Questo protocollo integra dataset trascrivomici pubblici e la validazione delle cellule epiteliali del colon per identificare S100P come biomarcatore condiviso associato a malattie infiammatorie intestinali, cancro colorettale e adenocarcinoma pancreatico.
Articolo di ricerca
S100P come biomarcatore condiviso nelle malattie infiammatorie intestinali, nel cancro colorettale e nell'adenocarcinoma pancreatico: un'analisi trascritomica integrata
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è associata a un aumento del rischio di cancro colorettale (CRC) e adenocarcinoma pancreatico (PAAD), tuttavia le caratteristiche molecolari condivise tra queste malattie rimangono incompletamente. Questo studio mirava a identificare geni comuni e vie biologiche associate a IBD, CRC e PAAD attraverso analisi trascrivomica integrata e validazione sperimentale. I dataset di espressione genica per IBD, CRC e PAAD sono stati ottenuti dai database The Cancer Genome Atlas e Gene Expression Omnibus. Sono state effettuate analisi della rete di coespressione genica ponderata e analisi di espressione differenziale per identificare geni associati alla malattia e condivisi. Gene Ontology e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (analisi sono state utilizzate per esplorare funzioni e vie biologiche arricchite. L'infiltrazione delle cellule immunitarie è stata valutata utilizzando l'identificazione del tipo cellulare tramite la stima dei sottoinsiemi relativi dei trascrizioni di RNA. È stata effettuata un'analisi delle caratteristiche operative del ricevitore per valutare la performance diagnostica dei geni comuni. È stata condotta un'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula per esaminare la distribuzione cellulare di S100P. Inoltre, gli effetti della riduzione della S100P sono stati valutati nelle cellule epiteliali coloniche stimolate da lipopolisaccaridi (LPS). Sono stati identificati in totale 162 geni associati alla malattia e quattro geni comuni. Le analisi di arricchimento funzionale hanno indicato un arricchimento significativo delle vie immunitarie e infiammatorie, inclusa la via di segnalazione dell'interleucina-17. L'analisi dell'infiltrazione immunitaria ha rivelato tendenze simili in diverse popolazioni di cellule immunitarie tra IBD, CRC e PAAD. L'analisi a singola cellula ha mostrato un'espressione elevata di S100P nelle cellule epiteliali di tutte e tre le malattie. La regolazione alla ribassa di S100P ha ripristinato la capacità proliferativa delle cellule epiteliali coloniche stimolate da LPS e ha ridotto l'espressione delle citochine infiammatorie. L'analisi trascrivomica integrata ha identificato S100P come biomarcatore associato a IBD, CRC e PAAD e ha evidenziato caratteristiche immunitarie condivise in queste malattie.
Introduzione
La malattia infiammatoria intestinale (IBD) rappresenta uno spettro di disturbi immunologici che colpiscono il tratto gastrointestinale, tra cui la colite ulcerosa e il morbo diCrohn 1. L'eziologia della IBD è altamente complessa, coinvolgendo anomalie immunitarie mucose, disbiosi e suscettibilitàgenetica 2. La MIB è una preoccupazione sanitaria globale con tassi di incidenza in aumento e notevoli oneri economici, e la sua crescente prevalenza ha attirato notevoleattenzione 1. È importante sottolineare che i pazienti con IBD hanno un rischio significativamente aumentato di sviluppare il cancro colorettale (CRC)3 e l'adenocarcinoma pancreatico (PAAD)4. Sebbene questa associazione sia stata ben documentata, il dialogo genetico tra IBD, CRC e PAAD rimane incompletamente compreso.
Studi precedenti suggeriscono fortemente che IBD, CRC e PAAD condividano processi patogeni comuni; tuttavia, mancano biomarcatori diagnostici specifici e sensibili e i meccanismi patogeni condivisi non sono stati completamente chiariti. Fortunatamente, con il rapido progresso e la diffusione delle tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, numerosi dataset trascrittomici di pazienti con IBD, CRC e PAAD sono diventati pubblici, permettendo un'indagine sistematica delle interconnessioni molecolari tra questemalattie 2,5,6.
Questo studio ha utilizzato dati di sequenziamento ad alto rendimento di pazienti con IBD, CRC e PAAD per identificare geni associati alla malattia e condivisi utilizzando l'analisi della rete di coespressione genica ponderata (WGCNA) e l'analisi differenziale dell'espressione. Questi geni sono stati ulteriormente studiati per identificare potenziali vie di segnalazione condivisa tra IBD, CRC e PAAD. Inoltre, abbiamo valutato il valore diagnostico di questi geni comuni. L'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha dimostrato che il gene chiave S100P era prevalentemente espresso nelle cellule epiteliali. Infine, abbiamo indagato il ruolo biologico di S100P nella MII.
