Questo protocollo descrive una laminectomia lombare standardizzata a livello L5 in topi C57BL/6J di età avanzata, al fine di stabilire un modello di disfunzione cognitiva postoperatoria minimizzando al contempo il deficit locomotorio, sostenendo così studi comportamentali, istologici e meccanicistici sui disturbi neurocognitivi perioperatori.
Articolo metodologico
Laminectomia lombare L5 in topi C57BL/6J anziani per modellare la disfunzione cognitiva postoperatoria
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La disfunzione cognitiva postoperatoria (POCD) è una complicanza neurologica comune dopo interventi chirurgici e anestesia, in particolare negli adulti anziani, ed è associata a un recupero ritardato, un ricovero prolungato e una riduzione della qualità della vita. Gli interventi ortopedici e spinali sono legati a un rischio relativamente elevato di POCD; tuttavia, i modelli preclinici che rispecchiano fedelmente le caratteristiche perioperatorie della chirurgia spinale rimangono limitati. I modelli comunemente utilizzati, tra cui laparotomia e frattura tibiale, possono provocare un deficit locomotorio persistente e un'infiammazione periferica prolungata che potrebbe confondere l'interpretazione degli esiti comportamentali cognitivi. In questo studio, viene descritto un protocollo standardizzato ed economico per modellare la POCD mediante laminectomia lombare L5 sotto anestesia da sevoflurano in topi maschi C57BL/6J di 18 mesi. L'intervento viene eseguito utilizzando strumenti chirurgici di routine e provoca una lesione chirurgica controllata minimizzando al contempo i deficit motori persistenti. La funzione cognitiva viene valutata mediante il test di riconoscimento dell'oggetto nuovo, il labirinto a forma di Y con braccio nuovo e il labirinto di Barnes, mentre il danno neuronale ippocampale e le alterazioni neuroinfiammatorie vengono valutati rispettivamente con la colorazione di Nissl e l'immunofluorescenza per Iba1. I risultati rappresentativi mostrano un'attività locomotoria preservata, un deterioramento delle prestazioni cognitive, una ridotta integrità neuronale ippocampale e un aumento della neuroinfiammazione ippocampale dopo l'intervento chirurgico. Questo modello standardizzato e accessibile fornisce una piattaforma clinicamente rilevante per indagare i meccanismi alla base della disfunzione cognitiva associata alla chirurgia spinale e per valutare potenziali interventi neuroprotettivi perioperatori.
Introduzione
La disfunzione cognitiva postoperatoria (POCD) è definita come un declino nell'apprendimento e nella memoria, nell'attenzione, nella velocità di elaborazione e nelle funzioni esecutive dopo l'anestesia e un intervento chirurgico1, colpendo prevalentemente i pazienti anziani, e la sua incidenza riportata sembra variare in base al contesto chirurgico e alla popolazione di pazienti2,3. È stato riportato che la POCD si verifica frequentemente negli adulti più anziani sottoposti a chirurgia ortopedica elettiva4. Clinicamente, la POCD può persistere per settimane o mesi dopo l'intervento ed è stata associata a un ricovero prolungato e a un aumento della mortalità5,6,7. Con il continuo invecchiamento della popolazione e l'aumento del volume di interventi chirurgici in tutto il mondo, la POCD è diventata una questione importante di sanità pubblica e di assistenza perioperatoria.
Dal punto di vista patofisiologico, il DOCP è considerato un disturbo multifattoriale indotto dal trauma chirurgico e dall'esposizione agli anestetici, con infiammazione neurologica, stress ossidativo, alterazione dell'autofagia e disfunzione sinaptica tra i meccanismi proposti alla base del malfunzionamento neuronale in regioni rilevanti per le funzioni cognitive, come l'ippocampo8. Per analizzare questi meccanismi e valutare possibili interventi, sono stati sviluppati diversi modelli preclinici di DOCP. I modelli preclinici comprendono modelli basati esclusivamente sull'anestesia, modelli basati su interventi chirurgici addominali e modelli di lesione ortopedica, come la frattura della tibia9. Sebbene questi modelli abbiano fatto progredire il campo, potrebbero non riprodurre completamente le caratteristiche perioperatorie rilevanti per gli interventi di chirurgia spinale e alcuni potrebbero introdurre fattori confondenti, come deficit motori prolungati e infiammazione tissutale persistente, che complicano l'interpretazione dei risultati cognitivi e dei meccanismi sottostanti.
Tra le strategie chirurgiche disponibili, abbiamo selezionato un modello di laminectomia lombare a livello L5 per studiare il deficit cognitivo precoce nel periodo postoperatorio in un contesto chirurgico standardizzato e specifico per la colonna vertebrale. Questa procedura provoca un danno chirurgico controllato e localizzato sotto anestesia inalatoria, permettendo di indagare le risposte neuroinfiammatorie postoperatorie e il malfunzionamento cognitivo senza causare un evidente deficit locomotore. Con l’affinamento di passaggi operatori chiave, questo protocollo offre un metodo standardizzato, pratico ed economico per studiare il deficit cognitivo associato agli interventi chirurgici sulla colonna vertebrale e valutare strategie neuroprotettive nel periodo perioperatorio.
Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le indicazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Zhejiang (numero di approvazione etica: ZJU20260153).
1. Preparazione preoperatoria
- Animali sperimentali, assegnazione ai gruppi, analgesia e cecità
- Utilizzare topi maschi C57BL/6J di 18 mesi di età, del peso di 30–34 g. Allevare i topi in un ciclo luce/buio di 12 h con libero accesso a cibo ed acqua.
- Lasciare che i topi si ambientino alle condizioni di allevamento per almeno 7 giorni prima dell'intervento chirurgico. Assegnare casualmente i topi al gruppo laminectomia L5 o al gruppo di controllo dopo l'acclimatazione.
- Assegnare a ciascun topo un numero identificativo codificato prima delle procedure sperimentali. Mantenere il codice di assegnazione ai gruppi in modo che le valutazioni comportamentali possano essere effettuate in cecità rispetto al trattamento.
- Sottoporre i topi del gruppo laminectomia L5 a anestesia con sevoflurano seguita da laminectomia lombare L5. Non esporre i topi del gruppo di controllo all'anestesia con sevoflurano, alla preparazione del sito chirurgico né a interventi chirurgici.
- Somministrare meloxicam per via sottocutanea a 2 mg/kg ai topi di entrambi i gruppi. Somministrare la prima dose dopo l'induzione dell'anestesia nel gruppo laminectomia L5 e nel momento corrispondente alla fine dell'intervento chirurgico nel gruppo di controllo.
- Somministrare dosi successive di meloxicam per via sottocutanea a 2 mg/kg ogni 24 h per 48 h ai topi di entrambi i gruppi. Allevare, manipolare e monitorare entrambi i gruppi nelle stesse condizioni per tutta la durata dell'esperimento.
- Eseguire tutte le valutazioni comportamentali secondo lo stesso programma sperimentale per entrambi i gruppi. Assicurarsi che l'investigatore che effettua le valutazioni comportamentali rimanga in cecità rispetto all'assegnazione ai gruppi.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e disinfettare l'area operatoria. Riscaldare preventivamente un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea durante l'anestesia. Preparare il meloxicam per la somministrazione perioperatoria.
- Accendere la macchina per l'anestesia gassosa e posizionare il topo in una camera di induzione. Indurre l'anestesia generale con sevoflurano al 3–5% per 3–5 minuti, mantenendo una portata di ossigeno di 1 L/min.
- Trasferire il topo anestetizzato sulla piattaforma chirurgica. Mantenere l'anestesia con sevoflurano al 1,5–3% somministrato attraverso una maschera anestetica con una portata di ossigeno di 0,5–0,8 L/min. Somministrare meloxicam per via sottocutanea a 2 mg/kg. La durata totale dell'anestesia, misurata dall'inizio dell'induzione con sevoflurano, è di circa 4 h. Regolare la concentrazione di sevoflurano secondo necessità per mantenere un piano anestetico stabile.
- Posizionare il topo in posizione prona con la colonna lombare rivolta verso l'alto. Fissare delicatamente gli arti anteriori con del nastro adesivo per stabilizzare l'animale e garantire un accesso ininterrotto al campo operatorio L5.
- Verificare una profondità anestetica adeguata controllando l'assenza del riflesso di ritrazione plantare. Applicare un unguento oftalmico per prevenire l'essiccamento della cornea.
- Rimuovere i peli dalla regione lombare mediana (circa L3–S1) utilizzando un rasoio per piccoli animali. Disinfettare la cute esposta con etanolo al 75%, quindi con iodopovidone, ripetendo la procedura 2–3 volte per garantire condizioni asettiche.
2. Chirurgia di laminectomia lombare L5
NOTA: Nel presente protocollo, tutti i passaggi chirurgici sono stati eseguiti mediante visualizzazione diretta, senza l'uso di un microscopio stereoscopico o lenti di ingrandimento.
- Posizionare il topo anestetizzato in posizione prona su un piano chirurgico preriscaldato. Fissare gli arti anteriori con del nastro adesivo per stabilizzare il corpo ed esporre completamente la regione lombare (Figura 1).
- Individuare il livello vertebrale L5 utilizzando i punti di repère superficiali. Palpare le creste iliache bilaterali e tracciare una linea trasversale immaginaria che colleghi i punti più alti.
- Utilizzare la linea trasversale come punto di repère approssimativo per lo spazio intervertebrale L5–L6. Posizionare al centro l'incisione cutanea prevista leggermente in senso craniale rispetto a questa linea, per mirare alla lamina L5.
- Disinfettare la sede chirurgica. Praticare un'incisione cutanea longitudinale mediana di circa 1,5–2,0 cm sopra il livello L5 predeterminato, per esporre la regione da L4 a L6.
- Ritrarre i margini cutanei con pinze sterili. Esporre la fascia dorsale e identificare la rafe fasciale mediana.
- Confermare il livello vertebrale dopo l'esposizione della colonna vertebrale. Individuare il giunto lombosacrale e la vertebra lombare più caudale.
