Un metodo definito a base di idrogel per generare organoidi mammari umani tridimensionali che riproducono la morfogenesi mammaria

Summary

Questo protocollo descrive un metodo definito a base di idrogel per generare organoidi mammari umani che riproducono caratteristiche chiave della morfogenesi mammaria in un sistema di coltura tridimensionale controllato.

Abstract

Lo sviluppo di sistemi modello umani fisiologicamente rilevanti che riproducano l'architettura tissutale e la dinamica dello stato cellulare rimane una sfida importante nello studio dello sviluppo del seno e degli eventi precoci nella carcinogenesi. Le colture bidimensionali convenzionali e molti sistemi tridimensionali non riescono a catturare l'organizzazione strutturale e i segnali microambientali che definiscono la ghiandola mammaria umana. Qui descriviamo un metodo riproducibile per generare organoidi mammari umani tridimensionali a partire da cellule epiteliali primarie incorporate in una matrice idrogel definita composta da collagene di tipo I, laminina, fibronectina e acido ialuronico. Questo sistema supporta la progressione delle singole cellule attraverso fasi chiave della morfogenesi mammaria, inclusa l'espansione dei progenitori, la modellazione epiteliale e la formazione di strutture terminali lobulari simili a unità, nonché l'emergere di un compartimento simile a mesenchima durante un periodo di coltura di 21 giorni. Forniamo un protocollo passo dopo passo per la preparazione dell'idrogel, la semina cellulare e le condizioni di coltura. Il metodo è compatibile con l'imaging ad alto contenuto e l'analisi quantitativa del numero di organoidi, della distribuzione delle dimensioni e della complessità architettonica. Questa piattaforma consente studi meccanicistici sulla plasticità epiteliale e sulle perturbazioni ambientali, fornendo un sistema scalabile e biologicamente rilevante per indagare i primi cambiamenti ai livelli tissutali associati al rischio di cancro al seno.

Introduction

Comprendere lo sviluppo delle ghiandole mammarie umane e gli eventi precoci che predispongono i tessuti alla trasformazione maligna richiede sistemi sperimentali che riproducano fedelmente l'architettura tissutale, la gerarchia cellulare e la segnalazione microambientale. Sebbene le culture epiteliali bidimensionali abbiano fornito importanti intuizioni meccanicistiche, mancano del contesto strutturale necessario per modellare l'organizzazione epiteliale e la^{morfogenesi 1}. I sistemi di coltura tridimensionale esistenti, inclusi quelli basati su estratti di membrana basale, hanno fatto avanzare il campo ma rimangono limitati da composizioni variabili, controllo incompleto sui componenti della matrice extracellulare e supporto incoerente dell'architettura tissutale^{di ordine superiore 1}. Inoltre, molti sistemi organoidi basati su estratti di membrana basale sono vincolati dalla loro incapacità di supportare costantemente l'emergere di un'organizzazione simile a^{tessuto 1}. In particolare, molti sistemi si affidano a componenti stromali esogeni piuttosto che a favorire lo sviluppo endogeno di microambienti di supporto, limitando così la loro capacità di modellare le interazioni epiteliali–mesenchemi che sono centrali per lo sviluppo tissutale e le malattie. Queste limitazioni limitano lo studio riproducibile dei processi di sviluppo, della plasticità epiteliale e degli effetti delle perturbazioni ambientali o molecolari sull'organizzazione dei tessuti.

Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un modello tridimensionale di organoide umano tridimensionale definito a base di idrogel che consente alle cellule epiteliali primarie di generare strutture organizzate all'interno di una matrice extracellulare^definita 2,3,4,5,8. L'idrogel è composto da collagene di tipo I, laminina, fibronectina e acido ialuronico, componenti selezionati in base ai loro ruoli consolidati nello sviluppo delle ghiandole mammari e nella morfogenesi epiteliale. Queste molecole della matrice extracellulare coinvolgono recettori cellulari distinti, tra cui integrine, recettori del dominio discoidinale, CD44 e RHAMM, e sono note per regolare la polarità epiteliale, la morfogenesi ramificata, il mantenimento delle cellule staminali, la meccanotrasduzione e l'organizzazione dei tessuti nella ghiandola mammaria ^6,7. Studi precedenti che descrivevano questo sistema idrogel hanno dimostrato che l'incorporazione di questi componenti della matrice extracellulare ha migliorato notevolmente la morfogenesi ductal-lobulare e la maturazione epiteliale rispetto alle condizioni basate solo sul collagene o basate su^{Matrigel 3,8}. Inoltre, le proprietà fisiche di questa formulazione idrogel erano precedentemente caratterizzate dalla microscopia a forza atomica, dimostrando che l'idrogel composito a matrice extracellulare mostrava una rigidità inferiore e un aumento del gonfiore rispetto ai gel a base di collagene (modulo di Young: 256,7 ± 20,0 Pa contro 559,2 ± 204,0 Pa, rispettivamente), coerente con un ambiente matriciale più morbido e^{idratato 8}.

È importante sottolineare che questo modello supporta l'emergere di un compartimento simile a mesenchima che sorge accanto alle strutture epiteliali, fornendo supporto strutturale e di segnalazione endogeno che riflette più da vicino l'organizzazione tissutale^{nativa 3}. La rilevanza fisiologica di questo sistema idrogel è stata valutata tramite confronti diretti con colture organoidi convenzionali basate su Matrigel utilizzando sia analisi morfologiche che trascridemiche. Studi precedenti hanno dimostrato che le colture idrogel supportavano una formazione più organizzata del tessuto ductal-lobulare e una differenziazione multilineage rispetto alle colture basate su Matrigel, preservando al contempo la risposta^{ormonale 8}. Più recentemente, analisi integrate di sequenziamento RNA unicellulare che confrontano organoidi derivati dall'idrogel, organoidi coltivati in Matrigel e tessuto mammario umano primario hanno dimostrato che gli organoidi coltivati in idrogel riproducono più fedelmente la gerarchia epiteliale, la diversità cellulare e le interazioni epiteliali–mesenchimale presenti nel tessuto mammario umano^{nativo 3}. Al contrario, gli organoidi coltivati con Matrigel erano arricchiti per stati basale ibridi proliferattivi e privi di popolazioni simili a stromi, compatibili con l'autoassemblaggio epiteliale piuttosto che con un'organogenesi diretta.

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo riproducibile e scalabile per generare organoidi a partire dal tessuto umano primario, con passaggi opzionali per la deplezione e la dissociazione dei fibroblasti verso singole cellule. Poiché questa piattaforma è compatibile con imaging live, imaging ad alto contenuto, analisi morfometrica quantitativa, tracciamento cellulare e studi di perturbazione genetica, può essere integrata con approcci a valle che valutano il numero di organoidi, la dimensione, l'architettura e la dinamica della crescita. Questa piattaforma fornisce quindi un sistema biologicamente rilevante per studiare lo sviluppo del seno umano, la plasticità epiteliale, le interazioni epiteliali-microambiente e le risposte a livello tissutale a perturbazioni dello sviluppo, molecolari o ambientali.

Una panoramica schematica del flusso di lavoro, inclusa la lavorazione dei tessuti, la preparazione dell'idrogel, la coltura organoide, la progressione dello sviluppo e le analisi a valle, è fornita nella Figura 1, mentre morfologie organoidi rappresentative generate tramite questa piattaforma sono mostrate nella Figura 2.

Figura 1. Panoramica del flusso di lavoro di generazione di organoidi a base di idrogel. (A) Diagramma di flusso che riassume il flusso di lavoro del protocollo, inclusa raccolta di tessuti, lavorazione dei tessuti, crioconservazione, recupero e preparazione opzionale delle cellule, preparazione di idrogel, coltura di organoidi, sviluppo di organoidi e applicazioni analitiche a valle. (B) Schema visivo che raffigura le principali fasi del protocollo di generazione organoide a base di idrogel, inclusi l'elaborazione e la preparazione dei tessuti, il recupero e la preparazione opzionale delle cellule, e la preparazione dell'idrogel e la semina degli organoidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Morfologie organoidi rappresentative generate nel sistema idrogel definito. Immagini rappresentative in campo chiaro di organoidi derivate da diversi tessuti umani coltivati nella matrice di idrogel definita. Gli organoidi mammari generati da singole cellule epiteliali derivate da mamoplastica di riduzione sono stati fotografiati al giorno 21 della coltura. Gli organoidi xenoinnesti derivati dal paziente generati da frammenti tumorali sono stati fotografiati al giorno 16 di coltura. Gli organoidi delle ghiandole salivare generati da frammenti epiteliali sono stati fotografiati al terzo giorno di coltura. Gli organoidi renali generati dai frammenti epiteliali sono stati fotografiati al giorno 17 di coltura. Barre della scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

