Protocollo standardizzato di citometria a flusso multicolore per la valutazione misurabile della malattia residua nella leucemia acuta

Sommario

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro standardizzato di citometria a flusso multicolore per la valutazione misurabile della malattia residua nella leucemia acuta, integrando la lavorazione controllata dei campioni, parametri di acquisizione armonizzati, strategie di gating sequenziali e interpretazione regolata per il denominatore per migliorare la riproducibilità analitica nei laboratori clinici di routine.

Abstract

La malattia residua misurabile (MRD) è un importante indicatore prognostico nella gestione della leucemia acuta. Tuttavia, la valutazione citometrica a flusso multicolore (MFC) di routine rimane vulnerabile a variabilità pre-analitica e analitica, inclusa emodiluzione, profondità di acquisizione incoerente e interpretazione soggettiva. Questo articolo presenta un flusso di lavoro operativo standardizzato per la valutazione di routine della MRD nella leucemia linfoblastica acuta a cellule B (B-ALL) e nella leucemia mieloide acuta (AML). Il protocollo incorpora criteri rigorosi di accettazione del campione, con valutazione integrata dell'emodiluzione, e utilizza un metodo di lisi di globuli rossi in massa per campioni di midollo osseo e sangue periferico. La standardizzazione analitica viene ottenuta tramite panel anticorpali a due tubi e otto colori specifici per la malattia, obiettivi di acquisizione armonizzati che richiedono almeno 500.000 eventi positivi al CD45 e strategie fisse di gating sequenziale. Inoltre, il flusso di lavoro applica limiti di rilevamento (LOD) e quantificazione (LOQ) aggiustati dal denominatore per supportare un sistema di reportistica a tre livelli oggettivo. La validazione su 197 campioni clinici ha dimostrato una forte ripetibilità, robusta linearità diluzionale e alta concordanza con sami molecolari ortogonali accoppiati. Collettivamente, questo protocollo fornisce un quadro pratico per il monitoraggio standardizzato delle MRD. per il monitoraggio standardizzato delle MRD nei laboratori clinici di routine integrando una gestione pre-analitica controllata e parametri analitici armonizzati.

Introduzione

Anche dopo aver raggiunto la remissione morfologica, i pazienti con leucemia acuta necessitano di monitoraggio continuo per la presenza misurabile di malattia residua (MRD) per valutare con precisione il rischio di ricaduta. Gli esami morfologici e citopatologici convenzionali non dispongono della sensibilità necessaria per rilevare popolazioni leucemiche residue a basso livello. Di conseguenza, la valutazione della MRD è diventata una componente essenziale del monitoraggio della malattia sia nella leucemia mieloide acuta (LMA) sia nella leucemia linfoblastica acuta a cellule B (B-ALL). Le recenti raccomandazioni dell'European LeukemiaNet sottolineano che una valutazione affidabile della MRD nella LMA dipende dalla standardizzazione tecnica e dalla riproducibilità tra osservatori piuttosto che dalla semplice disponibilità del saggio ^1,2. In B-ALL, la citometria a flusso multicolore (MFC) rimane particolarmente importante per i pazienti senza bersagli molecolari stabili. Studi precedenti hanno dimostrato che approcci citometrici a flusso multicolore standardizzati utilizzando disegni strutturati di pannelli anticorpali possono fornire una rilevazione residua riproducibile^{e sensibile della malattia 3}. La citometria a flusso è ampiamente utilizzata per la sua ampia applicabilità, i tempi di risposta rapidi e la costo-efficacia. Le prestazioni del saggio rimangono fortemente dipendenti dalla preparazione standardizzata del campione, dai parametri di acquisizione e dall'interpretazione dei^{dati 4}.

Una delle principali sfide tecniche nella valutazione del MRD citometrico di flusso è la rilevazione di eventi rari, fortemente influenzata dalla profondità di acquisizione e dal conteggio totale degli eventi. I pannelli di anticorpi identici possono produrre sensibilità analitiche diverse se i campioni vengono acquisiti con dimensioni del^{denominatore incoerenti 5}. La standardizzazione, quindi, va oltre la selezione degli anticorpi e richiede un trattamento armonizzato del campione, la lisi di globuli rossi in massa, la compensazione degli strumenti, obiettivi di acquisizione e strategie di gate. Nei campioni di midollo osseo, l'emodiluzione rappresenta anche una variabile pre-analitica significativa perché la contaminazione del sangue periferico può ridurre artificialmente il carico leucemico residuo^{apparente 6,7}. Inoltre, l'interpretazione degli eventi a bassa frequenza richiede soglie di segnalazione chiaramente definite basate sulla profondità di acquisizione specifica del campione. Studi recenti hanno sottolineato l'importanza dei limiti di rilevamento (LOD) e quantificazione (LOQ) regolati per il denominatore per migliorare la consistenza dell'interpretazione MRD citometrica^{a flusso 8}.