- Identificare L5 come la vertebra immediatamente craniale rispetto a L6, poiché i topi C57BL/6 possiedono tipicamente sei vertebre lombari. Confermare il livello contando due vertebre in senso craniale a partire dal giunto lombosacrale.
- Creare un piccolo foro lungo la rafe fasciale mediana. Ritrarre bilateralmente i muscoli paravertebrali sotto diretta visualizzazione.
- Separare i muscoli adiacenti al processo spinoso di L5 per esporre la lamina sottostante. Estendere l'esposizione in senso craniale fino al processo spinoso di L4 e in senso caudale fino al processo spinoso di L6, finché tutti e tre i processi spinosi risultino chiaramente visibili.
- Eseguire principalmente una dissezione prevalentemente ottusa e adiacente all'osso, utilizzando bastoncini di cotone o pinze fini. Utilizzare la dissezione a taglio solo quando necessario per rilasciare aderenze fasciali e minimizzare il sanguinamento.
- Mantenere la retrazione laterale con bastoncini di cotone per esporre completamente la lamina L5 e lo spazio interlaminares L5–L6. Riconfermare il livello vertebrale prima di procedere.
- Afferrare delicatamente il processo spinoso di L5 con una pinza ed elevare il processo spinoso e la colonna lombare adiacente a un angolo di circa 30° rispetto al piano chirurgico, per allargare lo spazio interlaminares L5–L6.
- Inserire le punte chiuse delle forbici oftalmiche nello spazio interlaminares L5–L6 sotto diretta visualizzazione. Far avanzare le forbici lungo un piano superficiale immediatamente al di sotto del margine caudale della lamina L5.
- Aprire leggermente le forbici per creare l'apertura ossea iniziale. Allargare la finestra di laminectomia rimuovendo piccoli frammenti ossei in modo sequenziale lungo i margini della lamina. Limitare la rimozione ossea alla lamina dorsale di L5 ed evitare di estendere la finestra ossea lateralmente nelle articolazioni facetarie bilaterali.
- Evitare un'inserzione eccessiva in profondità e una forza di taglio eccessiva per prevenire lesioni alla dura madre.
- Continuare a rimuovere la lamina in modo graduale finché la dura madre non risulti chiaramente visibile attraverso la finestra ossea.
- Ispezionare attentamente il campo chirurgico. Confermare l'assenza di sanguinamento attivo e verificare che la dura madre rimanga integra.
- Irrigare la sede chirurgica con soluzione salina sterile tiepida. Ottenere l'emostasi mediante compressione delicata.
- Chiudere la ferita per strati. Chiudere la cute con punti di sutura in nylon 6-0 e disinfettare la sede dell'incisione.
- Dopo la chiusura della ferita, continuare l'anestesia con sevoflurano fino a quando la durata totale dell'anestesia raggiunga circa 4 h. Quindi interrompere la somministrazione di sevoflurano e procedere alle cure postoperatorie.
3. Cura postoperatoria
- Nel momento corrispondente alla fine dell'intervento chirurgico nel gruppo con laminectomia, somministrare meloxicam per via sottocutanea a 2 mg/kg ai topi del gruppo controllo. Posizionare ogni topo nel gruppo con laminectomia su un tappetino riscaldante con temperatura controllata e mantenere la temperatura corporea finché l'animale non riprende conoscenza e non presenta una respirazione spontanea stabile e un'attività motoria regolare.
- Riportare ogni topo del gruppo con laminectomia nella propria gabbia dopo un completo recupero dall'anestesia. Successivamente, monitorare l'animale fino a quando non si osserva una deambulazione normale. Somministrare dosi successive di meloxicam per via sottocutanea a 2 mg/kg ogni 24 ore per un periodo di 48 ore ai topi di entrambi i gruppi.
- Ispezionare quotidianamente l'incisione chirurgica e l'integrità dei punti di sutura fino al terzo giorno postoperatorio. Ri-anestetizzare il topo e sostituire eventuali punti di sutura allentati o rotti, se necessario.
- Esaminare l'incisione giornalmente per verificare la presenza di gonfiore, sanguinamento, secrezioni o segni di infiammazione locale.
- Monitorare il peso corporeo, il comportamento di toeletta, l'attività spontanea e l'assunzione di cibo e acqua per tutta la durata del periodo postoperatorio.
- Eutanasia umana di qualsiasi topo prima del termine sperimentale previsto qualora si verifichi uno dei seguenti criteri prefissati di fine umano: perdita di almeno il 20% del peso corporeo preoperatorio; anoressia completa per 24 ore o assunzione di cibo inferiore al 50% della quantità normale per 3 giorni consecutivi; incapacità o riluttanza evidente a stare in piedi o ad accedere al cibo e all'acqua, persistente per 24 ore dopo il risveglio dall'anestesia; oppure uno stato moribondo caratterizzato da marcata depressione accompagnata da una temperatura corporea inferiore a 37 °C.
4. Valutazione comportamentale del DOCP
- Test del campo aperto (controllo della locomozione; giorno postoperatorio 3)
- Eseguire il test del campo aperto in un'arena di 45 cm × 45 cm con pareti alte 40 cm, sotto un'illuminazione di 20 lux. Posizionare la videocamera direttamente sopra il centro dell'arena in modo che l'intera area di prova sia visibile nel campo visivo.
