Un metodo ChIRP a base di UV per l'identificazione verificabile di proteine che interagiscono direttamente con lncRNA: dalle cellule coltivate al testicolo del topo

Sommario

Un metodo ChIRP basato su UV per identificare interazioni dirette lncRNA-proteina.

Abstract

Gli RNA non codificanti lunghi (lncRNA) sono emersi come importanti regolatori di diversi processi biologici. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base delle funzioni della maggior parte degli lncRNA restano poco compresi. Identificare proteine interagenti, in particolare le proteine leganti l'RNA (RBP), è una strategia chiave per chiarire la funzione degli lncRNA. Tra gli approcci disponibili, l'identificazione completa delle proteine di legaggio dell'RNA (ChIRP) abbinata alla spettrometria di massa è ampiamente utilizzata grazie al suo design semplice della sonda e al flusso di lavoro semplice. Il ChIRP convenzionale si basa sul reticolamento paraformaldeide (PFA), che cattura sia i contatti diretti RNA-proteina sia le interazioni indirette mediate da fattori di collegamento. Al contrario, la reticolazione UV combinata con condizioni di lavaggio rigorose preserva preferentemente le interazioni dirette RNA-proteina. Utilizzando l'incrocio di RNA Tug1 come modello, sono stati confrontati il crosslinking UV e il crosslinking PFA all'interno del framework ChIRP in cellule coltivate, dimostrando che il ChIRP basato su UV arricchisce le interazioni dirette lncRNA-proteina. Questo flusso di lavoro basato su UV è stato successivamente esteso ai testicoli di topo, in cui i tessuti sono stati dissociati in sospensioni a singola cellula prima del crosslinking UV, permettendo l'identificazione delle proteine di legame Tug1 in un contesto tessutale nativo. Il confronto con interattomi derivati da linee cellulari ha rivelato sia interattori condivisi che specifici per tessuto. Due interazioni dirette condivise sono state validate indipendentemente da immunoprecipitazione reticolante potenziata (eCLIP). Questo approccio ChIRP basato su UV è chiamato cPDiRT (cattura di proteine che interagiscono direttamente con un bersaglio RNA). Insieme, cPDiRT consente l'identificazione di proteine che legano l'RNA sia in cellule coltivate che nei tessuti nativi. La combinazione di dissociazione tissutale e reticolazione UV fornisce una strategia ampiamente applicabile per studiare le interazioni dirette lncRNA-proteina attraverso diversi sistemi d'organo.

Introduzione

Recenti studi trascritomici ad alta produttività hanno scoperto migliaia di lunghi RNA non codificanti (lncRNA) che partecipano a diversi processi biologici, che vanno dall'organizzazione della cromatina alla segnalazione^{cellulare 1,2}. Nonostante la loro ampia espressione e importanza funzionale, i meccanismi molecolari della maggior parte degli lncRNA rimangono poco definiti. Un ostacolo importante è l'identificazione dei loro partner proteici fisici, in particolare delle proteine leganti l'RNA (^RBPs)3,4,5.

I metodi attuali incentrati sull'RNA si basano principalmente sulla reticolazione chimica, che cattura sia le interazioni dirette che indirette RNA-proteina. Di conseguenza, questi approcci sono più adatti alla mappatura globale degli interactomi che all'identificazione di contatti diretti^{autentici 6}. L'identificazione completa delle proteine di legame dell'RNA seguita dalla spettrometria di massa (ChIRP-MS) è una tecnica ampiamente utilizzata per mappare le interazioni lncRNA-RBP grazie al suo semplice design della sonda e al flusso di lavoro^{efficiente 7,8}. Il ChIRP-MS convenzionale utilizza il reticolamento paraformaldeide (PFA), che cattura sia i contatti diretti RNA-proteina sia le associazioni indirette mediate da fattori di collegamento ^9,10.

Al contrario, il crosslinking UV a 254 nm offre un vantaggio fondamentale. Collega covalentemente RNA e proteine solo quando sono in contatto a distanza quasi zero (tipicamente <1 Å)¹¹. Questo processo converte i legami a idrogeno in legami covalenti stabili e consente condizioni di lavaggio ad alto contenuto di sale che rimuovono interattori indiretti non legati covalentmente. Di conseguenza, gli approcci basati su UV forniscono una maggiore specificità per le interazioni dirette RNA-proteina rispetto ai metodi di reticolazione^{chimica 12,13}. Tuttavia, gli approcci basati su UV rimangono sottoutilizzati negli studi con interattomo di lncRNA derivati dal tessuto, principalmente a causa di preoccupazioni sull'efficienza di reticolazione e la limitata penetrazione UV.

