Sorafenib più gemcitabina mostra evidenze preliminari di inibizione additiva della proliferazione delle cellule HepG2, mostra modifiche correlate nell'espressione di p-ERK e VEGF e sopprime la crescita del tumore epatico nei topi NOD/SCID.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo di ricerca
* These authors contributed equally
Sorafenib più gemcitabina mostra evidenze preliminari di inibizione additiva della proliferazione delle cellule HepG2, mostra modifiche correlate nell'espressione di p-ERK e VEGF e sopprime la crescita del tumore epatico nei topi NOD/SCID.
Il cancro del fegato rimane una delle principali cause di mortalità correlata al cancro a causa della resistenza ai farmaci e delle opzioni terapeutiche limitate. È urgente esplorare strategie terapeutiche per migliorare i risultati clinici. Questo studio pilota presenta un protocollo per valutare gli effetti potenziali e i meccanismi sottostanti della combinazione di sorafenib e gemcitabina nel cancro del fegato. È stata utilizzata la linea cellulare di carcinoma epatocellulare HepG2 ed è stato sviluppato un modello di xeno-trapianto in topi non obesi diabetici con immunodeficienza severa combinata (NOD/SCID). Vengono illustrate le fasi procedurali principali, tra cui: (1) coltura delle cellule HepG2 e trattamento farmacologico; (2) preparazione, incubazione e lettura dell'assorbanza nel saggio MTT; (3) estrazione delle proteine, elettroforesi su gel di poliacrilamide in presenza di SDS (SDS-PAGE), trasferimento e immunoblotting per ERK e p-ERK; (4) impianto sottocutaneo dello xeno-trapianto in topi NOD/SCID; (5) misurazione del tumore e calcolo del volume; e (6) immunohistochimica per VEGF su sezioni tumorali. Sono forniti passaggi critici, suggerimenti per la risoluzione dei problemi e specifiche dell'apparecchiatura. La combinazione di sorafenib (3 µmol/L) e gemcitabina (10 µmol/L) ha raggiunto un tasso di inibizione del 71,23% ± 6,76% a 72 h, con un valore di q pari a 1,35, suggerendo un effetto sinergico con questa specifica coppia di dosi nelle condizioni testate. Rispetto al gruppo di controllo, il trattamento combinato si è associato a una ridotta espressione di p-ERK, a un volume tumorale diminuito e a una colorazione immunostainante per VEGF qualitativamente più bassa. Questi dati mostrano un'associazione correlativa tra la riduzione dell'espressione di p-ERK e l'effetto antiproliferativo osservato, senza stabilire un rapporto di causalità. Nelle cellule HepG2 e nel modello di xeno-trapianto in topi NOD/SCID, la combinazione di sorafenib e gemcitabina mostra evidenze preliminari di potenziale antiproliferativo ed è associata a una ridotta espressione di VEGF; tuttavia, questo risultato non costituisce una prova diretta di attività antiangiogenica, poiché non sono state eseguite analisi della densità dei microvasi o valutazioni funzionali della vascolarizzazione. Questo protocollo riproducibile fornisce un quadro utile per valutare combinazioni di farmaci nei modelli di carcinoma epatocellulare (HCC) e può essere adattato ad altri regimi terapeutici mirati associati a chemioterapia, sebbene siano necessari ulteriori studi meccanicistici e di validazione delle dosi prima di trarre conclusioni di rilevanza clinica.
