Questo protocollo descrive l'allestimento di un modello murino di asma allergico (AA) indotto da ovoalbumina (OVA) per valutare i meccanismi terapeutici della Kechuanting Acupoint Sticking Therapy (KAST) sull'infiammazione delle vie aeree di tipo 2, modulando le cellule linfoidi innate di gruppo 2 polmonari (ILC2) attraverso il pathway peptidico correlato al gene della calcitonina (CGRP)/proteina 1 modificatrice dell'attività del recettore (RAMP1).
Articolo di ricerca
La terapia di applicazione di adesivi nell'acupunto Kechuanting allevia l'infiammazione delle vie aeree di tipo 2 in topi con asma allergica modulando il numero di ILC2
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
È stato dimostrato che la terapia con applicazione di farmaci nei punti di agopuntura Kechuanting (KAST) migliora efficacemente l'infiammazione delle vie aeree nei pazienti con asma allergico (AA); tuttavia, i meccanismi sottostanti rimangono poco chiari. Questo studio si è proposto di indagare i meccanismi terapeutici della KAST in un modello murino di AA dal punto di vista neuro-immunitario. È stato sviluppato un modello murino di asma allergico indotto da ova-albumina (OVA) e i topi sono stati trattati con KAST. Gli effetti della KAST sulle cellule linfoidi innate di gruppo 2 polmonari (ILC2) e sull'infiammazione delle vie aeree di tipo 2 sono stati valutati mediante citometria a flusso, colorazione con ematossilina-eosina (HE) e immunohistochimica. Il dosaggio del peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) nei tessuti polmonari è stato effettuato tramite western blotting (WB) e saggio immunoenzimatico (ELISA). È stata somministrata per via intranasale CGRP o l'inibitore del recettore CGRP BIBN-4096 in topi con asma allergico, al fine di indagare il ruolo regolatorio della via CGRP/proteina modificatrice dell'attività del recettore 1 (RAMP1) sulle ILC2 e sull'infiammazione delle vie aeree di tipo 2. La KAST ha ridotto il numero di ILC2 e attenuato l'infiammazione delle vie aeree di tipo 2, associandosi a una riduzione dell'espressione di CGRP nei tessuti polmonari. La somministrazione intranasale di CGRP ha aumentato le ILC2 di tipo RAMP1+ e il numero totale di ILC2 nei polmoni, peggiorando l'infiammazione delle vie aeree di tipo 2. Al contrario, la somministrazione intranasale di BIBN-4096 ha ridotto le ILC2 polmonari e attenuato l'infiammazione delle vie aeree di tipo 2. La KAST riduce l'infiammazione delle vie aeree nell'asma allergico, un effetto strettamente associato alla downregolazione della via CGRP/RAMP1 e alla conseguente soppressione delle ILC2 polmonari, come confermato anche da studi con inibizione farmacologica.
Introduzione
L'asma allergico (AA) è il fenotipo di asma più comune, che rappresenta dal 60% all'80% di tutti i casi di asma in Cina1. Si caratterizza per un'elevata prevalenza e un controllo subottimale della malattia, che compromette gravemente la qualità della vita dei pazienti e comporta un notevole carico economico2,3,4,5. Sebbene i corticosteroidi inalati (ICS) rimangano il trattamento clinico principale6, alcuni pazienti mostrano una risposta limitata e l'uso prolungato è spesso associato a effetti avversi e all'incapacità di arrestare il decorso della malattia7. Pertanto, lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche sicure ed efficaci rimane una priorità sia negli ambiti clinici che di ricerca. La terapia di applicazione topica mediante agopuntura Kechuanting (KAST), un'applicazione esterna della medicina tradizionale cinese, rilascia composti attivi per via transdermica, potenzialmente evitando l'effetto di primo passaggio epatico e minimizzando le reazioni avverse sistemiche8,9. Studi clinici hanno dimostrato che la KAST può alleviare i sintomi asmatici, ripristinare parzialmente la funzione polmonare e migliorare la qualità della vita dei pazienti10,11,12. Parallelamente, studi di metabolomica sierica, farmacologia delle reti e studi animali su modelli di asma suggeriscono che la KAST attenua l'infiammazione delle vie aeree riducendo i livelli sierici e nel lavaggio broncoalveolare (BALF) di mediatori infiammatori, inclusa la downregolazione dell'espressione di IgE, IL-4 e IL-139,13,14. Nel complesso, questi risultati forniscono evidenze a sostegno dell'efficacia terapeutica della KAST nell'asma. Tuttavia, i suoi meccanismi d'azione precisi rimangono ancora poco chiari.
Un meccanismo patologico fondamentale alla base della ricorrenza dell'AA è l'infiammazione delle vie aeree di tipo 2, in cui le cellule linfoidi innate di gruppo 2 (ILC2) svolgono un ruolo chiave15. In seguito a stimolazione da allergeni, le ILC2 secernono citochine come IL-5 e IL-13, promuovendo così l'infiammazione delle vie aeree16,17. Studi hanno dimostrato che l'eliminazione delle ILC2 attenua significativamente l'infiammazione delle vie aeree nei topi asmatici, sottolineandone il ruolo centrale nell'evoluzione della malattia18. In particolare, l'attivazione e la funzione delle ILC2 sono regolate strettamente da numerosi meccanismi, tra cui le interazioni neuro-immunitarie, che negli ultimi anni stanno ricevendo crescente attenzione. Evidenze recenti indicano che il peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) può legarsi alla proteina 1 modificatrice dell'attività del recettore (RAMP1) sulla superficie delle ILC2, inducendone l'attivazione e il conseguente rilascio di citochine di tipo 2, aggravando così l'infiammazione delle vie aeree nell'AA19,20,21. Nel presente studio, il nostro screening mediante sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento (RNA-seq) ha identificato il CGRP come un neuropeptide critico e fortemente modulato dall'intervento con KAST. Pertanto, concentrandoci sul percorso CGRP/RAMP1, abbiamo utilizzato KAST come intervento nei topi con AA per indagare i suoi potenziali meccanismi di modulazione dell'attività delle ILC2 e di attenuazione dell'infiammazione delle vie aeree di tipo 2.
Protocollo
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con la Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio pubblicata dalle National Academies of Sciences. Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico per gli Animali dell'Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Cinese di Nanchino (numero di approvazione: 2023DW-059-01). Un elenco completo di tutti i materiali, reagenti, strumenti e software utilizzati in questo studio è riportato nella Tabella dei Materiali.
Animali sperimentali e raggruppamento
Topi femmine sani BALB/c (di grado SPF, età 8–10 settimane) sono stati ottenuti dal Centro per gli Animali Sperimentali dell'Università di Medicina Cinese di Nanchino (licenza n. SYXK (Su) 2018-0049). Gli animali sono stati allevati in condizioni standard con un ciclo luce/buio di 12 ore alla temperatura di 24–26 °C. Cibo e acqua sterili sono stati forniti ad libitum, la lettiera è stata sostituita regolarmente e le gabbie sono state pulite periodicamente. Dopo 7 giorni di adattamento, i topi sono stati suddivisi casualmente in sei gruppi (n = 7/gruppo): gruppo normale, gruppo modello, gruppo CGRP, gruppo BIBN-4096, gruppo KAST e gruppo KAST + CGRP. L'assegnazione degli animali ai gruppi è avvenuta in modo casuale utilizzando una tabella di numeri casuali generata al computer. L'assegnazione dei gruppi è stata tenuta nascosta agli sperimentatori fino all'assegnazione degli interventi. Per ottimizzare l'utilizzo dei tessuti, i campioni di polmone dal gruppo randomizzato (n = 7 per gruppo) sono stati assegnati sistematicamente a diversi percorsi di lavorazione, con le dimensioni esatte dei campioni analizzati (n = 5, 4 o 3) per specifici saggi istologici e molecolari chiaramente indicate nelle rispettive legende delle figure. Nessun dato è stato escluso dall'analisi.