- Posizionare il topo al centro dell'arena e avviare immediatamente il tracciamento video dopo il posizionamento. Consentire al topo di esplorare liberamente per 5 min. Analizzare l'intera sessione di 5 min e calcolare la distanza totale percorsa e la velocità media del movimento utilizzando il sistema di tracciamento video.
- Analisi della deambulazione
- Eseguire l'analisi della deambulazione al giorno postoperatorio 3 utilizzando un sistema automatizzato di analisi della deambulazione.
- Posizionare ogni topo a un'estremità del percorso e consentirgli di attraversarlo liberamente. Registrare le impronte delle zampe durante la locomozione utilizzando la videocamera ad alta velocità integrata nel sistema di analisi della deambulazione.
- Registrare le prove di deambulazione per ogni topo e raccogliere tre percorsi validi con movimento continuo in avanti lungo il percorso per l'analisi successiva.
- Analizzare i dati delle impronte registrate utilizzando il software di analisi della deambulazione. Verificare le impronte identificate automaticamente e correggere manualmente la classificazione della zampa anteriore destra, zampa anteriore sinistra, zampa posteriore destra e zampa posteriore sinistra quando necessario, prima di estrarre i parametri della deambulazione.
- Quantificare la lunghezza del passo, il tempo di appoggio, la velocità della fase di oscillazione e l'area dell'impronta, e calcolare il valore medio ottenuto dai tre percorsi validi per ogni topo ai fini dell'analisi statistica.
- Maze di Barnes (apprendimento e memoria spaziale; giorni postoperatori 4–6)
NOTA: Eseguire il test del maze di Barnes una volta al giorno per tre giorni consecutivi a partire dal giorno postoperatorio 4. Condurre i test nella stessa finestra oraria giornaliera per minimizzare le variazioni circadiane.- Posizionare la scatola di fuga sotto il foro bersaglio designato. Mantenere la stessa posizione bersaglio per tutta la durata dell'esperimento.
- Posizionare il topo al centro del maze per iniziare ogni prova. Consentire al topo di cercare la scatola di fuga per un massimo di 3 min. Terminare la prova quando il topo entra nella scatola di fuga.
- Guidare delicatamente il topo verso il foro bersaglio se non riesce a individuare la scatola di fuga entro 3 min. Consentire al topo di rimanere brevemente nella scatola di fuga per rinforzare l'apprendimento del compito.
- Registrare la latenza di fuga e la distanza percorsa utilizzando il sistema di tracciamento video. Per le prove in cui il topo non entra nella scatola di fuga entro 3 min, assegnare una latenza di fuga di 180 s. Includere nell'analisi statistica solo la latenza di fuga e la distanza percorsa registrate durante la sessione finale del giorno 3.
- Riconoscimento di un oggetto nuovo (memoria di riconoscimento; giorni postoperatori 3–4)
NOTA: Utilizzare la stessa arena e lo stesso sistema di tracciamento video descritti per il test del campo aperto. Utilizzare la sessione del campo aperto del giorno postoperatorio 3 per abituare i topi all'arena di prova prima dell'addestramento al riconoscimento di un oggetto nuovo.- Posizionare due oggetti cilindrici identici in posizioni simmetriche all'interno dell'arena durante la sessione di addestramento. Consentire al topo di esplorare liberamente per 5 min.
- Dopo un intervallo di ritenzione di 1 h, sostituire uno dei due oggetti cilindrici familiari con un nuovo oggetto di forma cubica. Bilanciare la posizione dell'oggetto nuovo tra i diversi topi per minimizzare eventuali preferenze laterali. Consentire al topo di esplorare per 5 min.
- Registrare il tempo di esplorazione dedicato all'oggetto familiare e a quello nuovo utilizzando il sistema di tracciamento video. Includere nell'analisi solo i topi con un tempo totale di esplorazione degli oggetti di almeno 3 s.
- Calcolare l'indice di preferenza (PI) come:
Definire Tnuovo e Tfamiliare come i tempi trascorsi a esplorare l'oggetto nuovo e quello familiare, rispettivamente, durante la sessione di prova.
- Y-maze con braccio nuovo (memoria di riconoscimento spaziale; giorno postoperatorio 5)
- Eseguire il test in un maze a forma di Y composto da tre bracci identici separati da 120°. Bloccare casualmente uno dei bracci con una porta opaca e designarlo come braccio nuovo.
- Selezionare casualmente uno dei due bracci aperti come braccio di partenza. Designare l'altro braccio aperto come braccio familiare. Posizionare il topo all'estremità del braccio di partenza e consentirgli di esplorare liberamente i due bracci accessibili per 5 min.
- Dopo un intervallo interprova di 1 h, rimuovere la porta opaca e riportare il topo all'estremità dello stesso braccio di partenza.
- Consentire al topo di esplorare liberamente tutti e tre i bracci per 5 min.
