Sorafenib più gemcitabina mostra evidenze preliminari di inibizione additiva della proliferazione delle cellule HepG2, mostra modifiche correlate nell'espressione di p-ERK e VEGF e sopprime la crescita del tumore epatico nei topi NOD/SCID.
Articolo di ricerca
Valutazione del trattamento combinato con sorafenib e gemcitabina in cellule HepG2 e in un modello di xenotrapianto in topi NOD/SCID: uno studio pilota
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cancro del fegato rimane una delle principali cause di mortalità correlata al cancro a causa della resistenza ai farmaci e delle opzioni terapeutiche limitate. È urgente esplorare strategie terapeutiche per migliorare i risultati clinici. Questo studio pilota presenta un protocollo per valutare gli effetti potenziali e i meccanismi sottostanti della combinazione di sorafenib e gemcitabina nel cancro del fegato. È stata utilizzata la linea cellulare di carcinoma epatocellulare HepG2 ed è stato sviluppato un modello di xeno-trapianto in topi non obesi diabetici con immunodeficienza severa combinata (NOD/SCID). Vengono illustrate le fasi procedurali principali, tra cui: (1) coltura delle cellule HepG2 e trattamento farmacologico; (2) preparazione, incubazione e lettura dell'assorbanza nel saggio MTT; (3) estrazione delle proteine, elettroforesi su gel di poliacrilamide in presenza di SDS (SDS-PAGE), trasferimento e immunoblotting per ERK e p-ERK; (4) impianto sottocutaneo dello xeno-trapianto in topi NOD/SCID; (5) misurazione del tumore e calcolo del volume; e (6) immunohistochimica per VEGF su sezioni tumorali. Sono forniti passaggi critici, suggerimenti per la risoluzione dei problemi e specifiche dell'apparecchiatura. La combinazione di sorafenib (3 µmol/L) e gemcitabina (10 µmol/L) ha raggiunto un tasso di inibizione del 71,23% ± 6,76% a 72 h, con un valore di q pari a 1,35, suggerendo un effetto sinergico con questa specifica coppia di dosi nelle condizioni testate. Rispetto al gruppo di controllo, il trattamento combinato si è associato a una ridotta espressione di p-ERK, a un volume tumorale diminuito e a una colorazione immunostainante per VEGF qualitativamente più bassa. Questi dati mostrano un'associazione correlativa tra la riduzione dell'espressione di p-ERK e l'effetto antiproliferativo osservato, senza stabilire un rapporto di causalità. Nelle cellule HepG2 e nel modello di xeno-trapianto in topi NOD/SCID, la combinazione di sorafenib e gemcitabina mostra evidenze preliminari di potenziale antiproliferativo ed è associata a una ridotta espressione di VEGF; tuttavia, questo risultato non costituisce una prova diretta di attività antiangiogenica, poiché non sono state eseguite analisi della densità dei microvasi o valutazioni funzionali della vascolarizzazione. Questo protocollo riproducibile fornisce un quadro utile per valutare combinazioni di farmaci nei modelli di carcinoma epatocellulare (HCC) e può essere adattato ad altri regimi terapeutici mirati associati a chemioterapia, sebbene siano necessari ulteriori studi meccanicistici e di validazione delle dosi prima di trarre conclusioni di rilevanza clinica.
Introduzione
Il cancro del fegato è uno dei tumori più comuni e letali, ed è anche uno dei tumori maligni in più rapida crescita1,2. Sebbene l'incidenza del cancro del fegato sia in diminuzione, il carico complessivo di questa neoplasia continua ad aumentare. I dati epidemiologici globali del 2022 hanno rivelato che, secondo il database online del Global Cancer Observatory (GLOBOCAN) 2022, il tasso di incidenza standardizzato per età del cancro del fegato era di 15,0 casi ogni 100.000 abitanti, mentre il tasso di mortalità standardizzato per età era di 26,7 decessi ogni 100.000 abitanti, rendendolo la seconda causa principale di mortalità per cancro3Al momento, a causa della mancanza di trattamenti efficaci contro il cancro del fegato e del suo esordio insidioso, la maggior parte dei pazienti muore entro un anno dalla diagnosi. Il sorafenib è il primo inibitore multi-target delle chinasi approvato per l'uso clinico, che agisce su chinasi tirosina recettoriali come il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFR) e le chinasi serina/treonina.4,5Sorafenib, un inibitore multichinasico orale, esercita effetti antiproliferativi e antiangiogenetici nel cancro del fegato agendo su diversi percorsi dei fattori di crescita. Storicamente, sorafenib è stato la prima terapia sistemica approvata dalla FDA come trattamento di prima linea per pazienti con carcinoma epatocellulare avanzato o non resecabile6. Tuttavia, il panorama attuale dei trattamenti di prima linea per il carcinoma epatocellulare (HCC) avanzato si è notevolmente ampliato. Le opzioni raccomandate includono attualmente la combinazione di inibitori dei checkpoint immunitari atezolizumab più bevacizumab, lenvatinib e la combinazione di immunoterapia doppia durvalumab più tremelimumab, tra le altre. Nonostante questi progressi, sorafenib rimane un'opzione importante di prima linea, in particolare nelle regioni in cui le combinazioni di immunoterapia non sono facilmente disponibili o sono controindicate. Data l'ampia diffusione del suo utilizzo nel cancro del fegato, gli eventi avversi correlati al farmaco hanno rappresentato una preoccupazione7Nell'analisi del database del sistema di segnalazione degli eventi avversi della FDA (FAERS) dal 2006 al 2023, gli eventi avversi associati al sorafenib hanno interessato principalmente l'apparato digerente, la cute e i tessuti sottocutanei, nonché disturbi fisici aspecifici come infezione e lesioni.7. Sebbene alcuni pazienti con carcinoma epatico avanzato possano trarre beneficio dal trattamento con sorafenib, la maggior parte dei pazienti sviluppa alla fine resistenza o insuccesso terapeutico, con conseguente prognosi sfavorevole8,9,10. Nonostante il suo utilizzo, il sorafenib beneficia solo circa il 30% dei pazienti con carcinoma epatocellulare; inoltre, i pazienti che rispondono spesso sviluppano resistenza entro 6 mesi11I percorsi molecolari coinvolti nella resistenza al sorafenib includono la chinasi regolata da segnale extracellulare (ERK)/ERK fosforilata (p-ERK), la proteina chinasi B (Akt), la fosfoinositide 3-chinasi (PI3K)/AKT/mammalian target of rapamycin (mTOR) e il fattore inducibile da ipossia 1α (HIF-1α)/HIF-2αe percorsi correlati all'autofagia, con ERK/p-ERK specificamente evidenziato e selezionato nella presente ricerca11. La gemcitabina è un analogo della citidina che entra nell'organismo producendo difluorocitidina difosfato e difluorocitidina trifosfato, che esercitano diversi effetti inibitori sulla sintesi del DNA12. Nei tumori epatobiliari, la gemcitabina è stata valutata come componente della chemioterapia combinata. Tuttavia, è stato clinicamente riportato che la gemcitabina presenta anche una maggiore resistenza ai farmaci, limitandone l'efficacia.12,13. Pertanto, determinare in modo efficace ed efficiente il regime terapeutico ottimale è estremamente complesso. Studi recenti hanno mostrato che la combinazione di gemcitabina e sorafenib potrebbe presentare un'efficacia terapeutica potenziata, basata sulla previsione mediante un nuovo biomarker della stemness tumorale.14Tuttavia, per quanto ne sappiamo, nessuno studio ha esaminato questa combinazione specificamente nel cancro del fegato utilizzando cellule HepG2 e un modello di xeno-trapianto murino di carcinoma epatocellulare diabetico non obeso/severe combined immunodeficient (NOD/SCID). Pertanto, mancano ancora evidenze sperimentali che convalidino direttamente gli effetti additivi di sorafenib e gemcitabina nel cancro del fegato.
