Articolo metodologico

Interpretazione delle varianti cliniche con l'Integrative Genomics Viewer (IGV) per patologi molecolari

DOI:

10.3791/71808

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14 agosto 2026

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1University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 2University of Michigan, Department of Pathology, 3Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL), 4University of Chicago, Department of Pathology, 5University of Colorado, Department of Pathology, 6University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 7Broad Institute of MIT and Harvard, 8University of California San Diego, Department of Medicine, 9Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Division of Pathology and Laboratory Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Il software Integrative Genomics Viewer (IGV) offre una finestra ricca e intuitiva sui dati sottostanti per il rilevamento clinico di varianti. Di seguito presentiamo cinque esempi dimostrativi su come effettuare rapidamente la differenziazione tra eventi patogeni genuini ed artefatti, rafforzando così l'affidabilità diagnostica per i professionisti coinvolti nell'interpretazione molecolare dei saggi di sequenziamento di nuova generazione.

Abstract

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Il visualizzatore genomico integrato (IGV) è uno strumento fondamentale nella genomica clinica, che consente la visualizzazione e l'interpretazione di dati di sequenziamento complessi. L'applicazione di conoscenze cliniche unita alla valutazione visiva dei risultati del sequenziamento rappresenta il principale metodo con cui i patologi molecolari e altri professionisti valutano e concludono i casi. Una varietà di strumenti software può offrire supporto, ma la loro relazione con i dati sottostanti deve essere compresa e applicata in modo sistematico. Questo studio include informazioni essenziali sui tipi di file di dati del sequenziamento di nuova generazione (NGS) (ad esempio, FASTQ, BAM, VCF), con una discussione sui loro formati e scopi. Successivamente, descriviamo le funzionalità di IGV che derivano le sfumature da questi file. Utilizziamo una serie di casi pratici curati sulla base di casi clinici, attraverso i quali il lettore interagirà con dati di sequenziamento clinico NGS utilizzando il software IGV per esaminare vari tipi di varianti clinicamente rilevanti rispetto al genoma di riferimento umano. Questi casi clinici sono stati selezionati per descrivere esempi di alcune delle complessità nell'interpretazione dei dati genomici e per illustrare come l'utilizzo di IGV all'interno di un flusso di lavoro routinario possa fornire informazioni interpretative aggiuntive sulle varianti, oltre alle chiamate di varianti generate da algoritmi software bioinformatici standard. L'ispezione visiva delle varianti genomiche mediante gli strumenti presenti in IGV può rivelare sottili indizi contestuali (ad esempio, frequenza dell'allele di variante, bias della catena, contesto specifico del tessuto) che possono influenzare l'interpretazione delle varianti genomiche. Sebbene questo studio si concentri sull'uso di IGV per il rilevamento e l'interpretazione di varianti somatiche, le applicazioni fornite possono essere estese all'ambito germinale, inclusa l'analisi di varianti complesse e il rilevamento della mosaicismo.

Introduzione

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Negli ultimi anni, l'assistenza oncologica è stata trasformata dall'uso delle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) per guidare diagnosi, prognosi e selezione delle terapie1. L'analisi mediante NGS è diventata lo standard assistenziale in diversi tipi di tumore per: 1) stabilire una diagnosi di tumore definito a livello molecolare, 2) utilizzare risultati di biomarcatori indipendenti dal tipo di tumore per le decisioni terapeutiche e 3) determinare la stratificazione del rischio per specifici tipi di tumore2,3. Risultati accurati e tempestivi derivanti da analisi NGS e da altri test sui biomarcatori sono diventati un componente fondamentale per l'assistenza ai pazienti e la pianificazione terapeutica in oncologia.

I test NGS vengono generalmente eseguiti in grandi laboratori di riferimento oppure in laboratori ospedalieri o accademici, quando le istituzioni dispongono di competenze e risorse sufficienti per sviluppare e mantenere tali test. L'organizzazione Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL) è stata concepita come una rete collaborativa, focalizzata sulla condivisione delle conoscenze accademiche e dei costi dei reagenti4. Un impegno significativo del consorzio GOAL ha riguardato sessioni di formazione su componenti fondamentali per la revisione e la redazione di rapporti relativi a studi clinici. Tali sessioni sono state sviluppate come incontri pratici e includono un workshop interattivo sul visualizzatore genomico integrato (IGV), volto a illustrarne le funzionalità di base e avanzate in medicina genomica.

IGV è uno strumento di visualizzazione dati progettato per consentire agli utenti di esaminare facilmente dati NGS e altri set di dati di grandi dimensioni, poiché la maggior parte dei dati NGS risulta vasta e di difficile gestione senza un'interfaccia grafica5. Inizialmente, IGV non era stato progettato per l'analisi clinica delle varianti. Tuttavia, grazie alla sua semplicità d'uso per tutti i professionisti del settore molecolare, indipendentemente dal loro livello di esperienza in bioinformatica, è stato ampiamente adottato da molti laboratori come parte del complesso flusso di lavoro per la revisione dei dati6. Questo studio è stato realizzato come mezzo per diffondere tali informazioni all'ampia comunità di professionisti dei laboratori genetici.

La necessità clinica di utilizzare IGV come parte di un flusso di lavoro clinico comprende il rilevamento di errori di sequenziamento, la gestione delle complessità nella chiamata delle varianti genomiche e altre alterazioni ricorrenti in cui una visualizzazione aggiuntiva può assistere nell'interpretazione appropriata dei dati7. L'utilizzo di IGV richiede file bioinformatici standard provenienti da uno studio di sequenziamento di nuova generazione (NGS)8. Le funzionalità principali del software IGV consentono la visualizzazione dei dati di sequenziamento e richiedono la configurazione di un insieme di preferenze e opzioni per l'interpretazione clinica delle varianti (File Supplementare 1).