- Definire un ingresso in un braccio come l'ingresso del centro del corpo tracciato in una zona predefinita del braccio proveniente dalla zona centrale. Registrare il numero di ingressi e il tempo trascorso in ciascun braccio utilizzando il sistema di tracciamento video.
- Calcolare l'indice di preferenza basato sul tempo per il braccio nuovo come:
Definire Tnuovo, Tpartenza e Tfamiliare come i tempi trascorsi nei bracci nuovo, di partenza e familiare, rispettivamente. - Calcolare l'indice di preferenza basato sugli ingressi come:
Definire Enuovo come il numero di ingressi nel braccio nuovo ed Etotale come il numero totale di ingressi nei tre bracci durante la prova.
5. Elaborazione dei tessuti, colorazione con Nissl e colorazione per immunofluorescenza
- Elaborazione del tessuto
- All'endpoint sperimentale prestabilito, anestetizzare profondamente il topo con sevoflurano al 3% somministrato a un flusso di ossigeno di 2 L/min.
- Verificare la profondità adeguata dell'anestesia attraverso l'assenza del riflesso di ritrazione plantare. Mantenendo un'anestesia profonda e prima dell'arresto cardiaco, eseguire una perfusione transcardiaca con 20 mL di soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) per rimuovere il sangue intravascolare.
- Perfondere immediatamente il topo con 20 mL di paraformaldeide al 4% (PFA).
- Dissezionare l'intero cervello con attenzione. Immergere il cervello in PFA al 4% per 24 h a 4 °C per la postfissazione.
- Trasferire il cervello in soluzione al 30% di saccarosio fino a quando il tessuto affonda completamente.
- Incorporare il cervello in composto per ottimizzazione del taglio criostatico (OCT).
- Congelare rapidamente il tessuto incorporato e conservarlo a −80 °C fino alla criosezionatura.
- Colorazione di Nissl
- Portare sezioni criostatiche da 16 µm a temperatura ambiente. Lasciare asciugare le vetrini all'aria per 20 min.
- Risciacquare i vetrini con PBS per 2 min.
NOTA: Assicurarsi che le sezioni di tessuto rimangano saldamente attaccate ai vetrini prima della colorazione. - Coprire completamente le sezioni con soluzione colorante al blu di toluidina. Incubare per 30 min a 55 °C.
NOTA: Ottimizzare empiricamente il tempo di colorazione per sezioni da 16 µm per evitare un'eccessiva colorazione. - Risciacquare brevemente i vetrini con acqua distillata per 10–30 s.
- Differenziare le sezioni in etanolo al 95%, 85% e 75% in sequenza, per 2 min ciascuno.
NOTA: Regolare il tempo di differenziazione se necessario per ottimizzare l'intensità della colorazione. - Deparaffinizzare i vetrini due volte con xilene fresco per 5 min ciascuno.
NOTA: Eseguire tutti i passaggi con xilene all'interno di una cappa chimica. - Montare le sezioni con balsamo neutro. Posizionare delicatamente un coprioggetti su ciascuna sezione.
- Acquisire immagini delle sezioni colorate mediante microscopio ottico con obiettivo 20×. Identificare la regione CA1 in base al suo caratteristico strato compatto di cellule piramidali nella sezione coronale dell'ippocampo. Per ogni topo, analizzare una sezione coronale e acquisire due campi non sovrapposti dalla regione CA1 di ciascun emisfero ippocampale.
- Contare manualmente i neuroni Nissl-positivi morfologicamente integri e i corpi di Nissl utilizzando il plugin di conteggio cellulare nel software di analisi delle immagini. Identificare i neuroni integri per mezzo di un soma intatto, un nucleo rotondo con nucleolo visibile e abbondante sostanza di Nissl nel citoplasma; identificare i corpi di Nissl come strutture granulari o aggregate intensamente basofile all'interno del citoplasma neuronale.
- Fare la media dei valori ottenuti da tutti i campi analizzati per ottenere un singolo valore per animale. Assicurarsi che l'osservatore che effettua i conteggi rimanga cieco rispetto all'assegnazione al gruppo.
- Colorazione di immunofluorescenza per Iba1
- Lasciare che le sezioni cerebrali raggiungano la temperatura ambiente prima della colorazione.
- Immergere i vetrini in soluzione di recupero dell'antigene a base di citrato di sodio ed eseguire il recupero dell'antigene in un bagno termostatico a 80 °C per 25 min. Dopo il recupero dell'antigene, lasciare raffreddare naturalmente i vetrini e la soluzione a temperatura ambiente.
- Lavare le sezioni tre volte con soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) per 3 min ciascuna.
- Permeabilizzare le sezioni con Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 30 min a temperatura ambiente, seguito da tre lavaggi con PBS per 3 min ciascuno.
- Bloccare il legame non specifico incubando le sezioni con albumina sierica bovina (BSA) al 3% in PBS per 1 h a temperatura ambiente in una camera umidificata.
- Lavare le sezioni tre volte con PBS per 3 min ciascuna.
- Diluire l'anticorpo primario contro la molecola adattatrice legante il calcio ionizzato 1 (Iba1; 1:100) nella soluzione di blocco (BSA al 3% in PBS) e incubare le sezioni con l'anticorpo primario diluito per tutta la notte a 4 °C in una camera umidificata.