Le procedure descritte in questo manoscritto sono ampiamente utilizzate ma raramente presentate in un formato dettagliato, visivo e passo dopo passo, adatto alla riproduzione da parte di ricercatori alle prime armi. Abbiamo ipotizzato che la combinazione di sorafenib e gemcitabina inibisse in modo additivo la proliferazione delle cellule tumorali epatiche e la crescita del tumore, e che questo effetto fosse associato alla downregolazione della via ERK/p-ERK e alla riduzione dell'angiogenesi mediata dal fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF). Questo studio mira a esplorare preliminarmente l'effetto inibitorio della combinazione di sorafenib e gemcitabina sulla proliferazione della linea cellulare tumorale epatica HepG2 in vitro e in vivo e il relativo meccanismo (Supplementary Figure 1). La novità di questo studio risiede in tre aspetti: (1) è il primo a testare la combinazione sorafenib-gemcitabina specificamente nel cancro del fegato, utilizzando la diffusa linea cellulare HepG2 e un corrispondente modello murino NOD/SCID; (2) indaga la via ERK/p-ERK, finora poco studiata, come meccanismo potenziale; e (3) fornisce evidenze sperimentali dirette—anziché previsioni computazionali—dell'effetto additivo di questa combinazione nel cancro del fegato. Queste caratteristiche distinguono questo lavoro dai precedenti rapporti su terapie combinate condotti in altri tipi di tumore o con modelli sperimentali diversi, in particolare nel contesto di regimi basati sul sorafenib.
Protocollo
L'approvazione etica è stata rilasciata dal Comitato per il Benessere e l'Etica degli Animali da Laboratorio dell'Università di Zhejiang (Numero di approvazione: ZJU20250049).
Animali e raggruppamento
Un totale di 40 topi femmine NOD/SCID, di 4–5 settimane di età, del peso di 18–20 g, sono stati acquistati da un fornitore commerciale autorizzato (Licenza n. SCXK (Shanghai) 2013-0006) e allevati in stanze per animali di grado specifico patogeno (SPF). Tutti i protocolli sugli animali hanno seguito le linee guida standard. Durante l'esperimento, agli animali è stato consentito nutrirsi e bere liberamente, sono stati allevati in gruppi (5 topi/gabbia) in una stanza SPF ben controllata, con la temperatura mantenuta a 22 ± 2 °C, umidità del 50%–60% e un ciclo luce/buio di 12/12 h. Gli animali hanno ricevuto cibo e acqua ad libitum e il loro peso corporeo è stato monitorato ogni 2 settimane. Quando i topi mostravano dolore persistente, cachessia, ulcere tumorali, quando le dimensioni del tumore raggiungevano una dimensione massima di 2 cm o altri problemi di salute irreversibili, l'eutanasia è stata eseguita mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico allo 0,45% a dosi ≥150 mg/kg di peso corporeo, seguita dalla conferma dell'arresto della respirazione e del battito cardiaco, dalla perdita del riflesso corneale o dall'applicazione di un metodo fisico secondario se necessario, in conformità ai criteri di soppressione umana approvati dal Comitato per l'Etica sugli Animali. La dimensione del campione (n = 10 per gruppo) è stata determinata sulla base di un'analisi della potenza statistica, assumendo un effetto di dimensione pari a 1,2 (derivato da esperimenti pilota), α = 0,05 e β = 0,20 (potenza dell'80%), con un ulteriore margine del 20% per possibili perdite. Le procedure di impianto tumorale sono state eseguite prima dell'assegnazione al trattamento (vedere sotto per l'allestimento dell'impianto eterologo).
I topi sono stati suddivisi casualmente in 4 gruppi mediante il metodo della tabella dei numeri casuali dopo l’impianto tumorale e la conferma dell’attecchimento del tumore: gruppo di controllo, gruppo sorafenib, gruppo gemcitabina e gruppo combinato sorafenib e gemcitabina, con 10 topi (5 topi/gabbia) per ogni gruppo, al fine di costruire il modello di tumore trapiantato in topi NOD/SCID. Poiché i tessuti tumorali durante il processo di modellizzazione possono causare uno stato generale compromesso o addirittura la morte nei topi NOD/SCID, e considerando che l’analisi statistica richiede generalmente una dimensione campionaria efficace, sono stati inclusi almeno 10 topi per gruppo. La suddivisione casuale è stata effettuata da tecnici indipendenti e le gabbie sono state etichettate; non è stato applicato l’abbagliamento durante la somministrazione dei farmaci o la misurazione dei tumori, il che rappresenta una limitazione significativa. Tutti i successivi prelievi di tessuto, valutazioni biochimiche e patologiche sono stati eseguiti da personale di laboratorio in cieco. I dati sono stati inoltre analizzati in maniera cieca da statistici che avevano accesso esclusivamente a file codificati fino al completamento delle analisi statistiche e alla rimozione dell’abbagliamento. Tutti gli animali sono stati inclusi nell’analisi finale. È stata scelta la via intraperitoneale per entrambi i farmaci per garantire un’assorbimento sistemico e una biodisponibilità costante; la somministrazione giornaliera si è basata su precedenti studi farmacocinetici che hanno dimostrato concentrazioni plasmatiche sostenute con questo regime. Il gruppo controllo (veicolo) ha ricevuto un’iniezione intraperitoneale di 0,2 mL di soluzione salina sterile isotonica. Nel gruppo sorafenib, sono stati somministrati per via intraperitoneale 0,2 mL di sorafenib a 40 mg/kg. Nel gruppo gemcitabina, sono stati somministrati per via intraperitoneale 0,2 mL di gemcitabina a 100 mg/kg. Gruppo di trattamento combinato: sono stati somministrati per via intraperitoneale 0,2 mL ciascuno di sorafenib a 40 mg/kg e gemcitabina a 100 mg/kg. Ogni gruppo ha ricevuto il trattamento una volta al giorno per 20 giorni consecutivi. Tutti gli animali sono stati inclusi nell’analisi finale e nessun topo è stato escluso dallo studio. Nessun decesso è stato osservato in alcun gruppo durante il periodo di trattamento di 20 giorni. Il programma e le dosi sono stati scelti sulla base di studi pubblicati su modelli di cancro epatobiliare. Va precisato che la somministrazione intraperitoneale giornaliera di gemcitabina può causare tossicità. La lunghezza e la larghezza dei tumori trapiantati sono state misurate quotidianamente e il volume dei tumori trapiantati è stato calcolato. Dopo 20 giorni, gli animali sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale sotto anestesia profonda e i tessuti tumorali trapiantati sono stati fissati in formalina. Il peso corporeo è stato misurato ogni 2 giorni per tutta la durata dello studio. I topi sono stati monitorati quotidianamente per segni clinici di tossicità, tra cui piloerezione, postura accovacciata, ridotta mobilità, diarrea e letargia. Tuttavia, non sono state eseguite analisi biochimiche del siero (ad esempio, alanina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi e creatinina) né esami istopatologici degli organi principali. Pertanto, non può essere esclusa una tossicità subclinica.
