Un modello di sovraccarico di ferro basato su citrato di ammonio ferrico con letture associate alla ferroptosi nei mioblasti C2C12

Sommario

Qui presentiamo un modello rapido di sovraccarico di ferro basato su citrato di ammonio ferrico nei mioblasti C2C12 che produce carichi di ferro, cambiamenti molecolari associati alla ferroptosi e perdita precoce di vitalità sensibile alla ferrostatina.

Abstract

La ferroptosi è una forma di morte cellulare regolata dipendente dal ferro, implicata nell'invecchiamento e nelle malattie degenerative. In precedenza abbiamo scoperto che le cellule staminali muscolari invecchiate accumulano ferro intracellulare e subiscono una morte ferroptotica all'attivazione. Qui descriviamo un semplice modello in vitro che utilizza citrato di ammonio ferrico per generare sovraccarico di ferro nei mioblasti murini di C2C12. Il trattamento con citrato di ammonio ferrico ha aumentato la carica intracellulare di ferro, come dimostrato dall'elevato trascritto di ferritina a catena pesante e leggera, dall'aumento della proteina ferritina e dal segnale potenziato da un colorante di ferro labile a cellule vive. L'esposizione al citrato di ammonio ferrico (FAC) ha inoltre prodotto cambiamenti molecolari associati alla ferroptosi, tra cui un aumento dell'espressione di Slc40a1 e Hmox1 e una riduzione della proteina della glutatione perossidasi 4. La diminuzione associata alla FAC della glutatione perossidasi 4 è stata parzialmente invertita dalla deferoxamina. Dopo 12 ore, il citrato di ammonio ferrico citotossico ridusse la vitalità cellulare, e questo effetto fu salvato dalla ferrostatina-1, compatibile con una componente sensibile alla ferroptosi della morte cellulare. Nei momenti successivi, l'aumento della variabilità e la riduzione dell'intervallo dinamico del saggio limitano l'interpretabilità delle misurazioni di vitalità. Pertanto, questo protocollo fornisce un modello rapido e scalabile del carico di ferro mediato dal citrato di ammonio ferrico, che può essere utilizzato per studiare le risposte associate alla ferroptosi e testare interventi modificanti del ferro o della ferroptosi nelle cellule muscolari.

Introduzione

La ferroptosi è una forma di morte cellulare regolata (RCD), molecolarmente distinta dalle altre RCD. È stato scoperto per la prima volta usando l'erastina, una piccola molecola letale selettiva per la RAS (sarcoma del ratto), che si è rivelata causare morte cellulare non^{apoptotica 1}. Nel loro lavoro fondamentale, Dixon et al. descrissero per primi il suo meccanismo come dipendente dal ferro, coniando così il termine ferroptosi, che significa "caduta (morte) per ferro¹." Dal punto di vista molecolare, la ferroptosi si manifesta come un accumulo eccessivo di ferro, un aumento della perossidazione lipidica e un accumulo di specie reattive di ossigeno, portando alla morte^{cellulare 2}. È unicamente distinguibile dallo stress ossidativo e da altre forme di RCD per la sua indipendenza dall'attivazione della caspasi, un tratto distintivo dell'apoptosi, e l'assenza della proteina chinasi interagente con recettori fosforilati 3 (RIPK3) e della pseudo chinasi a dominio di linea mista (MLKL), che si osservano solo nella necroptosi³. Inoltre, la ferroptosi può essere alleviata anche con gli antiossidanti lipidici ferrostatina-1 e liprosstatina-1, e con il chelatore di ferro^{deferoxamine 4}. Sebbene la ferroptosi sia simile ad altri tipi di RCD in quanto tutte portano alla morte delle cellule, la sua presentazione la rende meccanicisticamente distinta da altre forme di RCD.

Lo studio della ferroptosi ha guadagnato popolarità nell'ultimo decennio, principalmente grazie agli sforzi continui sul campo per identificare nuovi tratti distintivi e sviluppare nuovi strumenti per studiarne i meccanismi sottostanti e il contributo alle malattie^{umane 5}. Un recente corpus di evidenze suggerisce che il sovraccarico di ferro e la ferroptosi siano contributi poco studiati alla fragilità e alla sarcopenia legate^{all'età 6,7,8}. Abbiamo recentemente dimostrato che le cellule staminali muscolari invecchiate (MuSCs) sono particolarmente suscettibili alla morte ferroptotica dovuta a un'infiammazione cronica che sopprime un programma genetico antiossidativo tramite il silenziamento^{epigenetico 9}. Abbiamo riscontrato che i MuSC anziani accumulano un livello aberrante di ferro elementare intracellulare, circa 30 volte superiore rispetto al loro omologo adulto. Sebbene la ferroptosi sia stata collegata a malattie in più organi e tessuti—principalmente quelli legati all'invecchiamento—il suo ruolo fisiologico rimane poco chiaro e merita ulteriori indagini.

Sebbene il nostro studio precedente abbia mostrato che i MuSC anziani sono sensibilizzati alla morte ferroptotica all'attivazione, il contributo specifico del carico di ferro a quel fenotipo resta da chiarire. Qui, stabiliamo un modello semplice di sovraccarico di ferro in mioblasti di C2C12 trattati con citrato di ammonio ferrico (FAC) e chiediamo se l'eccesso di ferro sia sufficiente a generare cambiamenti molecolari associati alla ferroptosi e perdita di vitalità sensibile alla ferrostatina. Le cellule C2C12 forniscono un sistema progenitore muscolare murino a bassa manutenzione, scalabile e facilmente^{reperibile 10}. Prevediamo che questo approccio offrirà una piattaforma pratica per studiare le risposte allo stress guidate dal ferro nelle cellule muscolari e per testare interventi che modifichino fenotipi associati alla ferroptosi.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule C2C12