Il cancro del fegato è uno dei tumori più comuni e letali, ed è anche uno dei tumori maligni in più rapida crescita1,2. Sebbene l'incidenza del cancro del fegato sia in diminuzione, il carico complessivo di questa neoplasia continua ad aumentare. I dati epidemiologici globali del 2022 hanno rivelato che, secondo il database online del Global Cancer Observatory (GLOBOCAN) 2022, il tasso di incidenza standardizzato per età del cancro del fegato era di 15,0 casi ogni 100.000 abitanti, mentre il tasso di mortalità standardizzato per età era di 26,7 decessi ogni 100.000 abitanti, rendendolo la seconda causa principale di mortalità per cancro3Al momento, a causa della mancanza di trattamenti efficaci contro il cancro del fegato e del suo esordio insidioso, la maggior parte dei pazienti muore entro un anno dalla diagnosi. Il sorafenib è il primo inibitore multi-target delle chinasi approvato per l'uso clinico, che agisce su chinasi tirosina recettoriali come il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFR) e le chinasi serina/treonina.4,5Sorafenib, un inibitore multichinasico orale, esercita effetti antiproliferativi e antiangiogenetici nel cancro del fegato agendo su diversi percorsi dei fattori di crescita. Storicamente, sorafenib è stato la prima terapia sistemica approvata dalla FDA come trattamento di prima linea per pazienti con carcinoma epatocellulare avanzato o non resecabile6. Tuttavia, il panorama attuale dei trattamenti di prima linea per il carcinoma epatocellulare (HCC) avanzato si è notevolmente ampliato. Le opzioni raccomandate includono attualmente la combinazione di inibitori dei checkpoint immunitari atezolizumab più bevacizumab, lenvatinib e la combinazione di immunoterapia doppia durvalumab più tremelimumab, tra le altre. Nonostante questi progressi, sorafenib rimane un'opzione importante di prima linea, in particolare nelle regioni in cui le combinazioni di immunoterapia non sono facilmente disponibili o sono controindicate. Data l'ampia diffusione del suo utilizzo nel cancro del fegato, gli eventi avversi correlati al farmaco hanno rappresentato una preoccupazione7Nell'analisi del database del sistema di segnalazione degli eventi avversi della FDA (FAERS) dal 2006 al 2023, gli eventi avversi associati al sorafenib hanno interessato principalmente l'apparato digerente, la cute e i tessuti sottocutanei, nonché disturbi fisici aspecifici come infezione e lesioni.7. Sebbene alcuni pazienti con carcinoma epatico avanzato possano trarre beneficio dal trattamento con sorafenib, la maggior parte dei pazienti sviluppa alla fine resistenza o insuccesso terapeutico, con conseguente prognosi sfavorevole8,9,10. Nonostante il suo utilizzo, il sorafenib beneficia solo circa il 30% dei pazienti con carcinoma epatocellulare; inoltre, i pazienti che rispondono spesso sviluppano resistenza entro 6 mesi11I percorsi molecolari coinvolti nella resistenza al sorafenib includono la chinasi regolata da segnale extracellulare (ERK)/ERK fosforilata (p-ERK), la proteina chinasi B (Akt), la fosfoinositide 3-chinasi (PI3K)/AKT/mammalian target of rapamycin (mTOR) e il fattore inducibile da ipossia 1α (HIF-1α)/HIF-2αe percorsi correlati all'autofagia, con ERK/p-ERK specificamente evidenziato e selezionato nella presente ricerca11. La gemcitabina è un analogo della citidina che entra nell'organismo producendo difluorocitidina difosfato e difluorocitidina trifosfato, che esercitano diversi effetti inibitori sulla sintesi del DNA12. Nei tumori epatobiliari, la gemcitabina è stata valutata come componente della chemioterapia combinata. Tuttavia, è stato clinicamente riportato che la gemcitabina presenta anche una maggiore resistenza ai farmaci, limitandone l'efficacia.12,13. Pertanto, determinare in modo efficace ed efficiente il regime terapeutico ottimale è estremamente complesso. Studi recenti hanno mostrato che la combinazione di gemcitabina e sorafenib potrebbe presentare un'efficacia terapeutica potenziata, basata sulla previsione mediante un nuovo biomarker della stemness tumorale.14Tuttavia, per quanto ne sappiamo, nessuno studio ha esaminato questa combinazione specificamente nel cancro del fegato utilizzando cellule HepG2 e un modello di xeno-trapianto murino di carcinoma epatocellulare diabetico non obeso/severe combined immunodeficient (NOD/SCID). Pertanto, mancano ancora evidenze sperimentali che convalidino direttamente gli effetti additivi di sorafenib e gemcitabina nel cancro del fegato.