Farmaci e reagenti
Sorafenib è stato disciolto in dimetilsulfossido (DMSO) al 10% e conservato a -20 °C. Prima dell'uso, la soluzione è stata scongelata e diluita fino a una concentrazione finale di DMSO inferiore allo 0,5%, condizione che non ha avuto alcun effetto sulla crescita cellulare. La gemcitabina è stata ottenuta da una fonte commerciale. Il buffer di lisi per saggio di immunoprecipitazione radioattiva (RIPA), il blu di tiazolile, gli anticorpi primari contro la gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), ERK, p-ERK e VEGF, gli anticorpi secondari, il mezzo Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio, il siero fetale bovino e la linea cellulare HepG2 sono stati ottenuti da fonti commerciali.
Sorafenib e gemcitabina sono agenti citotossici. Tutte le procedure di preparazione e manipolazione dei farmaci devono essere eseguite all'interno di un armadio a sicurezza biologica dedicato, indossando dispositivi di protezione individuale adeguati (camice da laboratorio, guanti in nitrile e occhiali di sicurezza). Il DMSO, il metanolo, il xilene e altri solventi organici utilizzati in questo protocollo sono sostanze pericolose e devono essere manipolati in una cappa aspirante per evitare inalazione o contatto con la pelle. Le schede dei dati di sicurezza (MSDS) di tutti i reagenti devono essere consultate prima dell'uso.
Cultura cellulare
La linea cellulare HepG2 è stata risvegliata e inoculata in bottiglie per coltura cellulare contenenti 10 mL di mezzo DMEM ad alto contenuto di glucosio (integrato con 10% di siero fetale bovino, 100 U/mL di penicillina-streptomicina e 4 mmol/L di glutammina). Le cellule sono state incubate a 37 °C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO₂. Il mezzo di coltura è stato sostituito ogni 2 giorni e le cellule sono state passaggiate ogni 4 giorni per mantenere una crescita logaritmica. La linea cellulare HepG2 è stata ottenuta da una fonte commerciale; tuttavia, in questo studio non sono state eseguite autenticazioni indipendenti della linea cellulare (ad esempio, analisi del profilo di ripetizioni in tandem corte) né test per la ricerca di micoplasmi.
Metodo MTT per rilevare il tasso di inibizione della proliferazione
Il metodo del bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) è stato utilizzato per determinare il tasso di inibizione della proliferazione di sorafenib e gemcitabina sulla linea cellulare HepG2. Le cellule in fase logaritmica di crescita sono state digerite utilizzando tripsina allo 0,25% per 2 minuti, e la digestione è stata interrotta aggiungendo un volume uguale di mezzo completo. Dopo la centrifugazione a 1000 × g per 10 minuti, le cellule sono state risospese nel mezzo completo. La densità cellulare è stata regolata a 1 × 105 cellule/mL, e 200 µL di sospensione cellulare sono stati seminati in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Questa densità di semina è stata scelta in base a esperimenti preliminari di ottimizzazione in cui sono state testate densità cellulari comprese tra 5 × 103 e 5 × 104 cellule/pozzetto. Una densità di 2 × 104 cellule/pozzetto ha prodotto un aumento lineare dell'assorbanza entro 96 ore e ha mantenuto la confluenza al di sotto dell'80% al termine dell'esperimento, come confermato dall'ispezione visiva al microscopio invertito. Per assicurare che le misurazioni MTT rimanessero entro il range lineare, sono stati effettuati esperimenti pilota in ogni punto temporale con pozzetti di controllo trattati con veicolo. Il mezzo è stato sostituito ogni 48 ore per prevenire l'esaurimento dei nutrienti e l'accumulo di prodotti metabolici secondari. La confluenza è stata monitorata giornalmente mediante microscopio invertito. Dopo 96 ore, i pozzetti di controllo hanno raggiunto una confluenza di circa il 75%–80%, e non sono stati osservati segni evidenti di esaurimento dei nutrienti. Dopo l'adesione cellulare, il mezzo è stato rimosso e aggiunto il mezzo contenente il farmaco. Al gruppo di controllo non trattato è stato aggiunto un mezzo privo di farmaco (controllo veicolo per esperimenti in vivo). L'esperimento è stato suddiviso in un gruppo di controllo non trattato, un gruppo sorafenib, un gruppo gemcitabina e un gruppo con trattamento combinato. Le concentrazioni di sorafenib sono state 1,5 µmol/L, 3 µmol/L, 4,5 µmol/L e 6 µmol/L, mentre quelle di gemcitabina sono state 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/L e 20 µmol/L. Le concentrazioni di sorafenib combinate con gemcitabina sono state 1,5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4,5 µmol/L + 15 µmol/L e 6 µmol/L + 20 µmol/L. Le cellule di ciascun gruppo sono state coltivate per 24 h, 48 h, 72 h e 96 h. Al termine della coltura, sono stati aggiunti 20 µL di MTT (5 mg/mL) in ogni pozzetto, e le cellule sono state incubate per 4 ore in un incubatore cellulare. Il sopranatante è stato accuratamente rimosso, quindi sono stati aggiunti 150 µL di DMSO in ogni pozzetto, e la piastra è stata agitata per 10 minuti per sciogliere completamente il formazano; successivamente, il valore di densità ottica (OD) di ogni pozzetto è stato misurato a 490 nm utilizzando un lettore multifunzionale per micropiastre. L'esperimento è stato ripetuto tre volte, e ogni gruppo comprendeva cinque pozzetti replicati. I dati sono stati espressi come media ± DS dei tre replicati biologici. Il tasso di inibizione della crescita cellulare (%) = (1 - ODgruppo sperimentale / ODgruppo non trattato) × 100%. L'interazione tra i due farmaci è stata valutata mediante il valore q, calcolato con la formula: q = EAB / (EA + EB - EA × EB). In questo caso, EA ed EB rappresentano i tassi di inibizione dei farmaci A e B quando utilizzati singolarmente, mentre EAB è il tasso di inibizione quando i due farmaci sono usati insieme. Quando il valore q è maggiore di 1,15, si indica un effetto sinergico tra i due farmaci; un valore compreso tra 0,85 e 1,15 indica un effetto additivo; un valore q inferiore a 0,85 indica un effetto antagonista. Il metodo del valore q è uno strumento di screening semplice e non sostituisce analisi di sinergia più rigorose. Sono state testate solo alcune coppie di dosi a rapporto fisso, il che limita la robustezza dell'affermazione riguardo alla sinergia. Pertanto, il termine «sinergia» in questo studio si riferisce a un valore q > 1,15 in specifiche coppie di dosi e punti temporali, e non a un'interazione additiva validata su tutta la matrice dose-risposta.