Per indagare le interazioni dirette lncRNA-proteina in un contesto fisiologicamente rilevante, è stato selezionato l'lncRNA Tug1 come sistema modello. Tug1 rappresenta un punto di riferimento ideale per convalidare un flusso di lavoro di interazione diretta compatibile con i tessuti grazie al suo severo fenotipo knockout e all'elevato arricchimento nei testicoli. L'ablazione genetica di Tug1 provoca sterilità maschile completa, spermatogenesi compromessa e morfologia anormale^{degli spermatozoi 14}. Inoltre, Tug1 supporta la funzione delle cellule di Sertoli e l'integrità della barriera emato-testicolo nei topi ad alto contenuto di^{grassi 15}. Nonostante questi fenotipi ben consolidati, i partner proteici diretti che mediano la funzione di Tug1 nel testicolo—un organo che esprime un gran numero di RBP recentemente profilati^{sperimentalmente 16}—restano sconosciuti. Questa lacuna di conoscenza riflette in gran parte il fatto che la maggior parte dei metodi di mappatura dell'interazione lncRNA-proteina è stata sviluppata per sistemi cellulari coltivati.

Per affrontare questa limitazione, il framework ChIRP è stato modificato sostituendo il reticolamento con PFA con il reticolamento UV per catturare proteine che interagiscono direttamente con Tug1. Le interazioni candidate sono state validate indipendentemente da immunoprecipitazione reticolante potenziata seguita da sequenziamento profondo (eCLIP-seq⁾¹⁷. Il flusso di lavoro è stato ulteriormente esteso alle applicazioni tissutali dissociando testicoli freschi di topo in singole cellule prima del crosslinking UV. Questo approccio ottimizzato è stato designato cPDiRT (cattura di proteine che interagiscono direttamente con un bersaglio di RNA).

L'applicazione di cPDiRT a Tug1 nel testis del topo ha permesso la mappatura di interazione diretta in un contesto tessutale nativo. Esperimenti paralleli in cellule coltivate hanno fornito un confronto affiancato tra profili di interazione basati su PFA e basati su UV. Combinato con la validazione indipendente di eCLIP, questo approccio ha generato un insieme di partner molecolari ad alta fiducia che potrebbero contribuire alla funzione di Tug1 durante la spermatogenesi. Il protocollo presentato qui consente la cattura di proteine che interagiscono direttamente con un lncRNA bersaglio sia in cellule coltivate che nei tessuti nativi. Definendo l'interattome diretto di Tug1 nel testicolo, questo metodo promuove gli studi meccanicistici di un lncRNA essenziale per la fertilità e fornisce una piattaforma generalizzabile per studiare le interazioni lncRNA-proteina nei tessuti riproduttivi e in altri tessuti complessi.

Protocollo

Tutte le soluzioni sono state preparate utilizzando acqua e reagenti ultrapuri senza nucleasi e proteasi. Tutti i reagenti e le attrezzature sono elencati nella Tabella dei Materiali.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico Animale dell'Università Medica di Nanchino (Approvazione n.: IACUC-1812003-4) e sono stati condotti in conformità con la Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio (Consiglio Nazionale della Ricerca, 8ª edizione). Mantenere i maschi C57BL/6 topi (4 settimane) in un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio con accesso ad libitum a cibo e acqua. Minimizza la sofferenza animale utilizzando il minor numero di animali necessari per ottenere significatività statistica. Eutanasiare i topi tramite inalazione di CO₂ seguita da una lussazione cervicale secondo i protocolli istituzionali approvati.