In conclusione, questo studio mirava a identificare biomarcatori diagnostici comuni e vie biologiche associate a IBD, CRC e PAAD, fornendo così preziose informazioni cliniche sulla prevenzione e il trattamento condivisi di queste malattie.
Protocollo
Questo studio ha utilizzato dataset pubblici e de-identificati dal Cancer Genome Atlas (TCGA) e dal Gene Expression Omnibus (GEO), oltre a linee cellulari commerciali consolidate. Non sono stati coinvolti partecipanti umani appena reclutati, né informazioni identificabili dei pazienti né campioni derivati dal paziente. Tutte le analisi sono state effettuate in conformità con le linee guida istituzionali pertinenti e i termini di utilizzo dei database pubblici. Pertanto, non era necessaria un'ulteriore approvazione etica istituzionale e un consenso informato per questo studio.
Fonte dei dati
I dati RNA-seq per le coorti IBD (GSE179285; piattaforma: GPL6480 e GSE24287; piattaforma: GPL6480), coorti CRC (TCGA-CRC; piattaforma: Illumina HiSeq 2000 e GSE87211; piattaforma: GPL13497) e coorti PAAD (GSE128735; piattaforma: GPL20301 e GSE62452; piattaforma: GPL6244) sono stati scaricati da TCGA e GEO. Tutti i dataset sono stati consultati il 5 dicembre 2025.
Per ogni dataset, i campioni sono stati rigidamente suddivisi in due sottogruppi, con i tessuti lesionistici/tumorali della malattia che fungevano da gruppo di caso e i tessuti normali non lesionistici corrispondenti come gruppo di controllo. In particolare, la coorte IBD conteneva 297 campioni di mucosa intestinale da pazienti con IBD e 56 campioni di mucosa intestinale normale da individui sani; la coorte CRC includeva 841 tessuti tumorali colorettali primari e 211 tessuti epiteliali colorettali normali adiacenti corrispondenti; e la coorte PAAD era composta da 114 tessuti tumorali PAAD e 106 tessuti parenchimali pancreatici normali.
Tutti i dataset all'interno della stessa categoria di malattia sono stati integrati in modo uniforme. La funzione normalizeBetweenArrays del pacchetto limma è stata applicata per eseguire la normalizzazione di quantili cross-campion, eliminando di fatto gli effetti batch interpiattaforme e standardizzando i valori di espressione genica tra diversi dataset per analisi differenziali successive.
Screening dei geni correlati a IBD, CRC e PAAD e dei geni comuni
Per prima cosa, i geni differenzialmente espressi (DEG) sono stati selezionati dalle coorti IBD, CRC e PAAD utilizzando il pacchetto limma, e i valori originali di P sono stati corretti con il metodo del tasso di falsa scoperta (FDR) di Benjamini-Hochberg. Nelle coorti IBD, CRC e PAAD, i criteri di screening sono stati stabiliti a |logFC| > 0,4 e P < 0,05. Inoltre, WGCNA è stato eseguito su tutti i geni, con una soglia minima di 100 (potenza soft-threshold = 0,90; tipo di rete = firmato). Di conseguenza, sono stati identificati DEG comuni e geni moduli tra le tre coorti. I geni identificati in modo coerente con entrambi i metodi sono stati definiti come geni comuni, mentre i geni restanti sono stati categorizzati come geni correlati.
PPI e analisi dell'arricchimento funzionale
Queste analisi sono state effettuate sui geni associati alla malattia. L'analisi dell'interazione proteina-proteina (PPI) è stata condotta utilizzando il database STRING (punteggio di interazione > 0,40). L'analisi di arricchimento funzionale includeva analisi Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), condotte utilizzando clusterProfiler, enrichplot e org. Hs.eg.db pacchetti (P < 0,05 e valore q corretto FDR [metodo Benjamini–Hochberg] < 0,05).
Profilazione del microambiente immunitario
CIBERSORT è un algoritmo affidabile per stimare i livelli di infiltrazione delle cellule immunitarie a partire dai dati di espressione genica utilizzando la matrice di firma implicita diLM22 7. In questo studio, l'algoritmo CIBERSORT è stato utilizzato per stimare l'entità dell'infiltrazione delle cellule immunitarie nei campioni delle coorti IBD, CRC e PAAD, al fine di esplorare le caratteristiche condivise del microambiente immunitario tra le tre malattie. L'analisi è stata eseguita con 1.000 permutazioni per calcolare i valori P per ogni campione, e la normalizzazione quantile (QN = TRUE) è stata applicata al file di espressione della miscela. Solo i campioni con valore CIBERSORT P < 0,05 sono stati mantenuti per le analisi successive, garantendo l'affidabilità dei risultati della deconvoluzione.