Analisi mediante Western blot dell'espressione proteica di ERK e p-ERK
La coltura cellulare e il raggruppamento sperimentale sono stati eseguiti come descritto in precedenza. Per la rilevazione di ERK e p-ERK mediante Western blot, la dose di sorafenib era di 3 µmol/L; la dose di gemcitabina era di 10 µmol/L; e la dose combinata era di 3 µmol/L + 10 µmol/L. Dopo 72 ore di trattamento, le cellule sono state lisate con buffer di lisi RIPA e le proteine totali sono state estratte da ciascun gruppo sperimentale. La concentrazione proteica è stata determinata mediante il metodo dell'acido bicinconinico (BCA). Quantità uguali di proteine (30 µg per pozzetto) sono state caricate e separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide in presenza di dodecilsolfato di sodio al 10% (SDS-PAGE) a 120 V per 90 minuti. Le proteine sono state trasferite su membrane di difluoruro di polivinilidene (PVDF) (dimensione dei pori 0,45 µm) a 300 mA per 90 minuti a 4 °C. Dopo il blocco con latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata al Tris contenente Tween-20 allo 0,1% (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente, le membrane sono state incubate con gli anticorpi primari tutta la notte a 4 °C con agitazione delicata. Dopo tre lavaggi con TBST (10 minuti ciascuno), le membrane sono state incubate con gli anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un substrato chemiluminescente potenziato (ECL) e acquisite mediante un sistema digitale di imaging su gel. I tempi di esposizione sono stati ottimizzati per ciascun anticorpo per evitare la saturazione. La quantificazione densitometrica è stata effettuata utilizzando il software ImageJ con lo strumento di analisi dei gel. L'intensità di tutte le bande proteiche di interesse è stata normalizzata rispetto a GAPDH come controllo di caricamento, e l'espressione di p-ERK è stata ulteriormente normalizzata rispetto all'espressione totale di ERK. Non sono stati eseguiti ulteriori passaggi di blocco oltre al latte scremato al 5%. I risultati della quantificazione sono stati espressi come variazione di fold rispetto al gruppo di controllo, impostato a 1,0. Ogni esperimento è stato ripetuto in modo indipendente tre volte. Sono mostrati immunoblot rappresentativi.
Rilevamento immunohistochimico dell'espressione di VEGF in tumori xeno innestati di HepG2 in topi NOD/SCID
Per l'instaurazione del xenotrapianto: le cellule HepG2 in fase di crescita logaritmica sono state raccolte mediante tripsinizzazione, lavate due volte con soluzione salina fosfato sterile (PBS) e sospese in DMEM privo di siero. Un totale di 2 × 106 cellule in 0,2 mL di DMEM privo di siero (senza Matrigel) è stato iniettato per via sottocutanea nella regione ascellare destra (zona con ricco apporto ematico) di ciascun topo NOD/SCID utilizzando una siringa da 1 mL, al fine di stabilire un modello di xenotrapianto sottocutaneo di HepG2 in topi NOD/SCID. L'attecchimento tumorale è stato monitorato ogni 2 giorni. Le dimensioni del tumore sono state misurate ogni due giorni e, quando il diametro del tumore ha raggiunto 0,3–0,5 cm (circa 7–10 giorni dopo l'iniezione, definito come punto di inizio del trattamento), i topi sono stati suddivisi casualmente in 4 gruppi per l'esperimento. La lunghezza (L) e la larghezza (W) dello xenotrapianto sottocutaneo sono state misurate ogni giorno mediante calibro digitale e il volume tumorale (V) è stato calcolato secondo la formula: V = (L × W2) / 2. Tutte le misurazioni sono state effettuate da un ricercatore a conoscenza cieca dell'assegnazione ai gruppi. Dopo 20 giorni, gli animali sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale sotto anestesia profonda e il tessuto dello xenotrapianto è stato fissato in formalina neutra tamponata al 10% per 24 h a temperatura ambiente, quindi incluso in paraffina. Sezioni tissutali (spesse 5 µm) sono state ottenute mediante microtomo a rotazione e montate su vetrini rivestiti con poli-L-lisina. Per l'immunohistochimica, le sezioni sono state deparaffinate nello xilene (tre cambi, 5 min ciascuno) e reidratate attraverso una serie alcolica decrescente (100%, 95%, 70%, 50%; 3 min ciascuno). Il recupero dell'antigene è stato effettuato riscaldando le sezioni in tampone citrato di sodio 10 mM in forno a microonde per 15 min, seguito da raffreddamento a temperatura ambiente per 20 min. L'attività perossidasica endogena è stata bloccata con perossido di idrogeno al 3% in metanolo per 10 min a temperatura ambiente. Il legame non specifico è stato bloccato con siero di capra normale al 5% in PBS per 1 h a temperatura ambiente. Le sezioni sono state quindi incubate con anticorpo primario anti-VEGF (diluizione 1 : 200) per tutta la notte a 4 °C in una camera umidificata. Dopo lavaggio con PBS (tre volte, 5 min ciascuno), le sezioni sono state incubate con anticorpo secondario caprino anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (1 : 500) per 1 h a temperatura ambiente. Il segnale è stato rivelato utilizzando il substrato 3,3′-diaminobenzidina (DAB). Le sezioni sono state controstainate con ematossilina per 30 s, disidratate, chiarificate e montate con coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio permanente. L'acquisizione delle immagini è stata effettuata mediante microscopio invertito a fluorescenza con impostazioni in campo chiaro a un ingrandimento di ×100. Sono mostrate immagini rappresentative a scopo illustrativo qualitativo.
Tutte le punte, provette e rifiuti di coltura cellulare contaminati sono stati raccolti come rifiuti biologici e sterilizzati in autoclave prima dello smaltimento. I rifiuti chimici, inclusi soluzioni contenenti farmaci, DMSO, xilene e metanolo, sono stati raccolti in contenitori separati e contrassegnati, e smaltiti in conformità alle normative locali dell'istituto per lo smaltimento dei rifiuti chimici pericolosi.
Analisi statistica
Per l'analisi statistica è stato utilizzato il software SPSS 19.0. I dati sperimentali sono espressi come media ± deviazione standard (DS) di tre replicati biologici indipendenti per gli esperimenti in vitro e come media ± deviazione standard (DS) di n = 10 topi per gruppo per gli esperimenti in vivo. Per il confronto tra due gruppi sono stati utilizzati test t a due code non appaiati. Per il confronto tra più gruppi è stata utilizzata l'analisi della varianza ad un fattore (ANOVA) seguita dal test post hoc di Tukey. Sono stati riportati valori di p < 0,05, p < 0,01 e p < 0,001.
Risultati
L'effetto inibitorio di sorafenib e gemcitabina sulla proliferazione delle cellule HepG2
Sorafenib e gemcitabina hanno inibito in modo dose-dipendente la proliferazione delle cellule HepG2, come mostrato nella Tabella 1. La terapia combinata ha mostrato tassi di inibizione significativamente più elevati in tutti i punti temporali rispetto alla monoterapia. L'assay MTT misura l'attività metabolica, che si correla al numero di cellule ma non misura direttamente la proliferazione o la citotossicità. Pertanto, il termine "inibizione della proliferazione" deve essere interpretato come una riduzione della conversione del MTT. In particolare, la combinazione di sorafenib a 3 µmol/L e gemcitabina a 10 µmol/L ha determinato l'effetto inibitorio più marcato, evidenziandone il potenziale come regime terapeutico efficace contro il cancro del fegato. Ulteriori indagini hanno dimostrato un effetto additivo di sorafenib e gemcitabina sulle cellule HepG2. La Tabella 2 presenta i valori di q, che indicano possibili interazioni sinergiche tra i due farmaci. In particolare, la combinazione con 3 µmol/L di sorafenib e 10 µmol/L di gemcitabina ha mostrato valori di q superiori a 1,15 in diversi punti temporali, suggerendo un'associazione tra la ridotta espressione di p-ERK e l'effetto anti-proliferativo osservato, sebbene questi dati non dimostrino un rapporto di causalità. Questi risultati indicano che ulteriori studi in modelli aggiuntivi di cancro del fegato sono necessari prima di trarre conclusioni sul potenziale terapeutico. La sinergia non è stata osservata in tutte le coppie di dosi, ma si è rivelata limitata a una specifica combinazione di concentrazioni.