1. Scongelamento delle celle
   NOTA: Tutti i passaggi della coltura cellulare devono essere eseguiti in un armadietto sterile per la biosicurezza.
   1. Prepara un tubo conico contenente 9 mL di mezzo caldo completo (medium Eagle modificato di Dulbecco con alto contenuto di glucosio e piruvato + 10% siero fetale bovino + 1% penn/streptococco).
   2. Scongelare una fiala di celle di C2C12 congelate (~1 milione) aggiungendo 800 μL di mezzo completo preriscaldato alla fiala dal materiale principale. Fai pipette su e giù lentamente.
   3. Quando il substrato aggiunto alla fiala in scongelamento si raffredda, rimuovilo e aggiungilo al tubo conico. Sostituisci con lo stesso volume di materiale caldo del tubo. Continua a pipettare su e giù e scambiando il substrato finché le cellule congelate non vengono risospese.
   4. Pipetta il contenuto della fiala nel tubo conico del mezzo. Inverti per mescolare, poi aggiungi il contenuto in una ciotola trattata con coltura cellulare da 10 cm. Incubare a 37 °C per 4 ore.
   5. Controlla le cellule al microscopio per assicurarti che si siano attaccate. Le cellule attaccate appariranno allungate, mentre quelle fluttuanti sono circolari e si muovono quando la piastra si muove.
      NOTA: Supponendo che le cellule placcate siano sane, la maggior parte dovrebbe essere attaccata.
   6. Aspira dal substrato per rimuovere cellule morte e detriti. Sostituisci con 10 mL di mezzo caldo e completo e riportalo nell'incubatrice. Lascialo incubare durante la notte, o finché il piatto non raggiunge l'80% di confluenza.
2. Semina delle cellule C2C12 per il trattamento del ferro
   1. Una volta raggiunta la confluenza desiderata, aspirare dal mezzo cellulare. Aggiungere 2 mL di PBS a goccia sul piatto, assicurando che l'intera superficie sia coperta; aspirazione.
   2. Aggiungi 2 mL di tripsina allo 0,25% alle cellule. Incubare a 37 °C per 5–10 minuti, oppure finché le cellule non si staccano. Una volta staccate, le cellule appariranno circolari al microscopio, e la tripsina e la sospensione cellulare saranno torbide e ispessite.
   3. Neutralizza la tripsina aggiungendo 8 mL di DMEM completo caldo. Usa una pipetta sierologica per mescolare accuratamente la soluzione e lavare la placca. Trasferire la sospensione della cella su un tubo conico.
   4. Inverti delicatamente il tubo 3–5 volte. Rimuovere il volume appropriato e contare le cellule utilizzando il metodo preferito (contatore cellulare, emocitometro, ecc.).
   5. Realizzare una sospensione di cellule sufficiente a seminare il numero desiderato di pozzi/piastre per n = 3 per ogni condizione: 10 cm piastra (per western blot): 100.000 cellule/piastra a 6 pozzi (per qPCR): 50.000 celle/pozzo, piastra a 96 pozzi (per ferro labile e colorazione da luminescenza): 1.000 celle/pozzo. Lascia incubare le cellule a 37 °C durante la notte.
3. Applicazione del trattamento con ferro sulle cellule seminate
   1. Il giorno del trattamento, aggiungere citrato di ammonio ferrico (FAC; formula = C₆H₁₁FeNO₇⁺³; MW = 265 g/mol) per completare il DMEM alle seguenti concentrazioni in condizioni sterili: Grave: 180 μM (0,0477 mg/mL), Citotossico: 1.800 μM (0,477 mg/mL).
      NOTA: Considera di aggiungere anche controlli, inclusi, ma non limitati al veicolo, deferossamina grave + 150 μM (un chelante ferroso), veicolo + 150 μM deferoxamina e/o veicolo + RSL3 (un induttore di ferroptosi; controllo positivo. Inoltre, vale la pena notare che il DMEM può contenere una piccola quantità di nitrato di ferro (III) non idrato, una fonte di ferro ferrico, alla base. Il lettore deve interpretare le concentrazioni FAC sopra raccomandate come un'aggiunta a qualsiasi ferro ferrico già presente nel mezzo di coltura del veicolo.
   2. Inverti per mescolare finché il FAC non si dissolve nel mezzo completo.
      NOTA: Poiché il FAC è solubile in acqua, non è necessario alcun DMSO o solvente aggiuntivo. L'aggiunta di FAC può alterare il pH della soluzione, quindi se si osserva un cambiamento drastico del colore del mezzo, si raccomanda di misurare il pH per garantire la vitalità delle cellule quando il substrato trattato viene aggiunto alla coltura.
   3. Aspira il materiale dalle cellule. Aggiungere lo stesso volume di mezzo completo integrato con ferro alle condizioni di trattamento e materiale intero non trattato ai pozzi/piastre del veicolo. Incubare a 37 °C per la durata desiderata del trattamento prima di procedere con il test preferito: analisi di ferro labile: trattamento FAC 2 ore, qPCR e western blot: trattamento FAC 12–24 ore, analisi di luminescenza: trattamento FAC 12 ore.