Preparazione della formulazione KAST
La formulazione è stata preparata dal Dipartimento di Farmacia dell'Ospedale affiliato all'Università di Medicina Cinese di Nanjing22. Sono state utilizzate nove erbe medicinali cinesi tradizionali: Semen Brassicae (2 parti), Rhizoma Corydalis (2 parti), Radix Kansui lavorata con aceto (1 parte), Asarum (1 parte), Ephedra (1 parte), Semen Lepidii (1 parte), Chiodi di garofano (1 parte), Corteccia di cannella (1 parte) e Gleditsia sinensis (1 parte). Ogni erba è stata macinata in polvere fine e setacciata attraverso un setaccio da 80 mesh. Per ogni 100 g di polvere miscelata, sono stati aggiunti 70 mL di succo fresco di zenzero e 30 mL di paraffina liquida, mescolati accuratamente e trasformati in cerotti da 0,3 g ± 5% con un diametro di 0,5 cm. In particolare, tutti gli ingredienti a base di erbe e lo zenzero fresco sono stati autenticati dal farmacista capo Lin-gang Zhao e conservati a 4 °C in un ambiente buio e asciutto prima dell'uso9. Per garantire la riproducibilità dell'intervento e la stabilità da lotto a lotto, è stato applicato uno standard rigoroso di controllo qualità basato sui metodi UPLC-Q-TOF-MS e HPLC precedentemente stabiliti dal nostro gruppo, confermando la presenza costante di principi attivi chiave come il tiocianato di sinapina23. Nella pratica, i cerotti da 0,5 cm sono stati fissati utilizzando un nastro adesivo medico traspirante e ipoallergenico di dimensioni 2,5 cm × 5,5 cm per assicurare un'ottimale somministrazione transdermica.
Creazione del modello murino di AA
Il modello AA è stato indotto seguendo un protocollo consolidato presente in letteratura, utilizzando la sensibilizzazione con OVA e provocazione intranasale24. A eccezione del gruppo Normale, tutti i topi sono stati sensibilizzati mediante iniezione intraperitoneale di 200 µL di soluzione salina contenente 100 µg di OVA e 2 mg di idrossido di alluminio nei giorni 0 e 12. Dal giorno 18 al 23, i topi sono stati sottoposti a provocazione intranasale una volta al giorno con 50 µg di OVA in 50 µL di soluzione salina. Dal giorno 24 al 53, l’OVA è stata somministrata intranasalmente ogni due giorni. Il giorno 54, dopo aver pesato i topi, è stata eseguita l’eutanasia mediante dislocazione cervicale e sono stati raccolti i tessuti. Successivamente, il coefficiente polmonare è stato determinato dividendo il peso totale dei polmoni per il peso corporeo.
Interventi
Dal giorno 40 al giorno 53, i topi del gruppo KAST e del gruppo KAST + CGRP sono stati rasati su un'area dorsale di 3 cm × 6 cm. Patches sono stati applicati bilateralmente sui punti di agopuntura Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) e Shenshu (BL23), fissati con nastro adesivo per 1,5 ore una volta al giorno per 14 giorni consecutivi. I topi dei gruppi CGRP e KAST + CGRP hanno ricevuto un'amministrazione intranasale di 10 µL di soluzione di Calcitonina/CALCA (1 pg/µL) ogni due giorni dal giorno 40 al giorno 53. I topi del gruppo BIBN-4096 hanno ricevuto un'amministrazione intranasale di 10 µL di soluzione di BIBN-4096 (0,3 mg/mL, antagonista del recettore CGRP) ogni due giorni. I gruppi normale e modello sono stati alimentati normalmente senza interventi. Il KAST è stato somministrato dal giorno 40 al giorno 53, dopo l'instaurazione dell'infiammazione delle vie aeree allergica (a partire dal giorno 40, ovvero 22 giorni dopo la prima sfida con OVA al giorno 18). Pertanto, in questo studio il KAST ha svolto un ruolo terapeutico piuttosto che profilattico.
Per la preparazione della pelle, la rimozione dei peli nella regione dorsale designata è stata eseguita utilizzando un rasoio elettrico. La localizzazione dei punti di agopuntura ha rigorosamente seguito la nomenclatura e la localizzazione standard dei punti di agopuntura per animali da laboratorio - Parte 3: Topi (T/CAAM 0002-2020), pubblicata dalla Società Cinese di Agopuntura e Moxibustione. Le quattro coppie di punti dorsali bilaterali sono state accuratamente segnate e definite come segue: Feishu (BL13: tra le coste al di sotto del processo spinoso della 3ª vertebra toracica, 3 mm lateralmente alla linea mediana posteriore), Geshu (BL17: al di sotto del processo spinoso della 7ª vertebra toracica, 3 mm lateralmente alla linea mediana), Pishu (BL20: al di sotto del processo spinoso della 12ª vertebra toracica, 3 mm lateralmente alla linea mediana) e Shenshu (BL23: al di sotto del processo spinoso della 2ª vertebra lombare, 3 mm lateralmente alla linea mediana). Il nastro 3M è stato avvolto saldamente per garantire un'adesione stabile, evitando qualsiasi spostamento della toppa o erosione cutanea secondaria durante il periodo di mantenimento di 1,5 h.
Le dosi di CGRP/CALCA (1 pg/µL, 10 µL per topo) e BIBN-4096 (0,3 mg/mL, 10 µL per topo) sono state scelte sulla base di studi pubblicati25. In particolare, per l'intervento con CGRP, è stata preparata una soluzione di BSA allo 0,1% sciogliendo 1 mg di BSA in 1 mL di ddH2O, seguito da vortex per ottenere una concentrazione finale di 1 mg/mL. Prima della ricostituzione, la polvere liofilizzata di proteina Calcitonina/CALCA è stata centrifugata a 12.000 × g per 30 secondi a 4 °C. Successivamente, sono stati aggiunti 20 µL della soluzione di BSA allo 0,1% preparata per ottenere una soluzione madre da 1 µg/µL. Il flaconcino è stato delicatamente capovolto diverse volte (senza vortex), centrifugato brevemente e lasciato a temperatura ambiente per alcuni minuti per assicurare una completa ricostituzione della proteina. Per preparare la soluzione operativa da 1 pg/µL senza generare un volume eccessivo in un unico passaggio, è stata effettuata una diluizione seriale standard in due passaggi: 1 µL della soluzione madre da 1 µg/µL è stato dapprima diluito in 999 µL di soluzione salina sterile per ottenere una soluzione intermedia da 1 ng/µL, quindi 1 µL di questa soluzione intermedia è stato ulteriormente mescolato con altri 999 µL di soluzione salina sterile per ottenere la soluzione operativa finale da 1 pg/µL. La soluzione operativa è stata mantenuta a 4 °C, mentre le rimanenti aliquote sono state conservate a -20 °C per un periodo fino a 2–3 mesi. Per il gruppo BIBN-4096, 1 mg di polvere di BIBN-4096 è stato sciolto in 333 µL di ddH2O per ottenere una soluzione madre da 3 mg/mL, che è stata poi suddivisa in aliquote da 50 µL per flaconcino e conservata a -80 °C. Per preparare la soluzione operativa da 0,3 mg/mL, ogni aliquota da 50 µL di soluzione madre è stata accuratamente mescolata con 450 µL di soluzione salina sterile. Dal giorno 40 al giorno 53, un volume di 10 µL della soluzione di CGRP da 1 pg/µL o della soluzione di BIBN-4096 da 0,3 mg/mL è stato somministrato per via intranasale a ciascun topo ogni due giorni, con leggero contenimento e senza anestesia.
Misure di esito e metodi di rilevamento
Test comportamentali
Al giorno 53, a seguito della sfida intranasale finale, le frequenze degli episodi di strofinamento del naso e di starnuti sono state monitorate e registrate mediante un sistema video digitale per una durata di 10 min. Le frequenze comportamentali nei video sono state conteggiate indipendentemente da due ricercatori in modo doppio cieco. In caso di discrepanza significativa tra i loro conteggi, un terzo ricercatore ha rivalutato il video e i dati con la maggiore coerenza sono stati selezionati per l'analisi statistica.
