Generazione di neuroni GABAergici da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo utilizzando l'espressione di ASCL1/DLX2 indotta dalla doxiciclina ad AAVS1

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per generare neuroni GABAergici da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo integrando i transgeni indotti dalla doxiciclina nel loco di porto sicuro AAVS1 . L'espressione stabile e omogenea del transgene fornisce un approccio efficiente per la differenziazione diretta nei neuroni GABAergici limitando il silenziamento del transgene, un problema comune negli approcci lentivirali.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti indotte nell'uomo (hiPSC) offrono un'opportunità senza precedenti per modellare le malattie neurologiche umane in vitro. La generazione affidabile di popolazioni neuronali definite, come i neuroni gamma-aminobutiric (GABAergico), è essenziale per questi studi. Questo protocollo dettaglia un metodo robusto per differenziare gli hiPSC in neuroni GABAergici utilizzando un sistema indottibile dalla doxiciclina. L'approccio si basa sull'integrazione stabile dei transgeni che codificano i fattori di trascrizione ASCL1 e DLX2 nel locus di integrazione virale adeno-associato 1 (AAVS1.) tramite knock-in mediato da CRISPR/Cas9. Questa integrazione mirata evita il silenziamento del transgene spesso osservato nell'integrazione lentivirale casuale. Il protocollo copre il mantenimento degli hiPSC, il processo di nucleofezione per l'integrazione dei transgeni, la selezione della puromicina per arricchire cellule ingegnerizzate con successo e la procedura di differenziazione passo dopo passo. Al momento dell'induzione con doxiciclina, gli hiPSC ingegnerizzati escono rapidamente dal ciclo cellulare, acquisiscono la morfologia neuronale ed esprimono marcatori della linea GABAergica entro 21 giorni. I passaggi chiave includono la neuro-induzione e la successiva maturazione utilizzando specifici fattori di crescita, oltre a possibili approcci per migliorare l'adesione cellulare durante la maturazione. Questo metodo standardizzato produce popolazioni arricchite di neuroni indotti che esprimono marcatori di linea GABAergica, fornendo uno strumento prezioso per la ricerca in neuroscienze e la modellazione cellulare.

Introduzione

Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) forniscono una piattaforma unica per modellare le malattie neurologiche umane in vitro. e per indagare i complessi meccanismi molecolari che guidano lo sviluppo e la^{degenerazione 1}. Questa tecnologia consente la generazione di modelli cellulari specifici per il paziente per indagare un'ampia gamma di condizioni, che vanno dalle anomalie neuroevolutive precoci nelle ciliopatie^{sindromiche 2} a sottili alterazioni epigenomiche osservate nella sporadica malattia^{di Alzheimer 3}. Di conseguenza, la differenziazione diretta degli hiPSC è diventata una pietra angolare delle moderne neuroscienze molecolari.

Per cogliere efficacemente le sfumature dei processi neurologici umani, è essenziale generare sottotipi neuronali altamente specifici e puri. Ad esempio, sono necessarie popolazioni neuronali definite per chiarire i ruoli trascrizionali specifici di proteine come MECP2 nei neuroni^{umani 4}, o per valutare le vulnerabilità mirate dei neuroni sensoriali periferici alle infezioni virali, come il SARS-CoV-2⁵. Inoltre, la costruzione di microambienti complessi e fisiologicamente rilevanti, come l'incorporazione della microglia funzionale in organoidi cerebrali 3D, si basa fondamentalmente sulla generazione robusta e prevedibile di linee neurali e gliali^{distinte 6}. Tra questi sottotipi, i neuroni GABAergici sono di particolare interesse per il loro ruolo inibitorio cruciale nel sistema nervoso centrale e per le loro implicazioni in vari disturbi neurologici e^{psichiatrici 7}. L'obiettivo generale di questo metodo è fornire un protocollo affidabile, efficiente e riproducibile per la differenziazione diretta degli hiPSC in neuroni indotti che esprimono marcatori di linea GABAergica. I protocolli tradizionali di differenziazione diretta per i neuroni GABAergici, che si basano su molecole di segnalazione estrinseche, possono essere dispendiosi in termini di tempo, altamente variabili e portare a popolazioni cellulari^{eterogenee 8}.