- Lavare le sezioni tre volte con PBS per 3 min ciascuna.
- Incubare le sezioni con IgG da capra anti-coniglio coniugata con fluorocromo 488 (H+L) (1:1000) per 90 min a temperatura ambiente al buio.
- Lavare le sezioni tre volte con PBS per 3 min ciascuna al buio.
- Controcolorare i nuclei con DAPI (1:8000) per 5 min al buio.
- Lavare le sezioni tre volte con PBS per 3 min ciascuna al buio.
- Montare le sezioni con mezzo di montaggio antifade, applicare i coprioggetti e proteggere le sezioni dalla luce fino all'acquisizione delle immagini.
- Acquisire immagini di fluorescenza della regione CA1 dell'ippocampo mediante microscopio confocale con obiettivo 20×. Utilizzare impostazioni di acquisizione identiche per tutte le sezioni incluse nei confronti quantitativi. Per ogni topo, analizzare una sezione coronale e acquisire due campi non sovrapposti dalla regione CA1 di ciascun emisfero ippocampale.
- Quantificare l'intensità media di fluorescenza di Iba1 nella regione CA1 dell'ippocampo utilizzando impostazioni di soglia identiche per tutte le immagini. Fare la media dei valori ottenuti da tutti i campi per ottenere un singolo valore per animale.
6. Analisi statistica
- Eseguire tutte le analisi statistiche utilizzando un software di analisi statistica. Presentare i dati come media ± deviazione standard (SD).
- Valutare la normalità dei dati mediante il test di Shapiro–Wilk. Valutare l'uguaglianza delle varianze mediante il test F.
- Confrontare i gruppi di controllo e quelli sottoposti a laminectomia L5 utilizzando un test t di Student a due code non appaiato quando l'assunzione di omoscedasticità è soddisfatta. Utilizzare il test t di Welch quando l'assunzione di omoscedasticità non è soddisfatta.
- Definire n come il numero di animali inclusi in ciascuna analisi. Considerare un valore di P < 0,05 statisticamente significativo.
Risultati
Tutti i topi sono sopravvissuti fino al termine sperimentale programmato, nessuno ha raggiunto i criteri predeterminati per il termine umano, e tutti sono stati inclusi nelle analisi finali. La funzione motoria è stata valutata al terzo giorno postoperatorio mediante analisi del campo aperto e della deambulazione. Né la distanza totale percorsa né la velocità media nel test del campo aperto differivano tra i gruppi, indicando un'attività locomotoria spontanea comparabile (Figura 2A). Anche l'analisi della deambulazione non ha mostrato differenze significative tra i gruppi nella lunghezza del passo, nel tempo di appoggio, nella velocità della falcata o nell'area di impronta (Figura 2B). Nel complesso, questi risultati indicano che la laminectomia L5 non ha prodotto un deficit motorio evidente sufficiente a spiegare le successive differenze nelle prestazioni cognitivo-comportamentali.
Le prestazioni cognitive sono state valutate mediante il test di riconoscimento dell'oggetto nuovo (NOR), il labirinto a forma di Y con braccio nuovo e il labirinto di Barnes. Nel test NOR, il gruppo sottoposto a laminectomia L5 ha mostrato un indice di preferenza per l'oggetto nuovo (PI) significativamente inferiore rispetto al gruppo di controllo (Figura 3A). Nel labirinto a forma di Y con braccio nuovo, il gruppo sottoposto a laminectomia L5 ha mostrato valori di PI significativamente più bassi sia per il tempo trascorso che per gli ingressi nel braccio nuovo (Figura 3B). Nel labirinto di Barnes, il gruppo sottoposto a laminectomia L5 ha mostrato una maggiore latenza di fuga e una distanza percorsa più lunga nel giorno 3 del test (Figura 3C). Nel complesso, questi risultati comportamentali indicano un deterioramento delle prestazioni cognitive postoperatorie a seguito della laminectomia L5.
Nella regione ippocampale CA1, il gruppo sottoposto a laminectomia L5 ha mostrato un numero significativamente inferiore di neuroni positivi alla Nissl e un numero significativamente minore di corpi di Nissl rispetto al gruppo di controllo, indicando un danno strutturale neuronale (Figura 4A, B). Inoltre, l'intensità media della fluorescenza di Iba1 è risultata significativamente aumentata nel gruppo sottoposto a laminectomia L5, in accordo con un aumento dell'attivazione microgliale (Figura 4C, D).