1. Preparare i buffer

1. Preparare il buffer di lisi cellulare
   1. Prepara il tampone di lisi cellulare contenente 50 mM di Tris-HCl (pH 7,0), 10 mM di EDTA e SDS all'1%.
   2. Immediatamente prima dell'uso, aggiungi 1 mM di PMSF, un cocktail di inibitori di proteasi e un inibitore specializzato di RNasi.
      ATTENZIONE: La SDS è un irritante per la pelle e gli occhi. Evita di inalare polvere o aerosol. La PMSF è altamente tossica, agisce come inibitore della colinesterasi ed è instabile in soluzione acquosa. Prepara il PMSF immediatamente prima dell'uso. Indossa guanti e occhiali di sicurezza quando maneggi questi reagenti. Maneggiare il PMSF in una cappa chimica.
2. Preparare il buffer di ibridazione
   1. Prepara un buffer di ibridazione contenente 750 mM di NaCl, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM EDTA e 15% di formamide.
   2. Immediatamente prima dell'uso, aggiungi 1 mM di PMSF, un cocktail di inibitori di proteasi e un inibitore specializzato di RNasi.
      NOTA: Conserva il formamide a 4 °C, protetto dalla luce.
      ATTENZIONE: Il formamide è un teratogeno e un rischio riproduttivo. Maneggiare la formamide in una cappa chimica indossando guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. Evita l'inalazione e il contatto con la pelle.
3. Prepara il tampone di lavaggio
   1. Prepara un tampone di lavaggio contenente 50 mM di Tris-HCl (pH 7,0), 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS e 0,5% desossicolato di sodio.
   2. Proteggi il buffer di lavaggio dalla luce durante la conservazione.
4. Prepara il tampone della proteinasi K (PK)
   1. Prepara un buffer PK contenente 100 mM di NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM di EDTA e 0,5% di SDS.
   2. Aggiungi la proteinasi K a una concentrazione finale del 5% immediatamente prima dell'uso.

2. Progettare e preparare le sonde

1. Probe antisens di progettazione
   1. Progetta sonde oligonucleotidiche antisense utilizzando il progettista online di sonde disponibile al¹⁸ singlemoleculefish.com.
2. Ottenere sonde biotinilate
   1. Ordina sonde antisenso con una modifica 3'-BiotinTEC.
3. Prepara la piscina di sonde
   1. Diluire ogni sonda singolarmente a 100 μM.
   2. Mescola volumi uguali di tutte le sonde per generare un pool di sonde. Mantenere una concentrazione finale combinata di oligonucleotidi di 100 μM.
   3. Conserva la piscina della sonda a -20 °C.
      NOTA: I parametri raccomandati per la progettazione della sonda sono i seguenti: (i) una sonda ogni 100 bp di RNA bersaglio, (ii) contenuto GC bersaglio del 45%, (iii) lunghezza della sonda di 20 nt e (iv) distanza di 60–80 nt tra le sonde.
      NOTA: Se l'RNA supera il limite di dimensione accettato dal progettista della sonda, dividere la sequenza in segmenti più piccoli prima della progettazione. Escludere le regioni ripetitive e quelle con un'ampia omologia di successioni.

3. Eseguire prelievo cellulare, dissociazione tissutale e reticolazione UV

1. Prepara controlli senza UV
   1. Preparare i campioni di controllo in parallelo con quelli sperimentali.
   2. Ometti la fase di reticolazione UV dai campioni di controllo.
   3. Eseguire tutte le procedure successive, inclusa sonicazione, pull-down RNA-proteina, estrazione RNA ed estrazione proteica, in modo identico per entrambi i gruppi.
      NOTA: Utilizzare il controllo senza UV per distinguere le interazioni RNA-proteina dipendenti da UV dal legame di fondo non specifico.
2. Prelevare cellule ed eseguire reticolazione UV
   1. Cellule coltivate a lavaggio
      1. Lavare le cellule tre volte con PBS per rimuovere il residuo del materiale di coltura.
   2. Celle a reticolazione incrociata
      1. Distribuire 3 mL di PBS in modo uniforme su una teglia di coltura da 15 cm.
      2. Irradiare cellule in un crosslinker UV da 254 nm a una dose di 4000 mJ/^cm2.
   3. Raccogliere celle reticolate
      1. Raccogli le celle in PBS dopo il crosslinking.
      2. Centrifuga la sospensione e scarta il soprantantante.
      3. Pesa il pellet e conferma una massa minima di 500 mg per campione.
3. Dissociare il tessuto testicolare ed eseguire il crosslinking UV
   1. Preparare i testicoli
      1. Decapsula i testicoli.
      2. Lava il fazzoletto due volte con DMEM.
   2. Eseguire la digestione della collagenasi
      1. Incubare il tessuto in DMEM contenente 1 mg/mL di collagenasi IV a 37 °C per 5–15 minuti.
      2. Continuare la digestione fino al rilascio dei tubuli seminíferi.
         NOTA: Non superare i 15 minuti di digestione.
   3. Lavare i tubuli seminiferi
      1. Centrifuga la sospensione a 1000 × g per 1 minuto a 4 °C.
      2. Rimuovi il soprannatante.
      3. Lava il pellet con 5–10 mL di DMEM.
      4. Centrifuga di nuovo nelle stesse condizioni.
   4. Eseguire la digestione della tripsina
      1. Risospendere il pellet con tripsina allo 0,25% contenente 1 mg/mL di DNasi I.
      2. Incubare a 37 °C per 5–15 minuti.
         NOTA: Non superare i 15 minuti di digestione.
   5. Fermare la digestione enzimatica
      1. Aggiungi un volume uguale di DMEM integrato con il 10% di FBS.
   6. Generare una sospensione a singola cella
      1. Filtra la sospensione attraverso un filtro a celle da 70 μm.
   7. Celle di lavaggio
      1. Centrifugare le celle a 2000 × g per 5 minuti a 4 °C.
      2. Scartate il soprannatante.
      3. Lava il pellet con 5–10 mL PBS.
      4. Centrifuga di nuovo nelle stesse condizioni.
   8. Cellule testicolari a collegamento incrociato
      1. Sospendere la sospensione a singola in PBS.
      2. Distribuisci la sospensione uniformemente su una piastra di coltura da 15 cm.
      3. Irradiare cellule in un crosslinker UV da 254 nm a una dose di 4000 mJ/^cm2.
   9. Raccogliere celle reticolate
      1. Per i controlli senza UV, ometti l'irradiazione.
      2. Raccogli le cellule in PBS.
      3. Centrifuga la sospensione e scarta il soprantantante.
      4. Pesa il pellet e conferma una massa minima di 500 mg per campione.
         NOTA: Il numero di topi necessari per ottenere circa 500 mg di pellet cellulare dipende dall'età e dalla resa tissutale. In questo studio sono stati utilizzati circa 10–12 topi di quattro settimane.