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire un flusso di lavoro standardizzato per la valutazione di routine MRD basata su MFC in B-ALL e AML. Il protocollo integra criteri di accettazione del campione, valutazione dell'emodiluzione, progettazione di panel anticorpali specifici per malattia, preparazione del campione per lisi di massa, obiettivi di acquisizione armonizzati, strategie fisse di accesso sequenziale e criteri di segnalazione adeguati al denominatore in un unico quadro operativo ^9,10. Combinando procedure pre-analitiche e analitiche standardizzate, questo metodo fornisce un approccio pratico e riproducibile per l'implementazione di routine in laboratorio clinico del monitoraggio MRD. La Figura 1 illustra il flusso di lavoro standardizzato pre-analitico e analitico implementato in questo studio. La Tabella 1 riassume le caratteristiche della coorte e del campione dei pazienti con leucemia linfoblastica acuta a cellule B (B-ALL) e leucemia mieloide acuta (AML) arruolati durante il periodo di validazione attraverso finestre di monitoraggio predefinite (fine induzione, consolidamento e pre-HSCT).

Figura 1: Flusso di lavoro standardizzato per la valutazione di routine multicolore del flusso multicolore di MRD. (A) Flusso di lavoro pre-analitico che mostra lo screening dei campioni e la valutazione della qualità attraverso intervalli di monitoraggio predefiniti. (B) Flusso di lavoro analitico dalla lisi di globuli rossi e colorazione degli anticorpi in massa fino al gate sequenziale, interpretazione aggiustata al denominatore e segnalazione finale delle MRD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Demografia consolidata dei pazienti, caratteristiche dei campioni clinici e metriche di acquisizione di routine. Questa singola tabella rivista riassume le caratteristiche cliniche di base della coorte arruolata composta dai casi di leucemia linfoblastica acuta a cellule B (B-ALL) e leucemia mieloide acuta (LMA) e combina la demografia a livello di paziente con le caratteristiche a livello di campione, intervalli di monitoraggio del trattamento, vitalità, punteggi di emodiluzione, profondità di acquisizione e classificazioni misurabili della malattia residua misurabile aggiustata per denominatore. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Protocollo

Tutte le procedure che hanno coinvolto campioni umani sono state eseguite secondo le linee guida istituzionali e approvate dal Comitato Etico del Secondo Ospedale Popolare di Neijiang (Approvazione n. PXTS887192). Lo studio ha utilizzato campioni clinici residui de-identificati ottenuti dopo test diagnostici di routine. Il consenso informato è stato rinunciato perché lo studio non ha influenzato la cura del paziente, l'allocazione dei trattamenti o le procedure di raccolta dei campioni. Le sostanze chimiche, i reagenti e le apparecchiature utilizzate nel protocollo sono elencate nella Tabella dei Materiali.

1. Raccolta di campioni e valutazione pre-analitica

1. Raccogliere aspirati di midollo osseo come tipo di campione preferito per la valutazione della malattia residua misurabile (MRD). Utilizzare campioni di sangue periferico solo quando l'aspirazione del midollo osseo è clinicamente controindicata o durante alcune analisi di sorveglianza e comparazione.
2. Raccogli il campione di midollo osseo durante il primo estrazione del midollo aspirato quando possibile. Evitare successive aspirazioni per minimizzare la contaminazione del sangue periferico e la sottostima della malattia residua a basso livello.
3. Trasferire i campioni in tubi di acido etilenediaminetetraacetico dipotassico (K2-EDTA) o in tubi anticoagulanti sodio-eparina immediatamente dopo la raccolta. Conservare e trasportare i campioni a temperatura ambiente (18–25 °C) e proteggerli dalla luce solare diretta.
   ATTENZIONE: Non mettere in frigorifero gli esemplari.
4. Processare tutti gli esemplari entro 24 ore dalla raccolta. Per gli studi di stabilità, conservare le aliquote per l'analisi ripetuta a 24 ore e 48 ore mantenendo condizioni di conservazione a temperatura ambiente.
5. Verifica l'identificatore del paziente, il tipo di anticoagulante, l'integrità del campione e il tempo di raccolta al momento della ricezione del campione. Esemplari rifiutati che dimostrano coagulazione estesa, emolisi grave o marcata degenerazione cellulare
6. Valutare i campioni di midollo osseo per l'emodiluzione prima dell'interpretazione finale. Calcola un punteggio di emodiluzione semi-quantitativa che varia da 0,00 a 1,00 per stimare la contaminazione del sangue periferico.
7. Determinare questo valore dividendo la proporzione di linfociti maturi per la somma dei progenitori CD34-positivi, dei granulociti immaturi e dei linfociti maturi, dove un quoziente più alto indica un maggiore effetto diluizionale.
   NOTA: Calcolare il punteggio usando la seguente formula:
    