Test di provocazione bronchiale
Entro 24 ore dall'ultima sfida, la reattività delle vie aeree è stata valutata utilizzando acetilcolina (ACh) nebulizzata a concentrazioni di 0, 5, 10, 20 e 40 mg/mL (300 µL per concentrazione, nebulizzati per 1 minuto). I valori di pausa aumentata (Penh), un indice adimensionale utilizzato empiricamente per indicare il restringimento delle vie aeree e valutare l'iperreattività bronchiale (AHR), sono stati registrati per 5 minuti dopo ogni nebulizzazione mediante plestimografia non invasiva dell'intero corpo. I topi sono stati abituati alla camera per 10 minuti prima della registrazione. Il valore Penh è stato calcolato automaticamente tramite il software integrato del sistema di archiviazione/trasmissione in tempo reale, secondo una formula empirica che bilancia i tempi espiratori/inspiratori e i flussi massimi.
Istopatologia (colorazione con ematossilina-eosina)
I tessuti polmonari fissati in paraformaldeide al 4% sono stati disidratati mediante una serie alcolica a gradazione crescente, chiarificati nello xilene e inclusi in blocchi di paraffina utilizzando un processore automatico. I blocchi sono stati tagliati a uno spessore di 4 µm, galleggiati in un bagno d'acqua a 42 °C e montati su vetrini. I vetrini sono stati cotti a 80 °C per 2 h e lasciati asciugare tutta la notte prima di essere raffreddati a temperatura ambiente. Per la colorazione, le sezioni sono state deparaffinizzate nello xilene (I e II, 20 min ciascuno), reidratate attraverso una serie alcolica di etanolo (100% I/II e 75%, 5 min ciascuno) e risciacquate con acqua corrente. I vetrini sono stati colorati con ematossilina per 3–5 min, differenziati con alcol acido all'1% e bluati in una soluzione bluante. Dopo il lavaggio, le sezioni sono state disidratate mediante etanolo all'85% e al 95% (5 min ciascuno) e controcoperte con eosina per 5 min. Infine, i vetrini sono stati disidratati in etanolo assoluto (I, II e III, 5 min ciascuno), chiarificati nello xilene (I e II, 5 min ciascuno), montati con balsamo neutro e lasciati asciugare all'aria. Le immagini sono state acquisite da campi casuali a un ingrandimento di 200× mediante un microscopio ottico e il sistema CaseViewer. L'infiammazione polmonare e l'ispessimento epiteliale sono stati valutati in cieco su una scala da 0 a 4: 0, nessuna infiammazione; 1, occasionali cellule infiammatorie; 2, pochi focolai (<3) infiammatori; 3, multipli focolai (≥3) infiammatori; 4, infiltrazione diffusa in tutto il polmone. L'ispessimento epiteliale è stato valutato come: 0, normale; 1, ispessimento visibile; 2, ispessimento parziale delle vie aeree; 3, ostruzione quasi completa; 4, assenza di struttura normale. Per ogni gruppo sperimentale, sono stati acquisiti ed analizzati un totale di 20 campi microscopici casuali per ottenere i punteggi istopatologici grezzi. I dati di ogni quattro campi sono stati mediati per ottenere un singolo punto dati indipendente, ottenendo una dimensione finale del campione di n = 5 repliche per gruppo per l'analisi statistica. La valutazione è stata effettuata in maniera cieca.
Sequenziamento dell'RNA
L'RNA totale è stato estratto da tessuti polmonari murini utilizzando il reagente TRIzol secondo il protocollo del produttore. La purezza, la concentrazione e l'integrità dell'RNA sono state valutate mediante spettrofotometro e una piattaforma basata su microfluidica. Le librerie del trascrittoma sono state costruite utilizzando un kit commerciale per la preparazione delle librerie e sequenziate su una piattaforma di sequenziamento ad alto rendimento per generare letture accoppiate di 150 bp. I dati grezzi sono stati sottoposti a controllo di qualità mediante un software di filtraggio appropriato per ottenere letture pulite, che sono state allineate al genoma di riferimento utilizzando uno strumento di allineamento sensibile alle giunzioni. I livelli di espressione genica sono stati calcolati come FPKM e i conteggi delle letture sono stati compilati tramite un'utilità specifica per il conteggio delle letture. L'analisi dell'espressione differenziale è stata eseguita utilizzando un pacchetto statistico specializzato, con soglie impostate a |log2 Variazione del Fold| ≥ 1 e p corretto < 0,05.
ELISA
I tessuti polmonari freschi di topo sono stati accuratamente pesati e omogeneizzati in tampone PBS in un rapporto rigoroso di 20 mg di tessuto per 200 µL di tampone. Gli omogeneati sono stati centrifugati a circa 13.400 × g per 10 minuti a 4 °C per raccogliere i sopranatanti proteici. Per la normalizzazione, il contenuto proteico grezzo dei sopranatanti è stato calibrato utilizzando il metodo BCA. La procedura ELISA è stata eseguita in triplicato tecnico utilizzando kit commerciali seguendo il protocollo del produttore. In breve, 50 µL di diluizioni standard o 50 µL di campioni pre-diluiti (10 µL di campione proteico mescolati con 40 µL di diluente per campioni, ottenendo una diluizione finale di 5 volte) sono stati aggiunti alle piastre a 96 pozzetti rivestite con anticorpo. Le piastre sono state sigillate e incubate a 37 °C per 30 minuti. Dopo cinque lavaggi con un tampone di lavaggio diluito 1:30, sono stati aggiunti 50 µL di reagente coniugato marcato enzimaticamente in ogni pozzetto (tranne nei pozzetti bianco), e la miscela è stata incubata a 37 °C per 30 minuti. Dopo altri cinque lavaggi, sono stati aggiunti 50 µL della soluzione cromogenica A e 50 µL della soluzione cromogenica B in ogni pozzetto, e la piastra è stata incubata al buio a 37 °C per 10 minuti. La reazione è stata arrestata aggiungendo 50 µL della soluzione di arresto, che ha provocato un cambiamento di colore da blu a giallo. L'assorbanza (valore di OD) di ogni pozzetto è stata misurata a 450 nm mediante un lettore di micropiastre entro 15 minuti. Le curve standard sono state tracciate utilizzando un modello di regressione logistica a quattro parametri o lineare (garantendo un valore di R2 > 0,99), a partire dalle quali sono state calcolate le concentrazioni della proteina bersaglio negli omogeneati di tessuto polmonare.
Citometria a flusso
I tessuti polmonari sono stati escissi, tritati e digeriti in 5 mL di RPMI-1640 contenente 10% di FBS, 50 µL di Liberase TM e 5 µL di DNasi I a 37 °C per 45 minuti con agitazione a 80 rpm. La sospensione digerita è stata filtrata attraverso un filtro cellulare da 400 mesh e centrifugata a 300 × g per 10 minuti a 4 °C. Il pellet è stato risospeso in 2 mL di tampone per la lisi dei globuli rossi per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo un lavaggio, le cellule sono state risospese e colorate con Ghost Dye Red 780 (1,25 µL per campione) per 20 minuti a 4 °C al buio per l'esclusione delle cellule morte. Dopo un ulteriore lavaggio, le cellule sono state bloccate con 10 µL di Reagente Bloccante FcR per 10 minuti a 4 °C. Successivamente, le cellule sono state colorate in superficie con i seguenti anticorpi coniugati a fluorocromi per 30 minuti a 4 °C: FITC anti-topo CD45 (0,5 µL), PE anti-topo/umano KLRG1 (1,25 µL), BB700 ratto anti-topo CD90.2 (0,5 µL) e una miscela di lineage biotinilata contenente anti-topo CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) (tutti 0,5 µL ciascuno) e anti-topo CD19 (2 µL). Dopo il lavaggio, le cellule sono state incubate con Streptavidina Brilliant Violet 605 (2 µL) per 30 minuti a 4 °C. I dati sono stati acquisiti su una piattaforma citometrica BD e analizzati mediante software FlowJo. Le matrici di compensazione per il riversamento della fluorescenza sono state monitorate e regolate automaticamente dal software calibrato dello strumento. La strategia gerarchica di gating per l'identificazione degli ILC2 polmonari è stata applicata in sequenza come segue: i linfociti totali sono stati inizialmente isolati in base alla morfologia di dispersione anteriore/laterale (FSC-A/SSC-A), seguiti dalla discriminazione dei doppietti mediante gating dei singoletti (FSC-H/FSC-A). Le cellule vitali sono state successivamente identificate escludendo le cellule morte (Ghost Dye-) e quindi sono stati applicati progressivamente dei gate standard per selezionare le popolazioni CD45+ e Lineage-. All'interno della finestra di gating delle cellule vitali CD45+ Lineage-, gli ILC2 polmonari sono stati definiti ed enumerati in modo esplicito in base ai successivi gate a cascata positivi sequenziali per i cluster CD90.2+ e KLRG1+.