Il flusso di lavoro del sequenziamento a lettura corta è caratterizzato dagli standard dei file FASTQ, mappa binaria di allineamento (BAM) e formato per la chiamata di varianti (VCF). Il NGS raggiunge un'elevata produttività generando milioni di short reads in parallelo. Sebbene questa strategia acceleri notevolmente la produzione di dati, ogni lettura rappresenta soltanto un frammento del DNA o RNA originale. Essa viene fissata a una posizione specifica sulla flow cell del NGS tramite la sua sequenza adattatrice. Le informazioni di sequenza e di qualità delle basi ottenute dal processamento ottico vengono registrate nei file FASTQ. Queste letture grezze consistono in sequenze di nucleotidi accompagnate dai punteggi di qualità per ciascuna base. Pertanto, una delle prime fasi nell'elaborazione delle letture grezze è l'allineamento di ciascuna lettura a un genoma di riferimento8. Poiché a ogni lettura viene assegnata una posizione specifica nel genoma di riferimento con la massima probabilità di allineamento, le letture corrispondenti alla stessa posizione si "accumulano" in ciascun locus, e questi dati vengono memorizzati in un file BAM secondo le specifiche del formato di mappatura delle allineamenti di sequenza (SAM) (disponibili all'indirizzo https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf; ultima verifica: 9/30/2025) (Figura 1A). Queste informazioni possono essere esaminate visivamente mediante un browser genomico come IGV. Come illustrato nella Figura 1B, il confronto tra le letture o tra queste e la sequenza di riferimento può evidenziare differenze o discrepanze tra le sequenze nucleotidiche. I riassunti soltanto di queste posizioni "varianti" lungo l'intero genoma vengono raccolti in un file VCF, che pertanto può essere molto più piccolo rispetto a un file BAM ma contenere comunque gran parte delle informazioni utili necessarie per l'analisi delle varianti. Per questo motivo, il file VCF è comunemente l'output finale delle pipeline di chiamata delle varianti (Figura 1C). Pertanto, mentre i file FASTQ contengono i dati grezzi delle letture e della qualità, il file BAM fornisce informazioni sulla sicurezza con cui tali letture si mappano sul genoma, e il file VCF rappresenta le differenze tra la sequenza di riferimento e la sequenza del campione, fornendo una quantità di dati molto più gestibile per l'analisi e la potenziale segnalazione.

I sei casi clinici presentati in questo studio illustrano scenari analitici comuni associati al rilevamento di varianti somatiche nei laboratori molecolari, nonché i problemi che complicano la corretta comprensione e interpretazione dei dati sottostanti. Nel complesso, questi casi sono stati selezionati per illustrare scenari interpretativi di crescente complessità e per mostrare come l'utilizzo di funzionalità avanzate in IGV possa descrivere in modo più esaustivo le caratteristiche genomiche complessive. Sebbene questo studio si concentri sull'interpretazione delle varianti somatiche, tali funzionalità sono applicabili anche all'uso di IGV nella visualizzazione e interpretazione di alterazioni germinali6. È importante notare che i termini utilizzati in questo articolo si basano sulla chimica del sequenziamento per sintesi e, ove appropriato, su altri termini o concetti analoghi relativi ad altre piattaforme.

Ogni caso clinico inizia con un contesto clinico molto breve, seguito da istruzioni su come analizzare la variante o le varianti e risolvere la domanda: quale (se presente) variante è reale e quale (se presente) è un artefatto. Il contesto clinico, insieme ai dettagli specifici dei dati di sequenziamento, è fondamentale per rispondere a tale domanda.

Protocollo

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I dati presentati qui sono una miscela di dati NGS simulati e reali provenienti da pazienti. Tuttavia, tutti i dati dei pazienti sono stati resi anonimi attraverso una combinazione di rimozione delle etichette ed estrazione delle letture da un singolo locus. Questo protocollo segue le linee guida applicabili del comitato etico per la ricerca umana di tutte le istituzioni degli autori.

1. Scaricamento dell'ultima versione di Integrative Genomics Viewer (IGV)

NOTA: IGV è un programma gratuito scaricabile per la visualizzazione di vari genomi, inclusi il genoma umano (https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/). IGV viene aggiornato periodicamente per includere nuove versioni di trascritti, caratteristiche e tracce, con la versione più recente solitamente in cima all'elenco.

  1. Scaricare il file disponibile dall'indirizzo URL (Uniform Resource Locator) riportato sopra, denominato 'IGV for Windows, Java Included', sul desktop; questa operazione potrebbe richiedere credenziali amministrative, a seconda dell'istituzione.
  2. Scegliere la versione del genoma umano che si intende analizzare nei rapporti (ad esempio, hg19 o hg38), disponibili all'interno di IGV.
    NOTA: Questo studio ha utilizzato IGV 2.19.7. In questo protocollo, è stata scaricata la versione per Windows con Java incluso. IGV è stato eseguito con l'allocazione di memoria predefinita di 8 GB di RAM. Le impostazioni consigliate nella scheda delle preferenze di IGV e in altre sezioni di IGV sono annotate nel File Supplementare 1.

2. Comprensione delle vignette cliniche e scaricamento dei file necessari

  1. Accedi al repository GitHub: tutti i file sono disponibili per il download nel repository GitHub https://github.com/Eitan177/Demo_IGV.
    NOTA: Nel repository GitHub è presente un file di sessione per ogni vignetta; caricando questo file di sessione non è necessario caricare i file separatamente né navigare verso il locus di interesse, poiché il file di sessione gestisce automaticamente questi passaggi.
  2. Carica un file di sessione tramite il menu file. Fai clic su File > Apri sessione e seleziona il file di sessione appropriato.