Figura 1: Procedura di laminectomia lombare a livello L5 per la modellizzazione della disfunzione cognitiva postoperatoria (POCD) nei topi. (A) Illustrazione della sede chirurgica a livello della lamina lombare L5 e dell’area di esposizione che comprende i livelli vertebrali adiacenti (L4–L6). (B) Immagini intraoperatorie che illustrano le fasi principali della procedura di laminectomia lombare a livello L5. (a) Regione lombare dopo la rasatura, con identificazione della linea mediana spinale; le frecce indicano la direzione dell’incisione cutanea pianificata. (b) Incisione cutanea mediana sulla colonna lombare. (c) Incisione della fascia con separazione progressiva dei muscoli paravertebrali per esporre i processi spinosi ed eliminare ulteriormente i tessuti intorno al processo spinoso e alla lamina L5, al fine di esporre completamente la lamina L5. (d) Laminectomia L5 dopo l’asportazione della lamina L5. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Valutazione dell'attività locomotoria e della deambulazione dopo laminectomia lombare a livello L5. (A) Test del campo aperto che mostra la distanza totale percorsa e la velocità media (n = 10). (B) Analisi della deambulazione che mostra la lunghezza del passo, il tempo di appoggio, la velocità della fase oscillante e l'area di impronta (n = 6). I dati rappresentano la media ± DS. La significatività statistica è indicata come ns, non significativa. Abbreviazioni: Control = gruppo di controllo; Laminectomy = gruppo con laminectomia L5. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Valutazioni comportamentali cognitive dopo laminectomia lombare L5. (A) Test di riconoscimento di un oggetto nuovo (n = 10). (B) Test del labirinto a Y con braccio nuovo (n = 10). (C) Test del labirinto di Barnes (n = 10). I dati rappresentano la media ± DS. La significatività statistica è indicata come *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001. Abbreviazioni: Controllo = gruppo di controllo; Laminectomia = gruppo sottoposto a laminectomia L5. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione istologica della regione CA1 dell'ippocampo dopo laminectomia lombare L5. (A) Immagini rappresentative della colorazione di Nissl nella regione CA1 dell'ippocampo. (B) Quantificazione dei neuroni positivi per Nissl (a sinistra) e dei corpi di Nissl (a destra) (n = 5). (C) Immagini rappresentative dell'immunofluorescenza per Iba1 nella regione CA1 dell'ippocampo. Scala = 100 µm. (D) Quantificazione dell'intensità media di fluorescenza di Iba1 (n = 6). I dati sono espressi come media ± DS. La significatività statistica è indicata come **P < 0,01 e ***P < 0,001. Abbreviazioni: Controllo = gruppo controllo; Laminectomia = gruppo sottoposto a laminectomia L5. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussione
È stato riportato un deficit cognitivo postoperatorio negli adulti anziani sottoposti a chirurgia spinale10. Evidenze sperimentali indicano inoltre che l'invecchiamento aumenta la suscettibilità al deterioramento cognitivo associato all'intervento chirurgico e alle risposte neuroinfiammatorie11,12. Il presente protocollo combina circa 4 h di anestesia con sevoflurano e una laminectomia a livello L5 in topi anziani per modellare il deficit cognitivo precoce postoperatorio. Il suo principale valore metodologico consiste nel fornire una procedura pratica e accessibile per lo studio dei cambiamenti comportamentali e delle alterazioni istologiche ippocampali successivi a un intervento chirurgico spinale.
I modelli preclinici di DCP comprendono esposizione esclusivamente all'anestesia, interventi chirurgici addominali e paradigmi di lesione ortopedica13. I paradigmi con sola anestesia permettono di valutare gli effetti degli anestetici in assenza di trauma chirurgico14, ma non riproducono l'esposizione combinata ad anestesia e danno tissutale. I modelli di chirurgia addominale e di frattura tibiale includono lesioni chirurgiche e sono stati utilizzati per studiare il deterioramento cognitivo associato all'intervento chirurgico15,16. Tuttavia, le sedi operatorie e i modelli di lesione tissutale differiscono da quelli delle procedure spinali. Poiché il tipo e l'intensità del trauma chirurgico possono influenzare gli esiti cognitivi postoperatori e le risposte infiammatorie centrali9, il contesto chirurgico deve essere preso in considerazione nella scelta di un modello preclinico. Il presente protocollo di laminectomia a livello L5, pertanto, fornisce un paradigma sperimentale correlato alla chirurgia spinale per esaminare il deterioramento cognitivo precoce nei topi anziani.
La sfida tecnica principale di questo protocollo consiste nel rimuovere una quantità sufficiente di osso dalla lamina L5 per esporre chiaramente la dura, evitando al contempo lesioni alla dura stessa. Durante una laminectomia effettuata sotto visione diretta, è necessario un controllo accurato della profondità dello strumento, della forza di taglio e dell'angolo di inserzione delle forbici oftalmiche. L'osso deve essere rimosso in modo graduale, mediante piccoli tagli controllati lungo i margini della lamina. Afferrare il processo spinoso L5 con una pinza ed elevare il segmento lombare operatorio a un angolo di circa 30° rispetto alla piattaforma chirurgica permette di allargare lo spazio interlaminares L5–L6. Questa manovra consente un'inserzione poco profonda delle punte delle forbici al di sotto del margine osseo e riduce il rischio di contatto con la dura. Una rimozione incompleta dell'osso può limitare l'esposizione chirurgica, mentre un taglio troppo aggressivo o una profondità eccessiva di inserzione possono causare lesioni alla dura. Un sanguinamento incontrollato può ostacolare il campo operatorio, compromettere il recupero postoperatorio e aumentare la variabilità nei risultati comportamentali. Quando lo spazio interlaminares non è sufficiente per un'inserzione sicura delle punte delle forbici, si deve riassestare la posizione e l'angolo di elevazione del segmento lombare operatorio, piuttosto che aumentare la profondità di inserzione. Se il sanguinamento ostacola il campo operatorio, la rimozione dell'osso deve essere sospesa fino al ripristino di un'adeguata visualizzazione, dopodiché qualsiasi osso residuo deve essere rimosso in modo incrementale.