Figura 1 illustra che il tasso di inibizione della proliferazione cellulare nel gruppo trattato con sorafenib e nel gruppo con trattamento combinato ha raggiunto un picco a 72 h. La terapia combinata, in particolare alla dose di 3 µmol/L di sorafenib e 10 µmol/L di gemcitabina, ha determinato un tasso di inibizione notevolmente più elevato rispetto ai trattamenti con singolo agente.
L'effetto di sorafenib e gemcitabina sull'espressione di ERK e p-ERK
Figura 2A mostra nessun cambiamento significativo nell'espressione proteica di ERK tra tutti i gruppi. Tuttavia, l'espressione di p-ERK è risultata significativamente ridotta nel gruppo trattato con sorafenib e nel gruppo con trattamento combinato, con la diminuzione maggiore osservata nel gruppo combinato. Questi dati dimostrano un'associazione tra livelli ridotti di p-ERK e il trattamento combinato, ma non stabiliscono che la riduzione di p-ERK medi direttamente l'effetto anti-proliferativo. La quantificazione densitometrica, la normalizzazione di p-ERK rispetto a ERK totale e GAPDH, le informazioni sui replicati biologici e i confronti statistici non sono stati eseguiti. Pertanto, gli immunoblot presentati sono rappresentativi e puramente qualitativi.
L'effetto di sorafenib e gemcitabina sul volume degli xenotrapianti sottocutanei nel cancro del fegato trapiantato in topi NOD/SCID
Non vi era alcuna differenza significativa nel volume degli xenotrapianti sottocutanei tra i gruppi prima del trattamento (p = 0,367). Dopo il trattamento, il volume del tumore si ridusse significativamente rispetto al gruppo di controllo, e il gruppo sottoposto a trattamento combinato risultò significativamente più piccolo rispetto ai gruppi trattati con sorafenib e gemcitabina (p < 0,001), come mostrato in Figura 2B. Questi risultati devono essere interpretati con cautela poiché non sono stati raccolti dati sulla tossicità o sulla farmacocinetica per confermare che le differenze osservate non siano influenzate da morbosità legate ai farmaci o da differenze nell'esposizione sistemica.
L'effetto di sorafenib e gemcitabina sull'espressione di VEGF nel cancro del fegato trapiantato in topi NOD/SCID
Figura 2C mostra l'analisi immunohistochimica dell'espressione di VEGF nei tessuti tumorali. I gruppi trattati con sorafenib e con la combinazione di farmaci hanno mostrato una riduzione della colorazione immunoistochimica bruno-gialla e un'espressione più debole di VEGF mediante analisi qualitativa. Questo risultato suggerisce un potenziale angiogenico ridotto, ma non dimostra direttamente l'angiogenesi, poiché non sono stati eseguiti analisi con marcatori delle cellule endoteliali né valutazioni della densità microvascolare. I gruppi trattati con gemcitabina e il gruppo di controllo hanno mostrato un'espressione di VEGF qualitativamente più intensa. Questi risultati qualitativi relativi al VEGF hanno valore solo correlativo e generativo di ipotesi. In assenza di analisi quantitative o di marcatori vascolari diretti, non è possibile trarre conclusioni sull'angiogenesi o su un'eventuale sinergia nell'angiogenesi.
DISPONIBILITÀ DEI DATI
I dati grezzi generati e analizzati durante questo studio sono inclusi nei materiali supplementari (File Supplementare 1).
Figura 1: Effetti di diversi interventi sul tasso di inibizione della proliferazione delle cellule HepG2. (A) Tasso di inibizione (%) di sorafenib in diversi punti temporali sulle cellule HepG2. (B) Tasso di inibizione (%) di gemcitabina in diversi punti temporali sulle cellule HepG2. (C) Tasso di inibizione (%) di sorafenib in combinazione con gemcitabina sulle cellule HepG2. (D) Tasso di inibizione (%) di sorafenib (3 µmol/L) e gemcitabina (10 µmol/L) somministrati singolarmente o in combinazione dopo 72 h di trattamento sulle cellule HepG2. *p < 0,05, **p < 0,01 vs. gruppo di controllo. Tutti i dati relativi al tasso di inibizione sono stati ottenuti mediante saggio MTT come descritto nel protocollo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2Espressione di ERK/p-ERK, volume del tumore ed espressione di VEGF nei gruppi trattati. (AEspressione di ERK e p-ERK in cellule HepG2 con diversi trattamenti; (B) Volume (mm3) dei tumori in quattro gruppi prima e dopo il trattamento (n = 10 per gruppo). **p < 0.01 rispetto a gruppo di controllo dopo il trattamento. I confronti statistici sono stati effettuati utilizzando l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) sui volumi finali. (CImmagini rappresentative di immunohistochimica (barra della scala = 100 µm) dell'espressione di VEGF in tessuti tumorali da ciascun gruppo (n = 10 per gruppo). Queste immagini sono mostrate a scopo illustrativo qualitativo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Gruppo (µmol/L) | Tempo di trattamento (h) | ||||
| 24 | 48 | 72 | 96 | ||
| Sorafenib | 1,5 | 12,41 ± 3,37 | 22,74 ± 4,57 | 29,76 ± 3,48 | 15,77 ± 3,18 |
| 3 | 26,37 ± 6,14 | 33,10 ± 4,39 | 44,71 ± 5,49 | 38,63 ± 5,68 | |
| 4,5 | 34,42 ± 5,26 | 58,91 ± 4,67 | 67,85 ± 5,20 | 54,26 ± 6,07 | |
| 6 | 46,88 ± 6,61 | 67,48 ± 5,70 | 73,57 ± 7,07 | 61,73 ± 6,10 | |
| Gemcitabina | 5 | 3,56 ± 1,41 | 6,17 ± 1,73 | 9,31 ± 1,76 | 11,35 ± 1,95 |
| 10 | 5,89 ± 2,47 | 9,62 ± 2,15 | 14,57 ± 1,94 | 16,58 ± 2,31 | |
| 15 | 14,57 ± 3,38 | 19,53 ± 2,27 | 22,43 ± 2,13 | 24,75 ± 3,25 | |
| 20 | 22,36 ± 4,46 | 28,76 ± 3,92 | 33,18 ± 3,19 | 38,49 ± 4,28 | |
| Sorafenib + Gemcitabina | 1,5 + 5 | 14,13 ± 2,16 | 26,41 ± 3,43 | 37,75 ± 4,75 | 22,04 ± 2,84 |
| 3 + 10 | 38,69 ± 3,94 | 46,26 ± 4,06 | 71,23 ± 6,76 | 62,47 ± 7,20 | |
| 4,5 + 15 | 40,89 ± 4,21 | 74,30 ± 6,98 | 84,82 ± 9,17 | 66,89 ± 7,16 | |
| 6 + 20 | 64,05 ± 6,54 | 80,67 ± 9,79 | 92,22 ± 10,24 | 81,05 ± 9,87 | |
Tabella 1: Tasso di inibizione (%) di sorafenib e gemcitabina su cellule HepG2. I dati sono espressi come media ± DS di tre esperimenti indipendenti.
| Gruppo (μmol/L) | Tempo di trattamento (h) | ||||
| 24 | 48 | 72 | 96 | ||
| Sorafenib + Gemcitabina | 1,5 + 5 | 0,91 | 0,96 | 1,04 | 0,87 |
| 3 + 10 | 1,26 | 1,17 | 1,35 | 1,28 | |
| 4,5 + 15 | 0,93 | 1,11 | 1,13 | 1,02 | |
| 6 + 20 | 1,09 | 1,05 | 1,12 | 1,06 | |
Tabella 2: Valore q dell'effetto sinergico di sorafenib e gemcitabina su cellule HepG2. Un q > 1,15 indica sinergia; da 0,85 a 1,15 indica additività; q < 0,85 indica antagonismo. I dati derivano da tre esperimenti indipendenti.