Per superare questi limiti, la programmazione anticipata mediata da fattori di trascrizione è emersa come una potente alternativa⁹. Questo protocollo utilizza un sistema di espressione indottibile da doxiciclina per guidare l'espressione dei fattori di trascrizione proneurali ASCL1 e DLX2¹⁰. Indirizzando questi transgeni al locus di porto sicuro del sito di integrazione virale adeno-associato 1 (AAVS1.) usando CRISPR/Cas9, questo metodo evita il problema comune del silenziamento dei transgeni associato all'integrazione lentivirale^{casuale 10}. Il costrutto donatore include un segnalatore fluorescente, come mCherry, per monitorare le cellule transgene-positive dopo la selezione. Questa strategia è pensata per supportare un'espressione transgenica più omogenea rispetto agli approcci di integrazione casuale, anche se la stabilità dell'espressione e la riproducibilità della differenziazione dovrebbero essere validate per ciascuna linea ingegnerizzata. Questo metodo standardizzato genera popolazioni arricchite di neuroni indotti che esprimono marcatori di linea GABAergica in circa 21 giorni, un intervallo temporale inferiore rispetto a quello degli approcci tradizionali a piccole^{molecole 8,10}. Questo protocollo è altamente appropriato per i ricercatori che necessitano di popolazioni neuronali scalabili e coerenti per applicazioni a valle come la microscopia ad alto contenuto, la trascrittomica a singola cellula o i saggi fisiologici funzionali.

Protocollo

ATTENZIONE: Le colture di hiPSC umane devono essere gestite come materiale potenzialmente biopericoloso secondo le procedure di biosicurezza istituzionale. Eseguire tutte le procedure di coltura hiPSC umana in un armadietto di sicurezza biologica certificato Classe II utilizzando una tecnica sterile. Tutti i rifiuti contenenti cellule umane, mezzi esposti a cellule umane e materiale plasmidico CRISPR/Cas9 devono essere decontaminati secondo le linee guida locali di biosicurezza prima dello smaltimento. Doxiciclina, puromicina, DMSO e altri reagenti chimici devono essere maneggiati con guanti e una protezione adeguata per occhi e pelle, e i rifiuti devono essere smaltiti secondo le procedure istituzionali per i rifiuti chimici. L'estratto di membrana del basamento (BME) deve essere maneggiato con tecnica sterile e conservato sul ghiaccio prima dell'uso per prevenire una polimerizzazione prematura. Lo stoccaggio di azoto liquido e la gestione crioviale devono essere eseguiti con guanti criogenici appropriati, protezione del viso e attenzione per evitare ustioni da freddo o esplosione di fiale durante lo scongelamento.

NOTA: Prima dell'editing mediato da CRISPR/Cas9 e della differenziazione neuronale, le colture hiPSC dovrebbero soddisfare criteri predefiniti di controllo qualità. Le cellule devono essere confermate negative per micoplasma, mostrare un cariotipo normale o un profilo di integrità genomica accettabile e mantenere un'espressione robusta di marcatori di pluripotenza, inclusi OCT4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 e/o SSEA4. Le colture dovrebbero mostrare la tipica morfologia compatta delle colonie hiPSC, con un alto rapporto nucleare/citoplasmatico, confini della colonia definiti e una differenziazione spontanea minima. Dovrebbero essere utilizzate solo colture attivamente proliferanti all'interno dell'intervallo di passaggio raccomandato, e le cellule non dovrebbero superare il numero massimo di passaggio definito dal laboratorio, tipicamente inferiore a 40, salvo diversa validazione. Le colture che mostrano morfologia anomala, eccessiva differenziazione spontanea, scarsa crescita, contaminazione confermata o evidenza di instabilità genomica dovrebbero essere escluse dagli esperimenti di editing e differenziazione. Tutti i materiali necessari per questo protocollo, comprese le ricette multimediali, sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione di reagenti e piastre di coltura