2. qPCR

1. Isolamento dell'mRNA per la qPCR
   ATTENZIONE: Il reagente di estrazione dell'RNA e il cloroformio rappresentano rischi respiratori. Manipolare solo in una cappa con i DPI corretti (camice da laboratorio, guanti usa e getta resistenti ai prodotti chimici e protezione per gli occhi).
   1. Al banco, aspirare il materiale dalle cellule. Lava le cellule due volte con PBS sterile e aspira accuratamente il liquido residuo.
   2. In una cappa a vapore, aggiungere il reagente di estrazione RNA alle celle nei seguenti volumi: piastra a 6 pozzi: 250 μL/pozzo, piastra da 10 cm: 1 mL/piatto.
   3. Lavorando sul ghiaccio nella cappa fumi, usa un raschiatore per cellulari per raschiare delicatamente via le celle lisate. Fai attenzione a raschiare accuratamente tutte le parti della piastra per massimizzare la resa di RNA.
   4. Pipetta il lisato in tubi microfuge sterili, preraffreddati e privi di RNAsi. Lasciali riposare a temperatura ambiente per 5 minuti.
   5. Per ogni mL del reagente di estrazione, aggiungere 200 μL di cloroformio ALL'INTERNO DI UNA CAPPA A POMPA. Agitare vigorosamente i campioni per almeno 30 secondi per combinare il reagente di estrazione e il cloroformio. Lasciali riposare a temperatura ambiente per 5 minuti.
      NOTA: Dopo che il tempo è trascorso, avviene la separazione delle fasi, con la fase acquosa traschisa (che contiene l'RNA) sopra.
   6. Centrifugare campioni per 15 minuti a 12.000 × g a 4 °C. Nel frattempo, etichettare i nuovi tubi autoclavati e aggiungere 500 μL (per mL di reagente di estrazione) di isopropanolo ai tubi sul ghiaccio.
   7. Trasferire solo la fase acquosa in ciascun tubo corrispondente. Mescola delicatamente per inversione, poi lascia riposare a temperatura ambiente per 10 minuti. Se si prevede una resa bassa, aggiungere 2 μL di GlycoBlue per visualizzare il pellet.
   8. Centrifugare per 15 minuti a 12.000 × g a 4 °C.
      NOTA: L'RNA precipitato può essere visibile sul fondo del tubo.
   9. Versa con attenzione l'eccesso di isopropanolo in un becher di rifiuti designato. Aggiungi 1 mL di etanolo di grado molecolare, al 100%, goccia a goccia al tubo, facendo attenzione a non staccare il pellet. Centrifugare per 5 minuti a 7.500 × g a 4 °C.
   10. Versa via etanolo. Inverti i tubi e lascia il tappo aperto sopra un tovagliolo di carta. Lascia asciugare il pellet finché non è senza gocce (~15–30 min).
       NOTA: Il pellet potrebbe diventare traslucido se non è stato aggiunto GlycoBlue.
   11. Risospendere il pellet in 25 μL di acqua sterile e priva di RNAse. Quantificare la concentrazione di RNA tramite spettrofotometria UV-visibile. Normalizza a una concentrazione uniforme tra i campioni che consenta un massimo di 1 μg di RNA in 16 μL per campione.
2. Sintesi del cDNA per qPCR
   NOTA: Completare tutti i passaggi sul ghiaccio per massimizzare la resa di RNA/cDNA.
   1. Campioni di scongelamento. Lava l'area di lavoro con un detergente RNAse.
   2. Aggiungere 1 μg di RNA da ogni campione a una sonda a strisce PCR corrispondente.
   3. Aggiungi 4 μL della miscela di cDNA in ogni provetta. Se necessario, aggiungere acqua sterile per raggiungere un volume totale di 20 μL. Far passare le miscele sotto i seguenti parametri del termociclatore: 25 °C per 5 minuti, 42 °C per 30 minuti, 85 °C per 5 minuti, 4 °C all'infinito.
3. Esecuzione di qPCR
   1. Diluire cDNA 1:10 in acqua sterile prima di effettuare ulteriori reazioni.
      NOTA: il cDNA può essere congelato a -20 °C per 1 mese o a -80 °C per 6 mesi.
   2. Diluire i primer a una concentrazione di 10 μM con acqua sterile. Includere i controlli e/o i geni di gestione corretti (ad esempio, B2M, TBP1).
   3. Realizzare miscele master per ogni gene di mantenimento e gene di interesse, in modo che ci sia abbastanza mix di reazione per eseguire ogni condizione del DNA in triplice. La ricetta del master mix (per reazione) è la seguente: 2x miscela PCR: 10 μL, primer diretto (10 μM): 1 μL, primer inverso (10 μM): 1 μL, acqua sterile: 8 μL.
   4. Posizionare una piastra di reazione qPCR in un blocco metallico raffreddato a 96 pozzi. Aggiungere 5 μL di cDNA diluito a ogni pozzo campione e 20 μL di miscela master di reazione in ciascun pozzo. Ispeziona ogni pozzo per assicurarti che tutti ricevano lo stesso volume, copri la piastra con un sigillante e usa uno strumento a bordo piatto per levigare le bolle.
   5. Centrifuga la piastra a 1.000 × g e 4 °C per 1 minuto. Posiziona la piastra in una macchina qPCR, assicurandoti che sia caricata nella corretta orientazione.
   6. Nel software qPCR, designa le identità campionari e geni di interesse per ciascun pozzo. Considera di creare un template se prevedi di eseguire più repliche con la stessa configurazione.
   7. Esegui il programma qPCR (durata: ~1:36 h) mostrato nella Tabella 1.
   8. Esporta i risultati come un . CSV o . File XLSX. Se la macchina qPCR utilizzata permette all'utente di scegliere quali valori esportare, verifica che i valori CT siano inclusi nel file esportato.
   9. Utilizzare i valori medi della CT per ogni condizione e gene di interesse—rispetto ai valori CT dei geni di mantenimento nella condizione corrispondente—per calcolare il cambiamento di piegamento di ciascun gene. Normalizzare il cambiamento di piegatura della condizione del veicolo a 1.0.

