Articolo metodologico

Liposomi attivati da luce e raggi X per l'editing genetico controllato e l'erogazione di farmaci

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DOI:

10.3791/71788

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14 agosto 2026

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1EosGene Therapeutics Pty Ltd, 2School of Biomedical Engineering, University of New South Wales, 3Biomedical AI Centre, Centenary Institute and Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 4Centre for Vision Research, Department of Ophthalmology, and Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney, 5Department of Ophthalmology, Westmead Hospital, 6School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering and Information Technology (FEIT), University of Technology Sydney

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive metodi per la fabbricazione di nanoparticelle lipidiche integrate con verteporfina, attivabili mediante luce visibile o radiazione a raggi X, per il rilascio spaziotemporale controllato di ribonucleoproteine CRISPR-Cas9 e agenti chemioterapici, con possibili ricadute traslazionali nelle applicazioni oftalmiche e oncologiche.

Abstract

La terapia fotodinamica (PDT) sfrutta l'attivazione di un fotosensibilizzatore per generare specie reattive dell'ossigeno (ROS), principalmente ossigeno singoletto. Oltre alla citotossicità diretta, questa fotochimica può essere riutilizzata per il rilascio su richiesta di carichi da sistemi di nanocarrier lipidici, consentendo un controllo spaziotemporale sulla somministrazione terapeutica che non è ottenibile con nanoparticelle lipidiche convenzionali. Questo protocollo presenta metodi per la fabbricazione e la caratterizzazione di due formulazioni distinte di nanoparticelle lipidiche integrate con verteporfina (VP): (1) liposomi attivati dalla luce, composti da DOTAP, DOPE, colesterolo e VP, per la somministrazione di complessi ribonucleoproteici (RNP) CRISPR-Cas9; e (2) liposomi attivati dai raggi X, composti da DOTAP, DOPC, VP e nanoparticelle d'oro, per il rilascio controllato di farmaci chemioterapici. A seguito dell'attivazione a 690 nm (luce visibile) o mediante radiazione clinica a raggi X (6 MeV), la VP genera ossigeno singoletto che ossida i componenti lipidici insaturi, destabilizzando la membrana della nanoparticella e rilasciando i carichi incapsulati. Sono forniti protocolli per la formulazione dei liposomi mediante idratazione di film sottile ed estrusione della membrana, caratterizzazione fisico-chimica, valutazione del rilascio del carico indotto da luce e raggi X, knockout genico in vitro in cellule umane e validazione in vivo mediante un sistema reporter visivo quantitativo nel pesce zebra e un modello di tumore xenotrapiantato nel topo. I risultati rappresentativi dimostrano il knockout di circa 326 fibre muscolari lente per embrione di pesce zebra tramite attivazione luminosa e una significativa soppressione della crescita tumorale tramite rilascio di doxorubicina indotto dai raggi X. Il precedente clinico relativo all'attivazione della verteporfina a 689–690 nm nell'occhio motiva la valutazione di questa piattaforma per la somministrazione oftalmica, sebbene la biodistribuzione retinica, la farmacocinetica e la sicurezza in animali di grandi dimensioni restino da stabilire. Questi metodi forniscono un approccio sperimentale con potenziale traslazionale per il rilascio di carichi terapeutici controllato esternamente. 

Introduzione

Le nanoparticelle lipidiche (LNPs) si sono affermate come la piattaforma di somministrazione non virale più clinicamente validata per terapeutici a base di acidi nucleici, come dimostrato dal loro impiego nei vaccini mRNA contro la COVID-191. Tuttavia, le LNP convenzionali rilasciano il loro carico dopo l'internalizzazione cellulare attraverso l'escape endosomiale, senza offrire un controllo esterno sui tempi, sulla localizzazione o sull'entità del rilascio del carico2. L'assenza di un controllo spaziotemporale limita la loro utilizzabilità in applicazioni in cui un rilascio preciso e su richiesta risulta terapeuticamente vantaggioso, tra cui editing genico sito-specifico, chemioterapia mirata in tumori eterogenei e silenziamento genico titolato in organi anatomicamente accessibili come l'occhio3,4.

La terapia fotodinamica (PDT) offre un meccanismo ben consolidato per effetti biologici attivati esternamente. Una volta attivati a specifiche lunghezze d'onda, i fotosensibilizzatori generano ossigeno singoletto (1O2) e altre specie reattive dell'ossigeno (ROS) in grado di ossidare biomolecole vicine5. Il verteporfin (VP), un derivato del benzoporfirina approvato clinicamente come Visudyne per il trattamento fotodinamico della neovascolarizzazione coroideale sottofovalelegata alla degenerazione maculare legata all'età (AMD), si presta particolarmente bene come componente fotosensibilizzante in nanoparticelle6. Il VP viene attivato clinicamente a 689 nm per la terapia fotodinamica oftalmica, stabilendo un precedente consolidato per la somministrazione oculare di luce6,7,8. Il VP presenta un'attività fotodinamica circa quattro volte maggiore rispetto ai derivati ematoporfirinici di prima generazione alle lunghezze d'onda che penetrano nei tessuti6.

Questa doppia funzionalità, per cui il VP agisce contemporaneamente come fotosensibilizzatore approvato a livello clinico e come innesco sensibile alla luce per il rilascio del carico delle nanoparticelle, costituisce la base meccanicistica dei protocolli descritti in questo documento. Quando viene incorporato nel doppio strato lipidico a bassi rapporti molari, il VP genera 1O2 a seguito dell'illuminazione, che, in accordo con la letteratura precedente, si ritiene ossidi le catene aciliche insature dei fosfolipidi, destabilizzando la membrana e rilasciando i carichi incapsulati9. Il breve raggio di diffusione del 1O2 (~20 nm negli ambienti biologici) limita la destabilizzazione della membrana alla vicinanza immediata del fotosensibilizzatore, minimizzando i danni al carico pur alterando in modo efficiente il doppio strato9,10. Inoltre, la modalità di attivazione a raggi X supera il limite di profondità di penetrazione nei tessuti della luce visibile. Quando nanoparticelle d'oro (3–5 nm) vengono co-incorporate nel doppio strato lipidico, l'irradiazione clinica con raggi X (6 MeV) potenzia l'attivazione del VP attraverso il trasferimento di energia mediato da elettroni Auger, estendendo l'applicabilità a tumori profondi11,12. Misure dirette di ossigeno singoletto effettuate utilizzando il Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) confermano che la produzione di 1O2 aumenta con la dose di raggi X ed è potenziata di circa 1,4 volte dal co-carico con nanoparticelle d'oro rispetto al VP da solo11.

Questa piattaforma ha una rilevanza traslazionale particolare per la terapia genica oftalmica. I trattamenti attuali anti-VEGF per la DMAE neovascolare richiedono iniezioni intravitreali frequenti, i cui risultati nel mondo reale peggiorano in caso di sottotrattamento cronico13,14, mentre le terapie geniche emergenti con AAV riducono questo onere ma esprimono l'anti-VEGF in modo costitutivo15,16 e quindi non possono essere titolate né interrotte, un aspetto preoccupante data la correlazione tra soppressione sostenuta del VEGF e atrofia geografica, ischemia retinica e fibrosi17,18. Un approccio basato su CRISPR attivato dalla luce, che utilizza liposomi VP, potrebbe invece consentire un'interruzione mirata del VEGF-A controllata dal clinico e limitata a livello spaziale, fornendo un controllo clinico sulla localizzazione e sui tempi dell'evento iniziale di editing genico, mantenendo al contempo la durata dell'editing genico. Lo stesso principio di rilascio attivato si estende alle distrofie retiniche da geni di grandi dimensioni, come la malattia di Stargardt (ABCA4)19,20, e al melanoma dell'uvea, in cui i meccanismi convergenti di VP si adattano bene alla biologia del tumore21,22.

