adotta un approccio bayesiano per il raffinamento iterativo, eccellendo nella gestione di dataset eterogenei e nel raggiungimento di ricostruzioni ad alta^{risoluzione 12}. Tuttavia, la sua intensità computazionale e la curva di apprendimento ripida spesso richiedono interventi di esperti. cryoSPARC, sfruttando l'accelerazione GPU e il deep learning, riduce significativamente i tempi di elaborazione ed è facile da^{usare 13}. EMAN2 offre una suite completa per il pizzico di particelle e la ricostruzione 3D ma richiede una lunga messa a punto manuale e manca di capacità di feedback in tempo^{reale 14}. Sebbene questi strumenti eccellono in aspetti specifici della ricostruzione 3D, rimangono confinati a funzionalità singolarità, mancando di integrazione con l'acquisizione dati a monte o la modellazione atomica a valle. Ad esempio, RELION e cryoSPARC richiedono il trasferimento manuale dei dati dal software di controllo del microscopio, introducendo inefficienze e potenziali errori. Inoltre, nessuno di questi strumenti fornisce una valutazione della qualità in tempo reale durante la raccolta dei dati o una transizione fluida alla costruzione di modelli atomici, causando flussi di lavoro frammentati che ostacolano la capacità produttiva e la riproducibilità.

La fase computazionale finale nella determinazione strutturale basata su crio-EM è la costruzione di modelli atomici, dove le coordinate molecolari vengono inserite iterativamente in mappe di densità ricostruite per chiarire le interazioni a livello atomico.

Sebbene gli approcci convenzionali alla costruzione di modelli impieghino algoritmi di minimizzazione energetica basati sulla fisica—incorporando potenziali elettrostatici, interazioni di van der Waals e vincoli di geometria del legame covalente—rimangono fortemente dipendenti dall'intervento manuale per il posizionamento iniziale del modello, l'interpretazione della densità e la validazione^{stereochimica} 15,16,17,18 . Questa dipendenza dalla curazione degli esperti non solo limita la capacità produttiva, ma introduce anche bias soggettivi, in particolare nei regimi a bassa risoluzione (< 4 Å) dove le caratteristiche di densità sono ambigue.

Per superare questi vincoli, le metodologie basate sul deep learning (DL) sono emerse come soluzioni trasformative, sfruttando le reti neurali per automatizzare l'estrazione delle caratteristiche, l'inizializzazione e il perfezionamento dei modelli. Questi approcci dimostrano prestazioni migliorate nella gestione di mappe di densità rumorose o incomplete, riducendo significativamente l'intervento manuale, come dimostrano i benchmark recenti che mostrano riduzioni del 40–60% nei passaggi dipendenti dall'utente rispetto alle pipeline^{convenzionali 19,20,21,22}.

Tuttavia, questi metodi richiedono invariabilmente l'esportazione di mappe di densità da software di ricostruzione 3D e l'importazione nelle strutture di costruzione di modelli. Prima dell'importazione, possono essere necessari ulteriori passaggi di pre-elaborazione—spesso coinvolgenti strumenti di terze parti—per ottimizzare le mappe di densità. Questo flusso di lavoro frammentato richiede trasferimenti di dati ripetitivi e conversioni di format, creando inefficienze. Inoltre, se i risultati iniziali della costruzione del modello non sono soddisfacenti, i ricercatori devono tornare alla fase di ricostruzione per il ricalcolo, seguita da un altro ciclo di costruzione e validazione del modello. Tali cicli iterativi ostacolano significativamente la capacità di produzione e l'efficienza operativa delle pipeline di determinazione strutturale crio-EM.

1.3 SMART: Una soluzione integrata per crio-EM end-to-end

Nonostante i notevoli progressi nella crio-EM SPA, la mancanza di soluzioni computazionali completamente integrate continua a ostacolare il suo potenziale per la biologia strutturale ad alto rendimento. I pacchetti software esistenti, pur eccellendo nell'automatizzare componenti isolati di workflow—come l'acquisizione dati o la ricostruzione 3D—non riescono a colmare le lacune critiche tra la raccolta di micrografie grezze, il perfezionamento delle mappe di densità e la costruzione di modelli atomici. Questa frammentazione richiede il trasferimento manuale dei dati, conversioni di formato e una regolazione ridondante dei parametri, causando inefficienze che si accumulano con la scala del dataset.