4. Eseguire la sonicazione

1. Prepara i lisati
   1. Risospendere i pellet cellulari nel buffer di lisi cellulare con un rapporto di 100 mg di pellet per 1 mL di buffer.
   2. Mescola accuratamente per ottenere una sospensione omogenea.
2. Campioni sonicati
   1. Sonica lisate usando un sonicatore a bagno d'acqua o un ultrasonicatore focalizzato.
   2. Continua la sonicazione finché il lisato non diventa visivamente chiaro.
      NOTA: Verifica la frammentazione del DNA tramite elettroforesi su gel di agarosio. Continuare la sonicazione finché la maggior parte dei frammenti di DNA non è tra 1 kb e 2 kb.

5. Eseguire il pull-down RNA-proteina

1. Raccolta dei campioni di input
   1. Rimuovere le aliquote di lisato per i controlli di input.
   2. Riservare circa 10 μL per l'analisi dell'RNA e 10 μL per l'analisi proteica.
   3. Mantenere i campioni di input a 37 °C durante le procedure di ibridazione e lavaggio.
2. Lisati preclear
   1. Aggiungi 30 μL di perline magnetiche prelavate a ciascun campione.
   2. Incubare i campioni a 37 °C per 30 minuti con miscelazione delicata in un forno di ibridazione.
      NOTA: Lava le perline magnetiche prima dell'uso. Posiziona le aliquote delle perline su un supporto magnetico per 1 minuto o finché la soluzione non diventa pulita. Rimuovi completamente la soluzione di stoccaggio. Lava le perline due volte con 500 μL di tampone di lisi cellulare.
3. Rimuovere le perle di pre-clearing
   1. Metti i campioni su un supporto magnetico.
   2. Trasferisci il soprandanante in un tubo nuovo.
   3. Ripeti il trasferimento una volta per assicurarti la completa rimozione delle perline residue.
4. Sonde ibride
   1. Aggiungi due volumi di buffer di ibridazione a ciascun campione.
   2. Aggiungere sonde a un rapporto di 1 μL di stock di sonda da 100 μM per 1 mL di lisato (Tabella Supplementare 1).
5. Reazioni di ibridazione da incubazione
   1. Incubare i campioni a 37 °C con rotazione end-to-end per 12–16 ore in un forno di ibridazione.
6. Prepara le perline di cattura
   1. Lavare 100 μL di sfere magnetiche tre volte con il tampone di lisi cellulare immediatamente prima della fine dell'ibridazione.
   2. Rimuovere tutto il residuo di buffer dopo il lavaggio finale.
7. Cattura complessi legati a sonde
   1. Brevi reazioni di ibridazione centrifughe.
   2. Risospendere le perle lavate in 1 mL di campione ibridato.
8. Legare complessi alle perline
   1. Riporta la sospensione a talloni al tubo originale.
   2. Incubare a 37 °C con miscelazione per 30–40 minuti.
9. Recupero delle perle
   1. Centrifuga brevemente campioni.
   2. Posiziona i tubetti su un supporto magnetico per 1–2 minuti o finché la soluzione non diventa chiara.
   3. Scartate il soprannatante.
   4. Rimuovi il liquido residuo usando una punta di pipetta.
      NOTA: Evita di disturbare il pellet magnetico durante la rimozione del liquido.
10. Complessi catturati da lavaggio
    1. Aggiungi 1 mL di buffer di lavaggio.
    2. Lava le perline a 37 °C con una miscelazione continua per 5 minuti.
    3. Ripeti la procedura di lavaggio cinque volte.
       NOTA: Il wash buffer contiene 1 M NaCl, che interrompe le interazioni proteica-proteina e proteina-RNA non covalenti preservando i reticuli indotti dai ragazzi UV covalenti. Queste condizioni rigorose rimuovono interattori indiretti e background non specifici, arricchendo così i partner proteici^{diretti 19}.
11. Materiale di riserva per l'analisi dell'RNA
    1. Trasferire l'1%–10% delle sfere lavate in un tubo fresco per l'analisi dell'RNA.
    2. Usa subito le perline rimanenti per l'estrazione proteica o conservale a -80 °C.
       NOTA: Mettere in pausa il protocollo qui se necessario. Conserva i campioni di perle a -80 °C fino all'estrazione delle proteine.
12. Proteine elute
    1. Aggiungi un buffer di campione SDS alle perline.
    2. Bollire i campioni a 95 °C per 30 minuti per eluire proteine e invertire i collegamenti incrociati.
    3. Procedi all'analisi della spettrometria di massa.