   dove un punteggio più alto indica una maggiore contaminazione del sangue periferico.
8. Classifica i punteggi di emodiluzione come segue: <0,20, accettabile; 0,20–0,39, lievemente emodilutato; e ≥0,40, sostanzialmente emodilutato.
   NOTA: Non assegnare interpretazioni definitive MRD-negative a campioni marcatamente emodilutati a meno che non vengano confermate dimensioni adeguate del denominatore e conservazione dell'architettura precursore del midollo.

2. Preparazione di panel anticorpali specifici per la malattia

1. Prepara pannelli standardizzati di anticorpi a due tubi e otto colori specifici per la malattia per l'analisi B-ALL e AML. Raggiungere la standardizzazione dei pannelli rispettando rigorosamente i marcatori fissi della spina dorsale su tutti i tubi per garantire un stabile gating della popolazione.
2. Utilizzare coniugati fluorocromi coerenti per gli antigeni di linea corrispondenti e seguire rigorosamente i volumi di titolazione raccomandati dal produttore per minimizzare la variabilità della fluorescenza da lotto a lotto.
3. Consulta la Tabella Supplementare 1 per combinazioni di marcatori, assegnazioni di fluorocromo, cloni di anticorpi, volumi di colorazione e parametri di acquisizione.
4. Per la valutazione B-ALL, utilizzare CD19, CD45, CD34, CD10 e CD20 come marcatori della spina dorsale in entrambe le tubette per definire le popolazioni precursori e i modelli di maturazione. Aggiungi CD38, CD58 e CD81 al Tubo 1.
5. Aggiungere CD66c, CD123 e CD73 o CD304 al tubo 2 secondo l'immunofenotipo diagnostico associato alla leucemia stabilito alla valutazione basale.
6. Per la valutazione AML, utilizzare CD45, CD34, CD117, CD13, CD33 e HLA-DR come marcatori della colonna dorsale in entrambi i tubi per definire le popolazioni blastocische e mieloidi immature.
7. Aggiungere CD7 e CD56 al tubo 1 per valutare l'espressione di antigene incrociata. Aggiungere CD11b e CD15 al tubo 2 per valutare le anomalie di maturazione mieloide.

3. Preparazione e colorazione della lisi in massa

1. Trasferire 2,0 mL di midollo osseo ben miscelato o campione di sangue periferico in un tubo di polipropilene da 15 mL. Se il volume del campione è limitato, si utilizza un volume minimo di input di 1,0 mL.
2. Aggiungi 10 mL di tampone di lisi al cloruro di ammonio preriscaldato al campione. Incubare la sospensione per 10 minuti a temperatura ambiente per lisare i globuli rossi.
3. Centrifuga il campione a 500 × g per 5 minuti. Scartare il soprandanante con cura senza disturbare la pellet cellulare nucleata.
4. Risospendere il pellet in 2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente albumina seroica bovina allo 0,5% e 2 mM di acido etilenediaminetetraacetico (EDTA). Ripeti il passaggio di lavaggio una volta se la contaminazione residua da emoglobina rimane visibile.
5. Determinare la concentrazione delle cellule nucleate utilizzando un analizzatore ematologico automatico o il conteggio manuale dell'emocitometro con esclusione del blu di tripano. Si consideri una concentrazione minima di cellule nucleate di 5 × 10⁶ cellule/mL come ottimale per l'acquisizione standard.
   NOTA: Se la resa cellulare scende sotto questa soglia, concentrarsi il campione con una centrifugazione aggiuntiva a 500 × g per 5 minuti e ridurre con attenzione il volume del tamponamento di risospensione per massimizzare la densità cellulare.
6. Aliquota 5 × 10⁶ cellule nucleate per tubo per colorazione di routine. Aumentare l'input a un massimo di 1 × 10⁷ celle per tubo per un'analisi ad alta sensibilità quando il recupero del campione^{consente 6,7}.
7. Aggiungi il cocktail di anticorpi titolato individualmente e il colorante di vitalità riparabile specificato nella Tabella dei Materiali a ogni tubo secondo la configurazione del pannello di colorazione validata. Il pannello di routine validato utilizza 5 μL per ogni anticorpo coniugato con fluorocromo, a meno che la titolazione raccomandata dal produttore non indichi un diverso volume specifico per anticorpi.
8. Assicurarsi che il volume finale di reazione di colorazione sia mantenuto rigorosamente a 100 μL per test per preservare la stechiometria ottimale tra anticorpi e antigeni. Incubare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
9. Lavare le cellule colorate una volta usando il tampone di lavaggio e risospendere il pellet finale in 500 μL di tampone di acquisizione.
10. Prepara controlli di compensazione a singola colorazione utilizzando perle di compensazione lo stesso giorno dell'acquisizione del campione.