3. Western blot

1. Proteina isolante per western blot
   NOTA: Esegui tutti i passaggi sul ghiaccio per massimizzare la resa proteica.
   1. In un armadietto di biosicurezza, aspirare dal mezzo di coltura. Risciacquare le cellule con abbastanza PBS freddo da coprire il fondo della piastra di coltura. Aspira, poi ripeti.
   2. Aggiungere un buffer RIPA integrato con cocktail inibitori di proteasi e fosfatasi per prevenire la degradazione delle proteine. Utilizzare 75 μL di soluzione RIPA per la coltivazione in una piastra a 6 pozzi, oppure 200 μL di soluzione RIPA in una piastra da 10 cm.
   3. Lavorando sul ghiaccio, usa un raschiatore a celle per sciogliere delicatamente le cellule lisate dalla piastra di vetro. Fai particolare attenzione a rimuovere le cellule da tutte le parti della placca, compresi i bordi. La soluzione apparirà chiara e in parte viscosa.
   4. Pipetta la sospensione a celle RIPA in tubi microfuge raffreddati. Centrifugare i campioni per 10 minuti a velocità massima di 4 °C. Trasferisci il soprannatante (il lisato proteico) in un tubo preraffreddato. Scarta la pallina.
   5. Quantifica la concentrazione proteica eseguendo un saggio di Bradford o BCA. Normalizzare i campioni a 1 μg/μL in acqua pura arricchita con cocktail su congelamento con proteasi e inibitori della fosfatasi.
   6. Diluire i lisati nel tampone di Laemmli, assicurando che le concentrazioni finali di proteine siano uniformi tra i campioni. Bollisci a 95 °C per 10 minuti per denaturare la proteina. Per ottenere i migliori risultati, usa il western blotting subito dopo la preparazione. Altrimenti, immagazzina le proteine in Laemmli a -20 °C nel breve termine (≤ 1 mese) o a -80 °C nel lungo periodo.
2. Preparazione dei gel di acrilammide per SDS-PAGE
   ATTENZIONE: L'acrilammide è una neurotossina e deve essere maneggiata solo indossando DPI appropriati (camice da laboratorio, guanti resistenti ai prodotti chimici e protezione per gli occhi).
   1. Determina le proteine di interesse e la dimensione di queste proteine consultando il sito web dell'azienda con l'anticorpo/i da utilizzare. Utilizzare la dimensione prevista della proteina o proteine di interesse per decidere quale percentuale di acrilammide dovrebbe avere il gel.
      NOTA: l'acrilammide al 10%-15% funziona bene per la maggior parte dei pesi molecolari.
   2. Assembla il supporto e il telaio per la fusione del gel secondo le indicazioni del produttore.
   3. Per il gel risolvente, si combina acrilammide, acqua sterile, 1,5 M Tris/HCl pH8.8 tampone e dodecil solfato al 10% in un tubetto conico nei volumi appropriati per il numero e la percentuale di acrilammide dei gel da preparare, secondo la Tabella 2, che elenca i componenti necessari per 2 gel. Mix per inversione.
   4. Aggiungi una soluzione di persolfato di ammonio al 10% e TEMED alla miscela. Inverti per mescolare.
   5. Aggiungi immediatamente la soluzione al telaio del getto gel, riempiendo fino a quando il volume della soluzione nel telaio del gel non è appena inferiore a quello necessario per raggiungere il fondo del pettine, se il pettine dovesse essere inserito.
   6. Aggiungi immediatamente 100–200 μL di etanolo puro a goccia sopra il gel indurente. Se i lisati proteici devono essere scongelati e/o denaturati, completate questa procedura durante questo periodo di incubazione. Scongelare proteine su ghiaccio.
      NOTA: Questo disperderà la soluzione in modo che il gel non si indurisca in modo irregolare.
   7. Una volta indurito, versa via l'etanolo. Per il gel di impilamento, si combina acrilammide, acqua sterile, 0,5 M Tris/HCl pH6.8 buffer e dodecil solfato di sodio al 10% in un tubetto conico nei volumi appropriati per il numero e la percentuale di acrilammide dei gel da preparare, secondo la Tabella 2, che elenca i componenti necessari per due gel. Mix per inversione.
   8. Aggiungi la soluzione di persolfato di ammonio al 10% e TEMED alla miscela. Mix per inversione.
   9. Aggiungi immediatamente la soluzione di impilamento al telaio gel finché il volume non raggiunge la cima. Aggiungi il pettine gel immediatamente dopo aver versato il gel. Lascia riposare per ~1 ora o finché la forma dei pozzi non cambia quando il supporto per il gel viene leggermente dondolo.
3. Gel di caricamento
   1. Riempire la camera o le camere di elettroforesi con il buffer di corsa fino alla linea di riempimento appropriata per il numero di gel da eseguire.
   2. Trasferisci il telaio in gel con i pettini ancora all'interno nella camera di elettroforesi. Aggiungi più buffer di corsa nello spazio tra i gel finché il serbatoio non è pieno. Tira delicatamente fuori i pettini dai gel immersi.
   3. Sottittare 5–10 μL di scala in un pozzo di ciascun gel.
   4. Pipetta 5–20 μL di proteina estratta e campioni di Laemmli buffer in ciascun pozzo. Aggiungi 5–10 μL di 1x Laemmli buffer a qualsiasi pozzo vuoto.
      NOTA: Il volume che aggiungi potrebbe richiedere ottimizzazione in base alla prevalenza della proteina o proteine di interesse e/o dell'efficacia degli anticorpi.
4. Esecuzione di SDS-PAGE
   1. Collega la camera di elettroforesi a un pacco di alimentazione. Impostato per funzionare a 150 V per 45 minuti.
      NOTA: A seconda della configurazione, potrebbe essere necessario più tempo o una tensione più alta per effettuare la migrazione completa, quindi regolare secondo necessità.
   2. Una volta che la proteina è migrata all'estremità del gel (dove si incontrano il caster e il telaio del gel alla base dell'apparecchio), ferma la corsa e spegni il power pack.
5. Completamento del trasferimento proteico
   NOTA: Questa sezione è stata sviluppata utilizzando un apparato di trasferimento rapido di proteine.
   1. Versa il tampone di trasferimento in una teglia gel. Aggiungi una pila di trasferimento, seguita da una membrana di nitrocellulosa e un'altra pila di trasferimento al liquido per formare un sandwich con la membrana al centro. Assicurati che la pila sandwich sia completamente immersa nel buffer di trasferimento.
   2. Accendi l'apparecchiatura di trasferimento rapido delle proteine e seleziona il protocollo appropriato per il numero di gel e la dimensione della proteina o proteine di interesse.
      NOTA: 1,3 A e 25 V per 10 minuti si è dimostrato funzionare bene, ma potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione.
   3. Rimuovi la pila di trasferimento superiore con le pinze e lascia che l'eccesso di liquido scorra nella vaschetta del gel. Sposta la pila sull'apparato di trasferimento proteico e stendilo il più piatto e dritto possibile; Usa un rullo o un tubo conico per lisciare eventuali pieghe. Ripeti con la membrana.
   4. Usa uno strumento a estremità smussata per separare delicatamente le metà superiore e inferiore del telaio per la fusione. Trasferisci il gel alla membrana dell'apparato di trasferimento proteico.
   5. Usa le pinze per sollevare la pila di trasferimento rimanente dal vassoio del gel. Drena il liquido in eccesso, poi posizionalo sopra la membrana e l'altro stack. Chiudi la scatola del gel e esegui il programma.
6. Bloccaggio e colorazione con anticorpi
   1. Apri la scatola del gel e usa le pinze per rimuovere la pila superiore, poi solleva il gel. Conferma che ci siano bande dalla scala sulla membrana. Taglia la membrana includendo solo la fascia di dimensioni di interesse.
   2. Trasferisci la membrana in una scatola pulita per blot. Aggiungi 5 mL di buffer bloccante, o abbastanza da coprire la membrana. Blocca sotto agitazione a temperatura ambiente per 1 ora.
   3. Nel frattempo, prepararsi alla colorazione degli anticorpi aggiungendo la concentrazione raccomandata di anticorpi primari a 5 mL di albumina sirica bovina al 2% in tampone di lavaggio per membrana. Colora anche per proteine domestiche (ad esempio, GAPDH, β-actina).
   4. Rimuovi dall'agitazione e versa via il buffer di blocco. Aggiungi 5 mL della soluzione primaria per anticorpi. Incubare al buio sotto agitazione a 4 °C durante la notte (~12–16 ore).
      NOTA: D'ora in avanti, tutti i passaggi devono essere completati al buio.
   5. Lava la membrana 3 x 5 minuti sotto agitazione a temperatura ambiente con il tampone di lavaggio.
   6. Aggiungi la concentrazione raccomandata di anticorpi secondari al 5% di BSA nel wash buffer. Prepara 5 mL di soluzione per ogni membrana.
   7. Versa via l'eccesso di buffer di lavaggio. Aggiungi 5 mL di soluzione secondaria di anticorpi a ogni blot. Incubare al buio sotto agitazione a temperatura ambiente per 1 ora.
   8. Lava la membrana 3 x 10 minuti sotto agitazione a temperatura ambiente con il tampone di lavaggio. Immaginela immediatamente.
7. Rilevamento e analisi delle proteine di interesse
   1. Immagini delle proteine usando la piattaforma preferita.
   2. Usa ImageJ o un'altra piattaforma per quantificare l'intensità di ogni banda di interesse.