Immunofluorescenza (IF)
Le sezioni di polmone congelate sono state scongelate a temperatura ambiente per 15–30 minuti e lavate tre volte con PBST (PBS contenente 0,05% di Tween-20) per 6 minuti ciascuna, per rimuovere il composto OCT. Dopo aver asciugato il liquido in eccesso, è stato tracciato un contorno idrofobo intorno al tessuto utilizzando una penna per immunohistochimica. Le sezioni sono state incubate in un buffer di blocco e permeabilizzazione contenente Triton X-100 allo 0,3% e siero di capra al 5% a 37 °C per 100 minuti, seguito da un'incubazione notturna (16–20 h) a 4 °C con l'anticorpo primario. Il giorno successivo, le sezioni sono state portate a temperatura ambiente per 30 minuti, lavate tre volte con PBST e incubate con un anticorpo secondario coniugato a un fluorocromo, compatibile con la specie, a 37 °C al buio per 60–90 minuti. Dopo altri tre lavaggi con PBST, i nuclei sono stati contrastati con DAPI (diluito 1:1 o 2:1 in PBS) per 8 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo un ultimo ciclo di lavaggi con PBST (3 × 6 minuti), le sezioni sono state montate con un mezzo di montaggio anti-sfaldamento, sigillate per evitare la formazione di bolle d'aria e conservate al buio. Le immagini sono state acquisite mediante microscopio confocale a un ingrandimento di 400×. Il numero di cellule positive per campo è stato contato manualmente utilizzando il software Leica LAS X. Per ogni gruppo sperimentale, sono stati analizzati un totale di 15 campi microscopici scelti casualmente per ottenere i conteggi grezzi delle cellule. I dati di ogni tre campi sono stati mediati per ottenere un singolo punto dati indipendente, ottenendo una dimensione finale del campione di n = 5 repliche per gruppo per l'analisi statistica. Il conteggio è stato effettuato in modo cieco.
Immunoeistochimica (IHC)
Le sezioni in paraffina sono state disidratate in tre passaggi di xilene (15 min ciascuno), reidratate attraverso una serie alcolica decrescente (100% due volte, 85% e 75%; 5 min ciascuno) e risciacquate con acqua distillata. Il recupero dell'antigene è stato eseguito in tampone citrato (pH 6,0) utilizzando una pentola a pressione (3 min a pressione elevata dopo ebollizione), seguito da raffreddamento e tre lavaggi di 5 min in PBS (pH 7,4). La perossidasi endogena è stata bloccata con H2O2 al 3% per 15 min a temperatura ambiente al buio. Dopo il lavaggio, le sezioni sono state delimitate con una penna idrofoba e bloccate con siero di capra al 3% per 30 min. Le sezioni sono state quindi incubate tutta la notte a 4 °C con gli anticorpi primari diluiti in PBS: anti-IL-4 (1:400), anti-IL-5 (1:300) o anti-IL-13 (1:150). Il giorno successivo, le sezioni sono state lavate e incubate con anticorpi secondari coniugati con HRP (anti-topo per IL-4; anti-coniglio per IL-5 e IL-13) per 50 min a temperatura ambiente. I segnali sono stati visualizzati utilizzando una soluzione di DAB appena preparata, controllata al microscopio, e interrotta con acqua corrente. Infine, le sezioni sono state controstainate con ematossilina, differenziate, bluizzate, disidratate attraverso alcoli in graduale concentrazione e xilene, quindi montate con balsamo neutro per l'esame microscopico. La densità ottica media (IOD/Area) è stata quantificata mediante una piattaforma software di analisi dell'immagine a un ingrandimento di 200×. Per ogni gruppo sperimentale, sono stati acquisiti in totale 15 campi microscopici scelti casualmente per ottenere i valori grezzi. I dati di ogni tre campi sono stati mediati per ottenere un singolo punto dati indipendente, ottenendo una dimensione finale del campione di n = 5 repliche per gruppo per l'analisi statistica. La valutazione è stata effettuata da due osservatori in cieco.
Immunoblotting (WB)
Per la preparazione del campione, i tessuti polmonari di topo (circa 30 mg) sono stati finemente tritati e omogeneizzati in 300 µL di tampone di lisi RIPA pre-raffreddato, integrato con 1% di cocktail inibitore di proteasi/fosfatasi. L'omogeneizzazione è stata eseguita utilizzando un omogeneizzatore per tessuti a 60 Hz per quattro cicli (60 s per ciclo). I lisati sono stati quindi centrifugati a circa 13.400 × g per 15 min a 4 °C per raccogliere il sopranatante. Le concentrazioni totali di proteine sono state determinate mediante un kit standard per saggio proteico BCA. I campioni sono stati quindi normalizzati, mescolati con buffer di caricamento 5x in rapporto volumetrico 4:1 e denaturati a 95 °C per 7 min. Per l'elettroforesi su SDS-PAGE, i campioni proteici (20 µg per corsia) sono stati caricati insieme a un marcatore di peso molecolare proteico pre-colorato, risolti a tensione costante di 80 V per 20 min e poi regolati a 120 V per 70 min. Le proteine sono state quindi trasferite per via umida su membrane PVDF da 0,22 µm a corrente costante di 300 mA per 120 min in un bagno di ghiaccio. Le membrane sono state bloccate con BSA al 5% in TBST per 1 h a temperatura ambiente e incubate tutta la notte (fino a 18 h) a 4 °C con anticorpi primari contro CGRP (1:500) e GAPDH (1:2000). Dopo tre lavaggi con TBST (10 min ciascuno), le membrane sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (1:10000) per 1–2 h a temperatura ambiente. Dopo altri tre lavaggi, le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un substrato chemiluminescente potenziato (ECL) all'interno di un sistema di imaging VILBER Fusion FX. Le intensità delle bande sono state quantificate utilizzando ImageJ 1.8 e l'espressione della proteina bersaglio è stata normalizzata rispetto al controllo interno GAPDH.
Analisi statistica
Tutti i dati sperimentali sono espressi come media ± deviazione standard (SD). L'analisi dei dati e la creazione dei grafici statistici sono stati eseguiti utilizzando una piattaforma statistica specializzata. Prima dei confronti tra gruppi, i dataset sono stati sottoposti sistematicamente a test di normalità. Per dati normalmente distribuiti con varianze omogenee, è stata applicata l'analisi della varianza unidirezionale o bidirezionale ordinaria (ANOVA), seguita dai test post hoc di Tukey, Šídák, Holm-Šídák o LSD di Fisher per confronti multipli a coppie. Quando si confrontavano più gruppi con un singolo gruppo di controllo, è stato utilizzato il test di Dunnett. Per dataset con varianze eterogenee, è stata impiegata l'ANOVA di Brown-Forsythe, seguita dal test post hoc T3 di Dunnett. Per dataset che non rispettavano la normalità, è stato utilizzato il test non parametrico di Kruskal-Wallis, seguito dal test post hoc di Dunn per confronti multipli. Un valore P < 0,05 è stato considerato indicativo di differenze statisticamente significative. Diversi livelli di significatività sono indicati dinamicamente con *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001 e ****p < 0,0001. Tutte le valutazioni degli esiti sperimentali, incluse la valutazione istologica, l'analisi mediante citometria a flusso e la quantificazione delle immagini, sono state effettuate in maniera rigorosamente in cieco.