Per affrontare queste limitazioni, presentiamo la piattaforma integrata di workflow cryo-EM, una piattaforma computazionale integrata che unifica l'intera pipeline CRYO-EM SPA in un flusso di lavoro coeso guidato dall'IA. La piattaforma integrata integra tre moduli fondamentali: DataSmart (acquisizione automatica dei dati), CryoSmart (ricostruzione 3D abilitata da reti neurali ibride) e ModelSmart (modellazione atomica basata su deep learning).

I tre moduli computazionali della piattaforma sono interconnessi tramite un flusso dati standardizzato, permettendo un flusso dati snello in cui l'output di un modulo può informare gli aggiustamenti dei parametri nelle fasi successive di elaborazione. Questa integrazione mira a ridurre il numero di passaggi manuali e trasferimenti di dati necessari nei workflow convenzionali crio-EM, potenzialmente migliorando l'accessibilità e l'efficienza per i laboratori di biologia strutturale.

Protocollo

La linea cellulare Expi293F utilizzata per l'espressione proteica della proteina TRPML1 umana è stata acquistata dalla Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd (Numero di catalogo: SC0236058). L'identità della linea cellulare è stata correttamente autenticata tramite profilazione Short Tandem Repeat (STR) (File Supplementare 1).

Dichiarazione Etica
Questo studio non ha coinvolto partecipanti umani, animali o campioni prelevati direttamente da esseri umani o animali. La proteina TRPML1 umana è stata prodotta tramite espressione ricombinante e purificata in vitro. La linea cellulare Expi293F utilizzata per l'espressione proteica ricombinante è una linea cellulare consolidata e consolidata disponibile commercialmente. Di conseguenza, non erano necessarie l'approvazione etica istituzionale e il consenso informato scritto.

NOTA: La piattaforma di workflow integrata crio-EM è strutturata in tre moduli principali: un modulo di acquisizione dati automatizzata, un modulo di ricostruzione 3D abilitato da rete neurale ibrida e un modulo di modellazione atomica basato su deep learning, con i dati che fungono da interfaccia di comunicazione tra questi componenti software, come illustrato nella Figura 2. Il sistema integrato di piattaforma di workflow cryo-EM adotta un'architettura Browser-Server (B/S), che consente agli utenti di eseguire tutte le operazioni tramite un'interfaccia web, garantendo così usabilità e accessibilità operativa.

1. Acquisizione Automatizzata dei Dati

NOTA: La piattaforma integrata di workflow crio-EM è composta da tre moduli principali: un modulo di acquisizione dati automatizzata, un modulo di ricostruzione 3D abilitato da rete neurale ibrida e un modulo di modellazione atomica basato su deep learning. I dati fungono da interfaccia di comunicazione tra questi componenti software (Figura 2). Il sistema utilizza un'architettura Browser-Server (B/S) che consente tutte le operazioni tramite un'interfaccia web.