3. Configurazione della traccia di copertura

NOTA: In IGV, la finestra principale include una "coverage track". In determinati contesti, anche una piccola frazione di letture contenenti varianti tumorali specifiche può essere clinicamente significativa. Per questo motivo, è fondamentale ottenere una profondità di lettura molto elevata in tutte le regioni del genoma analizzate. Se solo il 2% delle letture contiene una certa variante, potrebbe essere necessaria una profondità di lettura di centinaia o migliaia per identificare in modo convincente la variante – da cui il termine "deep sequencing".

  1. Verificare la presenza della traccia di copertura: Dal menu in alto, fare clic su Visualizza > Preferenze e selezionare la scheda Allineamenti. In alto nella scheda è presente una casella etichettata 'Mostra traccia di copertura'. Assicurarsi che sia selezionata.
  2. Verificare la soglia di variante a basso livello clinicamente significativa: Accedere alla scheda Allineamenti come descritto al punto 3.1 e scorrere verso il basso fino a quando non appare visibile la casella etichettata Frazione allica della copertura. Impostare il valore nella casella su 0.01 e premere Salva (la finestra delle preferenze dovrebbe chiudersi dopo aver premuto Salva).

4. Configurazione delle letture con clipping morbido

NOTA: Questa impostazione è estremamente utile per rilevare varianti strutturali più ampie, come riarrangiamenti genici, variazioni del numero di copie o eventi combinati di inserzione–delezione. I vignette avanzate—come quelle incentrate sulle amplificazioni e delezioni di EGFR—dimostrano come le letture con estremità tagliate (soft-clipped) possano confermare la presenza di varianti strutturali che altrimenti potrebbero essere trascurate dai metodi standard di chiamata delle varianti.

  1. Abilita clip morbidi: Dal menu in alto, fare clic su Visualizza > Preferenze, e selezionare il Allineamenti scheda. Scorrere verso il basso fino alla casella Mostra basi con clipping morbido e assicurarsi che sia selezionato (File Supplementare 1) per rivelare letture parzialmente allineate, ovvero quelle i cui estremi non si mappano in modo netto sul riferimento e sono "tagliato" spento