4. Configurazione degli strumenti e acquisizione dati

1. Esegui il controllo qualità quotidiano dell'avvio sul citometro di flusso prima di acquisire i campioni del paziente. Verifica fluidica, allineamento laser, prestazioni del rilevatore e valori target di fluorescenza utilizzando perle di calibrazione, seguendo le istruzioni del produttore.
2. Prepara controlli di compensazione a singola colorazione utilizzando gli stessi fluorocromi inclusi nei panel di anticorpi. Regolare la matrice di compensazione prima dell'acquisizione del paziente e confermare che i marcatori della colonna dorsale rimangano entro i range predefiniti del bersaglio di fluorescenza.
3. Utilizzare lo stesso modello di acquisizione, impostazioni del rilevatore, strategia di compensazione e gerarchia di gating per tutti i campioni analizzati durante il periodo di validazione.
   NOTA: Garantire una corretta armonizzazione tra gli strumenti stabilendo valori standardizzati di intensità mediana di fluorescenza bersaglio per tutti i rivelatori utilizzando perle di calibrazione specializzate, e confermare che campioni identici producano profili di fluorescenza comparabili tra le piattaforme prima dell'acquisizione dei dati clinici.
4. Acquisire dati a una portata bassa o moderata per ridurre gli eventi coincidenti e preservare l'accuratezza della rilevazione degli eventi rari. Monitorare continuamente la velocità degli eventi durante l'acquisizione.
5. Acquisire almeno 500.000 eventi nucleati positivi al CD45 per ciascun risultato di MRD segnalabile. Quando la qualità del campione e la stabilità degli eventi lo permettono, estendere l'acquisizione a 1,0–1,5 milioni di eventi totali, specialmente quando si sospetta una malattia residua di basso livello.
6. Pausa o interruzione dell'acquisizione se si verificano instabilità fluidica, ostruzioni del campione, cambiamenti bruschi nella velocità degli eventi o un deterioramento visibile della qualità della dispersione. Refiltrare o remixare il campione quando opportuno, e riacquisire il campione solo dopo che il flusso stabile è stato ristabilito.

5. Accesso sequenziale e interpretazione regolata al denominatore

1. Analizza i dati della citometria in flusso utilizzando software di analisi della citometria a flusso validato. Utilizzare la stessa strategia di gate sequenziale per tutti i campioni per ridurre la variabilità tra operatori.
2. Stabilire modelli di maturazione normali e rigeneranti acquisendo e analizzando indipendentemente una banca di riferimento di almeno 20 campioni di midollo osseo normali o rigeneranti per fungere da modelli di espressione di base.
3. Escludere i detriti usando i parametri di scatter in avanti e di scatter laterale. Isolare le singole cellule applicando una gating tra area di scattering diretta e altezza di scattering diretta.
4. Escludere le celle non vitali utilizzando il cancello di colorante di vitalità indicato nella tabella Materiali. Eliminate regolarmente queste cellule non vitali perché mostrano un legame anticorpale non specifico e possono aumentare artificialmente il rumore di fondo o imitare popolazioni rare e aberranti.
   NOTA: Richiedono una soglia minima di vitalità del 75% per un'analisi ottimale a valle, osservando che i campioni inferiori a questo valore richiedono un'interpretazione cauta riguardo a potenziali artefatti di eventi rari. Definire il denominatore leucocitario tramite la gating su eventi positivi a CD45 con caratteristiche di scattering laterale appropriate.
5. Per i campioni B-ALL, limitare l'analisi al compartimento precursore CD19-positivo. Implementare un quadro alternativo di accesso per i pazienti che ricevono terapie mirate anti-CD19.
6. Spostare la valutazione primaria ai compartimenti positivi al CD22, CD24 o CD34 per catturare la popolazione leucemica indipendentemente dall'espressione del CD19. Valutare i modelli di maturazione di CD34, CD10 e CD20 e identificare popolazioni aberranti utilizzando i modelli di espressione di CD38, CD58, CD81, CD66c, CD123 e CD73 o CD304.
7. Per i campioni AML, definire la regione del blasto o precursore usando l'espressione CD45, side scatter, CD34 e CD117.
8. Valutare l'espressione aberrante o asincrona di marcatori mieloidi e di linea incrociata, inclusi CD13, CD33, HLA-DR, CD7, CD56, CD11b e CD15.
9. Calcola il limite di rilevamento (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) specifici per campione utilizzando il numero totale di eventi acquisiti positivi al CD45 come denominatore:
    