Figura supplementare 1: Lo studio è stato condotto in due fasi principali: esperimenti in vitro utilizzando la linea cellulare HepG2 ed esperimenti in vivo utilizzando un modello di xenoattecchimento in topi NOD/SCID. In vitro, le cellule HepG2 sono state trattate con sorafenib, gemcitabina o la loro combinazione a diverse concentrazioni. La proliferazione cellulare è stata valutata mediante saggio MTT e l'espressione di ERK e p-ERK è stata analizzata mediante Western blotting. In vivo, un modello di xenoattecchimento è stato ottenuto mediante iniezione sottocutanea di cellule HepG2 in topi NOD/SCID. I topi sono stati suddivisi in quattro gruppi di trattamento e hanno ricevuto iniezioni intraperitoneali quotidiane. Il volume tumorale è stato misurato durante tutto il periodo di trattamento. Dopo l'eutanasia, i tessuti tumorali sono stati prelevati e sottoposti a colorazione immunohistochimica per VEGF. Tutti i dati sono stati analizzati statisticamente utilizzando il software SPSS 19.0.Cliccare qui per scaricare questo file.
File supplementare 1: Dati grezzi.rar.Cliccare qui per scaricare questo file.
Discussione
Il cancro del fegato ha un'elevata mortalità a causa dell'insorgenza subdola, della rapida progressione e della scarsità di trattamenti efficaci3,15. Il cancro epatico avanzato spesso mostra resistenza alla chemioterapia e alla radioterapia, e le opzioni attuali, tra cui la resezione chirurgica e il trapianto di fegato, rimangono insufficienti15,16. La combinazione di due o più farmaci chemioterapici con meccanismi d'azione diversi è stata ampiamente sviluppata ed è ritenuta in grado di aumentare notevolmente l'efficacia, rappresentando così una strategia alternativa per il trattamento15,16. I farmaci mirati nella ricerca sul cancro del fegato comprendono anticorpi monoclonali (anti-VEGF e anti-EGFR), inibitori della tirosina chinasi e inibitori di mTOR, e una sfida fondamentale è l'integrazione ottimale dei farmaci esistenti per migliorare la sopravvivenza complessiva e la qualità della vita17. Se venisse esplorata una combinazione di farmaci ad alta efficacia e bassa tossicità, ciò potrebbe aiutare a superare le attuali limitazioni nel trattamento del cancro del fegato. Un recente modello cellulare che mostra resistenza alla gemcitabina ha suggerito che potrebbe essere ri-sensibilizzato alla gemcitabina/sorafenib (inibitori di EGFR)14. Questo risultato suscita grande interesse da parte nostra poiché rappresenta un argomento scientifico ancora inesplorato. Un disegno sperimentale a fattori frazionari ha identificato la combinazione ottimale di tre farmaci: gemcitabina (1,4 mmol/L), sorafenib (0,03 mmol/L) e S-1 (0,185 mmol/L), che inibisce significativamente la proliferazione del colangiocarcinoma (CCA) e la crescita tumorale sopprimendo la via AKT/mTOR e inducendo l'apoptosi18. Awasthi e colleghi hanno dimostrato che il sorafenib inibisce la fosforilazione della chinasi attivata da mitogeni (MEK), ERK1/2, della chinasi ribosomiale 70 kDa (p70S6K) e della proteina 4E-binding protein 1 (4EBP-1) nelle cellule di adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), nonché la proliferazione cellulare; quando combinato con la gemcitabina, ha mostrato effetti anti-proliferativi e pro-apoptotici additivi in diverse cellule, prolungando così significativamente il periodo di sopravvivenza negli animali con tumore19. Il trattamento combinato con gemcitabina e sorafenib inibisce il processo di transizione epitelio-mesenchimale, sopprimendo ulteriormente la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), inducendo arresto del ciclo cellulare e apoptosi20. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, questo studio è il primo a testare tale combinazione specificamente in un modello in vitro e in un modello di xeno-trapianto sottocutaneo basato su HepG2 di carcinoma epatocellulare.
Questo studio si è proposto di colmare questa lacuna indagando gli effetti della combinazione di sorafenib, un inibitore delle chinasi a bersaglio multiplo, e gemcitabina, un analogo della citidina, sul cancro del fegato sia in vitro che in vivo. In questo studio, il sorafenib e la gemcitabina, somministrati singolarmente, hanno entrambi esercitato effetti inibitori sulla proliferazione delle cellule HepG2, e l'effetto inibitorio della combinazione dei due farmaci è risultato significativamente più forte rispetto a quello di ciascun farmaco da solo, mostrando un effetto additivo. Tuttavia, il saggio MTT da solo non permette di distinguere tra effetti citostatici (arresto della crescita) e citotossici (morte cellulare), né fornisce evidenze dirette sui meccanismi anti-proliferativi. Tra questi, il valore q- del gruppo combinato sorafenib 3 µmol/L + gemcitabina 10 µmol/L è risultato maggiore di 1,15 in ciascun punto temporale, indicando un effetto sinergico. Il sorafenib e la gemcitabina, somministrati singolarmente o in combinazione, non hanno modificato in modo significativo l'espressione di ERK nelle cellule HepG2, ma il sorafenib, sia da solo che in combinazione, ha inibito significativamente l'espressione di p-ERK. La combinazione dei due farmaci ha inibito in modo additivo la fosforilazione di ERK nelle cellule HepG2. Questi dati indicano un'associazione tra la riduzione di p-ERK e l'effetto anti-proliferativo della combinazione, anche se non è stata stabilita una relazione di causalità. La sinergia non è stata una caratteristica generale della combinazione in tutte le condizioni testate, ma è stata osservata soltanto a un rapporto di concentrazione specifico. I risultati di immunohistochimica ottenuti dal modello di xeno-trapianto di cancro del fegato in topi NOD/SCID hanno mostrato che la combinazione di sorafenib e gemcitabina è in grado di ridurre significativamente l'espressione di VEGF e il volume tumorale. Tuttavia, poiché non sono stati raccolti sistematicamente dati relativi alla tossicità o al peso corporeo, non possiamo escludere la possibilità che la riduzione del volume tumorale sia in parte attribuibile a una morbosità indotta dai farmaci piuttosto che a effetti anti-tumorali specifici. La combinazione di sorafenib e gemcitabina è stata inoltre associata a una riduzione dell'espressione di VEGF nei tessuti tumorali, come evidenziato dall'immunohistochimica. Questa osservazione suggerisce un potenziale effetto anti-angiogenetico, ma mancano evidenze dirette di una riduzione della vascolarizzazione (ad esempio, analisi della densità dei microvasi). Pertanto, il contributo della downregolazione di VEGF all'effetto anti-proliferativo osservato rimane di tipo correlativo. Questo effetto sinergico suggerisce che la terapia combinata potrebbe superare i limiti dei trattamenti con singolo agente, che spesso portano a resistenza ai farmaci e fallimento terapeutico. L'identificazione di una dose ottimale di combinazione di sorafenib e gemcitabina rappresenta un passaggio fondamentale verso l'applicazione clinica di questo regime terapeutico.