1. Inizializzazione del progetto
   1. Crea un nuovo progetto su una piattaforma software automatizzata per moduli di acquisizione dati.
   2. Se lo desideri, seleziona l'opzione per ereditare le impostazioni di configurazione di un progetto recente. Riutilizzare i parametri ereditati per l'installazione del microscopio elettronico invece di creare una nuova configurazione.
2. Ispezione per spostamento del fascio
   NOTA: Eseguire la regolazione dello spostamento del fascio all'interno del software di controllo del microscopio elettronico a trasmissione (TEM).
   1. Controllo a basso ingrandimento (Atlas e GridSquare)
      1. Apri il modulo Screening . Acquisire immagini con l'ingrandimento Atlas e GridSquare.
      2. Verifica che le immagini siano adeguatamente illuminate e prive di spostamento del fascio. Assicurati che il centro dell'immagine non sia posizionato sopra le barre della griglia.
   2. Controllo di ingrandimento per acquisizione dati
      1. Acquisire immagini con l'ingrandimento di acquisizione dati (ad esempio, 60K o 100K). Valuta l'allineamento della trave.
      2. Correggere lo spostamento del fascio prima di procedere se l'acquisizione dell'immagine fallisce o si osserva uno spostamento significativo del fascio.
   3. Controllo dell'ingrandimento eucentrico dei fori
      1. Acquisire immagini con il foro/ingrandimento eucentrico (tipicamente 8K). Regola lo spostamento del fascio finché il punto di illuminazione non è centrato, se il fascio non è centrato.
      2. Non modificare la posizione del diaframma. Verifica che la dimensione dell'apertura corrisponda a quella utilizzata durante l'acquisizione dei dati.
3. Regolazione dell'altezza Z
   1. Auto-Eucentrico Adattamento
      1. Accedi alla pagina Screening . Sposta il palco in un'area pulita di film di carbonio all'ingrandimento del foro o dell'altezza eucentrica. Apri il modulo Auto-Eucentric nella pagina AutoFunzione .
      2. Clicca su Start. Monitora il pannello di log per i feedback. Spostati in un'area diversa e ripeti la procedura se l'operazione fallisce.
   2. Regolazione dell'automessa a fuoco
      1. Apri il modulo AutoFocus nella pagina AutoFunzione . Clicca su Start.
      2. Rivedi i messaggi del log. Regola i parametri come indicato o ripeti la Sezione 1.3.1 se l'autofocus fallisce.
4. Controllo dell'allineamento dell'ingrandimento
   1. Ispezione dell'Allineamento
      1. Individua una caratteristica distintiva nell'ingrandimento dati e acquisisci un'immagine. Acquisire un'immagine all'ingrandimento Hole/EucentricHeight.
      2. Confronta le regioni centrali di entrambe le immagini. Procedere alla calibrazione se si osserva un disallineamento tra l'ingrandimento dei dati e del foro.
      3. Ispezionare l'allineamento tra le ingrandimenti Hole e GridSquare se le ingrandimenti Data e Hole sono allineati. Procedere senza calibrazione se tutti i livelli di ingrandimento sono allineati.
   2. Calibrazione a spostamento di ingrandimento
      1. Vai alla pagina Calibrazione . Apri il modulo Magnification Shift . Inizia con l'ingrandimento dati o il minimo ingrandimento disallineato.
      2. Acquisisci un'immagine ad alto ingrandimento che contenga una caratteristica distintiva. Acquisire un'immagine corrispondente a basso ingrandimento. Valuta lo spostamento tra le due immagini.
      3. Clicca con il tasto destro sulla posizione corrispondente al centro delle caratteristiche nell'immagine a basso ingrandimento. Seleziona Muovi qui. Riacquisire l'immagine ad alto ingrandimento e verificare l'allineamento.
      4. Ripeti l'aggiustamento se necessario. Clicca su Successiva per procedere alla coppia di ingrandimento successiva dopo l'allineamento. Ripeti la procedura di calibrazione per tutte le restanti coppie di ingrandimento disallineate.
5. Preparazione per la raccolta dei dati
   1. Esegui acquisizione atlante, selezione dei quadrati, imaging quadrato e selezione dei buchi