    
10. Classifica l'interpretazione finale della MRD in una delle tre categorie: MRD-positiva, sotto LOD o limitata analiticamente.
    1. Assegnare il risultato come MRD-positivo quando un gruppo chiaro e contiguo di eventi aberranti supera il LOD specifico del campione e dimostra un immunofenotipo internamente coerente distinto dalle popolazioni ematopoietiche normali o in rigenerazione.
       NOTA: Non classificare gli eventi dispersi e non raggruppati come MRD-positivi. Utilizzare un approccio di analisi integrata che combina sia l'immunofenotipo associato alla leucemia (LAIP) tracciato dal campione diagnostico di base sia strategie di riconoscimento di pattern diverse dalla norma (DfN).
    2. Assegnare il risultato come inferiore al LOD quando sono presenti eventi sospetti rari ma non raggiungono la soglia specifica di segnalazione del campione.
    3. Assegnare il risultato come limitato analiticamente quando la dimensione del denominatore è insufficiente, l'emodiluzione è sostanziale, la qualità del campione è scarsa o le limitazioni pre-analitiche o analitiche impediscono un'interpretazione negativa e sicura.
11. Esaminare in modo indipendente tutti i casi MRD-positivi e borderline a basso livello da un secondo analista qualificato.
12. Finalizza l'interpretazione della citometria a flusso prima di esaminare i dati dei comparatori molecolari accoppiati, inclusi i risultati quantitativi della reazione a catena della polimerasi o dei risultati del sequenziamento di nuova generazione.

6. Metodologia di validazione analitica

1. Valutare la ripetibilità analitica preparando aliquote duplicate dalla stessa sospensione cellulare post-lisi. Acquisire e analizzare almeno 30 campioni accoppiati in modo indipendente.
2. Valutare la linearità diluzionale preparando diluizioni seriali su sei livelli all'interno dell'intervallo a basso carico atteso. Confrontare i valori MRD osservati con i valori MRD attesi nella serie di diluizione.
3. Valutare la riproducibilità interoperatori e inter-strumenti analizzando campioni di riferimento tra più operatori qualificati e citometri a flusso armonizzati.
4. Trasformare le percentuali di flusso citometrico e MRD molecolare accoppiato usando la trasformazione log10 prima del confronto statistico. Valutare l'accordo quantitativo utilizzando analisi di correlazione e analisi di Bland-Altman.

Risultati

Caratteristiche del dataset di implementazione di routine

Durante il periodo dello studio, 197 campioni consecutivi hanno superato lo screening di idoneità e la valutazione pre-analitica della qualità ed entrarono nel flusso di lavoro riportabilizzato. La coorte dello studio includeva 98 pazienti, 62 (63,3%) con leucemia linfoblastica acuta a cellule B (B-ALL) e 36 (36,7%) con leucemia mieloide acuta (LMA). La coorte era composta da 64 maschi (65,3%) e 34 femmine (34,7%), con un'età mediana di 32 anni (intervallo interquartile [IQR], 13–49 anni; intervallo, 2–73 anni). La percentuale mediana di esplosioni al valore di base era del 67,2% (IQR, 56,9% – 80,2%).

La maggior parte degli esemplari analizzati erano aspirati di midollo osseo (174/197, 88,3%), mentre quelli di sangue periferico rappresentavano 23/197 (11,7%). Secondo gli intervalli di monitoraggio predefiniti, 86 campioni (43,7%) sono stati raccolti alla fine della terapia di induzione, 65 (33,0%) durante la terapia di consolidamento e 46 (23,4%) prima del trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) (Tabella 1).

La vitalità mediana del campione era dell'88,3% (IQR, 84,4% – 92,6%). Il flusso di lavoro di acquisizione ha prodotto una mediana di 1.116.901 eventi totali (IQR, 908.521–1.258.946) prima della pulizia dei dati. Dopo l'esclusione analitica sequenziale di detriti, doppietti coincidenti e celle non vitali, la strategia di gating ha raggiunto una mediana di 907.325 eventi target positivi a CD45 (IQR, 690.112–1.095.836), con un tempo mediano di acquisizione di 11,9 min. Il punteggio mediano di emodiluzione era 0,20 (IQR, 0,14–0,28). Seguendo l'interpretazione aggiustata per denominatore, 41 campioni (20,8%) sono stati classificati come MRD-positivi e 156 campioni (79,2%) sono stati classificati come inferiori al limite di rilevamento specifico per campione (LOD) (Tabella 1).