Risultati
KAST riduce le ILC2 polmonari e attenua l'infiammazione delle vie aeree di tipo 2
Per studiare gli effetti terapeutici della KAST, è stato sviluppato un modello murino di AA indotta da OVA e trattato con cerotti applicati nei punti di agopuntura Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) e Shenshu (BL23) (Figura 1A). Dopo la creazione del modello, i topi con AA hanno mostrato una riduzione del peso corporeo, mentre i topi trattati con KAST hanno mostrato un aumento significativo del peso corporeo rispetto al gruppo modello (Figura 1B). Il coefficiente polmonare, un indicatore dell'infiammazione polmonare, era aumentato nei topi con AA ma risultava notevolmente ridotto dopo il trattamento con KAST (Figura 1C). Le valutazioni comportamentali hanno rivelato un aumento di starnuti e grattamenti nasali nei topi con AA, sintomi significativamente attenuati dal trattamento con KAST (Figura 1D–E). La pletismografia corporea integrale ha mostrato che i valori di Penh, indicativi di iperreattività bronchiale, erano aumentati nei topi con AA ma si riducevano dopo il trattamento, suggerendo un miglioramento della funzionalità polmonare (Figura 1F). L’analisi istopatologica con colorazione ematossilina-eosina ha evidenziato un'infiltrazione di cellule infiammatorie peribronchiali e perialveolari nel gruppo modello rispetto ai controlli normali. Al contrario, l'infiltrazione infiammatoria era ridotta nel gruppo trattato con KAST (Figura 2A–B). L’immunohistochimica ha mostrato che IL-4, IL-5 e IL-13 erano localizzate principalmente nel citoplasma delle cellule infiammatorie infiltrate e in alcune cellule epiteliali, con possibile accumulo negli spazi interstiziali. Rispetto ai controlli normali, il gruppo modello presentava segnali positivi e valori di densità ottica media notevolmente aumentati, che risultavano significativamente ridotti nel gruppo KAST (Figura 2C–H). La citometria a flusso ha ulteriormente dimostrato che il numero di ILC2 era significativamente aumentato nei polmoni dei topi con AA rispetto ai controlli normali, mentre il trattamento con KAST riduceva in modo marcato il numero di ILC2 (Figura 2I–J).
KAST attenua l'infiammazione delle vie aeree di tipo 2 sopprimendo l'asse CGRP/RAMP1
L'iperattivazione delle ILC2 è regolata da multipli fattori. L'analisi mediante RNA-seq ha rivelato che l'espressione di CGRP era significativamente aumentata nei topi con AA, mentre il KAST riduceva in modo marcato i livelli polmonari di CGRP (Figura 3A). Il Western blot e l'ELISA hanno confermato livelli proteici di CGRP più elevati nel gruppo modello rispetto ai controlli, livelli che venivano ridotti dal KAST (Figura 3B–D). Questi risultati indicano che il KAST attenua l'espressione di CGRP nei polmoni degli animali con AA, modulando così le risposte immunitarie delle ILC2. Nel complesso, queste variazioni riscontrate nell'analisi mediante sequenziamento ad alto rendimento e nel dosaggio proteico suggeriscono una forte associazione tra l'intervento terapeutico con KAST e la riduzione dei livelli polmonari di CGRP nei topi con AA.
Per approfondire il ruolo del CGRP, i topi AA sono stati trattati con CGRP esogeno, con l'antagonista del recettore del CGRP BIBN-4096 o con KAST in combinazione con CGRP. I risultati dell'ELISA hanno mostrato livelli proteici di CGRP significativamente ridotti nei gruppi KAST e BIBN-4096, livelli aumentati nel gruppo CGRP e livelli più elevati nel gruppo KAST + CGRP rispetto a KAST da solo (Figura 4A). La citometria a flusso ha rivelato che il numero di ILC2 era ridotto nei gruppi KAST e BIBN-4096, ma aumentato nei gruppi CGRP e KAST + CGRP rispetto al gruppo modello (Figura 4B–C). La colorazione con ematossilina-eosina ha mostrato una ridotta infiltrazione di cellule infiammatorie attorno alle vie aeree e agli alveoli nei gruppi KAST e BIBN-4096, mentre l'infiltrazione era aggravata nei gruppi CGRP e KAST + CGRP (Figura 4D–E). L'ELISA ha ulteriormente confermato una diminuzione dei livelli di IL-4, IL-5 e IL-13 nei gruppi KAST e BIBN-4096, ma un aumento nei gruppi CGRP e KAST + CGRP (Figura 4F–H).
Il numero di ILC2s polmonari RAMP1+ nei diversi gruppi è stato valutato mediante colorazione immunofluorescente multicolore. I risultati hanno dimostrato che, rispetto al gruppo di controllo normale, il numero di ILC2s RAMP1+ totali nei tessuti polmonari del gruppo modello era significativamente aumentato. Rispetto al gruppo modello, il numero di ILC2s polmonari RAMP1+ è ulteriormente aumentato in modo significativo nel gruppo CGRP, mentre risultava notevolmente ridotto sia nel gruppo BIBN-4096 che nel gruppo KAST. In particolare, rispetto al gruppo KAST, il gruppo KAST + CGRP ha mostrato un significativo incremento del numero di ILC2s polmonari RAMP1+, indicando che la reintegrazione esogena di CGRP ha invertito con successo gli effetti inibitori di KAST sulle popolazioni di ILC2s RAMP1+ totali (Figura 5A–B).
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
I set di dati grezzi completi generati e analizzati durante lo studio attuale sono stati depositati in un archivio pubblicamente accessibile. In particolare, questi materiali completi comprendono tutte le scansioni originali complete delle membrane per i saggi di Western blot (WB), tutte le immagini microscopiche grezze complete ad alta risoluzione per gli esami di istologia (HE e IHC) e immunofluorescenza (IF), nonché i set di dati delle singole repliche e i fogli Excel per le quantificazioni. Tutti i dati grezzi sono disponibili pubblicamente al seguente DOI permanente: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32979065. L'ordine di gating per la citometria a flusso è riportato nella Figura supplementare 1. Due immagini complete di blot sono fornite come Figure supplementari 2–3, e i dati quantitativi sono inclusi nel Tabella supplementare 1.