6. Estrazione dell'RNA

1. Proteine digerenti
   1. Risospendere i campioni di RNA legati alla sfera in 100 μL di buffer PK.
   2. Regolare i campioni di input di RNA a un volume finale di 100 μL usando il buffer PK.
2. Incubare con la proteinasi K
   1. Incubare i campioni a 50 °C per 45 minuti con miscelazione continua.
3. Inattivare la proteinasi K
   1. Riscaldare a 95 °C per 10 minuti.
4. Aggiungi reagente TRIzol
   1. Aggiungi 500 μL di reagente TRIzol a ciascun campione.
   2. Vortice a fondo.
   3. Incuba per 5 minuti a temperatura ambiente.
      ATTENZIONE: Il reagente TRIzol contiene fenolo e guanidina tiocianato. Maneggia il reagente con una cappa chimica indossando guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. Evita l'inalazione e il contatto con la pelle. Se avviene contatto con la pelle, lava immediatamente con acqua e sapone.
5. Eseguire la separazione delle fasi
   1. Aggiungi 100 μL di cloroformio a ciascun campione.
   2. Vortice a fondo.
   3. Incuba per 5 minuti a temperatura ambiente.
6. Recupero della fase acquosa
   1. Centrifugare i campioni a 4 °C per 15 minuti.
   2. Trasferire la fase acquosa superiore in un tubo fresco.
7. Legare l'RNA alle colonne di purificazione
   1. Aggiungere un volume uguale di etanolo al 100% alla fase acquosa.
   2. Mescola bene.
   3. Carica i campioni sulle colonne di purificazione dell'RNA.
8. Purificare RNA
   1. Esegui la pulizia dell'RNA secondo le istruzioni del produttore.
   2. Eluto RNA in 30 μL di acqua priva di nucleasi.
9. Verifica l'arricchimento dell'RNA tramite qRT-PCR
   1. Utilizzare 1 μL di RNA eluzionato per ogni reazione per la PCR di trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR).
   2. Valutare l'arricchimento dell'RNA bersaglio rispetto ai controlli.