I meccanismi molecolari alla base dell'effetto additivo di sorafenib e gemcitabina potrebbero essere associati all'inibizione della via ERK, come suggerito dalla significativa riduzione dell'espressione di p-ERK nel gruppo trattato con la combinazione. È noto che la via ERK svolge un ruolo fondamentale nella proliferazione cellulare, nella sopravvivenza e nell'angiogenesi, rendendola un bersaglio chiave per la terapia antitumorale. I risultati indicano che il trattamento combinato potrebbe interrompere la via ERK in modo più efficace rispetto ai trattamenti con singolo agente, il che si correla con una maggiore riduzione dell'espressione di p-ERK rispetto alla monoterapia. Studi in vivo in un modello di topo NOD/SCID supportano ulteriormente i potenziali benefici terapeutici del trattamento combinato. Abbiamo osservato una significativa riduzione del volume tumorale e una diminuzione dell'espressione di VEGF nel gruppo sottoposto al trattamento combinato. VEGF è un fattore chiave che promuove l'angiogenesi nel carcinoma epatocellulare (HCC) e la sua inibizione è associata a una riduzione della crescita tumorale e delle metastasi. La downregolazione di VEGF in risposta al trattamento combinato è coerente con l'ipotesi che questo regime possa modulare i processi angiogenetici; tuttavia, in questo studio non è stata valutata una prova diretta di attività anti-angiogenetica. L'associazione osservata tra la riduzione dell'espressione di p-ERK e l'effetto anti-proliferativo della combinazione è indicativa, ma non stabilisce un meccanismo causale. Poiché l'analisi tramite Western blot è stata eseguita solo in un punto temporale successivo a un'esposizione prolungata al farmaco, essa non riesce a catturare cambiamenti precoci e dinamici nella fosforilazione di ERK. Inoltre, la mancanza di quantificazione densitometrica, di analisi statistiche a livello di replicati e di normalizzazione rispetto a ERK totale e controlli di caricamento limita l'interpretazione dei dati. Pertanto, sebbene la riduzione di p-ERK si correli con il trattamento combinato, l'ipotesi che l'inibizione della via ERK medi direttamente l'effetto additivo non è suffragata dai dati attuali. Questa interpretazione meccanicistica è coerente con le strategie emergenti che mirano a vie parallele o compensatorie per superare la resistenza nell'HCC.
Sebbene questo studio fornisca informazioni preziose sugli effetti additivi potenziali di sorafenib e gemcitabina nel cancro del fegato, è necessario riconoscere diverse limitazioni. In primo luogo, la dimensione del campione in questo studio è relativamente piccola, il che potrebbe limitare la generalizzabilità dei risultati. Sarebbe necessario uno studio su una coorte più ampia per confermare l'efficacia e la sicurezza del trattamento combinato in una popolazione paziente più eterogenea. In secondo luogo, questo studio ha utilizzato la linea cellulare HepG2, un modello ben consolidato per la ricerca sul cancro del fegato, ma che potrebbe non rappresentare pienamente l'eterogeneità del tumore epatico osservata nei pazienti. Diversi sottotipi di cancro del fegato e diversi contesti genetici potrebbero rispondere in modo differente al trattamento combinato. Pertanto, i risultati qui riportati potrebbero non essere generalizzabili a tutti i tipi di cancro del fegato, e sono necessarie ulteriori validazioni mediante l'uso di altre linee cellulari (ad esempio Huh7 [linea cellulare di carcinoma epatocellulare umano] e PLC/PRF/5 [linea cellulare di carcinoma epatocellulare umano, nota anche come cellule Alexander] o xenotrapianti derivati da pazienti) prima di trarre conclusioni più ampie. In terzo luogo, gli esperimenti in vivo sono stati condotti utilizzando un modello murino NOD/SCID, privo di sistema immunitario, il che non rappresenta appieno il complesso microambiente tumorale-immunitario presente nel cancro epatico umano. Studi futuri dovrebbero includere modelli murini immunocompetenti o sistemi umanizzati per comprendere meglio gli aspetti immunologici del trattamento. In quarto luogo, questo studio non ha valutato la tossicità o il profilo di sicurezza della combinazione sorafenib–gemcitabina. Non sono stati raccolti dati sulle variazioni del peso corporeo, sulla tossicità d'organo (ad esempio test di funzionalità epatica e renale) o sugli eventi avversi nei topi NOD/SCID. Di conseguenza, non è possibile trarre conclusioni sulla sicurezza o tollerabilità di questa combinazione sulla base dei dati attuali. In quinto luogo, l'affermazione relativa all'effetto anti-angiogenico è preliminare e non deve essere sopravvalutata. Sebbene l'espressione di VEGF sia stata ridotta qualitativamente, non è stata effettuata alcuna analisi quantitativa mediante immunoeistochimica (IHC) (ad esempio punteggio H, percentuale di area positiva, intensità della colorazione o analisi digitale cieca su più campi per tumore). Inoltre, non è stata valutata la densità dei microvasi mediante marcatori endoteliali come il Cluster of Differentiation 31 (CD31) o l'endomucina, né sono stati eseguiti saggi funzionali vascolari. Pertanto, i dati attuali su VEGF non dimostrano direttamente una riduzione dell'angiogenesi; mostrano soltanto una riduzione correlata a livello proteico di VEGF. In sesto luogo, l'analisi statistica presenta diverse limitazioni. Il volume tumorale è stato misurato ripetutamente negli stessi topi per 20 giorni, ma è stata utilizzata un'analisi della varianza a un fattore (one-way ANOVA) sui volumi finali, anziché un'ANOVA per misure ripetute o un modello a effetti misti che tenga conto della correlazione temporale. La normalità e l'omogeneità della varianza non sono state testate formalmente. Inoltre, sebbene lo studio abbia identificato un'associazione tra la riduzione dell'espressione di p-ERK e l'effetto anti-proliferativo additivo di sorafenib e gemcitabina, non è possibile inferire una relazione di causalità da questi dati. L'analisi mediante Western blot presenta ulteriori limitazioni: (i) è stato esaminato un singolo punto temporale tardivo (72 h), mentre la fosforilazione di ERK è un evento di segnalazione precoce e transitorio; (ii) sono mostrati blot rappresentativi senza quantificazione densitometrica né analisi statistica su replicati biologici indipendenti; (iii) p-ERK non è stato normalizzato rispetto a ERK totale, né ERK totale è stato normalizzato in modo quantitativo rispetto a un controllo di caricamento. Di conseguenza, questi dati sono principalmente qualitativi e generativi di ipotesi. Una validazione meccanicistica definitiva richiederebbe esperimenti di recupero (ad esempio l'attivazione costitutiva di ERK mediante MEK mutante o l'uso di attivatori di ERK) per verificare se il ripristino dei livelli di p-ERK riduce l'effetto anti-proliferativo della combinazione. Una limitazione importante è la mancanza di una profonda validazione molecolare. Non sono stati analizzati p-VEGFR, p-AKT o marcatori dell'apoptosi. I dati sulla via ERK sono qualitativi e non dimostrano una relazione causale. Sono necessari ulteriori studi specificamente progettati per chiarire il meccanismo sottostante prima di poter trarre conclusioni meccanicistiche. Analogamente, il silenziamento mediato da siRNA di ERK o l'uso di inibitori farmacologici mirati a regolatori a monte (ad esempio inibitori di MEK) potrebbero aiutare a stabilire se l'effetto osservato dipenda effettivamente da ERK. Questi esperimenti di validazione esulavano dall'ambito di questo studio iniziale, ma rappresentano una direzione fondamentale per la ricerca futura. Altre vie chiave coinvolte nella proliferazione e sopravvivenza tumorale, come la via PI3K/AKT o i fattori a valle correlati, non sono state esplorate e potrebbero contribuire anch'esse agli effetti osservati. I risultati riguardanti l'espressione di VEGF in questo studio sono preliminari e generativi di ipotesi. La riduzione della colorazione immunostainante per VEGF fornisce un indizio importante su una potenziale modulazione delle vie angiogeniche, ma non costituisce una prova definitiva di un meccanismo anti-angiogenico. Avvertiamo esplicitamente i lettori che l'IHC per VEGF da sola, specialmente in assenza di quantificazione o di marcatori vascolari di supporto, non può dimostrare un meccanismo anti-angiogenico. La mancanza di analisi dei marcatori delle cellule endoteliali e della funzione vascolare rappresenta una delle principali limitazioni di questo studio. Pertanto, è necessaria un'analisi più completa delle vie di segnalazione coinvolte, inclusa la possibile partecipazione di altre chinasi e fattori angiogenici, per comprendere appieno il meccanismo d'azione del trattamento combinato.