      1. Apri il modulo Atlas . Lascia il campo delle tessere vuoto per ottenere tutte e 81 le tessere, oppure inserisci il numero desiderato di tessere da acquisire.
      2. Naviga all'interfaccia Selezione Casella . Clicca con il tasto destro per selezionare i quadrati adatti.
      3. Accedi alla pagina di selezione delle buche . Clicca su Prepara Tutto. Monitora la finestra di log fino al completamento dell'acquisizione dell'immagine.
      4. Seleziona un'immagine quadrata catturata dalla lista delle immagini. Usa la funzione Trova Buchi per eseguire la selezione automatica dei fori quando i fori sono chiaramente visibili.
         ATTENZIONE: Il rilevamento automatico dei fori può fallire su griglie con ghiaccio denso o contaminazione superficiale. Verifica visivamente i fori rilevati prima dell'acquisizione e utilizza il metodo semi-automatizzato di selezione dei fori quando la rilevazione automatica non è affidabile.
      5. Utilizzare la funzione di selezione basata sul seme quando ghiaccio spesso o contaminazione impediscono una selezione automatica affidabile (Figura 3).
         1. Scegli una buca centrale. Seleziona due fori adiacenti che formano un angolo retto.
         2. Seleziona due fori distanti lungo le direzioni definite dalla seconda e dalla terza buca.
         3. Clicca su Invia. Abilita Move All quando elabori un'altra casella. Trascina uno dei cinque fori per semi fino a un foro libero. Clicca su Invia.
   2. Definizione del modello
      1. Naviga alla pagina Definizione Template . Clicca su Acquisisci per ottenere un'immagine. Verifica che l'immagine contenga un buco completo.
      2. Clicca con il tasto destro sull'area di destinazione e seleziona MoveStageTo se non è visibile una buca completa. Riacquista l'immagine del modello. Specifica la posizione dell'imaging e la posizione dell'autofocus trascinando i marker corrispondenti.
      3. Inserisce il numero di fotogrammi per buco. Inserisci il valore di defocus desiderato (ad esempio, −1,5 μm). Verifica tutti i parametri di acquisizione (Figura 4).
6. Ricontrollo del cambio di fascio
   1. Ripetere la Sezione 1.2 dopo aver completato tutte le procedure di preparazione.
7. Correzione dell'astigmatismo e del coma
   1. Correzione dell'astigmatismo
      1. Sposta il palco in un'area pulita con pellicola di carbonio. Regola l'altezza usando l'AutoFocus al valore di defocus desiderato (ad esempio, −1,5 μm). Apri il modulo Autostigmate nella pagina AutoFunzione .
      2. Clicca su Start. Monitora l'output Ctffind nel pannello log. Rivedere l'astigmatismo e i valori di adeguamento alla risoluzione. Ripeti la procedura in un'area diversa se l'astigmatismo rimane elevato.
   2. Correzione del coma
      1. Apri il modulo Autocoma se i risultati dell'Autostigmate rimangono subottimali dopo più tentativi. Clicca su Start.
8. Raccolta Automatizzata dei Dati
   1. Naviga alla pagina AutoCollect . Clicca su Start. Consentire al sistema di eseguire automaticamente le calibrazioni AutoEmission e AutoZLP .
   2. Acquisire dati utilizzando i parametri definiti nelle impostazioni di Screening, Data Acquisition e Preparation. Monitorare il processo di raccolta automatica (Figura 5).
      PUNTO DI PAUSA: Dopo il completamento della raccolta dati, gli stack di film acquisiti possono essere memorizzati e il protocollo ripreso nella fase di elaborazione delle immagini in un momento successivo senza influire sui risultati a valle.
9. Monitoraggio Remoto Istantaneo
   1. Monitorare i progressi della raccolta utilizzando il modulo di monitoraggio remoto. Rivedi i risultati della correzione del movimento in tempo reale generati con MotionCor2²³. Rivedere le misurazioni in tempo reale di astigmatismo e defocalizzazione.
   2. Condividi l'URL di monitoraggio con gli utenti autorizzati. Accedi allo stato della raccolta e alle informazioni sulla qualità dei dati da un computer o dispositivo mobile. Rivedi un esempio di funzionalità di monitoraggio remoto nella Figura 6.