5. Vignette cliniche

  1. Vignetta n. 1: Distinguere una vera variante patogena di KRAS (oncogene omologo del virus della sarcoma di ratto di Kirsten) da un artefatto di sequenziamento.
    NOTA: Il caso A riguarda un uomo di 65 anni con adenocarcinoma polmonare appena diagnosticato, in cui la valutazione istologica ha stimato circa l'80% di cellule tumorali. Il profilo NGS ha identificato una variante KRAS NM_004985.5 c.34G>T (p.G12C), una mutazione driver nota nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). La variante missenso risultante KRAS c.34G>T (p.G12C) si verifica in circa il 13% degli adenocarcinomi polmonari e rende idonei alla terapia mirata9. Il caso B riguarda una donna di 54 anni con un sarcoma noto (stima del 50% di tessuto tumorale e 50% di tessuto normale). La stessa variante KRAS c.34G>T (p.G12C) è stata identificata in questo campione. Tuttavia, poiché la variante KRAS c.34G>T (p.G12C) è raramente riportata nei sarcomi, la sua presenza suscita sospetto di un possibile artefatto di sequenziamento. 
    1. Flusso di lavoro IGV (file di sessione KRAS.xml)             
      1. Caricare i dati: Selezionare Hg19 nel menu a tendina del genoma, caricare il file bam kras2A_fixed_backbone_2A_new_final_sorted.bam e navigare verso chr12:25.398.281–25.403.833 per focalizzarsi sulla regione del gene KRAS. Si noti che il file indice (stesso nome del file bam, ma con estensione .bai) deve trovarsi nella stessa directory del file bam.  
      2. Esaminare copertura e VAF: Esaminare il codone 12 nell'esone 2 (NM_004985.5) e fare clic sulla posizione della variante nella traccia di copertura per visualizzare la profondità di lettura in quella posizione. Si noti una sostituzione G→T (evento di transversione), con un VAF del 35%–40%, altamente coerente con una mutazione driver clonale eterozigote (Figura 2A), specialmente nel contesto di circa l'80% di cellularità tumorale.   
      3. Cercare il bias di filamento: Codificare per colore in base al filamento (vedi File Supplementare 1, Passaggio 4) per rivelare una distribuzione quasi 50:50 tra filamento diretto (rosso) e inverso (blu) nel campione polmonare.  
      4. Ripetere i passaggi 5.1.1.1–5.1.1.3 per il caso B, il campione di sarcoma: Caricare il file bam kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam e osservare il VAF <1% e il supporto quasi esclusivo del filamento diretto, indicativo di un artefatto di PCR/allineamento (Figura 2B).
  2. Vignetta n. 2: Risolvere una classificazione errata di una variante multinucleotidica (MNV).
    NOTA: Una donna di 50 anni con melanoma metastatico sottoposta a profilatura tumorale basata su NGS. L'analisi identifica una potenziale mutazione BRAF (proto-oncogene B-Raf, chinasi serina/treonina) c.1798_1799delinsAA. Mentre la mutazione BRAF NM_004333.6: c.1799T>A (p.V600E) è più comune in vari tumori solidi, la mutazione BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) è relativamente specifica per il melanoma, poiché la luce UV può indurre transizioni C>T nei dipirimidine10. Secondo le regole HGVS, due varianti a singolo nucleotide (SNV) in cis devono essere nominate come un'unica MNV. In molti casi, una pipeline bioinformatica potrebbe identificare erroneamente questa variante complessa come due SNV adiacenti in cis: BRAF c.1798G>A e BRAF c.1799T>A. Poiché esistono considerazioni tecniche (legate al chiamante di varianti) e biologiche (differenza tra cis e trans), vi è preoccupazione che la mutazione possa essere riportata in modo errato al momento della convalida, a meno che non vi sia una visualizzazione dei dati durante la revisione clinica.      
    1. Flusso di lavoro IGV (file di sessione BRAF.xml)           
      1. Caricare i dati: Selezionare Hg38 nel menu a tendina del genoma, caricare il file bam kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam e navigare verso chr7:140.453.136–140.753.336. Si noti che il file indice (stesso nome del file bam, ma con estensione .bai) deve trovarsi nella stessa directory del file bam.
      2. Zoomare sul codone 600 di BRAF: Si noti un cambiamento dinucleotidico GT→AA basato sulle posizioni adiacenti della traccia di copertura che sono verdi e blu anziché grigie, coerente con p.V600K. 
      3. Scansionare per due SNV individuali per determinare se sono in cis o trans: Si noti che entrambe le SNV sono mappate sugli stessi allineamenti e sono in cis.  
      4. Esaminare filamento e copertura: Colorare gli allineamenti per mostrare un supporto pressoché equilibrato tra filamento diretto e inverso (vedi File Supplementare 1, Passaggio 4) e un VAF superiore al 50%, coerente con una mutazione driver clonale. Un valore soglia di 0,01 nella traccia di copertura (vedi File Supplementare 1, Passaggio 3 per la configurazione) garantisce che eventuali sottoclone parziali rimangano visibili (Figura 2C).  
      5. Considerare il contesto e la nomenclatura MNV: I due cambiamenti nucleotidici sono adiacenti tra loro. In base al consenso esperto, si devono chiamare SNV entro 50 bp di distanza che mappano sullo stesso allineamento come un'unica variante "complessa" o "delins"11. 
  3. Vignetta n. 3: Indagare un'inserzione nell'esone 9 di KIT (proto-oncogene KIT, tirosina chinasi recettoriale) in un tumore stromale gastrointestinale (GIST)
    NOTA: Un paziente maschio di 58 anni con un tumore stromale gastrointestinale sottoposto a resezione, per cui è stata richiesta un'analisi NGS. I risultati mostrano una possibile variante in KIT. Le mutazioni di KIT sono un driver frequente nei GIST, presenti in circa il 75% dei casi, e sono bersagliabili. Dopo le mutazioni attivanti nell'esone 11, le mutazioni attivanti nell'esone 9 di KIT sono i driver più comuni identificati, anche se i GIST con mutazione nell'esone 9 e quelli con mutazione nell'esone 11 si comportano diversamente rispetto alla sensibilità agli inibitori della tirosina chinasi12. 
    1. Flusso di lavoro IGV (file di sessione KIT.xml)
      1. Caricare i dati: Selezionare il genoma Hg19, caricare il file BAM KITdupmod2.bam e assicurarsi che il file indice (stesso nome del file bam, ma con estensione .bai) sia nella stessa directory. Navigare verso chr4:55.592.144-55.592.257, corrispondente a una porzione dell'esone 9 del gene KIT.
      2. Comprimere la vista: Fare clic con il tasto destro sulla traccia di allineamento e selezionare Compresso per condensare la visualizzazione (Figura 3A).
      3. Individuare l'inserzione: Identificare il marcatore di inserzione, a forma di punta di freccia, immediatamente sopra la traccia di copertura, posizionato tra le posizioni 55.592.178 e 55.592.179, che indica un'inserzione breve (Figura 3B,C).
      4. Interagire con l'inserzione: Fare clic sulla punta di freccia per espandere la vista e su uno degli allineamenti con basi che riempiono il gap per visualizzarne i dettagli in un popup. Confrontare la sequenza inserita con la sequenza di riferimento per determinare se si tratta di una duplicazione (Figura 3D,E).