I tessuti primari che altrimenti sarebbero stati scartati come rifiuti medici dopo l'intervento chirurgico sono stati prelevati in conformità con tutte le leggi pertinenti utilizzando protocolli approvati dai comitati di revisione istituzionale del Maine Medical Center e del Tufts Medical Center. Tutti i tessuti sono stati anonimizzati prima del trasferimento e non sono stati ricondotti a pazienti specifici. Per questo motivo, questa ricerca ha ottenuto lo status di esenzione dal Committee on the Use of Humans as Experimental Subjects presso il Massachusetts Institute of Technology e presso la Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Tutti i pazienti iscritti a questo studio hanno firmato un modulo di consenso informato accettando di partecipare allo studio e alla pubblicazione dei risultati.

1. Elaborazione e preparazione dei tessuti

NOTA: Eseguire tutte le procedure che coinvolgono tessuti umani in conformità con le linee guida istituzionali per la biosicurezza e le etiche. Consulta gli schemi del flusso di lavoro mostrati nelle Figure 1A e 1B per una panoramica visiva dei passaggi del protocollo e della preparazione degli organoidi prima di iniziare la procedura.

1. Prepara MEGM utilizzando un mezzo basale epiteliale mammario integrato con estratto di ipofisi bovina da 52 μg/mL, 10 ng/mL di fattore di crescita epidermica umana, 5 μg/mL di insulina, 500 ng/mL di idrocortisone, 1% (v/v) di GlutaMAX e 1% (v/v) di antibiotico-antimicotico (100X).
2. Prepara il mezzo di dissociazione aggiungendo 1,5 mg/mL di collagenasi A (conservata a −20°C) e 100 U/mL di ialuronidasi (conservata a 4°C) al mezzo epiteliale mammario (MEGM).
3. Ricevere tessuto mammario umano ottenuto da mastectomie profilattiche e mammoplastiche di riduzione entro 24 ore dall'escissione, non fissato in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e mantenuto a 4°C. Pesa il tessuto su un bilanciamento di precisione per determinare il peso totale del tessuto.
4. Metti il tessuto in un armadietto sterile per la biosicurezza. Trita meccanicamente il tessuto^{in 3–} 5 mm 3 frammenti usando bisturi sterili. Trasferire circa 2–3 g di tessuto tritato in un tubo conico da 15 mL. Aggiungi 10 mL di mezzo dissociativo a ogni tubo.
5. Incubare i tubi a 37°C su un rotatore orbitale a 8 giri al minuto per 12–18 ore per digerire enzimaticamente il tessuto. Si considera la digestione completa quando non rimangono grandi frammenti di tessuto e una sospensione omogenea di materiale frammentato uniformemente è visibile in tutto il mezzo.
6. Lascia sedimentare i frammenti epiteliali per gravità per 5 minuti. Confermare che non restino frammenti visibili sospesi nel mezzo e che sia presente un pellet distinto. Scartare con cura e scartare il soprannatante senza disturbare il pellet.
   NOTA: Il sovrantantante contiene cellule stromali e componenti della matrice, e può essere lavato e utilizzato o conservato per altri studi.
7. Risospendere il pellet in un mezzo di lavaggio da 10 mL composto dal 5% di siero bovino fetale (FBS) in PBS. Centrifuga a 250 × g per 5 minuti in una centrifuga a secchio oscillante a temperatura ambiente.
8. Ripeti il passaggio di lavaggio altre tre volte o finché il sovrantantante non è pulito e privo di detriti visibili.
9. Risospendere il pellet finale in un mezzo congelante composto dal 10% di dimetilsolfosdo (DMSO) in MEGM a un volume di 1 mL per grammo di peso tissutale iniziale.
   ATTENZIONE: Il DMSO è dannoso al contatto o all'inalazione. Utilizzare l'uso di dispositivi di protezione individuale adeguati e lavorare con un cappuccio di sicurezza chimica se richiesto dalle linee guida istituzionali.
10. Aliquota 1 mL della sospensione in ogni cryoviale. Posizionare i cryovials a −80°C in un contenitore congelante prima di conservarli a lungo termine in azoto liquido.
    NOTA: Questo passaggio rappresenta un punto di pausa. Conservare i campioni a −80°C prima di trasferirli in condizioni di conservazione a lungo termine.