Le procedure descritte in questo manoscritto sono ampiamente utilizzate ma raramente presentate in un formato dettagliato, visivo e passo dopo passo, adatto alla riproduzione da parte di ricercatori alle prime armi. Abbiamo ipotizzato che la combinazione di sorafenib e gemcitabina inibisse in modo additivo la proliferazione delle cellule tumorali epatiche e la crescita del tumore, e che questo effetto fosse associato alla downregolazione della via ERK/p-ERK e alla riduzione dell'angiogenesi mediata dal fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF). Questo studio mira a esplorare preliminarmente l'effetto inibitorio della combinazione di sorafenib e gemcitabina sulla proliferazione della linea cellulare tumorale epatica HepG2 in vitro e in vivo e il relativo meccanismo (Supplementary Figure 1). La novità di questo studio risiede in tre aspetti: (1) è il primo a testare la combinazione sorafenib-gemcitabina specificamente nel cancro del fegato, utilizzando la diffusa linea cellulare HepG2 e un corrispondente modello murino NOD/SCID; (2) indaga la via ERK/p-ERK, finora poco studiata, come meccanismo potenziale; e (3) fornisce evidenze sperimentali dirette—anziché previsioni computazionali—dell'effetto additivo di questa combinazione nel cancro del fegato. Queste caratteristiche distinguono questo lavoro dai precedenti rapporti su terapie combinate condotti in altri tipi di tumore o con modelli sperimentali diversi, in particolare nel contesto di regimi basati sul sorafenib.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
L'approvazione etica è stata rilasciata dal Comitato per il Benessere e l'Etica degli Animali da Laboratorio dell'Università di Zhejiang (Numero di approvazione: ZJU20250049).
Animali e raggruppamento
Un totale di 40 topi femmine NOD/SCID, di 4–5 settimane di età, del peso di 18–20 g, sono stati acquistati da un fornitore commerciale autorizzato (Licenza n. SCXK (Shanghai) 2013-0006) e allevati in stanze per animali di grado specifico patogeno (SPF). Tutti i protocolli sugli animali hanno seguito le linee guida standard. Durante l'esperimento, agli animali è stato consentito nutrirsi e bere liberamente, sono stati allevati in gruppi (5 topi/gabbia) in una stanza SPF ben controllata, con la temperatura mantenuta a 22 ± 2 °C, umidità del 50%–60% e un ciclo luce/buio di 12/12 h. Gli animali hanno ricevuto cibo e acqua ad libitum e il loro peso corporeo è stato monitorato ogni 2 settimane. Quando i topi mostravano dolore persistente, cachessia, ulcere tumorali, quando le dimensioni del tumore raggiungevano una dimensione massima di 2 cm o altri problemi di salute irreversibili, l'eutanasia è stata eseguita mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico allo 0,45% a dosi ≥150 mg/kg di peso corporeo, seguita dalla conferma dell'arresto della respirazione e del battito cardiaco, dalla perdita del riflesso corneale o dall'applicazione di un metodo fisico secondario se necessario, in conformità ai criteri di soppressione umana approvati dal Comitato per l'Etica sugli Animali. La dimensione del campione (n = 10 per gruppo) è stata determinata sulla base di un'analisi della potenza statistica, assumendo un effetto di dimensione pari a 1,2 (derivato da esperimenti pilota), α = 0,05 e β = 0,20 (potenza dell'80%), con un ulteriore margine del 20% per possibili perdite. Le procedure di impianto tumorale sono state eseguite prima dell'assegnazione al trattamento (vedere sotto per l'allestimento dell'impianto eterologo).