      5. Esaminare la copertura: Fare clic sulla traccia di copertura immediatamente adiacente al marcatore di inserzione per visualizzare il numero di allineamenti di supporto, che può essere confrontato con il conteggio totale degli allineamenti per determinare la frequenza approssimativa dell'allele variante (VAF), in questo caso ~28%.
      6. Verificare il bias di filamento: Ordinare gli allineamenti per filamento e visualizzare le basi soft-clippate (vedi File Supplementare 1, sezione 3) per mostrare una regione di interesse adiacente all'inserzione negli allineamenti inversi (Figura 3F).
  4. Vignetta n. 4: Indagare una delezione nell'esone 19 di EGFR (recettore del fattore di crescita epidermico) nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC).
    NOTA: Una donna di 70 anni con NSCLC appena diagnosticato sottoposta a resezione chirurgica della massa. Viene richiesta un'analisi NGS su una sezione di tessuto con purezza tumorale sufficiente, i cui risultati mostrano una possibile variante in EGFR. Molte mutazioni di EGFR sono sensibili agli inibitori della tirosina chinasi, e questa variante potrebbe avere un impatto sulla terapia e sulla prognosi del paziente13.
    1. Flusso di lavoro IGV (file di sessione EGFR.xml)
      1. Caricare i dati: Selezionare il genoma Hg19, caricare il file bam EGFRE746_A750delmod.bam, assicurarsi che il file indice (stesso nome del file bam, ma con estensione .bai) sia nella stessa directory e navigare verso chr7:55.242.420-55.242.513, corrispondente a una porzione dell'esone 19 del gene EGFR.
      2. Indagare la delezione utilizzando la traccia di copertura: Esaminare la traccia di copertura per identificare una piccola regione di copertura ridotta non posizionata alle estremità degli allineamenti (Figura 4A,B). L'esame della traccia di copertura mostra una copertura inferiore in una piccola porzione dell'esone 19.
      3. Indagare la delezione utilizzando gli allineamenti: Espandere la vista di allineamento per mostrare gli allineamenti con un gap di allineamento, rappresentato come una linea nera all'interno dell'allineamento (Figura 4C,D).
      4. Considerare il contesto genomico: Esaminare la sequenza nucleotidica di riferimento coinvolta e immediatamente circostante la delezione. Valutare la chiamata di delezione nel contesto della posizione all'interno della sequenza di riferimento, poiché le delezioni in regioni di omonucleotidi o ripetitive possono rappresentare un artefatto di sequenziamento, specialmente se presenti a bassa frequenza dell'allele variante. Consultare la sezione Visualizzazione di una piccola delezione del File Supplementare 2 per una descrizione dettagliata del flusso di lavoro.
  5. Vignetta n. 5: Indagare alterazioni di EGFR in un paziente con glioblastoma.
    NOTA: Una donna di 77 anni con glioblastoma di tipo selvaggio per IDH sottoposta a sequenziamento di nuova generazione (NGS). I risultati indicano un possibile guadagno di copia di EGFR e una possibile riarrangiamento EGFRvIII (delezione degli esoni 2–7). Sia l'amplificazione di EGFR che le alterazioni di EGFRvIII hanno rilevanza prognostica e terapeutica nel glioblastoma. Inoltre, queste due alterazioni si verificano spesso contemporaneamente, il che significa che la presenza di una può supportare la validità dell'altra quando rilevata a livelli bassi.
    1. Flusso di lavoro IGV (file di sessione copynumber.xml):
      1. Caricare i dati: Selezionare il genoma Hg38, caricare il file di segmentazione proband.seg e i campioni di confronto, c1.seg-c9.seg, trascinandoli e rilasciandoli nella finestra di IGV. Navigare verso Chr7.
        NOTA: I file di segmentazione generati da CNVKit sono disponibili per il download. L'intero flusso di lavoro per l'uso di CNVKit per generare la quantificazione del numero di copie è al di fuori dell'ambito di questo studio. Tuttavia, brevemente, è stato utilizzato CNVKit versione 0.9.9 (disponibile per il download da https://github.com/etal/cnvkit) con un riferimento aggregato preesistente costituito da campioni normali euploidi. L'input consiste in un file bed contenente 9.144 posizioni di sonda del backbone CNV, distribuite lungo il genoma. Un aspetto importante da considerare è che i dettagli specifici degli input e dei parametri della pipeline per il numero di copie sono meno importanti del fatto che i campioni siano elaborati utilizzando una configurazione identica per tutti i campioni in un run. Ciò facilita il riconoscimento di eventuali bias sistematici.
      2. Valutare la mappa termica: Confrontare l'intensità relativa del colore tra il campione di interesse (individuare la riga della mappa termica corrispondente a questo campione, etichettata proband) e gli altri campioni (c1-9) per distinguere i veri cambiamenti nel numero di copie dagli artefatti.
        NOTA: Il confronto visivo verticale di un locus in tutti i campioni è il metodo per identificare anomalie (differenze qualitative basate su differenze di colore tra le righe piuttosto che differenze quantitative) in un dato locus in ciascun campione rispetto allo sfondo. Fare riferimento alla Figura 5 e alla sezione Visualizzazione dei cambiamenti nel numero di copie del File Supplementare 2 per i passaggi dettagliati.
  6. Vignetta n. 6: Indagare EGFRvIII in un paziente con glioblastoma.
    NOTA: Lo stesso paziente presenta anche evidenza di un riarrangiamento EGFRvIII (delezione degli esoni 2–7). Sia l'amplificazione di EGFR che le alterazioni di EGFRvIII hanno rilevanza prognostica e terapeutica nel glioblastoma. Inoltre, queste due alterazioni si verificano spesso contemporaneamente, il che significa che la presenza di una può supportare la validità dell'altra quando rilevata a livelli bassi.
    1. Flusso di lavoro IGV (file di sessione egfr_vIII.xml):
      1. Caricare i dati: Selezionare il genoma Hg19, caricare il file bam del paziente proband.bam, assicurarsi che il file indice (stesso nome del file bam, ma con estensione .bai) sia nella stessa directory e navigare verso il gene EGFR.
      2. Visualizzare i punti di rottura di EGFRvIII: Regolare la vista per esaminare singolarmente i punti di rottura candidati (a monte dell'esone 2 e a valle dell'esone 7 per EGFRvIII) ed eseguire 'ordinamento per base'  (o utilizzare la scorciatoia Ctrl-s su Windows/Linux o Cmd-s su Mac) ai punti di rottura per visualizzare l'accumulo di allineamenti soft-clippati.
      3. Allineare con BLAT: Fare clic con il tasto destro su una sequenza soft-clippata e selezionare BLAT sequence (IGV utilizza i parametri predefiniti di UCSC; vedere https://ucsc.crg.eu/FAQ/FAQblat.html per i parametri predefiniti di BLAT). Fare clic sulla prima riga e osservare la traccia Blat che appare nella parte inferiore della sezione delle tracce di IGV.
        NOTA: Anche un singolo allineamento che si allinea alla giunzione esone 1/introne 1 e alla giunzione introne 6/esone 7 può essere prova sufficiente di EGFRvIII, purché si escluda una contaminazione incrociata da un altro campione come causa di questo allineamento. Fare riferimento alla Figura 6 e alla sezione Visualizzazione del riarrangiamento strutturale del File Supplementare 2 per i passaggi dettagliati.