Validazione analitica: ripetibilità, linearità e stabilità

Le prestazioni analitiche del flusso di lavoro standardizzato sono state valutate attraverso studi di ripetibilità, linearità diluzionale e stabilità a breve termine (Figura 2). Aliquote duplicate preparate dagli stessi campioni lisati in massa hanno dimostrato una forte ripetibilità, con un coefficiente di variazione duplicato mediano dello 0,101% e un CV al 95° percentile dello 0,222%.

Figura 2: Validazione analitica del flusso di lavoro standardizzato MRD per citometria a flusso multicolore. (A) Distribuzione della vitalità del campione tra i campioni analizzati. (B) Correlazione tra valori MRD attesi e osservati tra esperimenti seriali di diluizione sull'analisi logaritmica. (C) Concordanza tra analisi replicate indipendenti durante la valutazione della ripetibilità. (D) Stabilità delle misurazioni MRD dopo la conservazione a temperatura ambiente a 0 h, 24 h e 48 h. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per valutare il comportamento di rilevamento a basso livello, sono stati analizzati 12 esperimenti di diluizione seriali per un totale di 72 osservazioni nell'intervallo inferiore atteso di MRD. I valori MRD osservati hanno mostrato una forte concordanza con i valori attesi in un'analisi logaritmica (r = 0,999^{, R 2} aggiustato = 0,998, pendenza = 1,009, intercetta = 0,018), indicando una linearità preservata tra intervalli di eventi a bassa frequenza.

I test di stabilità a breve termine hanno mostrato riduzioni progressive della vitalità del campione nel tempo, con la mediana di vitalità che è diminuita dall'89,1% a 0 ore all'84,9% a 24 ore e all'80,6% a 48 ore. Al contrasto, la variazione relativa assoluta mediana del carico MRD è rimasta limitata a 24 ore (6,2%) e 48 ore (12,0%), supportando l'elaborazione di routine entro un intervallo di 24 ore dopo la ricoleczione.

Riproducibilità interoperatorio e inter-strumento

La riproducibilità interoperatoria e inter-strumento è stata valutata utilizzando 24 campioni di riferimento analizzati su più operatori e citometri di flusso armonizzati, generando un totale di 96 valutazioni. La deviazione relativa assoluta mediana dai valori di riferimento era del 13,7%. Questi risultati dimostrano prestazioni analitiche costanti dopo la standardizzazione della preparazione del campione, delle impostazioni di acquisizione e delle strategie di gate sequenziali (Tabella 2).

Tabella 2: Indicatori di validazione analitica e comparazione dei metodi per il flusso di lavoro standardizzato e misurabile della malattia residua. Questa tabella è limitata ai risultati di validazione, tra cui la ripetibilità intra-saggio, la linearità diluizionale, la stabilità a breve termine, la riproducibilità interoperatori e inter-strumenti, e le metriche di confronto dei metodi molecolari ortogonali; non duplica la demografia dei pazienti o le caratteristiche del campione riportate nella Tabella 1. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Applicazione clinica e confronto di metodi ortogonali

È stato effettuato un confronto ortogonale utilizzando 117 campioni accoppiati, inclusi 75 analizzati tramite reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR) e 42 tramite sequenziamento di nuova generazione (NGS). Le valutazioni qPCR hanno monitorato principalmente i trascrizioni di fusione specifiche per malattia stabilite alla diagnosi, inclusi BCR::ABL1, RUNX1::RUNX1T1 e PML::RARA. Gli approcci NGS hanno valutato i riarrangiamenti genici clonali delle immunoglobuline o dei recettori dei T-cell per la leucemia linfoblastica e hanno monitorato le mutazioni somatiche ricorrenti utilizzando pannelli mieloidi mirati per la leucemia mieloide acuta. I valori MRD citometrici a flusso hanno dimostrato una forte correlazione con risultati molecolari accoppiati tra livelli misurabili di malattia (r = 0,893 nell'analisi logaritmica).

L'analisi di Bland-Altman ha dimostrato una differenza logaritmica media di −0,093 con limiti di concordanza che variano da −0,848 a 0,663 (Figura 3). Tra i casi discordanti, è stato identificato un risultato falso negativo tra 25 campioni molecolarmente positivi. Il flusso di lavoro ha mostrato una percentuale di concordanza positiva del 78,1%, una percentuale negativa del 97,6% e un tasso complessivo di concordanza del 92,3%.