Valutazione del valore diagnostico dei geni comuni
Il valore diagnostico dei geni comuni nelle coorti IBD, CRC e PAAD è stato valutato utilizzando l'analisi delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) con il pacchetto pROC in R. Il compromesso ottimale tra sensibilità e specificità è stato visualizzato utilizzando curve ROC.
qRT-PCR, trasfezione cellulare e saggio sulla formazione della colonia
qRT-PCR e trasfezione cellulare sono state condotte secondo studiprecedenti 8,9,10. La trasfezione transitoria è stata eseguita utilizzando il reagente di trasfezione jetPRIME (Polyplus, Cina) secondo le istruzioni del produttore. Le cellule venivano incubate con la miscela di trasfezione per 6 ore, dopo di che il mezzo veniva sostituito con il DMEM completo. Esperimenti successivi furono eseguiti 48 ore dopo la trasfezione.
Brevemente, l'RNA cellulare totale è stato estratto utilizzando il reagente TRIzol. L'RNA veniva trascritto inversamente in cDNA utilizzando PrimeScript RT Master Mix. La PCR quantitativa è stata eseguita utilizzando la qPCR TB Green. β-actin veniva utilizzata come gene di riferimento interno per la normalizzazione dell'espressione. Sono stati condotti esperimenti biologici in triplice. Le sequenze di primer e la sequenza siS100P si trovano in uno studio precedente 11.
Le celle NCM460, FHC, HCT116, SW116, PANC1 e BXPC2 sono state ottenute come elencato nella Tabella dei Materiali. Tutte le linee cellulari sono state sottoposte a identificazione cellulare e test a micoplasmi.
Durante gli esperimenti, tutte le cellule sono state spedite per 3–5 generazioni. Tutte le cellule sono state coltivate in DMEM completo contenente il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina–estreptomicina.
Il saggio di formazione della colonia è stato eseguito come descritto in uno studio precedente12. Per un breve periodo, 1.000 cellule furono seminate in ciascun pozzo di una lastra a 6 pozzi e coltivate per 10 giorni prima che l'esperimento venisse terminato. Le cellule sono state fissate con il 4% di paraformaldeide, colorate con lo 0,1% di viola cristallina e le colonie sono state conteggiate usando ImageJ.
Analisi dei geni comuni basata sui dati scRNA-seq
I dati scRNA-seq provenienti dal dataset IBD (GSE214695), dal dataset CRC (GSE166555) e dal dataset PAAD (GSE154778) sono stati preprocessati come descritto negli studiprecedenti 8,13. Le matrici di conteggio grezzo venivano collassate tramite l'espressione media per simboli genici duplicati usando limma::avereps. Il filtraggio iniziale ha mantenuto i geni rilevati in almeno tre cellule e in cellule contenenti almeno 50 trascrizioni uniche. Le cellule con una frazione di trascrizione mitocondriale >5% o meno di 50 geni rilevati sono state rimaste. La normalizzazione logaritmica è stata eseguita con un fattore di scala di 10.000, seguita da una trasformazione stabilizzante della varianza per identificare i 1.500 geni più variabili, che sono stati standardizzati secondo lo Z-score prima dell'analisi dei componenti principali (PCA). I geni marker che definiscono il cluster sono stati filtrati usandologarittimate 2 (variazione di fold) > 0,5, una frazione di rilevamento ≥0,25 nei cluster target e un valore P aggiustato <0,05.
In breve, la preelaborazione dei dati veniva effettuata utilizzando il pacchetto Seurat, e l'annotazione dei tipi di celle veniva eseguita con il pacchetto SingleR (versione 2.6.0). Il clustering delle celle è stato eseguito in Seurat utilizzando la costruzione di grafi k-vicini più prossimi e l'incorporamento t-SNE basato sulle dimensioni PCA 1–20. Sono stati quindi esaminati i livelli di distribuzione ed espressione dei geni comuni tra i diversi tipi cellulari.
Costruzione del modello IBD
Secondo studiprecedenti, 14, lipopolisaccaridi (LPS) sono stati utilizzati per indurre infiammazione nelle cellule epiteliali coloniche umane normali (FHC e NCM460), generando così un modello IBD che imita l'infiammazione. Sono stati condotti esperimenti biologici in triplice. Le cellule venivano coltivate di routine in un incubatore umidificato a 37°C con il 5% diCO2. Quando la confluenza cellulare ha raggiunto circa il 50%–70%, il mezzo di coltura è stato sostituito con un mezzo fresco e completo e le cellule sono state trattate con 10 ng/mL LPS per 12 ore. Un volume uguale di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) è stato utilizzato come controllo del veicolo. Il volume di coltura era di 2 mL per pozzo in piastre a 6 pozzi. Dopo il trattamento, il mezzo veniva rimosso, le cellule venivano lavate due volte con PBS sterile pre-raffreddato e venivano raccolte per analisi successive.