1. Prepara il mezzo di congelamento combinando 40 mL di sostituzione sirica knock-out (KOSR) e 10 mL di dimetilsolfosida (DMSO) in un tubo conico da 50 mL.
2. Omogeneizza il mezzo di congelamento pipettando su e giù 10 volte. Conserva la soluzione a 4 °C per un massimo di 1 mese.
3. Diluire l'estratto di membrana basale (BME) nel mezzo Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) di Dulbecco a una concentrazione finale di 80 μg/mL.
   NOTA: Prima della diluizione, verifica la concentrazione della soluzione BME ricevuta utilizzando il numero di lotto sul sito web del venditore.
4. Aggiungi 1 mL di BME diluito per pozzo su una piastra a 6 pozzi. Restituisci immediatamente il BME delle azioni a 4 °C per un massimo di 1 mese.
5. Inclina la piastra per distribuire la soluzione uniformemente su tutta la superficie dei pozzi. Assicurati che non ci siano aree non rivestite.
6. Incubare il piatto per almeno 30 minuti a 37 °C prima dell'uso.
   NOTA: Non esiste un tempo massimo di incubazione. Se incubano per più di 1 giorno, assicurarsi che il DMEM/F-12 non evapori. La soluzione BME utilizzata per un pozzo può essere riutilizzata solo una volta per rivestire un secondo pozzo. La manipolazione della BME a temperatura ambiente dovrebbe essere breve a causa della sua rapida polimerizzazione.

2. Manutenzione e passaggio degli hiPSC

NOTA: In questo protocollo, mezzo di manutenzione hiPSC si riferisce a mTeSR plus. mTeSR plus è il mezzo raccomandato per la manutenzione di routine, il passaggio, il recupero dopo la nucleofezione e la selezione della puromicina.

1. Esegui il passaggio hiPSC circa ogni 4–6 giorni quando le cellule raggiungono il 60% di confluenza.
2. Aspirare il mezzo di coltura dai pozzi usando una pipetta aspirante.
3. Aggiungi 1 mL di ReLeSR al pozzo e incuba per 30 secondi a temperatura ambiente.
4. Aspirare il reagente di dissociazione e incubare la piastra per 8 minuti a 37 °C.
5. Aggiungi delicatamente 1 mL di mezzo di mantenimento hiPSC usando una pipetta da 5 mL. Raccogli la sospensione della cella in un tubo da 50 mL.
6. Mescola 10 μL della sospensione della cella con 10 μL di blu di tripano in un tubo a microcentrifuga. Carica 10 μL della miscela su un vetrino cellulare per determinare la concentrazione cellulare vitale.
7. Aspira il rivestimento BME da un pozzo già preparato. Aggiungere 2 mL di mezzo di mantenimento hiPSC integrato con inibitore della chinasi a bobina associata alla Rho (ROCK) (Y-27632; finale 10 μM).
8. Semina 100.000 hiPSC nel pozzo, puntando a una vitalità del >90%. Muovi la piastra con un movimento a otto per garantire una distribuzione omogenea delle cellule.
9. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂.
10. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con 2 mL di mTeSR fresco più mezzo senza inibitore ROCK.
    NOTA: Un cambiamento transitorio nella morfologia cellulare (allungamento cellulare) è atteso in presenza dell'inibitore ROCK. Verifica che le cellule riacquistino la loro morfologia caratteristica dopo la rimozione.