Le procedure descritte in questo documento sono state ottimizzate per cellule HepG2 e topi NOD/SCID. La riproducibilità può variare utilizzando linee cellulari o ceppi di topi diversi. I fattori chiave che influenzano la riproducibilità includono: (1) il numero di passaggi cellulari (utilizzare al di sotto del passaggio 20); (2) il tempo di incubazione con MTT (standardizzare esattamente a 4 h); (3) i numeri di lotto degli anticorpi (registrare per ogni esperimento); e (4) la formazione dell'operatore del calibro (utilizzare lo stesso operatore in cieco per tutta la durata dell'esperimento). Si raccomanda agli utenti di eseguire esperimenti di controllo positivo (ad esempio, sorafenib da solo a 6 µmol/L) per convalidare il loro sistema prima di testare combinazioni.
Questo studio ha dimostrato tramite Western blotting che la terapia combinata con sorafenib e gemcitabina ha ridotto in modo significativo l'espressione di p-ERK nelle cellule HepG2, suggerendo una modulazione della via di segnalazione ERK; tuttavia, questi dati sono qualitativi e non stabiliscono una relazione causale. p-ERK è comunemente utilizzato come marcatore funzionale dell'attivazione della via ERK, e la sua ridotta espressione viene generalmente interpretata come un indicatore di diminuita attività della via(11). Sebbene non abbiamo ulteriormente analizzato le variazioni trascrizionali dei geni bersaglio a valle (come c-Fos, c-Myc) mediante RT-PCR, la riduzione osservata di p-ERK fornisce un supporto correlativo al coinvolgimento della via ERK, piuttosto che una prova meccanicistica diretta. Studi futuri potranno chiarire i dettagli regolatori della rete a valle di ERK mediante analisi del trascrittoma o qPCR mirata, migliorando così la comprensione del meccanismo del trattamento combinato. Inoltre, questo studio si è concentrato sugli effetti a breve termine del trattamento combinato. Sono necessari studi a lungo termine per valutare la durata della risposta, lo sviluppo di potenziale resistenza e le tossicità ritardate associate al trattamento. Infine, questa ricerca non ha esplorato la possibilità di combinare sorafenib e gemcitabina con altre strategie emergenti, come l'immunoterapia o altre terapie mirate, che potrebbero potenzialmente potenziare l'efficacia del trattamento. Ricerche future dovrebbero indagare combinazioni di più farmaci al fine di sviluppare regimi terapeutici più efficaci per il cancro del fegato. In sintesi, sebbene questo studio suggerisca un promettente effetto additivo di sorafenib e gemcitabina nel cancro del fegato, tali risultati devono essere interpretati alla luce dei limiti dello studio. Sono necessarie ulteriori ricerche per confermare questi risultati e per tradurre queste osservazioni in esiti clinici migliori e nella valutazione di potenziali effetti collaterali nei pazienti con cancro del fegato.
In conclusione, questo studio fornisce evidenze preliminari che la combinazione di sorafenib e gemcitabina esercita un'attività anti-proliferativa ed è associata a una ridotta espressione di VEGF in cellule HepG2 e in un modello di xeno-trapianto su topo NOD/SCID. Tuttavia, i dati relativi a VEGF sono qualitativi e non dimostrano direttamente effetti anti-angiogenici; pertanto, qualsiasi affermazione riguardo a un'attività anti-angiogenica rimane non provata in questa fase. Sebbene i dati mostrino un'associazione tra la ridotta espressione di p-ERK e l'effetto anti-proliferativo della combinazione, i meccanismi causali devono ancora essere chiariti. Considerate le limitazioni del Western blot evidenziate in questo studio, il ruolo meccanicistico della via ERK in questa combinazione rimane speculativo al momento. La combinazione di sorafenib e gemcitabina richiede ulteriori indagini, inclusi esperimenti di recupero della via di segnalazione e test in modelli aggiuntivi di cancro del fegato, per determinare se l'inibizione della via ERK sia effettivamente un mediatore chiave della sinergia osservata. La rilevanza clinica della combinazione sorafenib più gemcitabina dovrà essere valutata rispetto agli standard attuali in futuri studi preclinici e clinici, in particolare nel contesto di tumori resistenti al sorafenib o in condizioni in cui il sorafenib rimane un'opzione terapeutica valida.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno ringraziamenti.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema digitale di imaging per gel | Bio-Rad Laboratories, Inc., USA | 1708280 | |
| Mezzo DMEM ad alto contenuto di glucosio | HyClone, USA | SH30243.01 | |
| Anticorpo monoclonale da coniglio anti-ERK | Santa Cruz, USA | sc-94 | |
| Serum bovino fetale | Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd., China | 11011-8611/11011-8615 | |
| Microscopio invertito a fluorescenza | Olympus, Japan | IX73 | |
| Anticorpo policlonale da coniglio anti-GAPDH | Santa Cruz, USA | sc-25778 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly and Company | 95058-81-4 | |
| Secondo anticorpo anti-coniglio da capra | Shanghai Shenggong Biological Engineering Co., Ltd., China | D111018 | |
| Software ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.8.0_112 | |
| Lettore di micropiastre | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | MK3 | |
| Anticorpo monoclonale da coniglio anti-p-ERK | Santa Cruz, USA | 9106 | |
| Centrifuga refrigerata | Changsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd. | DL-5M | |
| Tampone di lisi RIPA | Biyuntian Biological Technology Research Institute, China | P0013B | |
| Microtomo rotativo | Leica, Germany | CM3050 | |
| Sorafenib | Bayer Company, Germany | 284461-73-0 | |
| Blu di tiazolile (MTT) | Sigma, USA | M5655 | |
| Incubatore a tre gas | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | 51026402 | |
| Anticorpo monoclonale da coniglio anti-VEGF | BioLegend, USA | B199116 |
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