Figura 1: Effetti di KAST sui sintomi e sulla funzione polmonare nei topi AA. (A) Protocollo per l'induzione dell'asma allergico mediante OVA. (B) Statistiche del peso corporeo dei topi in ciascun gruppo, n = 5. (C) Coefficiente polmonare dei topi in ciascun gruppo, n = 5. (D) Numero di strofinamenti nasali nei 10 minuti successivi all'ultimo richiamo, n = 5. (E) Frequenza degli starnuti nei 10 minuti successivi all'ultimo richiamo, n = 5. (F) Valori di Penh nei topi di ciascun gruppo dopo stimolazione con diverse concentrazioni di acetilcolina, n = 5. I dati sono espressi come media ± DS. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. I confronti statistici sono stati effettuati mediante ANOVA a una via o ANOVA a due vie, seguiti da un test post hoc per confronti multipli quando applicabile. n = replicati biologici. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Regolazione del numero di ILC2 e dell'infiammazione delle vie aeree di tipo 2 da parte di KAST nei topi AA. (A) Modifiche morfologiche dei polmoni esaminate mediante colorazione con ematossilina-eosina. Barra della scala = 50 µm. Ingrandimento: 200×. Il punteggio di infiammazione è stato valutato in maniera cieca. (B) Analisi statistica dei punteggi di infiammazione tra i diversi gruppi, n = 5. (C–H) Immagini rappresentative di immunohistochimica e valori medi della densità ottica per l'espressione proteica di IL-4 (C, D), IL-5 (E, F) e IL-13 (G, H) nei tessuti polmonari dei diversi gruppi, n = 5. Barra della scala = 50 µm. Ingrandimento: 200×. (I) Diagrammi rappresentativi di citometria a flusso che mostrano la selezione finale degli ILC2 polmonari nei gruppi Normali, Modello e KAST. Le cellule singole vitali sono state selezionate in sequenza come CD45+ Lineage- (CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G, CD19), seguite da CD90.2+, e gli ILC2 polmonari sono stati infine identificati dall'espressione positiva di KLRG1+. I dati sono stati acquisiti su una piattaforma di citometria a flusso ad alte prestazioni e analizzati utilizzando un software specializzato per l'analisi della citometria a flusso. (J) Analisi degli ILC2 espressa come percentuale di cellule CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ tra le cellule vitali, n = 5. I dati sono riportati come media ± DS. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. I confronti statistici sono stati effettuati mediante ANOVA a un fattore seguita da appropriati test post hoc per il confronto multiplo. n = repliche biologiche. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: KAST inibisce l'espressione di CGRP nei tessuti polmonari di topi AA. (A) Mappa termica dell'espressione genica tra i diversi gruppi, n = 4. (B) Immagini rappresentative di WB per l'espressione di CGRP (10 kDa) e GAPDH (37 kDa) nei tessuti polmonari di ciascun gruppo. (C) Analisi WB dell'espressione proteica di CGRP nei tessuti polmonari, espressa come espressione relativa di CGRP (rapporto CGRP/GAPDH), n = 3. (D) Analisi ELISA dell'espressione proteica di CGRP nei tessuti polmonari, n = 4. I dati sono espressi come media ± DS. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. I confronti statistici sono stati effettuati mediante ANOVA a un fattore seguita da un test post hoc per confronti multipli. n = replicati biologici. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Effetti di KAST sul numero di ILC2 e sull'infiammazione aerea di tipo 2 tramite CGRP in topi AA. (A) Analisi mediante ELISA dell'espressione proteica di CGRP nei tessuti polmonari di diversi gruppi, n = 4. (B) Rappresentazione tipica di grafici di citometria a flusso relativi agli ILC2 (CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺) in ciascun gruppo. (C) Analisi degli ILC2 espressa come percentuale di cellule CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ rispetto alle cellule vitali, n = 5. (D) Modifiche morfologiche dei polmoni analizzate mediante colorazione con ematossilina-eosina (HE). Barra della scala = 50 µm. Ingrandimento: 200×. (E) Analisi statistica dei punteggi di infiammazione tra i diversi gruppi, n = 5. (F–H) Analisi mediante ELISA dell'espressione proteica di IL-4 (F), IL-5 (G) e IL-13 (H) nei tessuti polmonari di diversi gruppi, n = 4. I dati sono espressi come media ± DS. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. I confronti statistici sono stati effettuati mediante ANOVA a un fattore seguita da appropriati test post hoc per confronti multipli. n = replicati biologici. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Effetti di KAST sul numero di ILC2 nei tessuti polmonari tramite la via CGRP/RAMP1. (A) Numero di cellule di ILC2 RAMP1⁺ (definite come cellule triplo-positivie KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺) per campo a 400× nei tessuti polmonari, n = 5. (B) Colorazione fluorescente rappresentativa dei tessuti polmonari. I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu) e l'immunomarcatura è stata eseguita per KLRG1 (viola), GATA3 (rosso) e RAMP1 (verde). Barra della scala = 50 µm. Quantificazione: conteggio manuale di ILC2 RAMP1⁺ (cellule KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺) in modo cieco mediante una piattaforma specializzata di analisi delle immagini. I dati sono espressi come media ± DS. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. I confronti statistici sono stati effettuati mediante ANOVA a un fattore seguita da un test post hoc per confronti multipli. n = replicati biologici. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Esempi di grafici di citometria a flusso che illustrano la strategia di gating sequenziale per l'isolamento degli ILC2 polmonari. Innanzitutto, gli eventi totali sono stati selezionati utilizzando lo scatter in avanti (FSC-A) e lo scatter laterale (SSC-A). Le cellule doppie sono state escluse tramite FSC-A rispetto a FSC-H per ottenere cellule singole. Le cellule vitali sono state identificate come Ghost Dye Red 780⁻ al fine di eliminare le popolazioni di cellule morte. I leucociti sono stati quindi selezionati in base all'espressione di CD45⁺, seguiti dalla selezione di cellule negative per il lineage (Lin⁻). All'interno del sottoinsieme CD45⁺ Lin⁻, le cellule sono state ulteriormente selezionate in base all'espressione di CD90.2⁺, e gli ILC2 polmonari sono stati definiti in definitiva dall'espressione positiva di KLRG1 (KLRG1⁺).Cliccare qui per scaricare il file.
Figura supplementare 2: Immagine rappresentativa di un immunoblot del riferimento interno GAPDH (37 kDa) ottenuto da campioni di tessuto polmonare murino. La densità ottica integrata della banda è stata quantificata mediante il software ImageJ per la successiva normalizzazione.Cliccare qui per scaricare il file.
Figura supplementare 3: Immagine rappresentativa di un immunoblot del target protein CGRP (10 kDa) da campioni di tessuto polmonare di topo. L'espressione relativa di CGRP è stata calcolata dividendo la densità ottica integrata delle bande di CGRP per i corrispondenti valori di densità ottica integrata di GAPDH.Cliccare qui per scaricare il file.
Tabella supplementare 1: Valori dei dati grezzi. Valori dei dati grezzi utilizzati per creare i grafici.Fare clic qui per scaricare il file.
Discussione
Il trattamento dell'AA presenta diversi limiti, tra cui effetti collaterali associati all'uso prolungato di farmaci, un controllo incompleto dei sintomi e ricadute frequenti. Sebbene la farmacoterapia convenzionale sia efficace, spesso è accompagnata da esiti avversi come la dipendenza da steroidi26,27. Al contrario, la KAST offre un'alternativa sicura, economica e conveniente per la gestione dell'AA. Evidenze cliniche hanno dimostrato che la KAST può alleviare efficacemente i sintomi dell'asma modulando la funzione immunitaria polmonare28. In questo studio, abbiamo ulteriormente dimostrato che la KAST attenua l'infiammazione delle vie aeree di tipo 2 nei topi con AA inibendo la via CGRP/RAMP1 e riducendo il numero di ILC2.
L'immunità innata, in particolare le ILC2, svolge un ruolo indispensabile nell'insorgenza, nell'amplificazione e nel mantenimento dell'infiammazione delle vie aeree di tipo 2 nell'AA29. A seguito dell'esposizione a un allergene, le ILC2 rispondono rapidamente agli allarme derivati dall'epitelio, secernendo grandi quantità di IL-5 e IL-13 entro poche ore, innescando così risposte infiammatorie di tipo 230,31. Inoltre, le ILC2 promuovono la differenziazione delle cellule Th2 e la sintesi di IgE, amplificando ulteriormente le risposte immunitarie adattative e aggravando l'infiammazione delle vie aeree32. Studi hanno dimostrato che l'eliminazione genetica delle ILC2 riduce significativamente la durata dell'infiammazione delle vie aeree nei modelli di AA, evidenziandone il ruolo centrale nel mantenimento dell'infiammazione di tipo 218. Le ILC2 sono regolate da citochine (ad esempio, IL-25, IL-33, TSLP), mediatori infiammatori (ad esempio, leucotrieni) e neuropeptidi (ad esempio, CGRP, VIP, NMU)33. Tra questi, i neuropeptidi svolgono ruoli fondamentali nella regolazione dell'immunità innata. La neuromedina U (NMU) potenzia direttamente l'attività delle ILC2, inducendo rapidamente il rilascio di IL-5 e IL-1334. Il peptide intestinale vasodilatatore (VIP) contribuisce all'assunzione di nutrienti e alla regolazione circadiana, promuovendo la produzione di IL-5 da parte delle ILC2 e mantenendo l'omeostasi degli eosinofili33. Il CGRP aumenta notevolmente il rilascio di IL-5 da parte delle ILC2, favorendo così l'infiammazione delle vie aeree nell'AA. In particolare, RAMP1, la subunità recettoriale per il CGRP, è espressa a livelli molto più elevati sulle ILC2 rispetto ai recettori per altri neuropeptidi, suggerendo che il CGRP sia il ligando più potente per l'attivazione delle ILC235. In questo studio, l'analisi trascrittomica ha identificato il CGRP come uno dei neuropeptidi maggiormente differenzialmente espressi nei topi con AA, e saggi a livello proteico ne hanno confermato l'upregolazione nei tessuti polmonari. L'amministrazione esogena di CGRP ha ulteriormente aumentato il numero di ILC2 e il rilascio di citochine di tipo 2, aggravando l'infiammazione delle vie aeree.