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire metodi completi e riproducibili per la fabbricazione di nanoparticelle lipidiche integrate con VP, utilizzando due formulazioni distinte: una attivata dalla luce visibile (690 nm) e l'altra da radiazione X, nonché per valutare l'efficacia del rilascio in modelli sperimentali sia in vitro che in vivo. Poiché queste formulazioni differiscono per composizione lipidica, strategia di carico del principio attivo e modalità di attivazione, vengono presentate come protocolli separati. Questo protocollo è destinato a ricercatori che studiano piattaforme di nanoparticelle con rilascio attivato, strategie di somministrazione basate sulla terapia fotodinamica (PDT), modifiche genetiche controllate spaziotemporalmente o sistemi di somministrazione di farmaci oftalmici e oncologici attivati dalla luce.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali che coinvolgevano il pesce zebra sono stati eseguiti in condizioni standard secondo protocolli approvati dal Comitato per l'Etica nella Ricerca sugli Animali della Macquarie University (ARA: 2015-034). Gli esperimenti di xenotrapianto nei topi sono stati eseguiti in conformità con il Comitato per l'Etica sugli Animali della Macquarie University (numero di approvazione 2017/001). Tutte le procedure sono state condotte in conformità con l'Animal Research Act 1985 e il Animal Research Regulation 2010.

Parte A: VP-liposomi attivati dalla luce per il rilascio di CRISPR-Cas9 (basato su Aksoy et al.9)

1. Preparazione di VP-liposomi attivati dalla luce contenenti RNP CRISPR-Cas9

  1. Sciogliere DOTAP, DOPE, colesterolo (Chol) e VP in 500 µL di cloroformio in un matraccio con fondo rotondo di vetro, in un rapporto molare di 1:0,94:1:0,069.
    ATTENZIONE: Il cloroformio è tossico e volatile. Eseguire tutti i passaggi che coinvolgono il cloroformio in una cappa chimica utilizzando idonei dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti in nitrile e occhiali di sicurezza.
  2. Evaporare il cloroformio sotto un flusso di gas argon fino a formare un sottile film lipidico sulla parete del pallone.
  3. Posizionare il pallone sotto vuoto (ad esempio, in un liofilizzatore o in un essiccatore collegato a una pompa per vuoto) per tutta la notte (≥12 h) per rimuovere completamente il solvente residuo.
  4. Preparare la soluzione di idratazione mescolando sgRNA (concentrazione finale 0,01 µM) e proteina Cas9 (concentrazione finale 0,1 mg/mL) in 500 µL di acqua priva di nucleasi9. Incubare preliminarmente sgRNA e Cas9 a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire la formazione del complesso ribonucleoproteico (RNP) prima dell'idratazione.
    NOTA: Il complesso RNP viene caricato durante la fase di idratazione, non aggiunto successivamente alla formazione. Questo garantisce l'incapsulamento all'interno del nucleo acquoso del liposoma.
  5. Idratare il film lipidico essiccato aggiungendo direttamente sul film 500 µL di soluzione RNP e mescolare fino a ottenere una sospensione omogenea. Lasciare la sospensione lipidica idratata a temperatura ambiente per 2 h per consentire un'idratazione completa dei lipidi.
  6. Espellere la sospensione multilamellare risultante 11 volte attraverso una membrana in policarbonato da 200 nm utilizzando un mini estrusore per produrre liposomi unilamellari di dimensioni uniformi9.
    NOTA: per questa formulazione, il metodo di riduzione dimensionale è l'estruzione, non la sonificazione. Far passare la sospensione un numero dispari di volte (11) per assicurare che il prodotto finale si trovi dal lato opposto della membrana rispetto al materiale iniziale, riducendo così la contaminazione con vescicole non estruse.
  7. Conservare i VP-liposomi a 4 °C, al riparo dalla luce. Utilizzarli entro 48 h dalla preparazione per un'attività ottimale. Questo limite operativo di 48 h è conservativo: il rilascio di VP rimane inferiore al 3% nell'arco di 96 h in presenza di FBS al 10%9.
    NOTA: Per applicazioni in vitro e in vivo, preparare e manipolare i liposomi utilizzando una tecnica asettica standard e sterilizzare la sospensione finale mediante filtrazione attraverso un filtro da 0,22 µm prima dell'uso.

2. Caratterizzazione fisico-chimica dei VP-liposomi

  1. Diluire la sospensione di liposomi 1:100 in acqua priva di nucleasi. Misurare il diametro idrodinamico, l'indice di polidispersione (PDI) e il potenziale zeta mediante scattering dinamico della luce (DLS). Eseguire tutte le misurazioni DLS in triplice replicato (n = 3 replicati tecnici) per ogni campione e riportare i valori come media ± deviazione standard.
    NOTA: Le caratteristiche previste per una formulazione di Parte A di successo sono un diametro idrodinamico di 167,5 ± 1,9 nm, PDI < 0,3, potenziale zeta di +28 ± 1,1 mV ed efficienza di incapsulamento di Cas9 di circa il 75,09%. Le caratteristiche fisico-chimiche rappresentative delle formulazioni di successo sono riassunte nella Tabella 1.9
  2. Per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), depositare 10 µL di sospensione di liposomi diluita su una griglia di rame ricoperta di carbonio. Colorare con acetato di uranile al 2% per 20 s. Acquisire le immagini a 100 kV9, ottenendo almeno 10 immagini rappresentative per ogni lotto.
ParametroParte A: VP-liposoma
(azionato da luce)		Parte B: VP/AuNP-liposoma
(azionato da raggi X)
Diametro idrodinamico167,5 ± 1,9 nm~100–150 nm
Indice di polidispersione (PDI)<0,3< 0,3 (tipico)
Potenziale zeta+28 ± 1,1 mVPositivo (basato su DOTAP)
Efficienza di incapsulamentoComplesso RNP Cas9: 75,09%Doxorubicina: caricamento remoto con solfato di ammonio; quantificato dopo lisi con 0,1% Triton X-100
Caricamento di nanoparticelle d'oroNon applicabile156 ± 24 AuNP per liposoma (ICP-MS)
Stabilità del rilascio del carico<3% di rilascio di VP in 96 h in FBS al 10%Stabile per 48 h in presenza di FBS allo 0%, 10%, 25% e 50% e a pH 7,4, 6,0 e 5,0
Condizione di attivazioneIrradiazione con LED a 690 nm, 0,15 mW/cm²Irradiazione clinica con raggi X a 6 MeV
Carico principaleComplesso RNP CRISPR-Cas9Doxorubicina
Modalità di attivazioneLuce visibileRadiazione a raggi X
Applicazione previstaModifica genetica attivataRilascio attivato di farmaco chemioterapico

Tabella 1: Parametri di caratterizzazione fisico-chimica e profili di stabilità delle due formulazioni di liposomi contenenti verteporfina (VP). Caratteristiche rappresentative delle formulazioni, parametri di carico, profili di stabilità e condizioni di attivazione per la formulazione di liposomi a rilascio indotto da luce (Parte A) e per la formulazione di liposomi VP/AuNP a rilascio indotto da raggi X (Parte B). Questi valori forniscono parametri di controllo qualità attesi per una corretta preparazione e caratterizzazione delle formulazioni e possono essere utilizzati come criteri di riferimento per la riproduzione dei protocolli descritti nel presente lavoro.