Analisi statistica
Tutte le analisi bioinformatiche sono state effettuate utilizzando il software R (versione 4.1.2). I confronti tra due gruppi sono stati effettuati utilizzando il test t di Student, mentre confronti tra più gruppi sono stati effettuati tramite analisi unidirezionale della varianza (ANOVA). L'analisi di correlazione è stata effettuata utilizzando il metodo Spearman. Tutti gli esperimenti cellulari sono stati ripetuti almeno tre volte e i dati sono presentati come la deviazione media ± standard (SD). Un valore P o FDR < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. NS, non significativo; P < 0,05 (*), P < 0,01 (**) e P < 0,001 (***).
Risultati
DEG in IBD, CRC e PAAD
Innanzitutto, le coorti IBD (GSE179285 e GSE24287), le coorti CRC (TCGA-CRC e GSE87211) e le coorti PAAD (GSE128735 e GSE62452) sono state integrate, e l'integrazione è stata valutata utilizzando PCA e grafici di densità di espressione genica. I risultati hanno mostrato che gli effetti di batch tra i diversi dataset sono stati effettivamente eliminati dopo l'integrazione (Figura 1A–F).
Figura 1. Normalizzazione delle coorti di malattie infiammatorie intestinali (IBD), cancro colorettale (CRC) e adenocarcinoma pancreatico (PAAD). (A) L'analisi a componenti principali (PCA) traccia prima e dopo la normalizzazione delle coorti IBD (GSE179285 e GSE24287). (B) Grafici di distribuzione dell'espressione genica prima e dopo la normalizzazione delle coorti IBD. (C) Grafici PCA prima e dopo la normalizzazione delle coorti CRC (TCGA-CRC e GSE87211). (D) Grafici di distribuzione dell'espressione genica prima e dopo la normalizzazione delle coorti CRC. (E) Grafici PCA prima e dopo la normalizzazione delle coorti PAAD (GSE62452 e GSE128735). (F) Grafici di distribuzione dell'espressione genica prima e dopo la normalizzazione delle coorti PAAD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Dopo l'integrazione del dataset e la correzione degli effetti batch, è stata effettuata un'analisi differenziale dell'espressione sulle coorti IBD, CRC e PAAD. All'interno di ciascuna coorte, i tessuti della lesione patologica o tumorali sono stati confrontati con tessuti normali abbinati per identificare i DEG. Nella coorte IBD sono stati identificati 183 DEG, inclusi 64 geni sottoregolati e 119 con un aumento (Figura 2A). Nella coorte CRC sono stati identificati 5.064 DEG, inclusi 2.477 geni sotto regolazione e 2.587 geni rialzati (Figura 2B). Nella coorte PAAD, sono stati identificati 2.293 DEG, inclusi 901 geni sottoregolati e 1.392 con un aumento (Figura 2C). Alla fine, sono stati identificati 40 DEG sovrapposti tra le coorti IBD, CRC e PAAD (Figura 2D).
Figura 2. Analisi differenziale dell'espressione delle coorti IBD, CRC e PAAD. (A) Mappa termica e grafico vulcanico dei geni differenzialmente espressi (DEG) nella coorte IBD. (B) Mappa termica e grafico dei vulcani dei DEG nella coorte CRC. (C) Mappa termica e grafico vulcanico dei DEG nella coorte PAAD. (D) Diagramma di Venn che mostra la sovrapposizione dei DEG tra le coorti IBD, CRC e PAAD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
WGCNA in IBD, CRC e PAAD
La WGCNA è stata eseguita sulle coorti IBD, CRC e PAAD. Nella coorte IBD, tre moduli sono stati identificati strettamente associati ai tratti clinici, con i moduli MEbrown e MEturchese che hanno mostrato le correlazioni più forti (Figura 3A). Analogamente, nella coorte CRC, otto moduli sono stati identificati strettamente associati a tratti clinici, con i moduli MEbrown e MEturquoise che hanno mostrato le correlazioni più forti (Figura 3B). Nella coorte PAAD, un modulo è stato identificato come strettamente associato ai tratti clinici, mentre i moduli MEblack e MEbrown hanno mostrato le correlazioni più forti (Figura 3C).