Da un punto di vista meccanicistico, il CGRP si lega a RAMP1 sulle ILC2 per regolarne le risposte immunitarie a valle. Sebbene alcune pubblicazioni esistenti descrivano il CGRP come un regolatore negativo che limita l'espansione delle ILC2 per proteggere dall'iper-infiammazione20,21, evidenze contrastanti indicano che il CGRP può collaborare con le alarmina per attivare in modo robusto l'immunità innata di gruppo 2 all'interno di specifici microambienti patologici. I nostri endpoint sperimentali si allineano in particolare con questa cascata, dimostrando un'aumentata infiltrazione delle ILC2 polmonari mediata dal CGRP nel microambiente allergico indotto da OVA. Al contrario, il blocco della via del CGRP mediante l'antagonista recettoriale BIBN-4096 migliora significativamente l'infiammazione delle vie aeree mediata dalle ILC2. Piuttosto che fornire evidenze dirette di ablazione genetica, i nostri risultati si basano su variazioni trascrittomiche associative e su esperimenti paralleli di intervento farmacologico (utilizzando CGRP esogeno e l'antagonista BIBN-4096) per dimostrare che la protezione terapeutica di KAST è strettamente correlata alla soppressione di aggregati di segnalazione CGRP/RAMP1 sulle ILC2.
Nonostante questi risultati promettenti, è necessario riconoscere diverse limitazioni intrinseche. In primo luogo, sebbene il modello murino indotto da OVA fornisca preziosi spunti meccanicistici, potrebbe non riprodurre pienamente il complesso paesaggio fisiopatologico e immunologico dell'asma allergico umano a causa di differenze interspecie. In secondo luogo, la dimensione relativamente ridotta del campione in alcuni saggi esplorativi impone la necessità di coorti più ampie per ottenere una generalizzazione statistica più ampia. In terzo luogo, questo studio ha prioritizzato principalmente l'asse di segnalazione CGRP/RAMP1/ILC2, il che significa che altre potenziali vie di interazione neuro-immunitaria e reti citochiniche sovrapposte meritano un'analisi più approfondita in futuro. In particolare, una limitazione tecnica significativa è l'assenza di un gruppo di controllo con applicazione di un punto fittizio (sham) mediante cerotti non medicati o posizionati in sedi non corrispondenti a punti di agopuntura. Di conseguenza, fattori confondenti non specifici—come lo stress meccanico derivante dalla rasatura, la manipolazione sperimentale e lo stimolo adesivo del cerotto stesso—non possono essere completamente isolati dalle proprietà terapeutiche specifiche della KAST. Per risolvere queste criticità, i nostri futuri percorsi di ricerca includeranno rigorosamente controlli fittizi accuratamente progettati e validazioni multiplo, al fine di consolidare ulteriormente la specificità e la riproducibilità di questi risultati. Per quanto riguarda la riduzione osservata dei livelli proteici di CGRP dopo l'intervento con BIBN-4096, è fondamentale chiarire che, sebbene il BIBN-4096 agisca principalmente come antagonista competitivo del complesso recettoriale RAMP1/CRLR piuttosto che come inibitore diretto della sintesi di CGRP, la sua somministrazione in vivo può ridurre l'accumulo locale del ligando nei tessuti. Questo fenomeno secondario è probabilmente mediato dall'interruzione del circuito di retroazione positiva neuro-immunitario. Bloccando RAMP1 su cellule immunitarie bersaglio come le ILC2, il BIBN-4096 sopprime il rilascio di citochine effettrici, il che a sua volta riduce l'attivazione infiammatoria retrograda delle terminazioni nervose sensoriali e delle cellule neuroendocrine polmonari (PNEC), attenuando così indirettamente la sintesi e il trattenimento tissutale di CGRP.
In sintesi, i nostri risultati empirici dimostrano che KAST modula efficacemente il microambiente immunitario innato polmonare agendo sull'asse neurale CGRP/RAMP1. Sebbene riconosciamo che un'estrapolazione clinica diretta richieda un'ottimizzazione cauta a causa delle differenze biologiche tra roditori e esseri umani, questi risultati forniscono una base meccanicistica fondamentale, finora mancante, che sostiene la tradizionale teoria cinese del "Fei Wai He Pi Mao" (il Polmone collegato a pelle e peli). Offrendo una prospettiva neuro-immunitaria più approfondita, questo protocollo stabilisce un punto di riferimento scientifico affidabile per guidare e sostenere future traduzioni cliniche prospettiche e multicentriche delle terapie tradizionali a base di erbe applicate nei punti di agopuntura per la gestione dell'asma allergico.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation of China (n. 82274632), dal Progetto di coltivazione dei talenti leader della provincia di Jiangsu per la medicina tradizionale cinese (n. SLJ0309), dal Natural Science Foundation della provincia di Jiangsu (n. BK20231381), dal Progetto del Piano di sviluppo scientifico e tecnologico della medicina tradizionale cinese della provincia di Jiangsu (n. ZT202205) e dal Laboratorio chiave di ricerca sull'agopuntura e la medicina del Ministero dell'Istruzione presso l'Università di Medicina Cinese di Nanjing (n. AML202304).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nastro medico traspirante 3M | 3M, USA | 1530C | Fissazione della toppa |
| Cloruro di acetilcolina | Sigma-Aldrich, USA | A6625 | Provocazione bronchiale |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, USA | G2939BA | Valutazione della qualità e integrità dell'RNA |
| Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, USA | (ordine personalizzato) | Immunofluorescenza (secondario) |
| Idrossido di alluminio | Sigma-Aldrich, USA | 239186 | Adiuvante |
| Anticorpo anti-CGRP (coniglio) | Abcam, UK | ab81887 | Western blot / IF |
| Topo BALB/c (femmina, SPF, 8–10 settimane, 18–22 g) | Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd. | B202407260106 | Modello animale |
| BB700 ratto anti-topo CD90.2 (clone 53-2.1) | BD Biosciences, USA | 566465 | Citometria a flusso |
| Citometro a flusso BD FACSCanto II | BD Biosciences, USA | FACSCanto II | Citometria a flusso |
| BIBN-4096 (Olcegepant cloridrato) | MedChemExpress LLC, USA | HY-10095A | Antagonista del recettore CGRP |
| Cocktail biotinilato per linaggio | BD Biosciences, USA | (Personalizzato, cloni come descritti) | Citometria a flusso |
| Streptavidina Brilliant Violet 605 | BD Biosciences, USA | 563260 | Citometria a flusso |
| BSA Albumina Fraxione V | BioFroxx (neoFroxx GmbH), Germania | 4240GR100 | Bloccaggio |
| Proteina Calcitonina/CALCA | MedChemExpress LLC, USA | HY-P77587 | Intervento CGRP |
| Anticorpo CD11c/ITGAX (coniglio) | Abmart, Shanghai, Cina | MU115408S | Immunofluorescenza |
| Tampone di recupero dell'antigene citrato | Boster, Cina | AR0024 | Immunohistochimica |