3. Nucleofezione degli hiPSC

1. Fai passare le cellule quando la confluenza raggiunge circa il 60%.
   NOTA: In questo protocollo, circa il 60% di confluenza corrisponde a colonie di hiPSC in crescita attiva che coprono poco più della metà della superficie del pozzo, con spazio visibile tra le colonie e una differenziazione spontanea minima. Le colonie non dovrebbero essere sovraccresciute, fuse estesamente o presentare centri densi e multilivello al momento della nucleofezione.
2. Assicurarsi che il dispositivo di nucleofezione sia acceso e che l'integratore di nucleofezione venga aggiunto alla soluzione di nucleofezione P3. Prepara un secchio di ghiaccio.
3. Aggiungere 110 μL della soluzione nucleofectiva P3 in un tubo microcentrifuga posto sul ghiaccio.
4. Aggiungere 1 μg del plasmide CRISPR/Cas9 e 1 μg del plasmide donatore contenente la cassetta ASCL1-P2A-DLX2 indotta dalla doxiciclina. Cassetta, reporter fluorescente e cassetta a resistenza alla puromicina nel tube. Mescola delicatamente senza creare bolle.
5. Prepara la piastra di destinazione aspirando il BME da due pozzi rivestiti. Aggiungere 2 mL di mezzo di mantenimento hiPSC contenente un inibitore ROCK in ciascun pozzo e incubare la piastra a 37 °C.
6. Dissociare le hiPSC al 60% di confluenza da un pozzo di una piastra a 6 pozzi come descritto nei passaggi 2.2-2.5. Trasferisci la sospensione in un tubo sterile e centrifuga per 5 minuti a 500 x g a temperatura ambiente.
7. Scartare il sovrantante e risospendere la pellet cellulare nei 110 μL della soluzione nucleofecttiva P3 contenente i plasmidi. Pipetta con delicatezza per evitare la formazione di bolle.
8. Trasferire 100 μL della sospensione cellulare in una cuvetta di nucleofezione posta sul ghiaccio.
9. Inserisci la cuvetta nel dispositivo nucleofector ed esegui il programma CB-150 per gli hiPSC.
10. Recupera immediatamente le celle usando una pipetta Pasteur in plastica. Trasferire volumi uguali della sospensione della cella nei due pozzi precedentemente preparati.
11. Distribuire le cellule con un movimento a otto e incubare a 37 °C.
12. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con mTeSR più un inibitore ROCK privo di substrato. Verifica l'efficienza della nucleofettazione osservando la fluorescenza, se applicabile.

4. Selezione degli antibiotici

ATTENZIONE: La puromicina è tossica. Gestire con le attrezzature di protezione individuale appropriate e smaltire i rifiuti secondo le linee guida istituzionali.

NOTA: Prima di selezionare le hiPSC modificate, determinare la concentrazione ottimale di puromicina per ciascuna linea di hiPSC. Seminare hiPSC non modificati a 100.000 cellule per pozzo in una piastra a 6 pozzi rivestita di BME in un mezzo di mantenimento per hiPSC integrato con inibitore ROCK. Dopo 24 ore, sostituire il mezzo con un nuovo mezzo di mantenimento hiPSC contenente puromicina a 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 e 1,5 μg/mL. Sostituire quotidianamente il mezzo contenente puromicina e monitorare la morfologia cellulare e la sopravvivenza tramite microscopia a campo chiaro per 5 giorni. La concentrazione selezionata dovrebbe eliminare tutte le hiPSC non modificate entro 3–5 giorni, minimizzando al contempo l'eccessiva tossicità. In questo protocollo, la concentrazione ottimale di puromicina è tipicamente 0,4–0,6 μg/mL.

1. Attendere 3 passaggi post-nucleofezione, tipicamente circa 1–2 settimane a seconda del tasso di recupero e crescita, per permettere la perdita di plasmidi non integrati prima di iniziare la selezione.
2. Esegui un passaggio cellulare e semina 100.000 cellule per pozzo.
3. Dopo 24 ore, si aggiunge puromicina alla concentrazione determinata dalla curva di uccisione, tipicamente 0,4–0,6 μg/mL.
4. Mantieni la selezione di puromicina per la durata prestabilita, generalmente circa 5 giorni.
5. Validare la popolazione selezionata tramite microscopia a fluorescenza o citometria a flusso per stimare la proporzione di cellule reporter-positive.
   NOTA: Procedere solo con popolazioni aggregate che mostrano espressione di reporter ampiamente omogenea, idealmente >80–90% di cellule reporter positive. Se l'espressione del reporter rimane mosaico, estendi la selezione, ripeti l'arricchimento o considera l'isolamento clonale prima della differenziazione.
6. Confermare il corretto targeting di AAVS1 tramite PCR di giunzione prima di iniziare la differenziazione neuronale.
7. Quando è richiesta una validazione rigorosa, verificare i prodotti PCR tramite sequenziamento Sanger e valutare il numero di copie del transgene tramite qPCR, ddPCR o un altro test appropriato con numero di copia.
8. Valutare l'integrazione casuale utilizzando saggi basati su PCR per sequenze di dorsale plasmidiche o analisi di integrazione genomica più ampia, a seconda dell'applicazione a valle prevista.
9. Confermare che la popolazione selezionata di hiPSC rimane mico-negativa, mantenga la morfologia tipica della colonia di hiPSC e mantenga una crescita robusta dopo la selezione della puromicina.
10. Rivaluta l'integrità genomica tramite cariotipazione, array SNP o altro saggio validato, soprattutto quando le cellule modificate saranno utilizzate per modellazione della malattia, sei funzionali o studi a lungo termine.
11. Valutare i potenziali effetti off-target di CRISPR/Cas9 tramite sequenziamento mirato di siti off-target previsti o, quando necessario, approcci genomici più ampi.
    NOTA: Non utilizzare colture per la differenziazione se mostrano morfologia anomala, scarso recupero dopo la selezione, espressione persistente del segnalatore mosaico, anomalie genomiche confermate o integrazione fallita di AAVS1 . In questo protocollo, alcuni hiPSC ingegnerizzati selezionati vengono utilizzati come popolazione aggregata e possono essere criopreservati prima dell'induzione da doxiciclina, una volta che l'espressione del reporter, il targeting, la morfologia e la crescita di AAVS1 . sono stati validati. La crioconservazione dopo l'induzione della doxiciclina o durante la maturazione neuronale non fa parte del flusso di lavoro standard e dovrebbe essere validata empiricamente prima dell'uso.