Figura 3. Analisi pesata della rete di coespressione genica (WGCNA) delle coorti IBD, CRC e PAAD. (A) Mappa termica che mostra correlazioni tra moduli di co-espressione genica e tratti clinici nella coorte IBD. (B) Mappa di calore che mostra correlazioni tra moduli di co-espressione genica e tratti clinici nella coorte CRC. (C) Mappa termica che mostra correlazioni tra moduli di co-espressione genica e caratteristiche cliniche nella coorte PAAD. (D) Diagramma di Venn che mostra geni sovrapposti identificati dai principali moduli di coespressione tra le coorti IBD, CRC e PAAD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Sulla base di geni provenienti da moduli significativamente correlati con tratti clinici, sono stati identificati 434 geni potenzialmente associati ai moduli coinvolti in IBD, CRC e PAAD (Figura 3D).
Analisi di Arricchimento Funzionale dei Geni Comuni in IBD, CRC e PAAD
Combinando i risultati dell'analisi di espressione differenziale e del WGCNA, sono stati identificati 40 DEG comuni e 122 geni associati ai moduli comuni. Per indagare le caratteristiche molecolari condivise di IBD, CRC e PAAD, questi geni sono stati integrati per ulteriori analisi, risultando in 158 geni associati alla malattia.
Per prima cosa, i 158 geni sono stati analizzati utilizzando il database STRING per costruire una rete PPI (Figura 4A). Successivamente sono state effettuate analisi di arricchimento GO e KEGG. L'analisi GO ha rivelato un arricchimento significativo nei processi biologici, incluso il processo metabolico ormonale (Figura 4B,C), mentre l'analisi KEGG ha mostrato arricchimento in vie tra cui la via di segnalazione dell'interleucina-17 (IL-17) e la via di segnalazione del recettore attivato dai proliferatori di perossisomi (PPAR) (Figura 4D,E).
Figura 4. Analisi di arricchimento funzionale dei geni associati alla malattia identificati in IBD, CRC e PAAD. (A) Rete di interazione proteina–proteina (PPI) di geni associati alla malattia. (B) Analisi di arricchimento tramite Ontologia Genica (GO) presentata come un dot plot di termini arricchiti di processo biologico, componenti cellulari e funzioni molecolari. (C) Rete gene–concetto GO che mostra le relazioni tra termini GO arricchiti e geni associati. (D) Analisi dell'arricchimento delle vie della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) presentata come un dot plot. (E) Rete gene–percorso KEGG che mostra le relazioni tra vie arricchite e geni associati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Analisi di correlazione dei geni comuni con infiltrazione cellulare immunitaria in IBD, CRC e PAAD
CIBERSORT è stato utilizzato per stimare i livelli di infiltrazione delle cellule immunitarie nelle coorti IBD, CRC e PAAD. Nella coorte IBD sono state osservate differenze nei livelli di infiltrazione delle cellule immunitarie tra campioni normali e IBD (Figura 5A), e sono state valutate correlazioni tra geni comuni e popolazioni di cellule immunitarie (Figura 5B). Analogamente, sono state osservate differenze nei livelli di infiltrazione delle cellule immunitarie tra campioni normali e CRC nella coorte di CRC (Figura 5C), e sono state valutate correlazioni tra geni comuni e popolazioni di cellule immunitarie (Figura 5D). Nella coorte PAAD sono state osservate anche differenze nei livelli di infiltrazione delle cellule immunitarie tra campioni normali e PAAD (Figura 5E), e sono state valutate correlazioni tra geni comuni e popolazioni di cellule immunitarie (Figura 5F).
Figura 5. Analisi dell'infiltrazione delle cellule immunitarie nelle coorti IBD, CRC e PAAD. (A) Grafici di violino che mostrano le proporzioni stimate delle popolazioni di cellule immunitarie nella coorte IBD. (B) Analisi di correlazione tra geni comuni e popolazioni di cellule immunitarie nella coorte IBD, inclusa la heatmap di correlazione delle cellule immunitarie e la rete di associazione gene–cellula immune. (C) Grafici di violino che mostrano le proporzioni stime delle popolazioni di cellule immunitarie nella coorte CRC. (D) Analisi di correlazione tra geni comuni e popolazioni di cellule immunitarie nella coorte CRC, inclusa la heatmap di correlazione delle cellule immunitarie e la rete di associazione gene-cellula immune. (E) Grafici a violino che mostrano le proporzioni stime delle popolazioni di cellule immunitarie nella coorte PAAD. (F) Analisi di correlazione tra geni comuni e popolazioni di cellule immunitarie nella coorte PAAD, inclusa la heatmap di correlazione delle cellule immunitarie e la rete di associazione gene–cellula immune. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Valutazione del potenziale valore dei geni comuni in IBD, CRC e PAAD
I modelli di espressione dei geni comuni sono stati ulteriormente valutati nelle coorti IBD, CRC e PAAD. S100P è stata costantemente sovraespressa in tutte e tre le coorti (Figura 6A, D, G). Inoltre, la performance diagnostica dei geni comuni è stata valutata tramite analisi ROC.