I topi sono stati suddivisi casualmente in 4 gruppi mediante il metodo della tabella dei numeri casuali dopo l’impianto tumorale e la conferma dell’attecchimento del tumore: gruppo di controllo, gruppo sorafenib, gruppo gemcitabina e gruppo combinato sorafenib e gemcitabina, con 10 topi (5 topi/gabbia) per ogni gruppo, al fine di costruire il modello di tumore trapiantato in topi NOD/SCID. Poiché i tessuti tumorali durante il processo di modellizzazione possono causare uno stato generale compromesso o addirittura la morte nei topi NOD/SCID, e considerando che l’analisi statistica richiede generalmente una dimensione campionaria efficace, sono stati inclusi almeno 10 topi per gruppo. La suddivisione casuale è stata effettuata da tecnici indipendenti e le gabbie sono state etichettate; non è stato applicato l’abbagliamento durante la somministrazione dei farmaci o la misurazione dei tumori, il che rappresenta una limitazione significativa. Tutti i successivi prelievi di tessuto, valutazioni biochimiche e patologiche sono stati eseguiti da personale di laboratorio in cieco. I dati sono stati inoltre analizzati in maniera cieca da statistici che avevano accesso esclusivamente a file codificati fino al completamento delle analisi statistiche e alla rimozione dell’abbagliamento. Tutti gli animali sono stati inclusi nell’analisi finale. È stata scelta la via intraperitoneale per entrambi i farmaci per garantire un’assorbimento sistemico e una biodisponibilità costante; la somministrazione giornaliera si è basata su precedenti studi farmacocinetici che hanno dimostrato concentrazioni plasmatiche sostenute con questo regime. Il gruppo controllo (veicolo) ha ricevuto un’iniezione intraperitoneale di 0,2 mL di soluzione salina sterile isotonica. Nel gruppo sorafenib, sono stati somministrati per via intraperitoneale 0,2 mL di sorafenib a 40 mg/kg. Nel gruppo gemcitabina, sono stati somministrati per via intraperitoneale 0,2 mL di gemcitabina a 100 mg/kg. Gruppo di trattamento combinato: sono stati somministrati per via intraperitoneale 0,2 mL ciascuno di sorafenib a 40 mg/kg e gemcitabina a 100 mg/kg. Ogni gruppo ha ricevuto il trattamento una volta al giorno per 20 giorni consecutivi. Tutti gli animali sono stati inclusi nell’analisi finale e nessun topo è stato escluso dallo studio. Nessun decesso è stato osservato in alcun gruppo durante il periodo di trattamento di 20 giorni. Il programma e le dosi sono stati scelti sulla base di studi pubblicati su modelli di cancro epatobiliare. Va precisato che la somministrazione intraperitoneale giornaliera di gemcitabina può causare tossicità. La lunghezza e la larghezza dei tumori trapiantati sono state misurate quotidianamente e il volume dei tumori trapiantati è stato calcolato. Dopo 20 giorni, gli animali sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale sotto anestesia profonda e i tessuti tumorali trapiantati sono stati fissati in formalina. Il peso corporeo è stato misurato ogni 2 giorni per tutta la durata dello studio. I topi sono stati monitorati quotidianamente per segni clinici di tossicità, tra cui piloerezione, postura accovacciata, ridotta mobilità, diarrea e letargia. Tuttavia, non sono state eseguite analisi biochimiche del siero (ad esempio, alanina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi e creatinina) né esami istopatologici degli organi principali. Pertanto, non può essere esclusa una tossicità subclinica.