5. Differenziazione nei neuroni GABAergici

1. Prepara il numero necessario di pozzi rivestiti di BME. Si noti che una ben seminata al giorno 0 produrrà un pozzo di neuroni GABAergici.
2. Prepara 6,9 mL di mezzo neuro-indutivo per pozzo, integrandolo con doxiciclina (1 μg/mL). Includere un volume in eccesso del 15% per compensare errori di evaporazione o pipettatura.
   NOTA: La doxiciclina viene utilizzata a una concentrazione finale di 1 μg/mL, a partire dal giorno 0, e mantenuta durante la differenziazione e la maturazione. Un nuovo mezzo contenente doxiciclina viene preparato ad ogni cambio di mezzo per mantenere un'induzione costante del transgene. Questa dose è stata scelta perché produceva un'espressione robusta di reporter e una conversione neuronale efficiente nelle nostre mani. In questo protocollo non veniva eseguita una risposta formale alla dose di doxiciclina; pertanto, i laboratori che adottano il metodo possono testare empiricamente 0,1–2 μg/mL doxiciclina se l'induzione del transgene appare subottimale.
3. Il giorno 0, dissociare gli hiPSC ingegnerizzati e seminare 200.000 cellule nei pozzi preparati rivestiti di BME. Incubare a 37 °C.
4. Nei giorni 1, 2 e 3, aspirare il mezzo e aggiungere 2 mL di nuovo mezzo neuroinduzionale contenente doxiciclina.
   NOTA: Entro il terzo giorno, l'espansione cellulare dovrebbe diminuire notevolmente e potrebbero iniziare ad apparire strutture simili a dendritiche. Se è richiesta una conferma sperimentale dell'uscita dal ciclo cellulare, l'immunocolorazione con Ki-67 o l'incorporazione di EdU/BrdU possono essere eseguite al giorno 3–4.
5. Al quarto giorno, preparare un mezzo di neuromaturazione contenente fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF) e neurotrofina-3 (NT-3), ciascuno a una concentrazione finale di 10 ng/mL, doxiciclina a 1 μg/mL e PluriSln a 20 μM.
6. Aspira il mezzo di neuroinduzione. Aggiungi con attenzione 2 mL del mezzo di neuromaturazione goccia per goccia lungo la parete del pozzo per evitare di disturbare i neuroni appena formati.
7. Al giorno 7, aspirare il mezzo e aggiungere delicatamente 2 mL di mezzo di neuromaturazione contenente neurotrofie e doxiciclina, ma omettendo l'inibitore della sopravvivenza delle cellule pluripotenti.
8. Per un mantenimento a lungo termine, si sostituisce completamente il mezzo di neuromaturazione ogni 3-4 giorni, adattando la frequenza in base alla densità cellulare.
   NOTA: Il giorno 21 è il punto finale standard per valutare l'identità neuronale GABAergica. Entro il giorno 21, le cellule dovrebbero mostrare caratteristiche neuronali GABAergiche, inclusa DLX1.e continuano a maturare le loro reti assonali. Una densità di semina di 200.000 cellule per pozzo è stata selezionata empiricamente per produrre colonie ben distanziate, evitando il sovraffollamento e la morte cellulare associata alla maturazione. Densità di 150.000–300.000 celle/pozzo sono compatibili, con densità più basse preferite per morfologia e densità più elevate per il recupero del materiale. Per ridurre il distacco, eseguire cambi più frequenti di metà a medio usando una pipetta da 1.000 μL a basso flusso senza inclinare la piastra di scatto. Se necessario, le cellule possono essere riplaciate una volta dopo l'induzione da doxiciclina di 3 giorni, prima dell'aggiunta del mezzo di maturazione, utilizzando rivestimenti potenziati come poli-L-lisina/laminina o laminina-521. Bisogna evitare ulteriori rimosse dopo l'inizio della maturazione.
9. Le colture possono essere mantenute oltre il giorno 21 per una maturazione prolungata se le reti rimangono attaccate, vitali e libere da colonie simili a hiPSC in proliferazione. Dopo il giorno 21, eseguire cambi di mezzo mezzo ogni 3–4 giorni con un nuovo mezzo di neuromaturazione contenente doxiciclina e fattori neurotrofici.
   NOTA: Utilizzare colture per i saghi a valle una volta che la morfologia neuronale e le reti neuritariche sono stabili, il distacco è minimo e non sono visibili colonie indifferenziate. Nelle nostre mani, le colture vengono tipicamente utilizzate tra il giorno 21 e il giorno 35.