3. Rilascio del carico attivato dalla luce e misurazione dell'ossigeno singoletto

  1. Per saggi di rilascio attivati dalla luce, preparare liposomi VP utilizzando la stessa formulazione lipidica e il protocollo di idratazione ed estrusione. Distribuire 100 µL della sospensione liposomiale in PBS in un dispositivo di dialisi sospeso in 12 mL di PBS mescolato a 80 giri/min.
  2. Irradiare i campioni con una sorgente luminosa a LED a 690 nm a 0,15 mW/cm2 per intervalli definiti (2, 4 e 6 min)9.
  3. Campionare il dializzato esterno a 0, 1, 3, 6 e 24 h e quantificare il VP rilasciato mediante fluorescenza; ottenere il VP totale lisando un’aliquota equivalente con 0,1% di Triton X-100.
  4. Calcolare il rilascio di VP come Rvp (%) = (Ft − F0)/(Fmax − F0) × 100, dove Ft, F0 e Fmax sono i valori di fluorescenza al tempo t, al valore iniziale e dopo la lisi con Triton, rispettivamente (n = 3).
  5. Confermare la destabilizzazione della membrana misurando la variazione del diametro idrodinamico mediante DLS prima e dopo l'irradiazione.
    NOTA: proteggere tutti i campioni contenenti VP dalla luce ambiente durante la preparazione e lo stoccaggio. Utilizzare provette ambrate o avvolgerli con carta d'alluminio.

4. Trasfezione in vitro e saggio di knockout genico

  1. Seminare le cellule HEK293-GFP (o una linea reporter equivalente) in piastre a 96 pozzetti a una densità tale da raggiungere circa il 70% di confluenza al momento del trattamento. Coltivare le cellule in mezzo completo (DMEM + 10% FBS + 1% penicillina-streptomicina) a 37°C e 5% CO₂2.
  2. Aggiungere nei pozzetti VP-liposomi contenenti RNP di sgRNA/Cas9 anti-GFP a 50 µg/mL. Per l'analisi mediante microscopia a fluorescenza, incubare per 2 h; per l'analisi mediante citometria a flusso, incubare per 1 h.
  3. Sostituire il mezzo con mezzo completo fresco. Irradiare le pozzette trattate con luce LED a 690 nm a 0,15 mW/cm². Per l'analisi mediante microscopia a fluorescenza, irradiare per 2, 4 o 6 minuti; per l'analisi mediante citometria a flusso, irradiare per 4 minuti. Includere controlli al buio (liposomi senza irradiazione) e controlli con sola luce (irradiazione senza liposomi).
  4. Valutare la delezione di GFP a 48 h dal trattamento mediante microscopia a fluorescenza o citometria a flusso.
    NOTA: Gli RNA guida devono essere convalidati prima dell'uso. Nello studio originale, i candidati RNA guida per eGFP sono stati sottoposti a screening per valutarne l'efficienza di taglio mediante analisi di polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP); l'RNA guida selezionato (sg_eGFP_06) ha mostrato un'efficienza di taglio pari all'88,24%. Il rischio di effetti fuori bersaglio è stato ridotto al minimo in silico verificando l'unicità del sito bersaglio (allineamento BLASTN contro il genoma di riferimento mediante Bowtie/Bowtie2, senza tolleranza di mismatch nelle prime dieci basi all'estremità 3'). Non è stata eseguita un'analisi sequenziale a livello genomica per rilevare effetti fuori bersaglio, sebbene tale passaggio sia raccomandato per applicazioni terapeutiche.9.
  5. Per misurare l'efficienza di incapsulamento, centrifugare un campione di liposomi a 15.000 giri/min per 1 h a 4 °C, seguita da filtrazione del soprannatante attraverso un filtro siringa Whatman Anotop 10 da 20 nm.
  6. Quantificare la Cas9 libera (non incapsulata) nel filtrato mediante saggio proteico BCA.
  7. Calcolare l'efficienza di incapsulamento come EE (%) = [(Ctot − Csup) / Ctot] × 100, in cui Ctot è la quantità totale di Cas9 aggiunta e Csup è il Cas9 non incapsulato recuperato nel surnatante. Vedi Tabella 1 per metriche rappresentative delle prestazioni della formulazione e per efficienze di incapsulamento attese.

5. Convalida in vivo: saggio con reporter visivo nel pesce zebra

  1. Preparare la miscela madre per l'iniezione combinando liposomi VP che contengono sgRNA mirato a eGFP e proteina Cas9 nei rapporti indicati nel protocollo originale9. La miscela madre finale da 8 µL contiene 3,5 µL di sgRNA (75 ng/µL), 1,0 µL di proteina Cas9 (500 ng/µL), 2,5 µL di liposomi VP e 1,0 µL di rosso fenolo. Per la miscela madre di controllo, sostituire 2,5 µL di liposomi con acqua priva di nucleasi.
  2. Microiniettare 2 nL della miscela madre nella cellula (non nel tuorlo) di embrioni di zebrafish allo stadio di singola cellula, utilizzando un sistema di microiniezione calibrato9.
    ATTENZIONE: Tutte le operazioni sugli zebrafish devono essere eseguite nel rispetto dei protocolli etici per la sperimentazione animale approvati. Manipolare con delicatezza gli embrioni per ridurre al minimo i danni meccanici durante l'iniezione.
  3. All'età di 2 ore post-fecondazione (hpf), irradiare gli embrioni iniettati con luce LED a 690 nm a un'intensità di 0,15 mW/cm2 per durate definite (ad esempio, 0, 1, 2 e 5 minuti) per attivare il rilascio del carico9.
  4. A 72 hpf, anestetizzare gli embrioni in Tricaine e montarli in agarosio a basso punto di fusione al 1%. Utilizzando la linea transgenica reporter smyhc1:eGFP, quantificare l'eliminazione delle fibre muscolari lente come perdita della fluorescenza di eGFP mediante microscopio a fluorescenza invertito e microscopio confocale.
  5. Acquisire immagini con stack di fuoco e contare le fibre muscolari lente negative per eGFP (eliminate) per ciascun embrione, analizzando tipicamente 16 embrioni per gruppo (ad esempio, in Imaris)9.
    NOTA: Questo saggio fornisce un'analisi visiva e quantitativa dell'efficienza di knockout genico. Nella linea reporter smyhc1:eGFP, le fibre muscolari lente sono normalmente positive per eGFP; un knockout riuscito viene determinato dalla perdita della fluorescenza di eGFP in queste fibre9.