Farmaci e reagenti
Sorafenib è stato disciolto in dimetilsulfossido (DMSO) al 10% e conservato a -20 °C. Prima dell'uso, la soluzione è stata scongelata e diluita fino a una concentrazione finale di DMSO inferiore allo 0,5%, condizione che non ha avuto alcun effetto sulla crescita cellulare. La gemcitabina è stata ottenuta da una fonte commerciale. Il buffer di lisi per saggio di immunoprecipitazione radioattiva (RIPA), il blu di tiazolile, gli anticorpi primari contro la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), ERK, p-ERK e VEGF, gli anticorpi secondari, il mezzo Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio, il siero fetale bovino e la linea cellulare HepG2 sono stati ottenuti da fonti commerciali.
Sorafenib e gemcitabina sono agenti citotossici. Tutte le procedure di preparazione e manipolazione dei farmaci devono essere eseguite all'interno di un armadio a sicurezza biologica dedicato, indossando dispositivi di protezione individuale adeguati (camice da laboratorio, guanti in nitrile e occhiali di sicurezza). Il DMSO, il metanolo, il xilene e altri solventi organici utilizzati in questo protocollo sono sostanze pericolose e devono essere manipolati in una cappa aspirante per evitare inalazione o contatto con la pelle. Le schede dei dati di sicurezza (MSDS) di tutti i reagenti devono essere consultate prima dell'uso.
Cultura cellulare
La linea cellulare HepG2 è stata risvegliata e inoculata in bottiglie per coltura cellulare contenenti 10 mL di mezzo DMEM ad alto contenuto di glucosio (integrato con 10% di siero fetale bovino, 100 U/mL di penicillina-streptomicina e 4 mmol/L di glutammina). Le cellule sono state incubate a 37 °C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO₂. Il mezzo di coltura è stato sostituito ogni 2 giorni e le cellule sono state passaggiate ogni 4 giorni per mantenere una crescita logaritmica. La linea cellulare HepG2 è stata ottenuta da una fonte commerciale; tuttavia, in questo studio non sono state eseguite autenticazioni indipendenti della linea cellulare (ad esempio, analisi del profilo di ripetizioni in tandem corte) né test per la ricerca di micoplasmi.
Metodo MTT per rilevare il tasso di inibizione della proliferazione
Il metodo del bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) è stato utilizzato per determinare il tasso di inibizione della proliferazione di sorafenib e gemcitabina sulla linea cellulare HepG2. Le cellule in fase logaritmica di crescita sono state digerite utilizzando tripsina allo 0,25% per 2 minuti, e la digestione è stata interrotta aggiungendo un volume uguale di mezzo completo. Dopo la centrifugazione a 1000 × g per 10 minuti, le cellule sono state risospese nel mezzo completo. La densità cellulare è stata regolata a 1 × 105 cellule/mL, e 200 µL di sospensione cellulare sono stati seminati in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Questa densità di semina è stata scelta in base a esperimenti preliminari di ottimizzazione in cui sono state testate densità cellulari comprese tra 5 × 103 e 5 × 104 cellule/pozzetto. Una densità di 2 × 104 cellule/pozzetto ha prodotto un aumento lineare dell'assorbanza entro 96 ore e ha mantenuto la confluenza al di sotto dell'80% al termine dell'esperimento, come confermato dall'ispezione visiva al microscopio invertito. Per assicurare che le misurazioni MTT rimanessero entro il range lineare, sono stati effettuati esperimenti pilota in ogni punto temporale con pozzetti di controllo trattati con veicolo. Il mezzo è stato sostituito ogni 48 ore per prevenire l'esaurimento dei nutrienti e l'accumulo di prodotti metabolici secondari. La confluenza è stata monitorata giornalmente mediante microscopio invertito. Dopo 96 ore, i pozzetti di controllo hanno raggiunto una confluenza di circa il 75%–80%, e non sono stati osservati segni evidenti di esaurimento dei nutrienti. Dopo l'adesione cellulare, il mezzo è stato rimosso e aggiunto il mezzo contenente il farmaco. Al gruppo di controllo non trattato è stato aggiunto un mezzo privo di farmaco (controllo veicolo per esperimenti in vivo). L'esperimento è stato suddiviso in un gruppo di controllo non trattato, un gruppo sorafenib, un gruppo gemcitabina e un gruppo con trattamento combinato. Le concentrazioni di sorafenib sono state 1,5 µmol/L, 3 µmol/L, 4,5 µmol/L e 6 µmol/L, mentre quelle di gemcitabina