Risultati

L'applicazione con successo di questo protocollo porta a una popolazione arricchita di neuroni indotti con caratteristiche molecolari GABAergiche. La strategia si basa sull'inserimento mirato di una cassetta ASCL1-P2A-DLX2 indotta dalla doxiciclina nel locus AAVS1 (Figura 1A). Dopo la selezione degli hiPSC ingegnerizzati, l'induzione da doxiciclina viene utilizzata per guidare la differenziazione neuronale GABAergica, come illustra...

Discussione

La generazione efficace dei neuroni GABAergici dipende fortemente da diversi passaggi critici all'interno di questo protocollo. Mantenere hiPSC di alta qualità e indifferenziati è fondamentale; La differenziazione spontanea prima della nucleofezione riduce drasticamente l'efficienza di integrazione e la purezza neuronale^{a valle 8}. Inoltre, una determinazione precisa della curva di uccisione della puromicina è essenziale per garantire l'eliminazione completa delle ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4D-Nucleofector™ Core Unit	Lonza	AAF-1002B	Per l'elettroporazione/nucleofezione di hiPSC.
6-well culture plates	Sarstedt	83.3920300	Piatti trattati per la cultura tissutale per il mantenimento e la differenziazione di hiPSC.
BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)	STEMCELL Technologies	78005	Proteina umana ricombinante per la maturazione neuronale; preparare secondo le istruzioni del produttore e utilizzare a una concentrazione finale di 10 ng/mL.
Cell counter (Countess)	Thermo Fisher Scientific	C10283	Usato per il conteggio delle cellule.
Centrifuge	VWR	76468-134	Per il pelleting delle cellule.
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	Heracell VIOS 160i o equivalente	Incubatore per colture cellulari che mantiene 37 °C, atmosfera umidificata e 5% CO2.
Cryotubes	Thermo Fisher Scientific	5000-0020	Flaconi criogenici sterili per il congelamento di hiPSC; possono essere utilizzati vial criogenici esterni filettati da 1,8–2,0 mL equivalenti.
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	Bio-Techne	BME001-05	Matrice di rivestimento BME standard utilizzata nel protocollo. Verificare la concentrazione di stock specifica del lotto dal certificato di analisi Bio-Techne e diluire in DMEM/F-12 a una concentrazione di lavoro di 80 µg/mL.
DMEM/F-12	Wisent	319-090-CL	Medium basale utilizzato per diluire BME.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma-Aldrich	D2650	Crioprotettore utilizzato nella preparazione del medium di congelamento.
Donor plasmid: inducible ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 targeting cassette	Custom plasmid	Addgene accession pending	Plasmid donatore AAVS1 personalizzato contenente cassetta ASCL1-P2A-DLX2 inducibile con doxiciclina ed elementi di selezione/reporter. Fornire la mappa del plasmide e la sequenza completa come file supplementare o su richiesta.
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Usato per indurre l'espressione di ASCL1-P2A-DLX2. Preparare una soluzione di stock sterile, aliquotare, proteggere dalla luce, conservare congelato e utilizzare a una concentrazione finale di 1 µg/mL.
Ethanol (70%)	Commercial Alcohols / Greenfield Global	P016EAAN	Per la sterilizzazione all'interno del gabinetto di sicurezza biologica; utilizzare etanolo al 70% approvato dall'istituto o equivalente.
Fluorescence microscope	ECHO	Revolve R4	Microscopio utilizzato per l'imaging a contrasto di fase e a fluorescenza dell'espressione del reporter e della morfologia neuronale.
GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor)	STEMCELL Technologies	78058	Proteina umana ricombinante per la maturazione neuronale; preparare secondo le istruzioni del produttore e utilizzare a una concentrazione finale di 10 ng/mL.
hiPSC line PGP1	EditCo Bio	PGP1 human iPSC line	Linea hiPSC umana a consenso aperto disponibile in commercio utilizzata in questo protocollo; registrare il numero di passaggio e lo stato di QC prima della modifica e della differenziazione.
Image-analysis software	ImageJ/Fiji	Open-source; la versione utilizzata dovrebbe essere riportata	Per la quantificazione della fluorescenza e l'elaborazione di immagini rappresentative.
KnockOut™ Serum Replacement (KOSR)	Thermo Fisher Scientific	10828028	Usato nella preparazione del medium di congelamento.
Laminin-521	STEMCELL Technologies	200-0117	Reagente di risoluzione dei problemi opzionale. Non fa parte del protocollo di rivestimento standard; può essere utilizzato come alternativa o matrice di rivestimento doppio se persiste il distacco neuronale.
Liquid nitrogen dewar	Thermo Fisher Scientific	Locator 6 Plus o equivalente	Conservazione a lungo termine di hiPSC congelate in fase vapore o azoto liquido secondo le procedure di sicurezza criogenica istituzionali.
Mr. Frosty™ Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Per il congelamento a velocità controllata delle cellule a -80 °C.
mTeSR™ Plus	STEMCELL Technologies	100-0276	Medium di mantenimento privo di feeder per hiPSC.
Neuro-induction medium	STEMCELL Technologies	08582	Medium di induzione neuronale commerciale utilizzato per l'induzione neuronale precoce.
Neuro-maturation base medium (BrainPhys™ Neuronal Medium)	STEMCELL Technologies	05790	Medium di base per la maturazione neuronale; supplementare con BDNF, GDNF, NT-3, doxiciclina e PluriSln-1 come descritto nel protocollo.
NT-3 (Neurotrophic Factor 3)	STEMCELL Technologies	78074	Proteina umana ricombinante per la maturazione neuronale; preparare secondo le istruzioni del produttore e utilizzare a una concentrazione finale di 10 ng/mL.
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit	Lonza	V4XP-3024	Kit contenente la soluzione P3 e le cuvette per la nucleofezione di hiPSC.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotico opzionale per ridurre il rischio di contaminazione batterica.
Plasmocin™ prophylactic	InvivoGen	ant-mpp	Antibiotico opzionale per prevenire la contaminazione da micoplasmi.
PluriSIn-1	STEMCELL Technologies	72822	Inibitore della sopravvivenza delle cellule pluripotenti per eliminare le hiPSC indifferenziate; preparare il stock secondo le istruzioni del produttore e utilizzare a una concentrazione finale di 20 µM.
Puromycin Dihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	A1113803	Antibiotico utilizzato per la selezione; preparare una soluzione di stock sterile, aliquotare, conservare congelato e determinare la concentrazione finale di lavoro mediante curva di morte, tipicamente 0,4–0,6 µg/mL.
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 AAVS1 gRNA plasmid	Addgene	85802	Plasmid CRISPR/Cas9 utilizzato per il targeting di AAVS1; includere la sequenza gRNA di AAVS1 nella mappa del plasmide o nelle informazioni supplementari.
qPCR analysis software	Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific	QuantStudio Design & Analysis Software o equivalente	Per l'estrazione di Ct e l'analisi RT-qPCR; riportare la versione del software utilizzata.
qPCR master mix	Thermo Fisher Scientific	PowerUp SYBR Green Master Mix, A25742	Per la quantificazione RT-qPCR dei marcatori neuronali e GABA