Parte B: VP-liposomi attivati da raggi X per il rilascio di farmaci chemioterapici (basato su Deng et al.11)

6. Preparazione di liposomi VP/AuNP attivati dai raggi X caricati con doxorubicina

  1. Mescolare 350 µL di DOTAP (100 mg/mL in cloroformio) e 370 µL di DOPC (100 mg/mL in cloroformio) in un pallone in vetro a fondo rotondo e portare il volume totale a 1,0 mL con cloroformio11.
    NOTA: nella Parte B si utilizza DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicerolo-3-fosfocolina), non DOPE. Le due formulazioni differiscono per il lipide ausiliario, e questa distinzione è fondamentale per la riproducibilità.
  2. Aggiungere 50 µL di VP (2,3 mg/mL in DMSO) e 40 µL di una sospensione di nanoparticelle d'oro (diametro 3–5 nm) alla miscela lipidica. Questo produce circa 156 ± 24 nanoparticelle d'oro per liposoma, come quantificato mediante ICP-MS11.
    NOTA: le nanoparticelle d'oro devono avere un diametro compreso tra 3 e 5 nm per potersi incorporare nel doppio strato lipidico. Particelle più grandi (ad esempio, 50 nm) non si integreranno nella membrana e non permetteranno il trasferimento di energia da elettroni Auger necessario per l'attivazione a raggi X11.
    NOTA: la formulazione base descritta qui è non mirata. Nello studio di riferimento, è stata introdotta una modifica opzionale a targeting attivo mediante inserimento post-formulativo di DSPE-PEG2000-Folato per indirizzare i liposomi verso cellule tumorali esprimenti recettori per il folato; questo passaggio può essere aggiunto senza alterare il meccanismo fondamentale di rilascio di VP/AuNP11.
  3. Evaporare il cloroformio sotto argon e asciugare sotto vuoto per tutta la notte come descritto nei passaggi 1.2–1.3.
  4. Idratare il film lipidico con 1,0 mL di tampone solfato di ammonio 250 mM (pH 5,5). Vortexare, lasciare la sospensione idratata per tutta la notte, quindi estrudere 11 volte attraverso una membrana in policarbonato da 200 nm11.
  5. Rimuovere il solfato di ammonio libero mediante dialisi contro PBS (pH 7,4) a 4 °C con quattro cambi di tampone, al fine di stabilire un gradiente transmembrana di solfato di ammonio.
  6. Caricare la doxorubicina (Dox) incubando i liposomi dializzati a un rapporto ponderale farmaco/lipide di 1:10 a 60 °C per 1 h11. Il gradiente di solfato di ammonio favorisce l'accumulo di Dox all'interno del liposoma.
  7. Rimuovere la Dox non incapsulata mediante dialisi contro PBS a 4 °C con quattro cambi di tampone.
  8. Caratterizzare i liposomi caricati mediante DLS (dimensione attesa: ~100–150 nm) e misurare l'efficienza di incapsulamento lisando i liposomi con 0,1% di Triton X-100 e quantificando la fluorescenza di Dox (eccitazione a 485 nm, emissione a 590 nm).
    NOTA: le formulazioni della Parte B di successo mostrano tipicamente un diametro idrodinamico di circa 100–150 nm, PDI < 0,3 e incorporazione di circa 156 ± 24 nanoparticelle d'oro per liposoma. Le caratteristiche fisico-chimiche rappresentative sono riassunte nella Tabella 1.11

7. Rilascio del farmaco innescato dai raggi X e citotossicità in vitro

  1. Irradiare liposomi VP/AuNP-caricati con calceina utilizzando un acceleratore lineare clinico (fascio di fotoni da 6 MeV) a dosi definite (1, 2 e 4 Gy)11. Quantificare il rilascio del carico misurando la fluorescenza della calceina (eccitazione a 485 nm, emissione a 510 nm) e ottenere il rilascio totale dopo la rottura con Triton X-100 allo 0,1%."
  2. Per i saggi di citotossicità, seminare cellule tumorali colorettali umane HCT116 in piastre a 96 pozzetti (ad esempio, 2 × 104 cellule/mL in FBS al 10%).
  3. Trattare le cellule con liposomi VP/AuNP-caricati con Dox e irradiare con raggi X come descritto in precedenza, includendo controlli con solo LipoDox, solo raggi X e non trattati. Valutare la vitalità cellulare mediante saggio MTS a 0, 2, 4 e 24 h dopo l'irradiazione con 4 Gy11.

8. Validazione in vivo: modello di tumore xenotrapiantato nel topo

  1. Inoculare 6–7 topi nudi femmine BALB/c di età settimanale per via sottocutanea nel fianco con 5 × 106 cellule HCT116 in 100 µL di mezzo McCoy’s 5A privo di siero11.
  2. Quando i tumori raggiungono un volume di circa 100 mm3, iniettare liposomi VP/AuNP caricati con Dox (equivalente a 10 mg/kg di Dox) per via intratumorale in un volume di 20 µL11.
  3. Dopo 24 ore dall'iniezione, irradiare i tumori con radiazione a raggi X di 4 Gy (6 MeV) utilizzando un acceleratore lineare clinico con opportuno schermaggio dei tessuti non bersaglio.
  4. Monitorare il volume tumorale ogni 2 giorni mediante calibro digitale. Calcolare il volume tumorale come V = (π/6) × L × W2, dove L è la dimensione maggiore e W è la larghezza perpendicolare11.
  5. All'endpoint sperimentale, escindere i tumori, fissarli in formalina neutra tamponata al 10% e preparare sezioni crioistologiche di 6 µm per l'analisi istologica (colorazione H&E)11.

9. Analisi statistica

  1. I dati quantitativi sono presentati come media ± deviazione standard (DS), salvo diversamente indicato.
  2. Le analisi statistiche per gli studi di knockout genico nel pesce zebra sono state eseguite mediante ANOVA ad un fattore, mentre i confronti tra due gruppi sono stati analizzati utilizzando un test t di Student a due code t-test, come riportato negli studi di origine. La significatività statistica è stata definita come p < 0.05.
  3. Per gli studi sui liposomi attivati dai raggi X, i dati relativi alla crescita del tumore, al peso corporeo, al rilascio del carico e agli esami istologici sono stati analizzati utilizzando il test t di Student t-test come descritti nella pubblicazione originale.
  4. La definizione di n per ogni esperimento è fornito nelle legende delle figure corrispondenti.
  5. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism versione 7.0 (GraphPad Software).
    NOTA: Questo protocollo riproduce flussi di lavoro sperimentali e set di dati rappresentativi di studi precedentemente pubblicati. I lettori dovrebbero fare riferimento alle pubblicazioni originali per i dettagli completi di analisi statistica, laddove applicabile9,11.