La separazione dei muscoli paravertebrali e la laminectomia a livello L5 possono contribuire a un dolore postoperatorio transitorio, ed è stata documentata un'ipersensibilità meccanica dopo laminectomia sperimentale nei topi17. Il meloxicam è stato somministrato secondo un regime analgesico predeterminato. È stato riportato che le espressioni facciali correlate al dolore postoperatorio nei topi persistano per circa 36–48 h18. Il regime analgesico della durata di 48 h aveva lo scopo di coprire questo periodo postoperatorio iniziale, e la valutazione cognitivo-comportamentale è stata avviata al terzo giorno postoperatorio, al termine del regime analgesico, per ridurre l'eventuale influenza del dolore immediatamente postoperatorio. Il test del campo aperto è stato utilizzato negli studi sperimentali di DOCP per valutare l'attività locomotoria spontanea e per determinare se una ridotta locomozione possa alterare le prestazioni cognitivo-comportamentali19,20. Di conseguenza, il test del campo aperto e l'analisi della deambulazione sono stati eseguiti al terzo giorno postoperatorio, prima della valutazione cognitiva. Non sono state osservate differenze significative tra i gruppi nell'attività locomotoria nel campo aperto né nei parametri della deambulazione, suggerendo che le successive differenze cognitivo-comportamentali difficilmente potessero essere spiegate principalmente da un evidente deficit motorio. Tuttavia, poiché il dolore spontaneo postoperatorio e il disagio della ferita non sono stati valutati direttamente, non si può escludere del tutto l'effetto residuo di tali fattori sulle prestazioni comportamentali. Studi futuri potrebbero includere valutazioni dirette del dolore spontaneo postoperatorio.
Nel complesso, questo protocollo fornisce un approccio sperimentale pratico per studiare il deterioramento cognitivo precoce nei topi anziani dopo una laminectomia al livello L5. Può essere utilizzato per indagare gli esiti comportamentali e i meccanismi sottostanti al deterioramento cognitivo associato all'intervento chirurgico sulla colonna vertebrale, nonché per valutare interventi volti a prevenire o ridurre il deterioramento cognitivo postoperatorio. Una validazione su coorti più ampie e in laboratori indipendenti contribuirebbe ulteriormente a stabilire la stabilità e la riproducibilità del modello.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Sanhua Fang della piattaforma delle strutture centrali della Scuola di Medicina dell'Università di Zhejiang, Yanhong Chen e Xuliang Zhang del centro animali dell'Università di Zhejiang per il supporto tecnico. Questo studio è stato finanziato dai seguenti fondi: Fondazione Nazionale delle Scienze Naturali della Cina (n. 82575196, 82074535 e U23A20508).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Topi maschi C57BL/6J | Suzhou Industrial Park Ai'er Maite Technology Co., Ltd. | SYXK2023-0005 | Modello animale |
| Software di tracciamento video ANY-maze | Stoelting Co., USA | 6000 | Tracciamento e analisi video del comportamento |
| Unguento oftalmico di eritromicina | Beijing Twinluck Pharmaceutical Co,. Ltd. | H11021270 | Prevenire la secchezza oculare |
| Pinzette fini | NA | NA | Tagliare la pelle |
| Pad riscaldante | NA | NA | Controllo termico |
| Anticorpo monoclonale coniglio anti-Iba1/AIF-1 (E4O4W) | Cell Signaling Technology | 17198 | Colorazione immunofluorescente per Iba1 |
| Apparecchiatura per anestesia inalatoria | RWD Life Science Co., Ltd. | R581S | Anestesia |
| MGT-PR | Anhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., China | MJY2025112704 | Analisi della deambulazione |
| Forbici microchirurgiche oftalmiche | NA | NA | Rimozione dell'osso |
| Soluzione per colorazione di Nissl | Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK2033 | Colorazione di Nissl |
| Forbici | Shang Shou Jin Zhong Surgical Instruments Jiangsu ITD.,Corp | Y00030 | Incisione cutanea |
| Sevoflurano | Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co,. Ltd. | 25062331 | Anestesia |
| Telo chirurgico monouso | Jiangxi Zhizheng Medical Equipment Co., Ltd. | 20212140221 | Piattaforma per intervento chirurgico |
| Tagliacapelli per piccoli animali | Yiwu Leiben Trading Co., Ltd. | 2504KFZB3592-03310 | Rimozione dei peli |
| Aghi chirurgici con filo per sutura | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LTD. | F603 | Sutura della pelle |
| Crema depilatoria Veet | RECKITT BENCKISER (India) Ltd | NA | Rimozione dei peli |
Riferimenti
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