7. Eseguire analisi LC-MS/MS

1. Proteine separate tramite SDS-PAGE
   1. Mescola proteine ottenute nello Step 5.12 con 4× campione LDS buffer.
   2. Separare le proteine su un gel Bis-Tris al 4%–12%.
   3. Tingi il gel usando un kit di tinta argentata.
   4. Elimina l'intera linea proteica come una sola banda.
2. Pezzi di gel per accise
   1. Elimina la fascia proteica usando un bisturi pulito.
   2. Minimizza la quantità di gel in eccesso.
   3. Taglia il gel in circa^{1 mm e 3} pezzi.
   4. Trasferisci i pezzi di gel su un tubo da 0,5 mL.
3. Blocchi di gel di detenuzione
   1. Aggiungi 100 μL di soluzione anticolorante.
   2. Vortice per 10 minuti.
   3. Centrifuga a 14.000 × g per 1 minuto.
   4. Rimuovi il soprannatante.
   5. Ripeti la procedura di decolorazione finché i pezzi di gel non diventano trasparenti.
4. Ridurre le proteine
   1. Aggiungi 100 μL di soluzione riduzionale.
   2. Incubare a 56 °C per 30 minuti.
   3. Campioni freddi a temperatura ambiente.
   4. Centrifuga brevemente e rimuovi il surnatante.
5. Proteine alchilate
   1. Aggiungi 100 μL di soluzione alchilante.
   2. Incuba a temperatura ambiente per 20 minuti al buio.
   3. Rimuovi il soprannatante.
   4. Lava i pezzi di gel con 100 μL di buffer digeritivo per 5 minuti.
6. Proteine digerenti
   1. Aggiungi una soluzione sufficiente per tripsina per coprire completamente i pezzi di gel.
   2. Incubare a 37 °C per 16–18 ore.
7. Peptidi estratti
   1. Aggiungi 30 μL di soluzione di estrazione.
   2. Sonicate per 15 minuti o vortice per 30 minuti.
   3. Centrifuga a 14.000 × g per 1 minuto.
   4. Trasferisci il soprandanante in un tubo nuovo.
   5. Ripeti la procedura di estrazione due volte.
   6. Raccogli tutti gli estratti.
   7. Estratti secchi e concentrati in un concentratore a vuoto per circa 1 ora.
8. Pulire peptidi usando un StageTip
   1. Risospendere i peptidi essiccati in 20 μL di acido formico (FA) allo 0,1%.
   2. Carica i campioni su un C18 StageTip.
   3. Centrifuga a 1.000 × g per 2 minuti.
   4. Lava lo StageTip con 20 μL di 0,1% di FA.
   5. Peptidi eluti con 20 μL di 60% acetonitrile/0,1% FA in una fiala LC-MS.
   6. Asciuga l'eluato.
   7. Risospendere i peptidi in 10 μL dello 0,1% di FA.
      NOTA: Mettere in pausa il protocollo qui se necessario. Conservare i peptidi purificati a -80 °C prima dell'analisi LC-MS/MS.
9. Acquisizione dati LC-MS/MS
   1. Ricostituire i peptidi in acido formico allo 0,1%.
   2. Separare peptidi su una colonna analitica da 75 μm × 250 mm C18 a una portata di 300 nL/min.
   3. Applicare il seguente gradiente B del solvente (acido formico allo 0,1% nell'acetonitrile):
      2%–25% B in 0–40 min
      25%–40% B in 40–48 min
      40%–99% B in 50–57 min
      Mantieni al 99% B per 3 minuti
   4. Operare lo spettrometro di massa in modalità acquisizione dipendente dai dati.
   5. Acquisire spettri MS a scansione completa su un intervallo m/z da 350–1200 a una risoluzione di 70.000.
   6. Acquisire quindici scansioni MS/MS consecutive di dissociazione collisionale ad energia superiore (HCD) con una risoluzione di 17.500.
   7. Registra una microscansione per ogni scansione.
   8. Imposta l'esclusione dinamica a 30 secondi.
10. Dati di spettrometria di massa di processo
    1. Elabora i dati grezzi utilizzando MaxQuant (v2.1.0.0).
    2. Cerca spettri rispetto a sequenze proteiche di topo scaricate da UniProt.
    3. Specifica la tripsina come enzima digestionale.
    4. Consentire un massimo di due scollature mancate.
    5. Specificare l'ossidazione della metionina come una modifica variabile.
    6. Specificare la cisteina carbamidometilazione come una modifica fissa.
    7. Imposta le tolleranze di massa del precursore e del frammento a 15 ppm e 20 ppm, rispettivamente.
    8. Controlla il tasso di false scoperte all'1% sia a livello di peptide che di proteina.
    9. Stima l'abbondanza proteica utilizzando la quantificazione senza etichettatura basata su iBAQ.

8. Eseguire l'analisi di arricchimento dell'ontologia genica

1. Analizzare l'arricchimento funzionale
   1. Esegui l'analisi di arricchimento Gene Ontology (GO) utilizzando il pacchetto clusterProfiler R (v4.6.0).
   2. Usa il database GO (v2024-09-20) come fonte di riferimento per le annotazioni.
   3. Applica la correzione Benjamini-Hochberg per test multipli.
   4. Definire la significanza statistica come un valore P aggiustato (FDR) < 0,05.