Risultati

Modifica genica attivata dalla luce (Parte A):

Seguendo il protocollo della Parte A, i VP-liposomi che incapsulavano il complesso CRISPR-Cas9 RNP hanno mostrato un rilascio del carico dipendente dalla luce. È stato osservato un rilascio minimo in condizioni di buio, mentre l'irradiazione a 690 nm (0,15 mW/cm2) ha prodotto un rilascio dose-dipendente che è aumentato con il tempo di illuminazione (Figura 1A)9. Il saggio con il reporter eGFP nei zebrafish ha fornito un'analisi visiva quantitativa dell'efficienza di knockout genico. Gli embrioni attivati dalla luce hanno mostrato un knockout di 308,37 ± 40,21 fibre muscolari lente positive per eGFP per embrione, rispetto a 53,15 ± 35,38 fibre nei controlli al buio (n = 80), con un aumento fino a 326,12 ± 36,55 fibre dopo 5 minuti di irradiazione (n = 60) (Figura 1B,C)9. In vitro, i VP-liposomi attivati dalla luce hanno ottenuto un silenziamento di GFP paragonabile a quello di Lipofectamine 2000 (riduzione di circa il 53% rispetto al 50%), fornendo in modo unico un controllo spaziotemporale attivato dalla luce (Figura 1C)9. Questi risultati dimostrano un controllo spaziotemporale, poiché la stessa formulazione di nanoparticelle ha prodotto efficienze di knockout marcatamente diverse a seconda dell'esposizione alla luce (Figura 1A–C).

Metodo di editing genico fotochimico; CRISPR-Cas9, microscopia a fluorescenza indotta da LED, risultati sperimentali, misurazione dell'intensità.
Figura 1. Consegna attivata dalla luce del CRISPR-Cas9 e knockout genico spaziotemporale in embrioni di pesce zebra. (A) Illustrazione schematica di liposomi contenenti verteporfina (VP) (DOTAP:DOPE:Col:VP = 1:0,94:1:0,06) che incapsulano complessi di ribonucleoproteina Cas9/sgRNA (RNP). A seguito di irradiazione con luce a 690 nm, la VP genera specie reattive dell'ossigeno che destabilizzano la membrana liposomiale e innescano il rilascio intracellulare del carico di CRISPR-Cas9. (B) Immagini rappresentative di fluorescenza di embrioni di pesce zebra smyhc1:eGFP a 72 h post-fecondazione (hpf) dopo trattamento con liposomi contenenti VP e durate crescenti di esposizione alla luce (0, 1, 2 e 5 min; 690 nm, 0,15 mW/cm2). La perdita della fluorescenza eGFP indica il knockout delle fibre muscolari lente. Gli insetti mostrano ingrandimenti delle regioni riquadrate. (C) Quantificazione dell'intensità di fluorescenza e del numero di fibre muscolari lente knockout per embrione, che dimostra l'attivazione dipendente dalla luce del CRISPR-Cas9 e il conseguente knockout genico. I dati sono espressi come media ± DS. Gli esperimenti sul pesce zebra sono stati analizzati mediante ANOVA ad un solo fattore (n = 80 embrioni per le misurazioni dell'intensità di fluorescenza e n = 60 embrioni per l'analisi del conteggio delle fibre; p < 0,0001). Gli esperimenti di validazione su HEK293-GFP sono stati analizzati mediante test t a due code (n = 4). Le barre della scala corrispondono a 500 µm (immagini d'insieme) e 100 µm (immagini ingrandite). Adattato con permesso da Aksoy et al.9 Copyright © 2020 American Chemical Society. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati subottimali nel saggio con zebrafish possono includere: (a) meno di 50 fibre alterate per embrione, indicativo di una scarsa qualità dei liposomi, di un'attività insufficiente della Cas9 o di una dose di luce subottimale; (b) mortalità degli embrioni superiore al 20%, suggerente un danno meccanico durante la microiniezione o una fototossicità eccessiva del VP; oppure (c) fibre alterate nei controlli non irradiati, indicativo di una fuoriuscita prematura del carico dalla formulazione liposomiale.

Consegna del farmaco attivata dai raggi X (Parte B):

I VP/AuNP-liposomi preparati secondo il protocollo della Parte B hanno mostrato un rilascio dose-dipendente di calceina in un intervallo di 1–4 Gy (Figura 2A,B)11. Nel modello di xeno-trapianto HCT116, i topi trattati con VP/AuNP-liposomi carichi di Dox seguiti da un'irradiazione con raggi X a 4 Gy hanno evidenziato un significativo soppressione della crescita tumorale rispetto alla Dox libera, ai soli raggi X e ai controlli con liposomi non irradiati (Figura 2C)11. L'analisi istologica delle sezioni tumorali ha rivelato aree necrotiche più ampie nel gruppo sottoposto a trattamento combinato, come valutato mediante colorazione H&E (Figura 2D).

Terapia del cancro con liposomi mirati ai raggi X; grafici sul rilascio di calceina, dimensione del tumore, analisi della necrosi.
Figura 2. Rilascio di doxorubicina attivato dai raggi X e soppressione della crescita tumorale. (A) Illustrazione schematica di liposomi contenenti doxorubicina (Dox) e integrati con nanoparticelle d'oro (AuNP) e verteporfina (VP). L'esposizione a radiazioni X attiva la VP tramite trasferimento di energia mediato da AuNP, generando ossigeno singoletto che destabilizza il doppio strato lipidico e induce il rilascio del carico. (B) Profili di rilascio di calceina da liposomi esposti a dosi crescenti di raggi X (0–4 Gy), che dimostrano un rilascio del carico dipendente dalla dose da parte dei liposomi VP/AuNP. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di quattro misurazioni. (C) Misure del volume tumorale (a sinistra) e del peso corporeo (a destra) in topi con xenotrapianti HCT116 trattati con PBS, LipoDox, raggi X soli o LipoDox attivato dai raggi X. I dati sono espressi come media ± DS (n = 4 topi per gruppo). La significatività statistica è stata valutata mediante il test t (P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001). (D) Sezioni tumorali rappresentative colorate con ematossilina ed eosina (H&E) e analisi morfometrica dell'area media di necrosi tumorale. Le frecce indicano regioni necrotiche rappresentative. I diagrammi a scatola mostrano la mediana e l'intervallo interquartile, con i baffi estesi fino a 1,5 × IQR. I dati sono stati analizzati utilizzando il test t (n = 5). Barra della scala = 50 µm. Adattato da Deng et al.11 ai sensi dei termini della licenza Creative Commons Attribuzione 4.0 Internazionale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati subottimali nel modello di xenotrapianto possono includere: (a) nessuna differenza nella crescita tumorale tra i gruppi di liposomi irradiati e non irradiati, indicante un rilascio insufficiente mediato dal VP o un'inadeguata incorporazione delle nanoparticelle d'oro; oppure (b) tossicità sistemica (perdita di peso > 15%), suggerente una fuoriuscita di Dox dai liposomi prima dell'attivazione con raggi X.

Discussione

Diversi passaggi di questi protocolli sono fondamentali per il successo. Nella Parte A, il rapporto molare dei lipidi (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0,94:1:0,06) deve essere mantenuto con precisione, poiché la concentrazione di VP determina direttamente l'intensità della generazione di 1O2 e, di conseguenza, l'efficienza del rilascio del carico9. È essenziale caricare il complesso RNP Cas9/sgRNA durante il passaggio di idratazione, piuttosto che mediante complessazione successiva alla formazione, per garantire l'incapsulamento nel nucleo acquoso. L'estruzione attraverso una membrana in policarbonato da 200 nm (11 passaggi) produce vescicole unilamellari uniformi; la sonicazione non deve essere utilizzata come alternativa, poiché potrebbe denaturare la proteina Cas9. Per la Parte B, la dimensione delle nanoparticelle d'oro (3–5 nm) è fondamentale, poiché le particelle devono essere sufficientemente piccole da integrarsi nel doppio strato lipidico per un efficace trasferimento di energia mediato da elettroni Auger al VP sotto irradiazione a raggi X11. Il metodo basato su gradiente di solfato di ammonio utilizzato per il caricamento della Dox richiede una dialisi completa del solfato di ammonio esterno prima dell'aggiunta del farmaco; una dialisi incompleta ridurrebbe l'efficienza di caricamento.