Risultati

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È importante notare che questo studio si concentra sulla descrizione delle sfumature della revisione delle varianti in IGV per la redazione di rapporti clinici. La redazione finale del rapporto clinico dovrebbe dipendere dalla specifica pipeline validata, dai criteri di qualità e dalle politiche di reporting di ciascun singolo laboratorio. Una trattazione completa di questo argomento importante va oltre gli scopi del presente studio; tuttavia, standard e linee guida raccomandati sono stati elaborati dal Collegio Americano di Genetica Medica e Genomica e dall'Associazione di Patologia Molecolare7 e vengono regolarmente applicati nei laboratori clinici.

Interpretazione del caso clinico n. 1:

Data l'elevata VAF, la distribuzione equilibrata tra i filamenti e l'incidenza nota della mutazione KRAS c.34G>T (p.G12C) nel cancro del polmone (Figura 2A), la variante nel caso A può determinare una terapia mirata e, pertanto, è fondamentale segnalarla a livello clinico. Nonostante una chiamata positiva per la stessa variante KRAS c.34 G>T nel secondo caso (sarcama) (Figura 2B), sono presenti diversi segnali di allarme che indicano una chiamata falsa positiva: (1) la frazione allettica della variante riportata (VAF) è di circa l'1%, valore notevolmente inferiore a quanto ci si aspetterebbe per un evento driver in un campione stimato avere anche una bassa cellularità tumorale (20%) e (2) le letture che supportano questa variante mostrano un bias di filamento, essendo quasi esclusivamente presenti sul filamento diretto. Unitamente alla mancanza di plausibilità biologica per questo tipo di cancro, le evidenze suggeriscono che il reperto nel caso B sia un artefatto.

Interpretazione del caso clinico n. 2:

Questo approfondimento illustra diversi errori distinti di cui i clinici devono essere consapevoli. In primo luogo, i chiamatori di varianti possono identificare in modo appropriato o inappropriato varianti genetiche adiacenti come due SNV oppure come un singolo MNV (Figura 2C). Ciò è dovuto alla differenza nell'implementazione dell'algoritmo di chiamata di varianti consapevole dell'aplotipo nei chiamatori di varianti somatiche. Solo pochi chiamatori di varianti, più recentemente pubblicati, incorporano questa caratteristica14,15. In secondo luogo, variazioni tecniche e basate sulla nomenclatura come queste vengono inserite in database esterni da centri di sequenziamento che utilizzano diverse pipeline bioinformatiche. Di conseguenza, tali database possono contenere molteplici descrizioni distinte di ciò che dovrebbe essere elencato come una singola variante genetica. A meno che non venga effettuata periodicamente una fase di normalizzazione del database, ciò può avere diversi effetti negativi sull'interpretazione clinica successiva. Nel complesso, queste possibili fonti di errore possono combinarsi e portare a un referto paziente errato. Questo scenario complesso sottolinea l'importanza della visualizzazione delle varianti mediante software di alta qualità come IGV.

Interpretazione del caso clinico n. 3:

Dato il supporto multiplo alla lettura per la duplicazione e il noto meccanismo di attivazione costitutiva di KIT con duplicazioni dell'esone 9 nei GIST, possiamo concludere che questa variante KIT c.1504_1509dup (p.A502_Y503dup) è reale e non un artefatto (Figura 3). Le mutazioni di KIT sono frequenti fattori oncogeni nei GIST, verificandosi in circa il 90% dei casi. Una caratterizzazione accurata della variante è fondamentale in questo contesto, poiché, sebbene le mutazioni attivanti dell'esone 11 siano le più comuni, i GIST con mutazioni nell'esone 9 presentano un comportamento diverso rispetto alla sensibilità agli inibitori della tirosina chinasi, modificando così l'approccio terapeutico. Data l'importanza clinica delle mutazioni di KIT nei GIST, questa variante dovrebbe essere inclusa nel rapporto finale.

Interpretazione del caso clinico n. 4:

Data la traccia di copertura, l'aspetto tipico di una piccola delezione, il supporto dato dalla lettura e il noto meccanismo di attivazione costitutiva delle delezioni dell'esone 19 di EGFR nel NSCLC, si può concludere che questa variante EGFR c.2235_2249del (p.E746_A750del) è reale e non un artefatto (Figura 4). Molte mutazioni di EGFR, inclusa questa ben nota delezione dell'esone 19, sono altamente sensibili agli inibitori della tirosina chinasi. Considerata l'importanza clinica delle mutazioni di EGFR nei NSCLC, questa variante dovrebbe essere inclusa nel rapporto finale.

Interpretazione del caso clinico n. 5 e del caso clinico n. 6:

Le mappe termiche confermano l'amplificazione di EGFR e il punto di rottura tra gli esoni 1 e 8, valutato con BLAT, che conferma entrambe le alterazioni in questo paziente (Figura 5 e Figura 6). L'amplificazione di EGFR è generalmente considerata un fattore prognostico di malattia più aggressiva, e la riorganizzazione genica di EGFRvIII è un biomarcatore specifico del GBM e potenzialmente bersagliabile16,17.

I flussi di lavoro selezionati possono essere riprodotti utilizzando i file salvati nel ramo principale del repository GitHub https://github.com/Eitan177/Demo_IGV (aggiornato il 6/9/2026), che contiene sei file di sessione, uno per ogni vignetta, cinque coppie di file bam e bai, uno per ogni vignetta che utilizza un file di allineamento, e 10 file seg per la vignetta cinque, che utilizza file di segmentazione anziché file di allineamento.