9. Eseguire la validazione eCLIP-seq

1. Prepara i campioni di eCLIP
   1. Eseguire immunoprecipitazione con reticolazione avanzata (eCLIP) come descritto^{in precedenza 17}.
   2. Prepara campioni cellulari reticolati UV per l'immunoprecipitazione di PABPC1 e CCT3.
   3. Campioni di lisi usando il buffer di lisi eCLIP.
2. Complessi RNA-proteina immunoprecipitati
   1. Aggiungi 10 μg di anticorpi a ogni campione.
   2. Cattura complessi RNA-proteina su sfere magnetiche.
   3. Raccogli i campioni di input prima dell'immunoprecipitazione.
3. Preparare le librerie di RNA
   1. RNA legati alle proteine defosforilati.
   2. Legare un adattatore RNA da 3' all'RNA recuperato.
   3. Lavare i campioni immunoprecipitati e dati in condizioni rigorose.
   4. Elute compessi bollendo le perline.
   5. Risolvi i campioni su un gel gradiente Bis-Tris 4%–12%.
   6. Trasferire complessi separati a una membrana di nitrocellulosa.
4. Recupero dell'RNA
   1. Eliminare una regione di membrana corrispondente alla dimensione.
   2. Digerire proteine usando urea e proteinasi K.
   3. Recuperare l'RNA dalla membrana.
5. Generare librerie di sequenziamento
   1. La trascrizione inversa ha recuperato l'RNA in cDNA.
   2. Purificare cDNA usando una miscela di esonucleasi I e fosfatasi alcaline di gamberi.
   3. Lega un adattatore di DNA all'estremità 3' del cDNA usando la ligasi di RNA T4.
   4. Amplifica librerie utilizzando una DNA polimerasi ad alta fedeltà.
   5. Separati librerie amplificate su un gel di agarosio a basso punto di fusione al 3%.
   6. Purifica le librerie selezionate per dimensioni usando un kit di estrazione gel.
   7. Librerie di sequenze su una piattaforma Illumina.
6. Analizza i dati eCLIP-seq
   1. Analizza i dati di sequenziamento utilizzando la pipeline ENCODE^{eCLIP 20}.
   2. Adattatori di trim e dimer adattatori da 3' usando cutadapt (v1.14).
   3. Align legge agli elementi di ripetizione UCSC usando STAR (v2.7.6a).
   4. Rimuovi la mappa delle letture agli elementi ripetuti.
   5. Allinea le letture rimanenti al genoma di riferimento mm10 (GENCODE vM23).
   6. Rimuovi i duplicati PCR.
   7. Identificare i siti di legame arricchiti utilizzando CLIPPER.
   8. Definire i picchi significativi come quelli con arricchimento di pieghe ≥ 8 e P ≤ corretto a 0,001.
   9. Identificare i picchi riproducibili utilizzando una soglia di tasso di scoperta irriproducibile (IDR) di 0,01.

Risultati

Per identificare le proteine di legame Tug1, è stato incorporato il crosslinking UV nel flusso di lavoro del ChIRP, stabilendo un metodo denominato cPDiRT (Figura 1). Il ChIRP convenzionale è stato eseguito per la prima volta nelle cellule GC2 per arricchire proteine che interagiscono con Tug1 (Figura 2A, B). L'analisi di spettrometria di massa ha identificato più di 190 proteine arricchite ris...