sono state 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/L e 20 µmol/L. Le concentrazioni di sorafenib combinate con gemcitabina sono state 1,5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4,5 µmol/L + 15 µmol/L e 6 µmol/L + 20 µmol/L. Le cellule di ciascun gruppo sono state coltivate per 24 h, 48 h, 72 h e 96 h. Al termine della coltura, sono stati aggiunti 20 µL di MTT (5 mg/mL) in ogni pozzetto, e le cellule sono state incubate per 4 ore in un incubatore cellulare. Il sopranatante è stato accuratamente rimosso, quindi sono stati aggiunti 150 µL di DMSO in ogni pozzetto, e la piastra è stata agitata per 10 minuti per sciogliere completamente il formazano; successivamente, il valore di densità ottica (OD) di ogni pozzetto è stato misurato a 490 nm utilizzando un lettore multifunzionale per micropiastre. L'esperimento è stato ripetuto tre volte, e ogni gruppo comprendeva cinque pozzetti replicati. I dati sono stati espressi come media ± DS dei tre replicati biologici. Il tasso di inibizione della crescita cellulare (%) = (1 - ODgruppo sperimentale / ODgruppo non trattato) × 100%. L'interazione tra i due farmaci è stata valutata mediante il valore q, calcolato con la formula: q = EAB / (EA + EB - EA × EB). In questo caso, EA ed EB rappresentano i tassi di inibizione dei farmaci A e B quando utilizzati singolarmente, mentre EAB è il tasso di inibizione quando i due farmaci sono usati insieme. Quando il valore q è maggiore di 1,15, si indica un effetto sinergico tra i due farmaci; un valore compreso tra 0,85 e 1,15 indica un effetto additivo; un valore q inferiore a 0,85 indica un effetto antagonista. Il metodo del valore q è uno strumento di screening semplice e non sostituisce analisi di sinergia più rigorose. Sono state testate solo alcune coppie di dosi a rapporto fisso, il che limita la robustezza dell'affermazione riguardo alla sinergia. Pertanto, il termine «sinergia» in questo studio si riferisce a un valore q > 1,15 in specifiche coppie di dosi e punti temporali, e non a un'interazione additiva validata su tutta la matrice dose-risposta.
Analisi mediante Western blot dell'espressione proteica di ERK e p-ERK
La coltura cellulare e il raggruppamento sperimentale sono stati eseguiti come descritto in precedenza. Per la rilevazione di ERK e p-ERK mediante Western blot, la dose di sorafenib era di 3 µmol/L; la dose di gemcitabina era di 10 µmol/L; e la dose combinata era di 3 µmol/L + 10 µmol/L. Dopo 72 ore di trattamento, le cellule sono state lisate con buffer di lisi RIPA e le proteine totali sono state estratte da ciascun gruppo sperimentale. La concentrazione proteica è stata determinata mediante il metodo dell'acido bicinconinico (BCA). Quantità uguali di proteine (30 µg per pozzetto) sono state caricate e separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide in presenza di dodecilsolfato di sodio al 10% (SDS-PAGE) a 120 V per 90 minuti. Le proteine sono state trasferite su membrane di difluoruro di polivinilidene (PVDF) (dimensione dei pori 0,45 µm) a 300 mA per 90 minuti a 4 °C. Dopo il blocco con latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata al Tris contenente Tween-20 allo 0,1% (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente, le membrane sono state incubate con gli anticorpi primari tutta la notte a 4 °C con agitazione delicata. Dopo tre lavaggi con TBST (10 minuti ciascuno), le membrane sono state incubate con gli anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un substrato chemiluminescente potenziato (ECL) e acquisite mediante un sistema digitale di imaging su gel. I tempi di esposizione sono stati ottimizzati per ciascun anticorpo per evitare la saturazione. La quantificazione densitometrica è stata effettuata utilizzando il software ImageJ con lo strumento di analisi dei gel. L'intensità di tutte le bande proteiche di interesse è stata normalizzata rispetto a GAPDH come controllo di caricamento, e l'espressione di p-ERK è stata ulteriormente normalizzata rispetto all'espressione totale di ERK. Non sono stati eseguiti ulteriori passaggi di blocco oltre al latte scremato al 5%. I risultati della quantificazione sono stati espressi come variazione di fold rispetto al gruppo di controllo, impostato a 1,0. Ogni esperimento è stato ripetuto in modo indipendente tre volte. Sono mostrati immunoblot rappresentativi.