Figura 6. Prestazioni diagnostiche dei geni comuni nelle coorti IBD, CRC e PAAD. (A) Livelli di espressione di FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1 nella coorte IBD. (B) Curve delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) che mostrano la performance diagnostica dei singoli geni comuni nella coorte IBD. (C) Curva ROC che mostra la performance diagnostica del modello diagnostico combinato nella coorte IBD. (D) Livelli di espressione di FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1 nella coorte CRC. (E) Curve ROC che mostrano la performance diagnostica dei singoli geni comuni nella coorte CRC. (F) Curva ROC che mostra le prestazioni diagnostiche del modello diagnostico combinato nella coorte CRC. (G) Livelli di espressione di FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1 nella coorte PAAD. (H) Curve ROC che mostrano la performance diagnostica dei singoli geni comuni nella coorte PAAD. (I) Curva ROC che mostra le prestazioni diagnostiche del modello diagnostico combinato nella coorte PAAD. I valori dell'area sotto la curva (AUC) e i relativi intervalli di confidenza al 95% sono mostrati, dove applicabile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella coorte IBD, i valori dell'area sotto la curva (AUC) erano 0,626 per FXYD3, 0,597 per S100P, 0,670 per PLA2G2A e 0,697 per MUC1, mentre il modello diagnostico combinato ha prodotto un AUC di 0,815 (Figura 6B,C). Analogamente, nella coorte CRC, i valori AUC erano 0,839 per FXYD3, 0,738 per S100P, 0,716 per PLA2G2A e 0,672 per MUC1, mentre il modello diagnostico combinato ha prodotto un AUC di 0,925 (Figura 6E,F). Nella coorte PAAD, i valori AUC erano 0,852 per FXYD3, 0,896 per S100P, 0,637 per PLA2G2A e 0,733 per MUC1, mentre il modello diagnostico combinato ha prodotto un AUC di 0,901 (Figura 6H,I).
Analisi scRNA-seq basata su geni comuni
Dopo la pre-elaborazione dei dati scRNA-seq dal dataset IBD, sono stati identificati 17 cluster cellulari e 8 tipi cellulari. La distribuzione dei geni comuni tra le diverse popolazioni cellulari è stata quindi valutata e i geni comuni sono stati espressi prevalentemente nelle cellule epiteliali (Figura 7A). Analogamente, la pre-elaborazione del dataset CRC ha identificato 20 cluster cellulari e 8 tipi cellulari, con i geni comuni espressi prevalentemente anche nelle cellule epiteliali (Figura 7B). Infine, la pre-elaborazione del dataset PAAD ha identificato 19 cluster cellulari e 7 tipi cellulari, e i geni comuni sono stati anch'essi prevalentemente espressi nelle cellule epiteliali (Figura 7C).
Figura 7. Analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) dei geni comuni nei tessuti IBD, CRC e PAAD. (A) Visualizzazione uniforme di approssimazione e proiezione della varietà (UMAP) dei cluster cellulari nel dataset IBD (GSE214695), corrispondenti annotazioni di tipo cellulare e grafici di caratteristiche che mostrano l'espressione di FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1 tra le popolazioni cellulari. (B) Visualizzazione UMAP dei cluster cellulari nel dataset CRC (GSE166555), le corrispondenti annotazioni per tipi cellulari e i grafici di caratteristiche che mostrano l'espressione di FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1 tra le popolazioni cellulari. (C) visualizzazione UMAP dei cluster cellulari nel dataset PAAD (GSE154778), corrispondenti annotazioni per tipi cellulari e grafici di caratteristiche che mostrano l'espressione di FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1 tra le popolazioni cellulari. Le scale di colore indicano i livelli relativi di espressione genica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Funzione biologica di S100P nella IBD
Data la costante sovraespressione di S100P nelle coorti IBD, CRC e PAAD, insieme a rapporti precedenti che descrivevano il suo ruolo in CRC ePAAD 15,16, questo studio ha approfondito ulteriormente la funzione biologica di S100P nell'IBD.
Innanzitutto, l'espressione di S100P è stata significativamente aumentata nel modello IBD indotto da LPS, e l'efficienza di knockdown di siS100P è stata confermata (Figura 8A,B). Inoltre, il trattamento con LPS ridusse la proliferazione cellulare, mentre l'inibizione dell'espressione di S100P ripristinò parzialmente la proliferazione cellulare (Figura 8C). Inoltre, il knockdown di S100P ha ridotto significativamente l'espressione di IL-1β, IL-6 e TNF-α nelle linee cellulari modello IBD FHC e NCM460 (Figura 8D,E). Infine, la riduzione della regolazione di S100P ha ridotto l'espressione di IL17RA nelle cellule epiteliali del colon, nelle cellule CRC e nelle cellule PAAD (Figura 8F).