Discussione

cPDiRT è stato sviluppato come un protocollo modificato basato su ChIRP che sostituisce il reticolamento paraformaldeide (PFA) con il crosslinking UV per catturare selettivamente le interazioni dirette lncRNA-proteina. Combinando la dissociazione enzimatica di tessuto testicolare fresco in singole cellule con il crosslinking UV, la mappatura di interazione diretta è stata estesa dalle linee cellulari coltivate ai tessuti nativi. Esperimenti paralleli in cellule coltivate hanno permesso u...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Gibco	25200056	per la dissociazione del tessuto e la preparazione di sospensioni cellulari singole
100% Etanol	Sigma-Aldrich	459844	per la pulizia dell'RNA
AffinityScript Reverse Transcriptase	Agilent	600107	per la sintesi di cDNA eCLIP
Anti-CCT3 Antibody	Abcam	Ab225878	anticorpo per eCLIP
Anti-PABPC1 Antibody	Abcam	Ab312314	anticorpo per eCLIP
Cloruro di metilene	Sigma-Aldrich	C2432	per l'estrazione dell'RNA
Collagenasa Tipo IV	Sigma-Aldrich	C5138	per la dissociazione enzimatica del tessuto testicolare
Reagenti di defosforilazione (T4 PNK)	New England Biolabs	M0201S	per la defosforilazione dell'RNA eCLIP
Medium DMEM ad alta glucosi	Gibco	11965092	per la coltura cellulare e il tampone di dissociazione del tessuto
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Magnetic Beads	Thermo Fisher Scientific	65001	per la cattura dei complessi sonda-RNA-proteina biotinilata
DynaMag-15 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12301D	per la separazione delle perle magnetiche
DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D	per la separazione delle perle magnetiche
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	per la chelazione dei cationi bivalenti nei tamponi di lisi e lavaggio
Esossuanidasi I	New England Biolabs	M0293S	per la purificazione del cDNA eCLIP
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	10099141C	per fermare la digestione della tripsina
Formammide	Thermo Fisher Scientific	AM9342	per la preparazione del tampone di ibridazione
Forno di ibridazione	TUOHE	LF-I	per l'ibridazione della sonda e il lavaggio delle perle
Agarosi a bassa temperatura di fusione	Sigma-Aldrich	A9414	per la selezione della dimensione della libreria eCLIP
Kit di estrazione del gel MinElute	Qiagen	28604	per la selezione della dimensione della libreria eCLIP
Kit miRNeasy Mini	Qiagen	217004	per la purificazione dell'RNA
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	per la preparazione del tampone di lavaggio ad alto contenuto di sali
Membrana di nitrocellulosa	GE Healthcare / Amersham	10600002	per il trasferimento western blot eCLIP
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85125	per il detergente del tampone di lavaggio
Acqua libera da nucleasi e proteasi	Thermo Fisher Scientific	10977035	per la preparazione di soluzioni prive di nucleasi
Gel Bis-Tris NuPAGE 4-12%	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX	per la selezione della dimensione eCLIP
Gel Bis-Tris pre-confezionati NuPAGE	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX	per la separazione delle proteine SDS-PAGE
PBS (pH 7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010023	per il lavaggio e la ri-sospensione delle cellule
Fenilsolfato di metile (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	inibitore della serina proteasi per il tampone di lisi cellulare; aggiunto fresco prima dell'uso
Cocktail di inibitori delle proteasi	Roche	4693132001	inibitore delle proteasi ad ampio spettro per il tampone di lisi cellulare; aggiunto fresco prima dell'uso
Proteinasi K	Sigma-Aldrich	P4850	per la digestione proteica nell'estrazione dell'RNA
qRT-PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	11704044	per la RT-PCR quantitativa per confermare l'arricchimento dell'RNA
Soluzione di RNase/Proteasi-Free DNase I	Thermo Fisher Scientific	EN0521	per la dissociazione del tessuto
Kit RNeasy Mini	Qiagen	74104	per la purificazione dell'RNA
Buffer di caricamento del campione SDS-PAGE	Beyotime	P0286	per la preparazione dei campioni proteici
Fosfatasi alcalina di gambero	New England Biolabs	M0371S	per la purificazione del cDNA eCLIP
Kit di colorazione argentata	Beyotime	P00175	per la visualizzazione delle proteine nei gel SDS-PAGE
Sodico deossicolato	Sigma-Aldrich	D6750	per il detergente del tampone di lavaggio
Sodico dodecil solfato (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	per la lisi cellulare e la denaturazione delle proteine
Superase-in RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	inibitore specializzato delle RNAsi; aggiunto fresco prima dell'uso
T4 RNA Ligasi	New England Biolabs	M0204	per la legatura degli adattatori eCLIP
Tris-HCl (pH 7.0)	Sigma-Aldrich	T5941	per la preparazione dei tamponi di lisi, ibridazione e lavaggio
Reagente TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026CN	per l'estrazione dell'RNA
Frantoio cellulare ad ultrasuoni	ATPIO	ATPIO-650D	per la lisi cellulare e la frammentazione del DNA
Crosslinker ultravioletto	Analytik Jena	UVP CL-1000	per il crosslinking UV delle interazioni RNA-proteina
Urea	Sigma-Aldrich	U5128	per la degradazione delle proteine eCLIP sulla membrana