2. Recupero e preparazione opzionale delle cellule

1. Scongelamento e recupero iniziale
   1. Rimuovere il tessuto criopriservato dalla conservazione a −80°C dopo il congelamento per almeno 24 ore, o dalla conservazione a lungo termine dell'azoto liquido. Immergi immediatamente il cryovial fino al tappo in un bagno d'acqua a 37°C e scongela rapidamente per 1 minuto per minimizzare la morte cellulare.
      NOTA: Agitare delicatamente il cryovial durante lo scongelamento per garantire un riscaldamento uniforme.
   2. Una volta completamente scongelato, trasferire immediatamente il contenuto del cryovial in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di MEGM. Centrifuga a 250 × g per 5 minuti.
2. Esaurimento opzionale dei fibroblasti
   NOTA: La deplezione dei fibroblasti tramite pre-placcatura è un passaggio opzionale di arricchimento utilizzato per ridurre le popolazioni stromali o fibroblastiche rapidamente aderenti quando si desidera una popolazione iniziale più arricchita epiteliale. Questo passaggio non è richiesto per la formazione dell'organoide e può essere adattato a seconda dell'obiettivo sperimentale.
   1. Risospendere il pellet con 10 mL di MEGM.
   2. Trasferire il tessuto sospeso in una ciotola di coltura cellulare da 10 cm. Incubare a 37°C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ per 90 minuti per consentire l'attacco dei fibroblasti.
      NOTA: Non disturbare la ciotola di coltura durante l'incubazione per garantire un'adegua efficiente ai fibroblasti.
   3. Raccogliere le cellule non aderenti contenenti il surnatante utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, inclinando delicatamente la tavola di coltura a circa 45°. Sciacquare delicatamente il piatto con 5 mL di PBS e unire il risciacquo con il surnadante raccolto.
   4. Centrifugare la sospensione combinata a 250 × g per 5 minuti per recuperare materiale arricchito epiteliale.
      NOTA: Le cellule che si sono attaccate alla piastra sono arricchite per i fibroblasti delle ghiandole mammarie e possono essere propagate separatamente aggiungendo un mezzo composto da DMEM + 10% FBS e antibiotici.
3. Dissociazione opzionale alle singole cellule
   1. Risospendere il pellet in 500 μL di soluzione enzimatica dissociativa preriscaldata (37°C) composta dallo 0,25% di tripsina. I reagenti di dissociazione alternativi possono richiedere ottimizzazione. Trasferire la sospensione su un tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Tritura il campione 20 volte usando una pipetta P1000 per favorire la dissociazione.
      ATTENZIONE: I reagenti enzimatici, dissociati, possono essere dannosi. Maneggiare l'uso di attrezzature di protezione personale adeguate ed evitare il contatto con la pelle o lo sguardo.
   2. Incubare il tubo a 37°C per 3-5 minuti. Dissociare meccanicamente il campione immediatamente dopo l'incubazione triturando 20 volte con una pipetta P1000.
   3. Aggiungi 1 mL di mezzo di lavaggio contenente siero per neutralizzare la reazione enzimatica. Centrifuga a 500 × g per 5 minuti.
   4. Risospendere il pellet in una soluzione dispasica da 300 μL (5 U/mL) e una soluzione di DNasi da 30 μL (1 mg/mL). Incubare a 37°C per 3–5 minuti.
   5. Dissocia meccanicamente il campione pipettando 15–20 volte. Aggiungere 700 μL di mezzo di lavaggio contenente siero alla sospensione.
   6. Filtra la sospensione della cella attraverso un filtro a 40 μm in un tubo pulito. Si può utilizzare un colino standard a celle da 40 μm o un colino a punta di pipetta Flowmi. I filtri Flowmi possono ridurre la perdita di campioni quando si lavora con numeri cellulari limitati.
   7. Determina il numero di cellule vitali usando l'esclusione blu di tripano. Mescolare 10 μL della sospensione cellulare con blu di tripano a un rapporto 1:1 e caricare 10 μL della miscela in una camera di conteggio cellulare o in un vetrione di conteggio. Determina la vitalità cellulare utilizzando un contatore cellulare automatico o un emocitometro.
   8. Centrifuga la sospensione a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   9. Risospendere la pellet cellulare nel MEGM alla concentrazione desiderata per la semina dell'idrogel.
      NOTA: Per gli esperimenti di semina a singola cellula, gli input tipici variano da circa 1.000 a 5.000 cellule per idrogel da 200 μL, a seconda dell'obiettivo sperimentale e delle caratteristiche del campione donatore. Le densità di semina più basse sono generalmente utilizzate per l'imaging dal vivo e studi di morfogenesi per facilitare il tracciamento dello sviluppo dei singoli organoidi, mentre densità più alte sono comunemente impiegate per analisi molecolari di endpoint, inclusa la raccolta di RNA e proteine.