Figura 8. La riduzione della regolazione della S100P attenua le risposte infiammatorie indotte da lipopolisaccaridi (LPS) nelle cellule epiteliali del colono. (A) Espressione relativa dell'mRNA S100P nelle cellule FHC dopo stimolazione LPS e knockdown di S100P. (B) Espressione relativa di mRNA di S100P nelle cellule NCM460 dopo stimolazione LPS e knockdown di S100P. (C) Immagini rappresentative della formazione delle colonie e quantificazione della proliferazione cellulare nelle cellule FHC e NCM460 dopo stimolazione LPS e knockdown di S100P. (D) Misurazione ELISA dei livelli di IL-1β, IL-6 e TNF-α nelle cellule FHC dopo stimolazione LPS e knockdown di S100P. (E) Misurazione ELISA dei livelli di IL-1β, IL-6 e TNF-α nelle cellule NCM460 dopo stimolazione LPS e knockdown di S100P. (F) Espressione relativa dell'mRNA di IL-17RA dopo il knockdown di S100P nelle cellule FHC, NCM460, HCT116, SW1116, PANC-1 e BxPC-3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Disponibilità dei dati
I dataset analizzati durante il presente studio sono pubblicamente disponibili in TCGA e nel repository GEO con i numeri di accessione TCGA-CRC, GSE179285, GSE24287, GSE87211, GSE128735, GSE62452, GSE214695, GSE166555 e GSE154778. Durante questo studio non sono stati generati nuovi dataset di sequenziamento.
Discussione
Studi precedenti hanno evidenziato l'associazione tra IBD, un disturbo gastrointestinale correlato al sistema immunitario, con diverse malattie, tra cui malattieneurodegenerative 17, sclerosimultipla 18, sclerosi lateraleamiotrofica 19, endometriosi20, artrite reumatoide2, linfomadi Hodgkin 21, CRC22 e PAAD23. La IBD è generalmente considerata un aumento del rischio di sviluppare sia CRC24 che PAAD23. Sebbene siano state riportate associazioni epidemiologiche tra queste malattie, le loro caratteristiche molecolari condivise rimangono incompletamente comprese. In questo studio, abbiamo integrato dataset trascrittomici in massa, dati scRNA-seq ed esperimenti funzionali cellulari per indagare le caratteristiche molecolari condivise tra IBD, CRC e PAAD. I nostri risultati forniscono ulteriori approfondimenti sulle potenziali caratteristiche molecolari e immunitarie condivise in questi contesti patologici.
In questo studio, abbiamo identificato 158 geni associati alla malattia tramite analisi di espressione differenziale e WGCNA, comprendenti 40 DEG comuni e 122 geni associati a moduli comuni. L'analisi dell'arricchimento funzionale ha dimostrato un arricchimento significativo delle vie inclusa la via di segnalazione IL-17. Studi precedenti hanno riportato ruoli importanti della segnalazione IL-17 nella progressione di IBD, CRC ePAAD 25,26,27. Queste osservazioni suggeriscono che i processi correlati all'IL-17 potrebbero rappresentare una caratteristica biologica comune in queste malattie. Tuttavia, il presente studio non ha indagato direttamente la relazione meccanicistica tra la segnalazione S100P e IL-17, e sono necessari ulteriori studi funzionali per chiarire questa associazione. Quattro geni comuni (FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1) sono stati identificati nei dataset analizzati. Studi precedenti hanno dimostrato che FXYD3 regola la crescita delle cellulePAAD 28, S100P è stata implicata nella progressione15,16 di CRC e PAAD, e MUC1 partecipa alla progressione di IBD, CRC e PAAD 29,30,31. Al contrario, PLA2G2A è stata studiata meno approfonditamente in tutte e tre le malattie. L'analisi ROC ha dimostrato che ciascuno dei quattro geni ha mostrato prestazioni diagnostiche misurabili, mentre il modello diagnostico combinato ha ottenuto prestazioni diagnostiche superiori rispetto ai singoli geni. I nostri risultati estendono quindi le osservazioni precedenti identificando questi geni come caratteristiche molecolari condivise in IBD, CRC e PAAD.
L'analisi dell'infiltrazione delle cellule immunitarie ha dimostrato schemi di infiltrazione simili per le cellule B naïf, le cellule natural killer (NK) a riposo e i macrofagi M0 nelle coorti IBD, CRC e PAAD. Inoltre, l'analisi scRNA-seq ha mostrato che FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1 erano prevalentemente espressi nelle cellule epiteliali. Questi risultati forniscono ulteriori informazioni sulla distribuzione cellulare dei geni identificati e sulla loro potenziale associazione con caratteristiche immunitarie. Tuttavia, le analisi attuali non stabiliscono interazioni dirette tra cellule epiteliali e microambiente immunitario, e sono necessari ulteriori studi meccanicistici.