La composizione lipidica può essere adattata per diverse applicazioni mantenendo invariato il meccanismo di rilascio mediato dal VP. Ad esempio, sostituendo una frazione di DOTAP con un lipide PEGilato (ad es., DSPE-PEG2000 al 5 mol%) si può migliorare il tempo di circolazione per somministrazioni sistemiche, anche se ciò ridurrà la carica superficiale positiva e potrebbe diminuire l'assorbimento cellulare in vitro2. Se le misurazioni DLS mostrano un PDI > 0,3, aumentare il numero di passaggi di estrusione o verificare l'integrità della membrana. Se la generazione di ossigeno singoletto è bassa nonostante un corretto incorporamento del VP, verificare la lunghezza d'onda e la densità di potenza della sorgente luminosa a LED mediante un misuratore di potenza calibrato, poiché l'attivazione del VP è specifica per la lunghezza d'onda (eccitazione massima a 425 nm per la banda Soret e attivazione terapeutica a 689–690 nm per la banda Q)9. Per il saggio nel pesce zebra, se la mortalità degli embrioni supera il 20% nei gruppi trattati, ridurre il volume di iniezione o la concentrazione dei liposomi per minimizzare la fototossicità associata al VP. Un quadro strutturato per la risoluzione dei problemi, basato sui parametri di riferimento della Tabella 1, è il seguente. PDI > 0,3: aumentare il numero di passaggi di estrusione e verificare l'integrità della membrana. Rilascio attivato scarso o assente nonostante un corretto incorporamento del VP: confermare l'uscita a 690 nm con un misuratore di potenza calibrato e verificare il rapporto molare del VP. Meno di circa 50 fibre muscolari a contrazione lenta knockout per embrione: ripreparare i liposomi, confermare l'attività del complesso RNP o aumentare il tempo di irradiazione. Perdita del segnale di eGFP nei controlli non irradiati: controllare le condizioni di conservazione utilizzando i liposomi entro 48 ore dalla preparazione e conservandoli a 4°C al buio, e confermare la stabilità della membrana. Nel modello di xenotrapianto, l'assenza di differenze tra i gruppi trattati con liposomi irradiati e non irradiati indica la necessità di confermare l'inclusione di nanoparticelle d'oro di 3–5 nm e verificare la dose di raggi X somministrata.

La limitazione principale della modalità attivata dalla luce (Parte A) è la profondità di penetrazione della luce a 690 nm, che limita l'attivazione diretta a tessuti superficialmente accessibili o a quelli suscettibili di somministrazione della luce mediante fibre ottiche5. La modalità attivata dai raggi X (Parte B) supera questa limitazione di profondità, ma richiede l'accesso a un acceleratore lineare clinico ed espone i tessuti circostanti a radiazioni ionizzanti, sebbene a dosi terapeutiche11,12. Attualmente, entrambe le formulazioni si basano sul DOTAP, un lipide cationico associato a citotossicità dipendente dalla dose, che potrebbe limitare la finestra terapeutica per la somministrazione sistemica2. La natura transitoria della modifica genica mediata da RNP è vantaggiosa per la sicurezza, ma implica che un'interruzione incompleta in una popolazione cellulare bersaglio non possa essere potenziata mediante dosaggi ripetuti nello stesso sito senza la re-somministrazione di nanoparticelle. Inoltre, questi protocolli sono stati validati in linee cellulari e modelli animali di piccole dimensioni; la traduzione a modelli animali di maggiori dimensioni e, in ultima analisi, all'applicazione clinica nell'uomo richiederà un'ottimizzazione delle formulazioni, studi di farmacocinetica e una valutazione tossicologica formale in condizioni GLP. In particolare, questo protocollo non include dati di farmacocinetica, biodistribuzione o penetrazione retinica. Sebbene la penetrazione della luce attraverso i tessuti oculari e altri sia ben caratterizzata in letteratura in base a lunghezza d'onda, pigmentazione e tipo di tessuto (e possa essere migliorata mediante agenti di chiarificazione ottica), studi quantitativi di farmacocinetica, biodistribuzione e somministrazione retinica rimangono passaggi fondamentali prima che possano essere formulate affermazioni di carattere traslazionale.

I sistemi convenzionali di nanoparticelle lipidiche (LNP), inclusi quelli utilizzati nei vaccini a mRNA, rilasciano il carico in modo passivo dopo l'assorbimento cellulare attraverso l'escape endosomiale, senza offrire alcun controllo temporale o spaziale sul rilascio1,2. I vettori virali come l'AAV consentono un'efficace somministrazione genica, ma presentano limitazioni legate alla capacità di impacchettamento (~4,7 kb), all'immunogenicità in caso di somministrazioni ripetute e all'espressione costitutiva del transgene, che non può essere modulata dopo l'amministrazione3. La piattaforma di liposomi VP affronta tali limitazioni fornendo un meccanismo di rilascio controllabile esternamente, indipendente dal tipo di carico, compatibile con carichi di grandi dimensioni (proteine, complessi RNP e piccole molecole), di tipo non virale e potenzialmente compatibile con somministrazioni ripetute, previa valutazione dell'immunogenicità e della tossicologia in studi con dosi ripetute.  A differenza dei sistemi optogenetici o termoresponsivi, l'approccio basato su VP sfrutta un fotosensibilizzatore già approvato a livello clinico, con dati di sicurezza consolidati e un'infrastruttura laser clinica esistente, in particolare in oftalmologia, dove il laser Visudyne a 689 nm è già uno strumento standard6. Sang et al. hanno inoltre dimostrato che nanoparticelle ibride lipide-polimero contenenti VP aumentano l'efficacia della terapia radiodinamica nei modelli di cancro del colon-retto, confermando l'adattabilità della generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) mediata da VP in diverse architetture di nanoparticelle12.