4. Dosaggio a tintura di ferro labile

1. Colorazione con tinta di ferro labile
   1. Completare tutta la sezione 1, seminando le celle in una piastra da 96 pozzi sotto trattamento con ferro per 2 ore. Assicurarsi che ci siano almeno tre pozzi per ogni condizione di trattamento con ferro, così come controlli negativi (veicolo; mezzo di coltura + 150 μM del chelante di ferro deferoxamina) e positivi (mezzi di coltura + 180 μM FAC + co-trattamento con colorante di ferro labile).
   2. Preparare una diluizione sufficiente a 1:200 della soluzione stock da 1 mM di colorante di ferro labile in substrati senza siero per ottenere 200 μL per ogni pozzo campione.
   3. Aspira dal mezzo di coltura. Lava due volte con PBS.
   4. Aggiungi la soluzione di colorazione in ogni pozzo e incuba per 1 ora a 37 °C.
   5. Lava una volta con PBS. Sostituisci con PBS.
   6. Immagini delle cellule utilizzando il canale rosso lontano di un microscopio a fluorescenza (646/662 nm). Salva ed esporta le immagini come . TIF.
2. Analisi della colorazione
   1. Apri le immagini in ImageJ.
   2. Apri la finestra di misurazione premendo m. All'interno della finestra di misurazione, sotto Risultati | Imposta le misure, seleziona l'area, la densità integrata e il valore grigio medio. Seleziona OK.
   3. Usa lo strumento Polygon per disegnare attorno a ogni cella dell'immagine. Premi m dopo ogni cella per aggiungere le misurazioni alla finestra di misurazione.
   4. Una volta che tutte le celle dell'immagine sono quantificate, copia e incolla tutti i valori in un foglio di calcolo. Usa lo strumento cerchio per effettuare almeno tre misurazioni di fondo in aree non occupate da celle.
   5. Utilizzare la seguente formula per calcolare la fluorescenza cellulare totale corretta (CTCF) per ogni cellula:
      CTCF = densità integrata – (area della cella selezionata x valore medio grigio delle letture di fondo)
   6. Confrontare i valori CTCF delle celle trattate con ferro con quelli delle celle del veicolo. Un aumento del CTCF indica un aumento dei livelli di ferro labile.

5. Saggio di luminescenza cellulare

1. Trattamento delle cellule per il saggio di luminescenza
   1. Completa la sezione 1, assicurandoti che il numero di pozzi corrisponda a n = 3 per ogni condizione che desideri includere. Aggiungi almeno tre pozzi di controllo senza celle (solo con mezzo completo). Dovrebbero essere aggiunti 100 μL di cellule e mezzo totale a ciascun pozzo.
   2. Dopo aver incubato le cellule non trattate durante la notte, applicare trattamenti e controlli secondo necessità. Assicurarsi di includere una condizione del veicolo (non trattata), condizioni con solo FAC, citotossico + 10 μM ferrostatina-1 (un agente antiferroptotico), veicolo + 1 μM RSL3 e/o veicolo + 10 μM ferrostatina-1 + 1 μM RSL3. Incubare per la durata desiderata (12–24 ore per massimizzare gli effetti del trattamento prevenendo al contempo una morte cellulare eccessiva).
2. Completamento del saggio di luminescenza
   1. Dopo il trattamento delle celle, scongelare i componenti del buffer di luminescenza alla temperatura ambiente. Combina i componenti necessari e conserva al buio finché non è pronto all'uso. Consulta le istruzioni del kit per i requisiti di stoccaggio a temperatura.
   2. Una volta completato il trattamento delle cellule, segui le istruzioni del kit per il trattamento.
      NOTA: Questo probabilmente includerà l'equilibrio a temperatura ambiente, seguito dall'aggiunta del buffer di luminescenza e da un periodo finale di incubazione breve a temperatura ambiente. Una volta aggiunto il buffer di luminescenza, tutti i passaggi devono essere eseguiti al buio.
   3. Completare e registrare la luminescenza usando un lettore di lastre o uno strumento simile.
      NOTA: Per questo protocollo è stato utilizzato un tempo di integrazione di 0,3 s.
   4. Normalizzare i valori di luminescenza dei pozzi sperimentali alla luminescenza media dei pozzi di controllo senza celle.
      NOTA: Valori di luminescenza più alti indicano un numero maggiore di cellule viventi.

Risultati

Basandoci su lavori precedenti nostri e di altri, abbiamo ipotizzato che aumentare il ferro extracellulare genererebbe un sovraccarico di ferro intracellulare nelle cellule muscolari murine e ci permetterebbe di monitorare le risposte associate alla ferroptosi a valle. Abbiamo quindi sviluppato il flusso di lavoro C2C12 descritto nella Figura 1, in cui le cellule sono state esposte a concentrazioni definite di citrato di ammonio ferrico per 2–24 ore, a seconda del test a valle.

Il primo passo per convalidare il nostro modello è stato confermare che il FAC potesse entrare nelle cellule. Utilizzando i primer validati descritti nella Tabella 3, abbiamo condotto qPCR sia per la catena pesante che quella leggera della ferritina e abbiamo determinato che l'aumento dell'apporto di ferro corrispondeva a livelli elevati di mRNA di ferritina (Figura 2A,B). A livello proteico, un aumento simile dei livelli di ferritina era visibile con l'aumento della concentrazione di FAC, anche se questo non sembrava dipendente dalla dose (Figura 2C). Analogamente, la colorazione delle cellule C2C12 vive trattate con FAC ha mostrato che coloro trattati con una dose citotossica di ferro — così come le cellule trattate con la dose grave e la colorazione di ferro labile contemporaneamente come controllo positivo — mostrano visivamente e quantitativamente un aumento dell'immagazzinamento di ferro rispetto alle cellule non trattate e a coloro esposti al solo chelatore di ferro deferoxamine (DFO; Figura 2D). Nel complesso, questi risultati suggeriscono che il ferro introdotto tramite FAC nel mezzo cellulare stia effettivamente entrando nelle cellule.