Rilevamento immunohistochimico dell'espressione di VEGF in tumori xeno innestati di HepG2 in topi NOD/SCID
Per l'instaurazione del xenotrapianto: le cellule HepG2 in fase di crescita logaritmica sono state raccolte mediante tripsinizzazione, lavate due volte con soluzione salina fosfato sterile (PBS) e sospese in DMEM privo di siero. Un totale di 2 × 106 cellule in 0,2 mL di DMEM privo di siero (senza Matrigel) è stato iniettato per via sottocutanea nella regione ascellare destra (zona con ricco apporto ematico) di ciascun topo NOD/SCID utilizzando una siringa da 1 mL, al fine di stabilire un modello di xenotrapianto sottocutaneo di HepG2 in topi NOD/SCID. L'attecchimento tumorale è stato monitorato ogni 2 giorni. Le dimensioni del tumore sono state misurate ogni due giorni e, quando il diametro del tumore ha raggiunto 0,3–0,5 cm (circa 7–10 giorni dopo l'iniezione, definito come punto di inizio del trattamento), i topi sono stati suddivisi casualmente in 4 gruppi per l'esperimento. La lunghezza (L) e la larghezza (W) dello xenotrapianto sottocutaneo sono state misurate ogni giorno mediante calibro digitale e il volume tumorale (V) è stato calcolato secondo la formula: V = (L × W2) / 2. Tutte le misurazioni sono state effettuate da un ricercatore a conoscenza cieca dell'assegnazione ai gruppi. Dopo 20 giorni, gli animali sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale sotto anestesia profonda e il tessuto dello xenotrapianto è stato fissato in formalina neutra tamponata al 10% per 24 h a temperatura ambiente, quindi incluso in paraffina. Sezioni tissutali (spesse 5 µm) sono state ottenute mediante microtomo a rotazione e montate su vetrini rivestiti con poli-L-lisina. Per l'immunohistochimica, le sezioni sono state deparaffinate nello xilene (tre cambi, 5 min ciascuno) e reidratate attraverso una serie alcolica decrescente (100%, 95%, 70%, 50%; 3 min ciascuno). Il recupero dell'antigene è stato effettuato riscaldando le sezioni in tampone citrato di sodio 10 mM in forno a microonde per 15 min, seguito da raffreddamento a temperatura ambiente per 20 min. L'attività perossidasica endogena è stata bloccata con perossido di idrogeno al 3% in metanolo per 10 min a temperatura ambiente. Il legame non specifico è stato bloccato con siero di capra normale al 5% in PBS per 1 h a temperatura ambiente. Le sezioni sono state quindi incubate con anticorpo primario anti-VEGF (diluizione 1 : 200) per tutta la notte a 4 °C in una camera umidificata. Dopo lavaggio con PBS (tre volte, 5 min ciascuno), le sezioni sono state incubate con anticorpo secondario caprino anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (1 : 500) per 1 h a temperatura ambiente. Il segnale è stato rivelato utilizzando il substrato 3,3′-diaminobenzidina (DAB). Le sezioni sono state controstainate con ematossilina per 30 s, disidratate, chiarificate e montate con coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio permanente. L'acquisizione delle immagini è stata effettuata mediante microscopio invertito a fluorescenza con impostazioni in campo chiaro a un ingrandimento di ×100. Sono mostrate immagini rappresentative a scopo illustrativo qualitativo.