2. Ricostruzione tridimensionale

NOTA: Utilizzare un modulo di ricostruzione 3D per eseguire ricostruzioni tridimensionali da dataset di immagini acquisiti in precedenza. Il flusso di lavoro include la creazione di progetti, l'importazione di micrografie, la stima della funzione di trasferimento di contrasto (CTF), la selezione delle particelle, l'estrazione delle particelle, la classificazione 2D, la generazione iniziale del modello e il perfezionamento 3D (Figura 7).

1. Creazione del progetto
   1. Accedi alla homepage del modulo di ricostruzione 3D. Clicca su Progetti per aprire la pagina di gestione progetti. Clicca su NUOVO PROGETTO.
   2. Inserisci il nome del progetto e specifica la posizione di archiviazione. Clicca su CREA PROGETTO. Clicca su Apri accanto al progetto appena creato. Clicca su NUOVO Esperimento per creare un nuovo esperimento.
      NOTA: Un progetto rappresenta una sessione complessiva di elaborazione dei dati, mentre un esperimento rappresenta un flusso di lavoro individuale all'interno di un progetto. Più esperimenti possono essere creati all'interno di un singolo progetto.
2. Importazione di file
   1. Clicca su Nuovo lavoro. Seleziona Importa e clicca su Crea. Seleziona il tipo di file appropriato. Importa i file .mrc generati durante l'acquisizione dei dati. Inserisci la dimensione dei pixel, la tensione di accelerazione e il numero di CPU. Clicca su Lavoro in coda.
      NOTA: Per terminare un lavoro in corso, clicca su Uccidi, poi su Cancella per riportare il lavoro nello stato dell'Edificio. Per i lavori completati o messi in coda, clicca su Cancella per reimpostare lo stato del lavoro.
3. Stima CTF
   1. Clicca su Nuovo lavoro. Seleziona Stima CTF e clicca su Crea.
      NOTA: Il modulo di ricostruzione 3D supporta più algoritmi di stima CTF. Questo protocollo utilizza CTFFIND4.
   2. Clicca sul pulsante Collega per le esposizioni. Seleziona le micrografie importate. Imposta il contrasto di ampiezza a 0,1, la risoluzione minima di adattamento a 30 Å, la risoluzione massima di adattamento a 4 Å, il valore minimo di ricerca di defocatura a 5.000 Å, il valore massimo di ricerca a 50.000 Å e la dimensione del passo di defocatura a 500 Å.
   3. Clicca su Lavoro in coda.
4. Selezione manuale delle particelle
   1. Clicca su Nuovo lavoro. Seleziona Selezione di particelle e poi seleziona Selezione di blob. Clicca su Crea. Clicca sul pulsante Collega per Micrografie (Esposizioni).
   2. Seleziona le micrografie importate. Inserisci i parametri richiesti. Clicca su Lavoro in coda. Ispezionare 3–4 micrografie rappresentative. Seleziona le particelle usando il tasto sinistro del mouse.
   3. Deseleziona le particelle usando il tasto destro del mouse. Determina l'intervallo di diametri delle particelle tra le particelle selezionate. Clicca Finito di Scelto! Estrae le particelle.
      NOTA: Misura le particelle da almeno tre micrografie.
5. Selettore di blob
   1. Clicca su Nuovo lavoro. Seleziona Selezione di particelle e poi seleziona Selezione di blob. Clicca su Crea. Collega l'input delle Micrografie (Esposizioni).
   2. Seleziona le micrografie importate. Inserisci i parametri richiesti. Clicca su Lavoro in coda.
6. Ispeziona le scelte di particelle
   1. Clicca su Nuovo lavoro. Seleziona Ispeziona le Scelte di Particelle. Clicca su Crea. Collega l'input delle Micrografie (Esposizioni). Collega le particelle in ingresso.
   2. Seleziona i file corrispondenti. Inserisci i parametri richiesti. Clicca su Lavoro in coda. Ispezionare 3–4 immagini rappresentative dopo il completamento del lavoro.