Dopo aver stabilito che il FAC aumentava il carico intracellulare di ferro, abbiamo poi cercato di determinare se il sovraccarico di ferro fosse accompagnato da cambiamenti molecolari e funzionali associati alla ferroptosi. Il FAC ha aumentato l'espressione di Slc40a1 (ferroportina) (Figura 3A) e elevato Hmox1 (Figura 3B). La FAC ha inoltre ridotto la proteina GPX4, e questa riduzione è stata parzialmente invertita dalla deferoxamine (Figura 3C). Il trattamento con RSL3 ha prodotto una riduzione simile di GPX4, collocando la risposta FAC all'interno di un contesto molecolare più ampio associato alla ferroptosi. Dal punto di vista funzionale, una dose citotossica di FAC ha ridotto la vitalità basata sulla luminescenza a 12 ore, e questa perdita precoce di vitalità è stata salvata dalla ferrostatina-1 (Figura 3D). Al confronto, a 24 ore la separazione tra le condizioni diventa meno pronunciata e più variabile (Figura 3E). Sebbene i campioni trattati con ferrostatina-1 rimangono elevati rispetto al solo FAC citotossico, la gamma dinamica complessiva del saggio si riduce in questo momento successivo. Insieme, questi dati mostrano che il trattamento con FAC produce sovraccarico di ferro, cambiamenti molecolari associati alla ferroptosi e una riduzione della vitalità sensibile alla ferrostatina dipendente dal tempo nelle cellule C2C12.

Figura 1: Abstract grafico del modello di sovraccarico di ferro. In questo modello, le cellule C2C12 vengono seminate e lasciate incubare durante la notte prima del trattamento con varie dosi fisiologicamente significative di mezzo colturale infuso di ferro e analisi molecolare diretta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Aumento dell'immagazzinamento di ferro labile e sintesi della ferritina dopo l'aggiunta di citrato di ammonio ferico. I livelli di mRNA di (A) catena pesante di ferritina e (B) catena leggera di ferritina aumentano con l'aggiunta di citrato di ammonio ferrico nel sistema. (C) I livelli di proteine FTH1 aumentano con l'aggiunta di ferro ferrico al sistema. (D) I livelli di ferro labile aumentano nelle cellule C2C12 trattate con ferro ferrico prima e contemporaneamente alla colorazione con un colorante di ferro labile di un rosso profondo, rispetto al controllo veicolo + deferossamina. La condizione di cotrattamento indica un trattamento simultaneo con mezzo di coltura + 180 μM FAC + colorante di ferro labile. Le barre di errore sono +/- SD. Abbreviazioni: FTH1 = catena pesante di ferritina; FTL1 = catena leggera ferritina; DFO = deferoxamina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Cambiamenti molecolari associati alla ferroptosi e riduzione dipendente dal tempo della vitalità cellulare dopo l'aggiunta di FAC. I livelli di mRNA di (A) ferroportin (Slc40a1) e (B) Hmox1 aumentano dopo il trattamento FAC. (C) La proteina GPX4 diminuisce dopo il trattamento FAC e in presenza del controllo RSL3 positivo; la deferoxamine inverte parzialmente la diminuzione associata alla FAC di GPX4. (D) Luminescenza delle cellule C2C12 dopo un trattamento di 12 ore con FAC, RSL3 e/o ferrostatina-1, normalizzato a pozzi senza cellule (solo media). (E) Luminescenza normalizzata delle cellule C2C12 trattate dopo un trattamento di 24 ore con FAC, RSL3 e/o ferrostatina-1. Le barre di errore sono +/- SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fermati
1	Aumenta a 50 °C a 1,6 °C/s, tieni per 2 minuti
2	Aumenta a 95 °C a 1,6 °C/s, tieni per 10 minuti
Stadio PCR (Run x 40)
1	Mantieni a 95 °C per 15 secondi
2	Riduci a 60 °C a 1,6 °C/s, tieni per 1 minuto
Stadio a curva di fusione
1	Aumentare a 95 °C a 1,6 °C/s, mantenere per 15 secondi
2	Riduci a 60 °C a 1,6 °C/s, tieni per 1 minuto
3	Aumenta a 95 °C a 0,15 °C/s, mantieni per 1 secondo.

Tabella 1: programma qPCR (durata: ~1:36 h) nella sezione 2 del protocollo.

	Gel risolvente			Gel di impilamento
Componente	10%	12.50%	15%
Acrilammide (mL)	5.6	6.9	8.3	0.65
Acqua sterile (mL)	6.9	5.3	3.9	3.05
Tris/HCl, 1,5 M pH 8,8 (mL)	4.2			-
Tris/HCl, 0,5 M pH 6,8 (mL)	-			1.25
10% di solfato di dodecile di sodio (μL)	166			50
0,1 g/mL persolfato di ammonio (μL)	80			25
TEMED	8.3			5

Tabella 2: Riepilogo dei componenti e volumi necessari per una configurazione efficace dei gel di risoluzione e impilamento per western blot. I volumi forniti sono sufficienti per due gel e possono essere scalati di conseguenza. Le percentuali indicano la quantità di acrilammide nella miscela.  NOTA: APS e TEMED vanno aggiunti per ultimi e solo quando sono pronti per la fusione, poiché attivano il processo di polimerizzazione del gel.