Tutte le punte, provette e rifiuti di coltura cellulare contaminati sono stati raccolti come rifiuti biologici e sterilizzati in autoclave prima dello smaltimento. I rifiuti chimici, inclusi soluzioni contenenti farmaci, DMSO, xilene e metanolo, sono stati raccolti in contenitori separati e contrassegnati, e smaltiti in conformità alle normative locali dell'istituto per lo smaltimento dei rifiuti chimici pericolosi.
Analisi statistica
Per l'analisi statistica è stato utilizzato il software SPSS 19.0. I dati sperimentali sono espressi come media ± deviazione standard (DS) di tre replicati biologici indipendenti per gli esperimenti in vitro e come media ± deviazione standard (DS) di n = 10 topi per gruppo per gli esperimenti in vivo. Per il confronto tra due gruppi sono stati utilizzati test t a due code non appaiati. Per il confronto tra più gruppi è stata utilizzata l'analisi della varianza ad un fattore (ANOVA) seguita dal test post hoc di Tukey. Sono stati riportati valori di p < 0,05, p < 0,01 e p < 0,001.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
L'effetto inibitorio di sorafenib e gemcitabina sulla proliferazione delle cellule HepG2
Sorafenib e gemcitabina hanno inibito in modo dose-dipendente la proliferazione delle cellule HepG2, come mostrato nella Tabella 1. La terapia combinata ha mostrato tassi di inibizione significativamente più elevati in tutti i punti temporali rispetto alla monoterapia. L'assay MTT misura l'attività metabolica, che si correla al numero di cellule ma non misura direttamente ...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Il cancro del fegato ha un'elevata mortalità a causa dell'insorgenza subdola, della rapida progressione e della scarsità di trattamenti efficaci3,15. Il cancro epatico avanzato spesso mostra resistenza alla chemioterapia e alla radioterapia, e le opzioni attuali, tra cui la resezione chirurgica e il trapianto di fegato, rimangono insufficienti15,16. La combinazione di due o più farmaci chemioterapici con ...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Gli autori non hanno ringraziamenti.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema digitale di imaging per gel | Bio-Rad Laboratories, Inc., USA | 1708280 | |
| Mezzo DMEM ad alto contenuto di glucosio | HyClone, USA | SH30243.01 | |
| Anticorpo monoclonale da coniglio anti-ERK | Santa Cruz, USA | sc-94 | |
| Serum bovino fetale | Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd., China | 11011-8611/11011-8615 | |
| Microscopio invertito a fluorescenza | Olympus, Japan | IX73 | |
| Anticorpo policlonale da coniglio anti-GAPDH | Santa Cruz, USA | sc-25778 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly and Company | 95058-81-4 | |
| Secondo anticorpo anti-coniglio da capra | Shanghai Shenggong Biological Engineering Co., Ltd., China | D111018 | |
| Software ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.8.0_112 | |
| Lettore di micropiastre | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | MK3 | |
| Anticorpo monoclonale da coniglio anti-p-ERK | Santa Cruz, USA | 9106 | |
| Centrifuga refrigerata | Changsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd. | DL-5M | |
| Tampone di lisi RIPA | Biyuntian Biological Technology Research Institute, China | P0013B | |
| Microtomo rotativo | Leica, Germany | CM3050 | |
| Sorafenib | Bayer Company, Germany | 284461-73-0 | |
| Blu di tiazolile (MTT) | Sigma, USA | M5655 | |
| Incubatore a tre gas | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | 51026402 | |
| Anticorpo monoclonale da coniglio anti-VEGF | BioLegend, USA | B199116 |
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.