   3. Verifica la corretta selezione delle particelle. Clicca Finito di Scelto! Posizioni di uscita.
7. Estrazione delle particelle dalle micrografie
   1. Clicca su Nuovo lavoro. Seleziona estratto dalle micrografie. Clicca su Crea. Collega l'input delle Micrografie (Esposizioni). Collega le particelle in ingresso. Seleziona i file corrispondenti.
   2. Imposta la dimensione della scatola di estrazione a 2–3 volte il diametro delle particelle. Usa una scatola di estrazione di 400 pixel per TRPML1. Imposta la dimensione del raccolto di Fourier da un quarto a metà della dimensione della scatola di estrazione.
   3. Usa un ritaglio di Fourier di 100 pixel per TRPML1. Clicca su Lavoro in coda.
      NOTA: Ridurre la dimensione del raccolto di Fourier diminuisce la domanda computazionale della GPU.
8. Classificazione bidimensionale
   1. Clicca su Nuovo lavoro. Seleziona Classificazione 2D. Clicca su Crea. Collega le particelle in ingresso.
   2. Importa la pila di particelle. Inserisci i parametri richiesti. Clicca su Lavoro in coda.
      NOTA: Seleziona le classi 50–200. Usa meno classi per dataset più piccoli e più classi per dataset più grandi.
9. Classi bidimensionali selezionate
   1. Clicca su Nuovo lavoro. Seleziona le classi 2D selezionate. Clicca su Crea. Collega le particelle in ingresso. Collega l'input dei Template.
   2. Importa i file richiesti. Clicca su Lavoro in coda. Aspetta che il lavoro entri nello stato di Attesa. Clicca su Attesa.
   3. Seleziona classi 2D chiare e ben definite. Clicca su Fatto.
10. Generazione iniziale dei modelli
    1. Clicca su Nuovo lavoro. Seleziona Abinit Reconstruction. Collega le particelle in ingresso. Importa le particelle selezionate.
    2. Inserisci il numero di classi iniziali. Inserisci il parametro di simmetria. Clicca su Lavoro in coda.
11. Raffinamento eterogeneo
    NOTA: Utilizzare raffinamento eterogeneo per campioni eterogenei e raffinamento omogeneo per campioni omogenei.
    1. Clicca su Nuovo lavoro. Crea un lavoro di raffinamento eterogeneo. Collega le particelle in ingresso. Collega l'ingresso Volume.
    2. Seleziona i file corrispondenti. Inserisci i parametri di raffinamento. Specificare la simmetria appropriata (ad esempio, C1). Clicca su Lavoro in coda.
12. Raffinamento omogeneo
    1. Clicca su Nuovo lavoro. Crea un lavoro di raffinamento omogeneo. Collega le particelle in ingresso. Collega l'ingresso Volume.
    2. Opzionalmente collega l'ingresso della Maschera. Importa lo stack di particelle e la classe di volume con le migliori prestazioni dal passaggio di raffinamento precedente. Inserisci i parametri richiesti.
    3. Specificare la simmetria appropriata (ad esempio, O o C1). Clicca su Lavoro in coda. Clicca su Output dopo il completamento del lavoro. Ispezionare la mappa di densità ricostruita nell'interfaccia del browser (Figura 8).
13. Miglioramento della mappa
    NOTA: Map Enhancer utilizza DeepEMhancer²⁴. Usa le mezze mappe ogni volta che è possibile. Le modifiche post-traduzionali e le molecole di ligando non sono state incluse nel set di addestramento DeepEMhancer e potrebbero non essere potenziate in modo accurato. Map Enhancer esegue l'affilatura locale, il mascheramento automatico e la riduzione del rumore.
    1. Clicca su Nuovo lavoro. Crea un lavoro da Map Enhancer. Importare il Volume generato durante il Raffinamento Omogeneo.
    2. Importa la Maschera corrispondente. Importa file mappati tramite l'opzione Map Data Path se necessario. Esegui il lavoro.