Infine, abbiamo indagato il ruolo biologico di S100P in un modello IBD indotto da LPS che imita l'infiammazione. L'espressione di S100P è aumentata significativamente dopo la stimolazione LPS, e il knockdown mediato da siRNA ne ha effettivamente ridotto l'espressione. Nelle condizioni sperimentali esaminate, il knockdown di S100P ha parzialmente ripristinato la proliferazione cellulare e ridotto l'espressione delle citochine infiammatorie IL-1β, IL-6 e TNF-α. Inoltre, la regolazione al ribasso di S100P era associata a una riduzione dell'espressione di IL17RA. Questi risultati supportano ulteriori indagini sull'S100P nelle risposte cellulari correlate all'infiammazione.
Questo studio presenta diverse limitazioni. Innanzitutto, sono stati eseguiti solo esperimenti di perdita di funzione, e non sono stati condotti esperimenti di sovraespressione o di salvataggio; pertanto, non si può stabilire un ruolo causale diretto di S100P. In secondo luogo, l'espressione di S100P è stata valutata principalmente a livello di mRNA e non è stata effettuata la validazione a livello proteico. In terzo luogo, gli esperimenti funzionali erano limitati a un modello cellulare che imita l'infiammazione, mentre i modelli CRC e PAAD non sono stati investigati sperimentalmente. Infine, sebbene le analisi multiomiche abbiano rafforzato l'identificazione delle caratteristiche molecolari condivise, sono necessari ulteriori studi meccanicistici e validazione in vivo per chiarire ulteriormente i ruoli biologici di S100P e degli altri geni condivisi.
In conclusione, questo studio ha identificato caratteristiche molecolari condivise, vie biologiche e caratteristiche immunitarie correlate tra IBD, CRC e PAAD. Quattro geni comuni (FXYD3, S100P, PLA2G2A e MUC1) hanno dimostrato potenziale diagnostico nei dataset analizzati, e S100P è stato ulteriormente indagato in un modello IBD che imita l'infiammazione. Questi risultati forniscono una base per studi futuri che indagano i meccanismi molecolari condivisi che collegano IBD, CRC e PAAD.
Dichiarazioni
Conflitto di Interessi:
Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il sostegno finanziario del National Key R&D Plan of China (Grant No. 2023YFB3210400).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BXPC2 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| CIBERSORT | N/A | N/A | Immune cell infiltration analysis |
| clusterProfiler package | Bioconductor | v4.8.0 | Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | A5256701 | Cell culture supplement |
| FHC cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| GEO dataset (GSE128735) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE154778) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE166555) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for colorectal cancer |
| GEO dataset (GSE179285) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE214695) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE24287) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE62452) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE87211) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for colorectal cancer |
| ggplot2 package | CRAN | v3.4.2 | Data visualization |
| HCT116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | v1.8.0 | Colony counting |
| jetPRIME Transfection Reagent | Polyplus | 101000046 | Cell transfection |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Beyotime Co., Ltd | S1735 | Induction of an inflammation-mimicking IBD cell model |
| limma package | Bioconductor | v3.54.0 | Differential expression analysis |
| NCM460 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| org.Hs.eg.db package | Bioconductor | v3.23.1 | Gene annotation for enrichment analysis |
| PANC1 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| Penicillin–streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic supplement for cell culture |
| pheatmap package | CRAN | v1.0.12 | Heatmap visualization |
| pROC package | CRAN | v1.19.0.1 | Receiver operating characteristic (ROC) analysis |
| PrimeScript RT Master Mix | Takara Bio | RR036A | Reverse transcription of RNA into cDNA |
| Primer sets for qRT-PCR | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Primer sequences reported in Reference 11 |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | v4.1.2 | Statistical and bioinformatics analyses |
| Seurat package | CRAN | v4.0 | Single-cell RNA sequencing data preprocessing and analysis |
| siS100P | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Small interfering RNA targeting S100P |
| SingleR package | Bioconductor | v2.6.0 | Cell type annotation for single-cell RNA sequencing |
| STRING database | STRING Consortium | N/A | Protein-protein interaction analysis |
| SW1116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| TB Green qPCR Mix | Takara Bio | RR430B | Quantitative real-time PCR |
| TCGA-CRC dataset | The Cancer Genome Atlas (TCGA) | N/A | Public colorectal cancer transcriptomic dataset |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA extraction |
| WGCNA package | CRAN | v1.73 | Weighted gene co-expression network analysis |
Riferimenti
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