Figura 3: Applicazione clinica e validazione ortogonale della valutazione standardizzata della MRD. (A) Distribuzione dei casi MRD-positivi tra gruppi di malattia e intervalli di monitoraggio. (B) Correlazione tra i valori MRD citometrici a flusso e i risultati dei comparatori molecolari accoppiati nell'analisi logaritmica. (C) Analisi Bland-Altman che confronta le misurazioni citometriche a flusso e quelle MRD molecolari accoppiate, con linee orizzontali che indicano il bias medio e i limiti del 95% di concordanza lungo l'intervallo analitico. (D) Distribuzione dei risultati MRD-positivi tra gli intervalli di monitoraggio del trattamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questi risultati dimostrano che il flusso standardizzato di citometria a flusso multicolore ha raggiunto un forte accordo con i test MRD molecolari ortogonali su campioni clinici di routine.

Tabella supplementare 1: Parametri operativi completi per il flusso di lavoro standardizzato per la citometria a flusso multicolore misurabile per la malattia residua. Questa tabella unificata delinea i componenti metodologici essenziali suddivisi in sezioni distinte. La Sezione A dettaglia le configurazioni specifiche dei panel di anticorpi per malattia, in cui la selezione CD73 o CD304 si basa sull'immunofenotipo diagnostico associato alla leucemia di base. La Sezione B delinea gli obiettivi standardizzati di elaborazione pre-analitica del campione e l'acquisizione citometrica a flusso. La Sezione C definisce le soglie di segnalazione rettificate per denominatore insieme ai criteri finali di interpretazione. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

L'obiettivo principale di questo studio era stabilire un flusso di lavoro standardizzato per la valutazione citometrica a flusso multicolore della malattia residua misurabile (MRD) nella leucemia acuta. Una valutazione affidabile della MRD dipende non solo dalla selezione dei pannelli di anticorpi, ma anche dalla gestione coerente del campione, dai parametri di acquisizione e dall'interpretazione dei^{dati 11}. I risultati di questo studio dimostrano che una lavorazione armonizzata dei campioni, una profondità di acquisizione controllata e i criteri di segnalazione adeguati al denominatore possono migliorare la riproducibilità analitica in ambiti di laboratorio clinico di routine. Questi risultati sono coerenti con i recenti tentativi di standardizzare la valutazione MRD citometrica a flusso in diverse istituzioni e operatori¹².

Un elemento importante di questo flusso di lavoro è la procedura di lisi dei globuli rossi a base di cloruro di ammonio. La rilevazione di MRD in eventi rari richiede l'acquisizione di grandi denominatori cellulari per raggiungere una sensibilità analitica adeguata. La preparazione standardizzata della lisi di massa ha permesso un recupero costante di numeri sufficienti di cellule nucleate, spesso superando 1,0–1,5 milioni di eventi acquisiti, mantenendo al contempo una vitalità accettabile del campione. Studi precedenti del Consorzio EuroFlow hanno sottolineato allo stesso modo che è necessario un alto livello di acquisizione di eventi per supportare la rilevazione sensibile e riproducibile di^{MRD 13}. Nei campioni con sensibilità analitica subottimale, la risoluzione dei problemi dovrebbe includere la valutazione del volume del campione, del recupero cellulare e della profondità di acquisizione.

Questo protocollo include anche una valutazione di routine dell'emodiluzione prima di interpretare i risultati MRD-negativi a basso livello. L'emodiluzione rimane una delle principali limitazioni pre-analitiche nei test MRD basati sul midollo osseo, poiché la contaminazione del sangue periferico può ridurre artificialmente il carico leucemico apparente. Incorporare direttamente un punteggio di emodiluzione semi-quantitativo nel flusso di lavoro di reportistica offre una ulteriore salvaguardia contro l'interpretazione errata come falso negativo. Studi precedenti hanno riportato che l'emodiluzione influisce significativamente sull'affidabilità dell'analisi MRD citometrica a flusso nella leucemia mieloide^{acuta 7}. Gli esemplari che dimostrano una notevole emodiluzione (≥0,40) devono quindi essere interpretati con cautela, soprattutto quando la profondità di acquisizione o la conservazione dei precursori del midollo sono inadeguate.