3. Una modellazione atomica basata sul deep learning

NOTA: Un modulo di modellazione atomica basato sul deep learning si basa sul framework^{SMARTFold 25} sviluppato in precedenza e supporta la costruzione di modelli atomici per proteine e acidi nucleici (RNA/DNA) da mappe di densità crio-EM.

1. Lancia un modulo di modellazione atomica basato su deep learning
   1. Accedi a un sistema di moduli di modellazione atomica basato sul deep learning. Apri l'interfaccia di invio delle attività. Carica la mappa di densità crio-EM nel pannello sinistro.
   2. Inserisci i parametri di input richiesti. Invia il compito di modellazione.
2. Carica la mappa di densità crio-EM
   1. Carica la mappa di densità in formato .mrc, .ccp4 o .map. Verifica che la dimensione del file sia inferiore a 100 MB.
      NOTA: Se la mappa di densità supera i 100 MB, riduci la dimensione del file prima di caricare.
      1. Ritaglia la mappa di densità alla regione di interesse usando UCSF ChimeraX²⁶ con il comando: volume zone. Ricampiona la mappa a una dimensione di pixel maggiore.
      2. Applica una maschera morbida per rimuovere le zone di solvente.
         NOTA: Ispezionare la mappa di densità prima di caricarla per garantire le prestazioni ottimali del modello e ridurre il rischio di errori di elaborazione.
3. Ispezionare e preparare la mappa di densità
   1. Esegui il ritaglio della mappa di densità. Per questa coltura la mappa di densità serve a rimuovere regioni inutili. Verifica che la mappa ritagliata contenga solo la regione richiesta per la costruzione dei modelli.
      NOTA: Il ritaglio riduce la dimensione del file e aiuta a prevenire il sovraplessamento di memoria durante la generazione del modello.
   2. Poi controlla l'inversione dello specchio. Ispeziona la mappa di densità per una possibile inversione dello specchio. Esamina α aree elicoidali nella mappa. Verifica che le eliche α presentino una configurazione destrorsa e si propaghino verso l'alto in senso antiorario. Inverti la mappa di densità se viene rilevata una struttura speculare.
4. Carica il file di sequenza
   1. Carica il file di sequenza corrispondente. In alternativa, inserisci manualmente la sequenza. Fornire tutte le sequenze proteiche o di acidi nucleici incluse nella ricostruzione.
   2. Specificare le informazioni di sequenza eteromerica o omomerica quando applicabile. Inserisci il nome della proteina, se desiderato (Passaggio opzionale).
5. Specifica la risoluzione della mappa. Entra in scena la risoluzione riportata della mappa di densità crio-EM. Seleziona la partizione di calcolo. Seleziona il nodo di calcolo della GPU da utilizzare per la generazione dei modelli.
6. Per specificare le Risorse CPU, inserisci il numero di CPU da allocare. Non superare otto CPU. Rivedi tutti i file e i parametri caricati. Clicca su INVIA per avviare la generazione del modello.
7. Ispezionare il modello atomico previsto
   1. Apri la finestra di visualizzazione interattiva dopo il completamento del lavoro. Ruota il modello per ispezionare le caratteristiche strutturali. Zooma e indietro per esaminare dettagli strutturali locali e globali.
   2. Ispeziona il modello da più orientazioni. Valutare la qualità del modello, la conformazione spaziale e le caratteristiche a livello atomico. Utilizzare il modello generato per l'analisi e la validazione a valle.
   3. Fai riferimento alla Figura 9 per un esempio dell'interfaccia di visualizzazione.

Risultati

TRPML1, noto anche come mucolipina-1 (MCOLN1), è un canale cationico lisosomale essenziale per mantenere l'omeostasi ionica, regolare il traffico vescicolare e supportare l'autofagia nelle cellule^{mammiferiche 27,28}. La disfunzione di TRPML1 dovuta a mutazioni genetiche è stata direttamente collegata alla mucolipidosi di tipo IV, un grave disturbo neurodegenerativo dell'immagazzinamento lisosomale caratterizzato da neurosviluppo anomalo, degenerazione retinica e a...