| Soluzione colorante DAPI | Beyotime, Shanghai, Cina | C1006 | Colorazione nucleare |
| ddH2O (acqua bidistillata) | Sigma-Aldrich, USA | 10977015 | Riconstituzione proteica e dissoluzione di polveri |
| DESeq2 | Bioconductor (pacchetto R) | Versione 1.42.0 | Software per analisi di espressione differenziale |
| DNasi I | Roche Diagnostics, Germania | 10104159001 | Digestione del tessuto polmonare |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam, UK | ab150106 | Immunofluorescenza (secondario) |
| Substrato ECL (Super Femto) | Nanjing Lanken Biotech, Cina | – | Chemiluminescenza nel Western blot |
| Kit per saggio proteico BCA migliorato | Beyotime, Shanghai, Cina | P0010 | Quantificazione proteica |
| Soluzione colorante Eosina Y | Sigma-Aldrich, USA | HT110216 | Storia (colorazione HE) |
| Etilene (Assoluto, grado analitico) | Sinopharm Chemical Reagent, Cina | 10009218 | Disidratazione del tessuto e istologia |
| Anticorpo F4/80 (topo, clone C-7) | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-377009 | Immunofluorescenza |
| fastp | Open Source (GitHub) | Versione 0.23.4 | Software di controllo qualità dei dati grezzi di RNA-seq |
| FITC anti-topo CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences, USA | 553080 | Citometria a flusso |
| FlowJo | BD Biosciences, USA | 10 | Analisi citofluorimetrica |
| Anticorpo monoclonale GAPDH (topo) | Proteintech, Wuhan, Cina | 60004-1-Ig | Western blot |
| Anticorpo GATA3 (topo, clone L50-823) | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-268 | Immunofluorescenza |
| Ghost Dye Rosso 780 | Tonbo Biosciences, USA | 13-0865-T100 | Esclusione delle cellule morte |
| Anticorpo secondario capra anti-coniglio IgG (H+L) cross-adsorbito | Thermo Fisher Scientific, USA | A11008 | Immunofluorescenza (secondario) |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, USA | 10.1.2 | Analisi statistica |
| Soluzione di ematossilina (Harris) | Sigma-Aldrich, USA | HHS16 | Istologia (colorazione HE) |
| HISAT2 | Johns Hopkins University (Open Source) | Versione 2.2.1 | Software di allineamento al genoma di riferimento per RNA-seq |
| Anticorpo secondario capra anti-topo IgG (H+L) coniugato con HRP | Proteintech, Wuhan, Cina | SA00001-1 | Western blot (secondario) |
| Anticorpo secondario capra anti-coniglio IgG (H+L) coniugato con HRP | Proteintech, Wuhan, Cina | SA00001-2 | Western blot (secondario) |
| HTSeq-count | EMBL (utility Python) | Versione 2.0.3 | Utility per il conteggio delle letture per caratteristica genomica in RNA-seq |
| Perossido di idrogeno (H2O2, soluzione al 3%) | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | Bloccaggio della perossidasi endogena |
| Anticorpo capra anti-coniglio IgG coniugato con iFluor™ 488 | Huabio, Cina | HA1121 | Immunofluorescenza (secondario) |
| Anticorpo monoclonale IL-4 | Proteintech, Wuhan, Cina | 66142-1-Ig | Western blot |
| Anticorpo IL13 | Affinity Biosciences, USA | DF6813 | Western blot |
| Anticorpo IL5 | Affinity Biosciences, USA | AF5123 | Western blot |
| Illumina Novaseq 6000 | Illumina, USA | – | Sequenziamento dell'RNA |
| ImageJ | NIH, USA | 1.8 | Quantificazione del Western blot |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, USA | Versione 6.0 | Quantificazione della densità ottica delle immagini |
| Formulazione erboristica KAST | Dipartimento di Farmacia, Ospedale affiliato dell'Università di Medicina Cinese di Nanjing | – | Intervento |
| Anticorpo monoclonale KLRG1 (2F1) | Thermo Fisher Scientific, USA | 58-5893-82 | Immunofluorescenza |
| Leica LAS X | Leica Microsystems, Germania | 4.5 | Quantificazione dell'immunofluorescenza |
| Microscopio confocale Leica STELLARIS 8 DIVE | Leica Microsystems, Germania | STELLARIS 8 | Acquisizione di immagini mediante immunofluorescenza |
| Liberase TM | Roche Diagnostics, Germania | 5401119001 | Digestione del tessuto polmonare |
| Marker (Scala proteica precolorata) | NCM Biotech, Suzhou, Cina | P9001 | Western blot |
| Kit ELISA per CGRP del topo | Aifang Biotechnology, Hunan, Cina | AF2491-A | ELISA |
| Kit ELISA per IL-13 del topo | Aifang Biotechnology, Hunan, Cina | AF-02456M1 | ELISA |
| Kit ELISA per IL-4 del topo | Aifang Biotechnology, Hunan, Cina | AF-02448M1 | ELISA |
| Kit ELISA per IL-5 del topo | Aifang Biotechnology, Hunan, Cina | AF-11729M1 | ELISA |
| Mezzo di montaggio al balsamo neutro | Sinopharm Chemical Reagent, Cina | 10014061 | Montaggio di vetrini istologici |
| Serum normale di capra (per bloccaggio) | Abcam, UK | ab7481 | Bloccaggio per immunohistochimica/IF |
| Composto per inclusione OCT | Sakura, USA | 4583 | Inclusione per criosezioni |
| Kit One-Step PAGE Gel Fast Preparation | Vazyme, Nanjing, Cina | E303-01 | Preparazione del gel SDS-PAGE |
| Albumina di uovo (OVA) | Sigma-Aldrich, USA | A5503 | Sensibilizzazione/sfida |
| Paraformaldeide (4% in PBS) | Biosharp, Cina | BL539A | Fissazione del tessuto |
| PE anti-topo/umano KLRG1 (clone 2F1) | BD Biosciences, USA | 564022 | Citometria a flusso |
| Cocktail inibitore della fosfatasi (50×) | Beyotime, Shanghai, Cina | P1092 | Estrazione proteica |
| Soluzione di poli-L-lisina | Boster, Cina | AR0003 | Rivestimento di vetrini istologici |
| Inibitore di proteasi e fosfatasi | NCM Biotech, Suzhou, Cina | P002 | Estrazione proteica |
| Membrana PVDF (0,22 μm) | Merck Millipore, USA | ISEQ00010 | Western blot |
| Anticorpo policlonale RAMP1 (coniglio) | Proteintech, Wuhan, Cina | 10327-1-AP | Immunofluorescenza |
| Tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) | Beyotime, Shanghai, Cina | C3702 | Preparazione del campione per citometria a flusso |
| Tampone di lisi RIPA (forte) | Beyotime, Shanghai, Cina | P0013B | Estrazione proteica |
| Mezzo RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11875093 | Base per digestione cellulare del tessuto |
| Mezzo di montaggio antifade potenziato SuperKine™ | Wuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd. | BMU104 | Montaggio per immunofluorescenza |
| Triton X-100 (detergente) | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | Permeabilizzazione per immunofluorescenza |
| Reagente TRIzol | Thermo Fisher Scientific, USA | 15596026 | Estrazione dell'RNA |
| Kit VAHTS Universal V10 per la preparazione di librerie RNA-seq | Vazyme, Nanjing, Cina | NR605-01 | Costruzione della libreria RNA-seq |
| Sistema di pletismografia corporea totale | Guangyuanda, Pechino, Cina | WBP-4 | Funzionalità polmonare (Penh) |
| Xilene (grado analitico) | Sinopharm Chemical Reagent, Cina | 10023418 | Deparaffinizzazione e chiarificazione |
Riferimenti
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