Il confronto ortogonale effettuato in questo studio ha dimostrato un forte accordo complessivo tra i metodi di valutazione del citometrico di flusso e quelli della MRD molecolare. Tuttavia, i casi discordanti sottolineano anche che la citometria a flusso e i saghi molecolari valutano aspetti biologici distinti della malattia residua. Studi precedenti hanno dimostrato che gli spostamenti fenotipici, l'evoluzione clonale e l'ematopoiesi rigenerativa possono contribuire a discrepanze tra le piattaforme^{analitiche 14}. Nel B-ALL, distinguere i precursori leucemici residui dagli ematogoni normali rimane particolarmente difficile a bassi carichi di malattia e richiede un'interpretazione integrata di pattern immunofenotipici multidimensionali piuttosto che anomalie antigeniche^{isolate 15}. Per questo motivo, tutti i casi di MRD borderline e di basso livello in questo flusso di lavoro sono stati esaminati indipendentemente da un secondo analista.

Questo studio presenta diverse limitazioni. Innanzitutto, la validazione veniva eseguita in un'unica istituzione utilizzando un numero limitato di strumenti armonizzati. In secondo luogo, i campioni di sangue periferico sono stati inclusi solo in situazioni cliniche selezionate perché non possono sostituire il midollo osseo per la valutazione di routine post-trattamento della MRD nella maggior parte dei contesti di leucemia acuta. Inoltre, alcuni parametri analitici, tra cui la valutazione dell'emodiluzione e l'interpretazione degli eventi a basso livello, richiedono ancora una revisione esperta dall'operatore nonostante il flusso di lavoro standardizzato. Tuttavia, il protocollo fornisce un quadro pratico per l'implementazione clinica di routine della valutazione standardizzata del MRD a flusso multicolore^16,17. Integrando la valutazione pre-analitica della qualità, strategie di acquisizione armonizzate e criteri di interpretazione adeguati al denominatore, questo flusso di lavoro supporta una segnalazione MRD più riproducibile e clinicamente coerente nella pratica di laboratorio di routine.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acquisition buffer	Laboratory-prepared	PBS contenente 0,5% BSA e 2 mM EDTA; volume di resuspendenza finale 500 µL	Resuspendenza finale prima dell'acquisizione citometrica a flusso
AML Tube 1 anti-CD117-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 104D2; fluorocromo: APC; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Identificazione precoce di mieloide/blasto
AML Tube 1 anti-CD13-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L138; fluorocromo: FITC; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Ancora di lignaggio mieloide
AML Tube 1 anti-CD33-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: P67.6; fluorocromo: PE; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Ancora di lignaggio mieloide
AML Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorocromo: PerCP-Cy5.5; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Marcatore di immaturità
AML Tube 1 anti-CD45-APC-H7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 2D1; fluorocromo: APC-H7; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Marcatore di base dei leucociti e definizione del denominatore
AML Tube 1 anti-CD56-V500 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: NCAM16.2; fluorocromo: V500; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Fenotipizzazione aberrante associata ai blasti
AML Tube 1 anti-CD7-V450 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: M-T701; fluorocromo: V450; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Rilevamento di aberranze inter-lineaggio
AML Tube 1 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: G46-6; fluorocromo: PE-Cy7; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Discriminazione tra maturazione e sottotipo
AML Tube 2 anti-CD117-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 104D2; fluorocromo: APC; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Identificazione precoce di mieloide/blasto
AML Tube 2 anti-CD11b-V450 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: ICRF44; fluorocromo: V450; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Valutazione della discordanza maturativa
AML Tube 2 anti-CD13-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L138; fluorocromo: FITC; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Ancora di lignaggio mieloide
AML Tube 2 anti-CD15-V500 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: HI98; fluorocromo: V500; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Valutazione del pattern mieloide diverso dal normale
AML Tube 2 anti-CD33-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: P67.6; fluorocromo: PE; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Ancora di lignaggio mieloide
AML Tube 2 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorocromo: PerCP-Cy5.5; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Marcatore di immaturità
AML Tube 2 anti-CD45-APC-H7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 2D1; fluorocromo: APC-H7; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Marcatore di base dei leucociti e definizione del denominatore
AML Tube 2 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: G46-6; fluorocromo: PE-Cy7; volume di colorazione: 5 µL/test nel pannello validato di routine a meno che la titolazione dell'anticorpo specifico non differisca	Discriminazione tra maturazione e sottotipo
Ammonium chloride-based red blood cell lysis buffer	Laboratory-prepared / commercial supplier	Ammonium chloride-based lysis buffer; 10 mL/test; 10 min at room temperature	Lisis in massa dei globuli rossi
Analysis software	Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Kaluza 2.1	Analisi dei dati e gating sequenziale
Automated hematology analyzer	Commercial supplier	Automated hematology analyzer used for nucleated cell concentration and viability assessment	Valutazione della concentrazione e della vitalità delle cellule nucleate
B-ALL Tube 1 anti-CD10