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Figura 1: Standard dei file NGS e flusso di lavoro del sequenziamento. (A) Le sequenze brevi generate su una flow cell vengono tracciate mediante misurazioni ottiche e memorizzate in formato FASTQ, che include sia i dati di sequenza sia i punteggi di qualità per ogni base. Queste sequenze vengono quindi ordinate e allineate a un genoma di riferimento, producendo un file BAM in cui ogni sequenza è "impilata" nel suo locus corrispondente. (B) Le discrepanze tra il genoma di riferimento e le sequenze (ad esempio, mutazioni puntiformi, piccole inserzioni/delezioni) vengono identificate mediante algoritmi di chiamata delle varianti. (C) Infine, le varianti rilevate vengono raccolte in un file VCF, che riassume le loro posizioni, le basi di riferimento e alternative, e altri dati di annotazione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Visualizzazione basata su IGV delle varianti KRAS c.34G>T (p.G12C) e BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K). (A) Visualizzazione di una variante reale (KRAS c.34G>T (p.G12C)) in IGV, che mostra un'elevata profondità di lettura (migliaia di letture) e circa il 35–40% di letture con una variazione G→T. Le letture forward (rosse) e reverse (blu) sono bilanciate, suggerendo una mutazione eterozigote vera. (B) Artifatto sospetto in un tessuto non rilevante, che mostra una variante con supporto minimo di letture (VAF dell'1%). La maggior parte delle letture della variante appare sul filamento forward (rosso), indicando un bias di filamento. (C) Una variante complessa, BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K), osservata in IGV, che rivela una sostituzione di due basi (GT→AA) in cis. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: Visualizzazione di una piccola inserzione. (A) La vista "compattata" dell'esone 9 di KIT in IGV aiuta a identificare la regione di interesse. (B) Regione di interesse (riquadro rosso) identificata visualizzando la barra di inserzione e le basi con clipping morbido. (C) Impostazione della vista "espansa" in IGV per consentire la visualizzazione dell'inserzione. (D) Cliccando sulla barra di inserzione (riquadro rosso) viene visualizzata la sequenza inserita. (E) La sequenza inserita viene confrontata con la sequenza di riferimento per identificare le basi duplicate. (F) Ordinamento delle letture in base al filamento di lettura, che mostra come le basi con clipping morbido corrispondano all'inserzione nelle letture inverse. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Visualizzazione di una piccola delezione. (A) Vista "compattata" dell'esone 19 di EGFR che mostra la delezione presente in numerose letture. (B) Utilizzo della traccia di copertura per esaminare il numero di letture nelle posizioni all'interno e adiacenti alla delezione. (C) Vista "espansa" che mostra la delezione, identificando il numero di basi eliminate. (D) Il confronto con la sequenza di riferimento (riquadro rosso) identifica le basi eliminate. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 5: Visualizzazione di un guadagno del numero di copie. (A) Un file seg contiene sei colonne: ID del campione, cromosoma, inizio, fine, marcatori nel segmento e media del segmento. (B) Il caricamento diretto dei file seg in IGV consente una visualizzazione agevole. (C) Visualizzazione dei dati in una vista genomica globale. Ogni campione appare come una riga di dati, con colori che indicano i valori: rosso per >0 e blu per <0, dove colori più intensi indicano valori più distanti da 0. Dopo aver aperto il campione di interesse e nove campioni casuali dello stesso run, si ottiene una mappa termica multicanale composta da dieci righe. Il campione di interesse è evidenziato nella parte inferiore all'interno di un riquadro rosso. (D) Restringendo la vista al locus EGFR, si osserva una barra rossa nel campione di interesse in basso, mentre nei campioni casuali si vedono barre bianche o blu. Questa differenza cromatica tra il campione di interesse e i campioni casuali nelle altre righe dimostra che la chiamata di amplificazione nel campione di interesse è superiore al rumore di fondo in questo locus. (E) Allargando la vista al cromosoma 7, si nota un contrasto tra il locus contenente EGFR nel nostro campione e l'assenza di tale segnale nei campioni casuali. L'amplificazione di EGFR appare come una sottile striscia rossa nel campione inferiore. (F) Restringendo la vista al locus MET, l'amplificazione di MET è riprodotta in misura variabile nei nove campioni casuali oltre che nel campione di interesse, suggerendo che questa chiamata di amplificazione sia un artefatto. Questo evidenzia la differenza nell'aspetto tra una chiamata reale del numero di copie al locus EGFR e un artefatto. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 6: Visualizzazione di una riorganizzazione genica di EGFRvIII. Prima di esaminare questo caso, assicurarsi che la visualizzazione delle basi soft-clippate sia stata configurata (vedere il File Supplementare 1 per ulteriori dettagli). (A) Passare alla prima giunzione candidata e impostare la visualizzazione della traccia di allineamento su «Compatta». (B) Spostarsi lungo il locus, applicando iterativamente la scorciatoia per ordinare per base, «control-s», finché non si osserva un accumulo di letture con lo stesso tipo di soft-clipping nella parte superiore della traccia di allineamento. Maggiore è la quantità di letture con lo stesso tipo di soft-clipping (rappresentato dalla casella rossa) nell'accumulo, maggiore sarà la certezza riguardo alla presenza di una riorganizzazione strutturale. (C) Lo strumento BLAT recupera la sequenza delle basi soft-clippate e identifica dove nel genoma tale sequenza è presente, insieme a un punteggio quantitativo che misura quanto strettamente la sequenza si allinea con una specifica sequenza in un database di riferimento. La selezione di una riga particolare sposterà la visualizzazione in quella posizione. (D) L'utilizzo nuovamente della funzione di ordinamento per base «control-s» mostra un accumulo di soft-clipping, questa volta sul lato opposto delle letture. Per confermare che non siano presenti basi aggiuntive nel campione rispetto al riferimento hg38, fare clic con il tasto destro del mouse su una lettura con una sequenza di basi soft-clippate ed eseguire nuovamente il confronto BLAT delle basi soft-clippate. La tabella risultante mostra il primo punto di rottura della giunzione, ovvero il locus inizialmente visualizzato, la giunzione tra l'esone 1 e l'introne 1. (E) La selezione della prima riga riporta al primo punto di rottura. Le basi presenti alla giunzione dell'allineamento di riferimento BLAT sono identiche alle basi soft-clippate utilizzate come query, indicando che l'intera sequenza di letture con soft-clipping è contenuta nell'allineamento della sequenza di riferimento. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File supplementare 1: Configurazione consigliata per IGV.Cliccare qui per scaricare il file.