Gene Target	Simbolo genetico	Funzione	Specie	Sequenza in avanti	Sequenza inversa
Beta-2-microglobulina	B2M	Gene di pulizia	Mouse	TCACACTGAA TTCACCCCCA	TCACATGTCT CGATCCCAGT
Proteina di legame a scatola TATA	TBP	Gene di pulizia	Mouse	CAGATGTGC GTCAGGCGTT	CCATGAAATAGT GATGCTGGGCAC
Catena pesante di ferritina	FTH1	Sottounità della proteina di stoccaggio del ferro ferritina	Mouse	TGGCTCTGAA GAACTTTGCCA	TCATCACGGTC TGGTTTCTTTA
Catena leggera della ferritina	Ftl1	Sottounità della proteina di stoccaggio del ferro ferritina	Mouse	AATGGGGTAAA ACCCAGGAGG	AGGAAGTCACA GAGATGAGGGT
Emeossigenasi 1	Hmox1	Converte biliverdina in bilirubina in presenza di eme, CO2 e ferro; Livelli elevati sono presenti nella ferroptosi	Mouse	CTAGCCTGGT GCAAGATACTG	TGTCTGGGAT GAGCTAGTGC
Ferroportin 1	SLC40a1	Trasporta l'eccesso di ferro fuori dalle cellule	Mouse	GCTGCTAGAA TCGGTCTTTGG	TGGAGTTCTG CACACCATTGA

Tabella 3: Elenco di primer qPCR validati per il trasporto del ferro e i geni della ferroptosi di interesse. I primer sono specifici per topi a causa del loro utilizzo nell'mRNA proveniente da cellule C2C12.

Discussione

L'obiettivo di questo studio era stabilire un modello pratico in vitro del sovraccarico di ferro nei progenitori muscolari murini e definire condizioni in cui le risposte associate alla ferroptosi possano essere rilevate in modo affidabile. Utilizzando questo flusso di lavoro, mostriamo che il trattamento con citrato di ammonio ferrico porta a un robusto accumulo intracellulare di ferro, accompagnato da un aumento dell'espressione di ferritina e da un segnale elevato di ferro labile. Il carico di ferro è inoltre associato a cambiamenti molecolari coerenti con lo stress correlato alla ferroptosi, inclusi un aumento dell'espressione di Slc40a1 e Hmox1 e una diminuzione della proteina GPX4. Dal punto di vista funzionale, l'esposizione citotossica al FAC induce una riduzione della vitalità cellulare che viene salvata dalla ferrostatina-1 nei primi momenti, supportando la presenza di un componente sensibile alla ferroptosi che contribuisce alla morte cellulare osservata.

La dose di ferro e la durata del trattamento sono parametri critici che influenzano direttamente l'interpretabilità di questo sistema. Nelle nostre mani, i primi momenti temporali (circa 12 ore) offrono la separazione più chiara tra le condizioni, permettendo alla ferrostatina-1 di salvare la citotossicità indotta dalla FAC in modo riproducibile. Nei momenti successivi (ad esempio, 24 ore), la vitalità complessiva diminuisce e la variabilità aumenta tra le condizioni, riducendo la gamma dinamica del saggio. Ciò è coerente con la perdita cumulativa di cellule e l'adattamento della popolazione sopravvissuta, come un aumento della capacità antiossidante o una gestione alterata del ferro.

La somministrazione di ferro ferrico (Fe³⁺) invece che di ferro ferroso (Fe²⁺), così come la concentrazione di ferro somministrata e la durata del trattamento, sono anch'essi aspetti critici del protocollo. L'uso del ferro ferrico è essenziale perché il ferro ferrico viene facilmente assorbito dalla transferrina, il principale trasportatore responsabile dell'importazione di ferro^{ferrico 11}. Sebbene il ferro ferroso possa essere assorbito da altri trasportatori (in particolare dal trasportatore metallico divalente DMT1), in questo contesto il ferro ferrico sembrava essere incorporato in modo più efficace rispetto al ferro^{ferroso 12}. Le concentrazioni di FAC scelte per questo protocollo sono state selezionate per la loro rilevanza fisiologica e l'uso in modelli simili^{passati 13,14}. La durata del trattamento con il ferro, essendo di 24 ore, si basava anch'essa su modelli simili nostri e altri. Tuttavia, in alcuni contesti (in particolare per la colorazione labile del ferro e gli sami di luminescenza cellulare), 24 ore si sono rivelate una durata di trattamento troppo lunga. In questi casi, un trattamento di 24 ore ha portato a una morte cellulare così significativa che non sono state trarre conclusioni a causa della distruzione del materiale cellulare. Ad esempio, RSL3 è un agente di perossidazione lipidica così potente che una durata di trattamento di 12 ore è stata sufficiente a indurre la perossidazione lipidica e allo stesso tempo garantire che gli effetti del sovraccarico di ferro fossero visibili simultaneamente (Figura 3C-E). Inoltre, per il colorante ferro labile, le cellule sono state trattate con FAC solo per una durata di 2 ore prima della colorazione (dopo aver tentato di colorare dopo trattamenti di ferro a 2, 4 e 24 ore) per catturare la risposta iniziale al sovraccarico di ferro prima che potesse verificarsi una distruzione cellulare eccessiva (Figura 2D). Nel complesso, sembra che i cambiamenti a livello genico e proteico siano stati meglio misurati dopo 12–24 ore di trattamento con il ferro, probabilmente perché questi cambiamenti richiedono più tempo perché le cellule si manifestino, mentre la colorazione era meglio effettuata dopo una durata di trattamento più breve.

Altri hanno sviluppato modelli simili. Un gruppo ha generato un modello C2C12 trattato con ferro ferrico per studiare il ruolo dell'asse p53-Slc7a11 nella ferroptosi. Hanno riscontrato che il trattamento con ferro ferrico per 48 ore aumentava la perossidazione lipidica e riduceva i livelli di Slc7a11 , indicando la ferroptosi¹³. Un altro modello simile—questa volta utilizzando cellule C2C12 trattate con solfato ferroso per studiare la relazione tra la via della ligasi ubiquitina Akt-FoxO3-E3 e la ferroptosi—ha coinvolto il trattamento con ferro in 4^{ore e 14}. Un filo conduttore tra questi è che coinvolgono il trattamento con ferro delle cellule C2C12 differenziate in miotubi, invece di rimanere nel loro stato mioblastico più simile a quello delle cellule staminali. Questo rende il nostro sistema particolarmente rilevante rispetto all'accumulo di ferro precedentemente osservato nei MuSC.

Nonostante sia un modo semplice per studiare gli effetti del sovraccarico di ferro sui muscoli in vitro, il metodo presenta dei limiti, poiché è stato utilizzato solo nel contesto delle cellule C2C12. Studi passati hanno dimostrato che le cellule staminali muscolari sono suscettibili al sovraccarico di ferro durante l'invecchiamento, suggerendo che un metodo simile possa essere valido in quel^{contesto 9}.