I metodi descritti in questo articolo hanno una rilevanza particolare per tre condizioni oftalmiche. Nella forma neovascolare della degenerazione maculare legata all'età (AMD), l'onere rappresentato dalle iniezioni anti-VEGF rimane un ostacolo critico per risultati ottimali. Dati provenienti da registri reali mostrano un trattamento notevolmente inferiore rispetto ai protocolli degli studi clinici (una media di 7,3 contro 12 iniezioni nel primo anno, con il 38,8% dei pazienti che interrompe il trattamento e un guadagno minimo dell'acuità visiva)14, oltre a un declino visivo a lungo termine nonostante un dosaggio frequente23. Le terapie geniche con AAV in via di sviluppo per ridurre questo onere—ixoberogene soroparvovec15, ABBV-RGX-31416 e il farmaco 4D-150 designato RMAT (riduzione delle iniezioni dell'83%)24—esprimono comunque transgeni anti-VEGF in modo costitutivo e non possono essere titolati né interrotti. Ciò rappresenta una potenziale preoccupazione, considerando le evidenze che collegano la soppressione continua del VEGF all'atrofia geografica (CATT17; una meta-analisi su 4.609 occhi18; e un aumento della prevalenza di atrofia fino al 78,3% nell'arco di otto anni25). Un sistema di liposomi attivabili dalla luce contenenti verteporfin (VP) e trasportanti CRISPR-Cas9 mirato al gene VEGF-A potrebbe invece consentire un knockout genico localizzato, permettendo al medico di controllare spazialmente e temporalmente l'evento iniziale di editing genico pur mantenendo la durata dell'effetto terapeutico.  Studi preclinici supportano la fattibilità di questo approccio. La co-somministrazione tramite LNP di mRNA per Cas9 e sgRNA mirato al gene VEGFA ha ridotto la neovascolarizzazione coroideale (CNV) indotta da laser nei topi26, varianti di LNP contenenti PEG hanno ottenuto editing genico nell'epitelio pigmentato retinico (RPE)27, e LNP guidati da peptidi hanno veicolato mRNA ai fotorecettori in primati non umani28. Tuttavia, nessuna terapia genica retinica basata su LNP ha ancora raggiunto studi clinici all'inizio del 202629, a sottolineare l'opportunità traslazionale. Nella malattia di Stargardt, la sequenza codificante del gene ABCA4, lunga circa 6,8 kb, supera la capacità di confezionamento dell'AAV, rendendo necessarie strategie con vettori doppi che presentano un'efficienza di trasduzione ridotta19. I candidati clinici includono le piattaforme AAV doppio vettore SB-007 e VG80130, insieme alla terapia modificatrice indipendente dal gene OCU410ST31. La somministrazione non virale di acidi nucleici può aggirare i limiti di confezionamento dell'AAV. Nanoparticelle PEG-ECO contenenti un plasmide ABCA4 hanno ridotto l'accumulo di A2E nei topi Abca4-/-20, mentre altri studi hanno dimostrato la consegna di grandi costrutti di DNA retinico32 e l'espressione mediata da LNP di mRNA in tessuti oculari33. Poiché un trattamento localizzato della macula e della fovea è sufficiente per preservare la visione centrale, i liposomi attivabili dalla luce (VP-liposomi) si prestano bene a veicolare alte concentrazioni di materiale terapeutico genico precisamente in queste regioni. Nel melanoma dell'uvea, il verteporfin agisce attraverso tre meccanismi complementari: citotossicità mediata dalla terapia fotodinamica (PDT), inibizione della via YAP/TAZ (con l'espressione di YAP1 correlata ai marcatori metastatici più forti, monosomia 3 e perdita di BAP1)21, e morte cellulare immunogenica tramite attivazione della via cGAS-STING. La combinazione dell'inibizione di YAP e della PDT mediata dal VP con la terapia anti-PD-L1 ha trasformato tumori immunologicamente freddi in tumori immunologicamente attivi, riducendo in modo significativo la crescita tumorale e prolungando la sopravvivenza nei modelli ortotopici22. Questi risultati sono coerenti con il tasso di risposta dell'80% riportato per la PDT basata sul verteporfin come trattamento primario del melanoma coroideale34. La facile accessibilità ottica dell'occhio all'attivazione a 689 nm, unita alla localizzazione ben definita della maggior parte dei melanomi uveali, posiziona i VP-liposomi come una piattaforma promettente per la somministrazione di trattamenti localizzati, riducendo potenzialmente la morbilità associata agli attuali approcci con brachiterapia e fasci di protoni.

Oltre alle applicazioni oftalmiche e oncologiche discusse in precedenza, la piattaforma di VP-liposomi è applicabile a qualsiasi contesto terapeutico che richieda un rilascio del carico controllato esternamente e su richiesta. Possibili applicazioni includono la modifica genica attivata dalla luce in condizioni dermatologiche accessibili all'illuminazione transcutanea, il rilascio di chemioterapia attivato dai raggi X sincronizzato con i programmi di frazionamento della radioterapia clinica e l'inattivazione genica spazialmente modulata per studi in biologia dello sviluppo. Diversi sistemi di editing genico fotoattivabili sono stati dimostrati in tessuti non retinici, tra cui l'editor di basi fotoattivabile Mag-ABE per la modifica del genoma in vivo con controllo spaziotemporale35 e un sistema di nanoparticelle a conversione ascendente attivate da NIR per l'editing spaziotemporale del CRISPR-Cas9 e per la terapia fotodinamica36. In oftalmologia, l'interesse crescente verso strategie durature di soppressione del VEGF sottolinea ulteriormente la necessità di sistemi di somministrazione che uniscano efficacia terapeutica a lungo termine e controllo esterno sui tempi e sulla localizzazione dell'attività biologica37. L'integrazione di questi metodi di fabbricazione con le tecnologie emergenti di somministrazione di LNP alla retina e con sistemi di editing genico fotoattivabili rappresenta una convergenza di componenti singolarmente validati, la cui applicazione combinata nell'occhio rimane una frontiera di ricerca aperta e potenzialmente ad alto impatto. I lavori in corso nel nostro gruppo sono orientati all'ottimizzazione di formulazioni per vie di somministrazione sottoretinica e intravitreale, alla valutazione dei profili di sicurezza in modelli oculari di grandi animali e all'adattamento della modalità attivata dai raggi X per un uso contemporaneo con i protocolli standard di radioterapia in oncologia clinica.