File supplementare 2: Flussi di lavoro condensati.Fare clic qui per scaricare il file.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La revisione accurata delle varianti ai fini della relazione clinica dipende da complessi algoritmi bioinformatici e dall'inclusione di una revisione visiva delle varianti complesse mediante l'utilizzo di IGV5,6. Questo studio è stato progettato per raccogliere una risorsa concisa di impostazioni consigliate per visualizzare alterazioni genomiche semplici e complesse in IGV (File Supplementare 1). Lo studio si concentra sulle alterazioni somatiche più comuni e su come esaminarle in IGV.

Il protocollo inizia con la valutazione di una mutazione di sostituzione semplice (Figura 2A) e di una mutazione di sostituzione complessa (Figura 2C), prestando particolare attenzione alla determinazione del fatto che il reperto identificato sia reale o un artefatto. Successivamente, si passa a un'inserzione semplice (Figura 3) e a una delezione semplice (Figura 4), evidenziando l'aspetto di queste alterazioni in IGV. Infine, vengono discussi gli eventi genomici complessi, inclusi i cambiamenti nel numero di copie (Figura 5) e i riarrangiamenti strutturali (Figura 6). I flussi di lavoro semplificati, che evidenziano i passaggi chiave per ciascuna di queste caratteristiche, sono riassunti nel File Supplementare 2. Questo studio ha lo scopo di familiarizzare il lettore con l'aspetto delle diverse alterazioni genomiche in IGV5.

È importante notare che IGV non viene utilizzato come strumento di pipeline per rilevare autonomamente le varianti. Sebbene al di fuori dell'ambito di questo manoscritto, si raccomanda vivamente che i laboratori di ricerca e si richiede ai laboratori clinici di definire politiche e procedure di laboratorio relative alle varianti riportabili, in base ai limiti di validazione del saggio per la frazione allica della variante e la profondità di copertura, alla necessità di conferma ortogonale per determinate varianti in specifiche circostanze, alle complessità legate alla versione del software bioinformatico e alla variabilità inter-osservatore nell'interpretazione visiva1,7.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siamo grati a tutti gli sviluppatori del software IGV, nonché al finanziamento dell'NIH che attualmente sostiene lo sviluppo di IGV: U24CA258406. Per lo sviluppo di questo studio non è stato ricevuto alcun finanziamento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BLATRicerca BLAT nel Genomahttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatPagina web autonoma di BLAT. L'API di BLAT è disponibile all'interno di IGV, nessuna installazione aggiuntiva richiesta
CNVKitGitHubhttps://github.com/etal/cnvkitRepository pubblico su GitHub con CNVKit scaricabile gratuitamente. Le istruzioni per scaricare ed eseguire CNVKit sono disponibili qui.
File di segmento comparatore n. 1 per la vignetta n. 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c1.segFile di numero di copie
File di segmento comparatore n. 2 per la vignetta n. 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c2.segFile di numero di copie
File di segmento comparatore n. 3 per la vignetta n. 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c4.segFile di numero di copie
File di segmento comparatore n. 4 per la vignetta n. 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c5.segFile di numero di copie
File di segmento comparatore n. 5 per la vignetta n. 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c6.segFile di numero di copie
File di segmento comparatore n. 6 per la vignetta n. 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c7.segFile di numero di copie
File di segmento comparatore n. 7 per la vignetta n. 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c8.segFile di numero di copie
File di segmento comparatore n. 8 per la vignetta n. 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c9.segFile di numero di copie
File di segmento comparatore per la vignetta n. 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c3.segFile di numero di copie
Sequenza del genoma umanoSequenza del genoma umanohttps://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/latest/hg38.fa.gzFile fasta scaricabile contenente l'assemblaggio del genoma umano Hg38.  Disponibile all'interno di IGV, nessun download aggiuntivo richiesto
Sequenza del genoma umanoSequenza del genoma umanohttps://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gzFile fasta scaricabile contenente l'assemblaggio del genoma umano Hg19. Disponibile all'interno di IGV, nessun download aggiuntivo richiesto
Pacchetto software IGVSoftware IGVhttps://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.19/IGV_Win_2.19.7-WithJava-installer.exeVersione software IGV 2.19.7 con Java (JDK 21), scaricabile gratuitamente. Il link fornito è per Windows, ma sono disponibili anche link per Linux e Mac.
File di segmento per il caso della vignetta n. 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.segFile di numero di copie
Repository GitHub del tutorialGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/tree/mainRepository pubblico GitHub con tutti i file necessari per riprodurre le sei vignette
Vignetta n. 1GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KRAS.xmlFile di sessione
Indice bai della vignetta n. 1, caso AGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam.bai		File di allineamento
File di allineamento bam della vignetta n. 1, caso AGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam		File di allineamento
Indice bai della vignetta n. 1, caso BGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam.bai		File di allineamento
File di allineamento bam della vignetta n. 1, caso BGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam		File di allineamento
Vignetta n. 2GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/BRAF.xmlFile di sessione
Vignetta n. 2  indice baiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam.bai		File di allineamento
Vignetta n. 2  file di allineamento bamGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam		File di allineamento
Vignetta n. 3GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KIT.xmlFile di sessione
File indice bai della vignetta n. 3GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.baiFile di allineamento
File di allineamento bam della vignetta n. 3GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bamFile di allineamento
Vignetta n. 4GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFR.xmlFile di sessione
File di allineamento della vignetta n. 4GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bamFile di allineamento
Vignetta n. 4 indice baiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.baiFile di allineamento
Vignetta n. 5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/copynumber.xmlFile di sessione
Vignetta n. 6GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/egfr_vIII.xmlFile di sessione
Vignetta n. 6 indice baiGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.baiFile di allineamento
File di allineamento bam della vignetta n. 6GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bamFile di allineamento

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