Nel complesso, questo modello dimostra che il sovraccarico di ferro è sufficiente a indurre un insieme riproducibile di cambiamenti molecolari associati alla ferroptosi e una riduzione della vitalità sensibile alla ferrostatina nelle cellule C2C12. Sebbene ulteriori saggi ortogonali possano affinare ulteriormente la classificazione della morte cellulare in contesti specifici, le risposte combinate molecolari e farmacologiche osservate qui sono coerenti con lo stress cellulare associato alla ferroptosi. Prevediamo che questo approccio faciliterà studi meccanicistici sulla disregolazione del ferro nell'invecchiamento muscolare e nelle malattie.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 kb Protein Ladder, 500 µL size	Bio-Rad	1610374	Conservare a -20 °C. Scongelare su ghiaccio.
15 mL Centrifuge Tubes CS500	Avantor/VWR	89039-664
30% Acrylamide/Bisphosphate solution, 29:1, 500 mL size	Bio-Rad	1610156	È una neurotossina. Maneggiare solo indossando attrezzatura protettiva adeguata (cappotto di laboratorio, guanti, protezione per gli occhi).
5425 / 5425 R Microcentrifuge	Eppendorf	05-414-052
5910 Ri centrifuge	Eppendorf	05-414-459PM2
96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165305
Ammonium persulfate, 10 g	Bio-Rad	1610700	Agente polimerizzante per la preparazione di gel di acrilammide come soluzione al 10% in peso/volume in acqua sterile. La polvere è stabile a temperatura ambiente, ma la soluzione dovrebbe essere conservata a lungo termine a -20 °C e a breve termine a 4 °C.
Anti-GAPDH, mouse antibody, 100 µg size	Thermo Fisher Scientific	AM4300	Usare a una concentrazione di 1:2000 in 2% BSA + buffer di lavaggio. Corre a 37 kDa.
BCA Protein Assay Kit with Dilution-Free BSA Protein Standards	Thermo Fisher Scientific	A55865	Seguire le istruzioni del produttore per l'uso. Si consiglia di conservare gli standard a 4 °C dopo il primo utilizzo.
Beta Actin Loading Control Monoclonal Antibody (BA3R), DyLight 800 4X PEG	Thermo Fisher Scientific	MA515739D800	Usare a una concentrazione di 1:1000 in 2% BSA + buffer di lavaggio. Corre a 42 kDa.
BioLite 6 Well Multidish Cell Culture-Treated Surface	Thermo Fisher Scientific	130184
Blot Box, Black, 9x6.5 cm, 5/pk	Fisher Scientific	501870983
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	Usare nella preparazione del buffer Laemmli.
BSA, solid, 100 g	Fisher Scientific	BP9703100	Conservare a 4 °C.
C2C12 cells	ATCC	CRL-1772	Conservare nella fase vapore di azoto liquido.
cDNA Supermix QScript 500 reactions	Avantor/VWR	101414-108	Conservare a -20 °C. Scongelare su ghiaccio.
Cell lifter, 100pk	Fisher Scientific	8100240	Poiché sono più grandi, utilizzare per l'estrazione di cellule da piatti da 10 cm e più grandi.
Cell scrapers, 10 inch handle, 100pk	Fisher Scientific	08-100-241	Poiché hanno una testa piccola, sono più adatti per rimuovere le cellule dalle piastre multi-pozzo.
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Kit, 10 mL	Promega	G7570
Chloroform, 99.9%	Thermo Fisher Scientific	610281000	Utilizzare solo in cappa aspirante e smaltire i rifiuti in un contenitore separato.
COMPLETE EDTA-free protease inhibitor tabs	Sigma-Aldrich	4693132001	Sciogliere 1 compressa in 500 µL di acqua sterile per creare una soluzione 100×.
CO2 100-120 V Incubator	Binder	9640-0002	Modello versione CBS 170-120 V. Usato per la coltura cellulare.
Deferoxamine mesylate, 50 mg	Fisher Scientific	5764/50	Il DFO è un chelante del ferro, quindi aggiungerlo alle cellule riduce il contenuto di ferro. Sciogliere in acqua per una concentrazione di stock di 1 M.
Dimethyl sulfoxide, 100 mL	Fisher Scientific	D5879-100ML	Usato per la colorazione del ferro labile e la ricostituzione.
DMEM, high glucose, pyruvate, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	11995065
Dylight 680 conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H&L)	Thermo Fisher Scientific	35568	Aggiungere a 5% BSA nel buffer di lavaggio in un rapporto di 1:5000.
DyLight 800 4× PEG conjugate Goat anti-Mouse IgG (H&L) Secondary Antibody	Thermo Fisher Scientific	SA535521	Aggiungere a 5% BSA nel buffer di lavaggio in un rapporto di 1:5000.
Easypet 3 1-channel pipet aid	Eppendorf	4430000018
Far-red Labile Fe2+ Dye	Sigma-Aldrich	SCT037	Preparare la soluzione di stock aggiungendo 50 µL di DMSO a un aliquota a temperatura ambiente. Sensibile alla luce. Concentrazione di stock: 1 mM
Ferric Ammonium Citrate, 500 g	MP Biomedicals	158040
Ferrostatin 10 mg	Fisher Scientific	502259214	Sequestrare i sottoprodotti della perossidazione lipidica, inibendo la ferroptosis in vitro. Sciogliere in DMSO per una concentrazione di stock di 10 mM.
Fetal Bovine Serum, Premium Plus, bottle, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A5669701	Usato per supplementare DMEM per la coltura cellulare C2C12. Aggiunto al 10% in volume.
Flex-Tube 1.5 mL PCR clean, colorless, 500 pcs.	Eppendorf	22364120
FTH1 (D1D4) Rabbit mAb 100 µL	Cell Signaling Technology	4393	Usare a una concentrazione di 1:1000 in 2% BSA + buffer di lavaggio. Corre a ~20 kDa.
Glycerol, ultrapure	Thermo Fisher Scientific	15514011	Usato nella preparazione del buffer Laemmli 6x.
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL), 300 μL	Thermo Fisher Scientific	AM9515	Usato per visualizzare il pellet durante la purificazione dell'RNA.
Image-iT Lipid Peroxidation Kit	Thermo Fisher Scientific	C10445	Pronto per l'uso. Sensibile alla luce. Concentrazione di stock: 10 mM
ImageJ software	National Institutes