Dichiarazioni

Y.A.A. è direttore e co-fondatore di EosGene Therapeutics Pty Ltd, azienda che detiene brevetti relativi alla tecnologia di nanoparticelle lipidiche attivate dalla luce descritta nel presente documento. E.M.G. e W.D. sono co-fondatori di EosGene Therapeutics.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano le strutture e l'assistenza tecnica fornite dalla Macquarie University Zebrafish Facility (lavori sui zebrafish) e dal Comitato per l'Etica sugli Animali della Macquarie University. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal Centro di Eccellenza ARC per la Biofotonica su Scala Nanometrica (CE140100003). Gli autori ringraziano inoltre il sostegno di EosGene Therapeutics Pty Ltd.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Membrana filtrante da 20 nm (Anotop 10 o equivalente)Whatman (Cytiva)N/AUtilizzata per la separazione del Cas9 libero durante le misurazioni dell'efficienza di incapsulamento
Sorgente luminosa a LED da 690 nmThorlabsM690L4Sorgente luminosa per innescare il rilascio del carico dai liposomi mediato da VP; densità di potenza regolabile
Antibiotico–Antimicotico (100X)Thermo Fisher Scientific15240062Supplemento per colture cellulari; concentrazione finale al 1%
Cilindro di gas argon e regolatoreN/AN/AUtilizzato per l'evaporazione del solvente durante la preparazione del film lipidico
Avanti Mini ExtruderAvanti Polar Lipids610000Sistema di estrusione manuale utilizzato con membrane in policarbonato da 200 nm per la standardizzazione delle dimensioni dei liposomi
Topi BALB/c nudi (femmine, 5–6 settimane)Animal Resources CentreN/ATopi immunodeficienti utilizzati per il modello di tumore xenotrapiantato HCT116
Kit per saggio proteico BCAThermo Fisher ScientificN/AUtilizzato per la quantificazione del Cas9 libero e per le misurazioni dell'efficienza di incapsulamento
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging SystemBio-Rad Laboratories12003154Sistema di imaging per gel e blotting western
CalceinaSigma-AldrichC0875Colorante fluorescente per saggi di rilascio; autoestingue a concentrazioni elevate
Spettrofotometro UV-Vis-NIR Cary 5000Agilent TechnologiesN/ASpettroscopia di assorbimento UV-Vis di liposomi e verteporfina
Cellule CCD841 CoN (epiteliali normali del colon umano)ATCCCRL-1790Linea cellulare epiteliale del colon normale; utilizzata come controllo non tumorale
CloroformioSigma-Aldrich288306Solvente organico per la preparazione del film lipidico
ColesteroloSigma-AldrichC8667Componente della membrana dei liposomi utilizzato nella formulazione attivata dalla luce
Acceleratore lineare clinico (fascio di fotoni da 6 MeV)Varian Medical SystemsN/ASorgente clinica di raggi X per studi di irradiazione
Calibro digitaleN/AN/AUtilizzato per misurare il volume dei tumori xenotrapiantati
Dimetilsolfossido (DMSO)Sigma-Aldrich472301Solvente per la preparazione della soluzione madre di verteporfina
DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicerolo-3-fosfocolina)Avanti Polar Lipids850375PComponente lipidico utilizzato nella formulazione attivata dai raggi X
DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicerolo-3-fosfoetanolammina)Sigma-AldrichP1223Lipide ausiliario utilizzato nella formulazione attivata dalla luce
DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilammonio-propano)Avanti Polar Lipids890890PLipide cationico utilizzato in entrambe le formulazioni
Cloridrato di doxorubicinaSigma-AldrichD1515Farmaco chemioterapico caricato nei liposomi attivati dai raggi X
DSPE-PEG2000Avanti Polar Lipids880120PLipide PEGilato utilizzato nella formulazione attivata dai raggi X
Mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092Mezzo di coltura cellulare per cellule HEK293 e PC12
Soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190144Buffer di lavaggio
Serum bovino fetale (FBS)Thermo Fisher Scientific10099141Supplemento per colture cellulari; concentrazione finale al 10%
Spectrofluorimetro Fluorolog-Tau3HORIBA ScientificN/ASpettroscopia di fluorescenza per la caratterizzazione della verteporfina
Software per la sovrapposizione a fuoco (ad es. Zerene Stacker)N/AN/AUtilizzato per generare immagini a fuoco sovrapposto nell'imaging del pesce zebra
Liofilizzatore (Alpha 1-4 LDplus)Martin Christ / John Morris ScientificN/AUtilizzato per l'essiccazione sotto vuoto e la rimozione del solvente
sgRNA per GFPThermo Fisher ScientificA35943RNA guida singolo che targetizza eGFP; utilizzato per la validazione dell'eliminazione genica
Nanoparticelle d'oro (3–5 nm, stabilizzate al citrato)NanoComposixN/ARadiosensibilizzatore utilizzato nella formulazione attivata dai raggi X
GraphPad PrismGraphPad Software7.0Analisi statistica e visualizzazione dei dati
Cellule HCT116 (carcinoma colorettale umano)ATCCCCL-247Linea cellulare di cancro al colon-retto utilizzata per studi in vitro e in vivo
Cellule HEK293/GFPGenTargetSC001Linea cellulare stabile esprimente GFP utilizzata per la validazione dell'eliminazione genica CRISPR
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570Colorante nucleare; concentrazione di lavoro di 5 µg/mL
Software per analisi delle immagini (ad es. Imaris)Bitplane (Oxford Instruments)N/AUtilizzato per la quantificazione delle fibre muscolari a contrazione lenta eliminate
ImageJ/FijiNational Institutes of Health (NIH)Open sourceSoftware per l'analisi delle immagini
Microscopio a fluorescenza invertitoLeica MicrosystemsDMi3000Utilizzato per l'imaging del pesce zebra reporter e la valutazione della fluorescenza GFP
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging SystemPerkinElmer128201Sistema di imaging fluorescente in vivo
Microscopio elettronico a trasmissione JEOL JEM-1400JEOLJEM-1400Imaging TEM dei liposomi
Microscopio confocale Leica SP2Leica MicrosystemsN/AImaging confocale dell'assorbimento cellulare
Agarosio a basso punto di fusioneN/AN/AUtilizzato per montare gli embrioni di pesce zebra durante l'imaging
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Reagente di trasfezione utilizzato come controllo positivo
Living Image SoftwarePerkinElmerN/ASoftware per acquisizione e analisi delle immagini
Mezzo McCoy's 5AThermo Fisher Scientific16600082Mezzo di coltura cellulare per cellule HCT116
Sistema di microiniezioneN/AN/AUtilizzato per la microiniezione negli embrioni di pesce zebra allo stadio a una cellula
Saggio di proliferazione cellulare MTSPromegaG3582Saggio di vitalità cellulare
Spettrofotometro NanoDropThermo Fisher ScientificND-2000Misurazioni di purezza e concentrazione dell'RNA
Acqua priva di nucleasiThermo Fisher ScientificR0582Utilizzata per la preparazione del complesso RNP CRISPR-Cas9
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070Mezzo di trasfezione
Paraformaldeide (4%)Sigma-AldrichP6148Fissativo per analisi istologica
Cellule PC12 (feocromocitoma del ratto)ATCCCRL-1721Linea cellulare di tipo neuronale utilizzata per studi di assorbimento
Filtri in membrana di policarbonato (200 nm)Avanti Polar Lipids610006Membrane per estrusione per la dimensionatura dei liposomi
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN74134Kit per l'estrazione dell'RNA
Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG)Thermo Fisher ScientificS36002Probo fluorescente per la rilevazione dell'ossigeno singoletto
Dispositivi di dialisi Slide-A-Lyzer MINI (cutoff di 10 kDa)Thermo Fisher Scientific69570Dispositivi di dialisi per la preparazione dei liposomi e il caricamento del farmaco
Colorante SYBR Gold per gel di acidi nucleiciThermo Fisher ScientificS11494Colorante per gel di acidi nucleici
Pesce zebra Tg(ubi:EGFP)Zebrafish International Resource CenterZDB-GENO-080606-2Pesce zebra transgenico utilizzato per la validazione in vivo di CRISPR
TNF-α (ricombinante umano)Life TechnologiesRTNFAICitochina utilizzata negli studi di induzione di TNFAIP3
TNFAIP3 sgRNAThermo Fisher ScientificN/AsgRNA che targetizza TNFAIP3
Tricaina metansolfonato (MS-222)N/AN/AAnestetico per pesce zebra utilizzato prima dell'imaging
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Detergente utilizzato per la lisi dei liposomi e saggi di rilascio
Proteina Cas9 TrueCut v2Thermo Fisher ScientificA36498Nucleasi Cas9 utilizzata per la preparazione del complesso RNP CRISPR-Cas9
Tripsina-EDTA (0,25%)Thermo Fisher Scientific25200056Reagente per la dissociazione cellulare
Acetato di uranile (2%)Electron Microscopy Sciences22400Colorazione negativa per imaging TEM
VerteporfinaSigma-AldrichSML0534-5MGFotosensibilizzatore incorporato nelle formulazioni lipidiche
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalZEN3600Misurazioni di scattering dinamico della luce e potenziale zeta

Riferimenti

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