Discussione

La determinazione strutturale delle macromolecole biologiche tramite crio-microscopia elettronica (crio-EM) implica intrinsecamente un flusso di lavoro prolungato e a più stadi che richiede una stretta integrazione di strumenti computazionali e affidamento su interventi esperti. La piattaforma integrata affronta questa sfida unificando acquisizione dati, ricostruzione 3D e modellazione atomica in un unico quadro verticalmente integrato—un passo verso flussi di lavoro crio-EM più snelli. ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
CryoSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Modulo di ricostruzione 3D della piattaforma SMART; rete neurale ibrida abilitata
Microscopio a elettroni crio-	Shuimu BioSciences Ltd.	SHUIMU TOTEM 300S	Utilizzato per l'acquisizione dei dati; dotato di filtro energetico
DataSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Modulo di acquisizione dati automatica della piattaforma SMART
DeepEMhancer	Open source	V0.17	Post-elaborazione del volume cryo-EM basata su apprendimento profondo; integrata in CryoSmart Map Enhancer
Rivelatore elettronico diretto	Gatan	GATAN K3 (6k x 4k)	Fotocamera utilizzata per la registrazione dei film
Griglia	Quantifoil	Au R1.2,1.3	Griglia per campioni cryo-EM
ModelSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Modulo di modellazione atomica basato su apprendimento profondo della piattaforma SMART; estende il framework SMARTFold
Piattaforma SMART	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Piattaforma cryo-EM integrata; architettura Browser-Server (B/S); include moduli DataSmart, CryoSmart e ModelSmart
Software di controllo TEM	Shuimu BioSciences Ltd.	V1.0	Software di controllo del microscopio elettronico per la regolazione dello spostamento del fascio
Topaz	Open source	V 2.5	Strumento di selezione delle particelle basato sull'apprendimento profondo; integrato come plug-in in CryoSmart
Campione di proteine TRPML1	Shuimu Biosciences Ltd.	SMPP-0053	TRPML1 umano (mucolipina-1); preparato internamente dal Dipartimento di Proteine e Cristallografia
Dispositivo di vetrificazione	Thermo Fisher Scientific	Vitrobot Mark IV	Per la preparazione del campione cryo-EM
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Software per uso generale per visualizzazione, analisi e altro
SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology)	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Piattaforma di flusso di lavoro cryo-EM integrata
SMARTFold	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Framework di apprendimento profondo alla base di ModelSmart
Leginon	National Resource for Automated Molecular Microscopy (NRAMM)	RRID:SCR_016731	Software di acquisizione dati cryo-EM automatizzato
SerialEM	University of Colorado	RRID:SCR_017293	Software di acquisizione TEM/cryo-EM automatizzato
EPU	Thermo Fisher Scientific	N/A	Software di raccolta dati cryo-EM automatizzato
EPU Multigrid	Thermo Fisher Scientific	N/A	Acquisizione cryo-EM automatizzata multi-griglia
Gatan Latitude	Gatan Inc.	N/A	Software di acquisizione per microscopia elettronica
JADAS	JEOL Ltd.	N/A	Sistema di acquisizione cryo-EM automatizzato
Auto-EMation	Tsinghua University	N/A	Software di acquisizione cryo-EM automatizzato
RELION	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016274	Software di ricostruzione cryo-EM bayesiana
cryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	RRID:SCR_016501	Elaborazione e ricostruzione di immagini cryo-EM
EMAN2	Baylor College of Medicine	RRID:SCR_017270	Suite di elaborazione immagini cryo-EM
CTFFIND4	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016732	Software di stima CTF
Gctf	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016500	Stima CTF accelerata da GPU
MotionCor2	Howard Hughes Medical Institute / UCSF	RRID:SCR_016499	Software di correzione del movimento
DeepEMhancer	Spanish National Center for Biotechnology (CNB-CSIC)	RRID:SCR_021214	Miglioramento della mappa cryo-EM basato sull'apprendimento profondo
Topaz	University of California Berkeley	RRID:SCR_018037	Selezione di particelle basata sull'apprendimento profondo
UCSF ChimeraX	University of California San Francisco	RRID:SCR_015872	Software di visualizzazione molecolare
CTFFIND4	Grigorieff Lab	RRID:SCR_016732	Adattabilità CTF utilizzata nel flusso di lavoro CryoSmart
EMDB-8840	Electron Microscopy Data Bank	Accession: EMD-8840	Mappa di riferimento TRPML1 umana
EMPIAR-10204	Electron Microscopy Public Image Archive	Accession: EMPIAR-10204	Set di dati di riferimento β-galattosidasi
Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)	Non specificato	N/A	Utilizzato per l'acquisizione dei dati cryo-EM
Microscopio elettronico FEI Tecnai	FEI (ora Thermo Fisher Scientific)	Non specificato	Menzionato nel flusso di lavoro citato
Filtro energetico	Non specificato	N/A	Utilizzato durante la raccolta automatizzata
Nodo di calcolo GPU	Non specificato	N/A	Utilizzato per i calcoli ModelSmart