3. Preparazione dell'idrogel e semina di organoidi

1. Preparazione delle scorte e calcoli di volume
   1. Mettere sulla ghiaccio la soluzione di laminina (1,18 mg/mL), la soluzione di acido ialuronico (1 mg/mL in acqua sterile), la soluzione di fibronectina (2 mg/mL in acqua sterile) e PBS 1× prima dell'uso. Conservare aliquote di laminina e fibronectina a −80°C e conservare la soluzione di acido ialuronico a 4°C. Scongelare lentamente i componenti congelati sul ghiaccio a 0°C–4°C prima dell'uso.
   2. Prepara una soluzione di integratore a matrice extracellulare al 25×. Per preparare 1 mL, si combinano 425 μL di laminina, 250 μL di acido ialuronico, 250 μL di fibronectina e 75 μL di PBS in un tubo mantenuto sul ghiaccio. Mescola delicatamente invertendo il tubo 3–4 volte. Conserva la soluzione a 4°C per un massimo di 1 mese.
   3. Determinare il volume e la composizione finale dell'idrogel desiderato prima della preparazione. Prepara almeno il 20% di volume in eccesso per compensare le perdite di materiale durante la pipettura e il trasferimento.
      NOTA: La formulazione idrogel consiste in collagene I, una concentrazione finale di 1× di integratori della matrice extracellulare (da uno stock al 25×) e 12,5% (v/v) di idrossido di sodio 0,1 N rispetto al volume di collagene I per neutralizzazione del pH e polimerizzazione.
      NOTA: Le concentrazioni finali di idrogel sono 1,7 mg/mL di collagene I, 20 μg/mL laminina, 20 μg/mL di fibronectina e 10 μg/mL di acido ialuronico.
   4. Calcola il volume richiesto di collagene I (_{V collagene}) utilizzando la seguente formula:
      
      Qui, C_finale  = 1,7 mg/mL, V_totale è il volume finale di idrogel desiderato, e C_stock è la concentrazione della soluzione di collagene. Usa concentrazioni di stock di collagene comprese tra 2 e 12 mg/mL.
      NOTA: La concentrazione di stock di collagene può variare tra i lotti. Concentrazioni più elevate aumentano la viscosità e devono essere pipettate lentamente.
   5. Calcola il volume di idrossido di sodio (V_NaOH) di 0,1 N utilizzando la seguente formula:
      V_NaOH = 0,125 x _{V collagene}
      Prepara una soluzione lavorativa a idrossido di sodio a 0,1 N diluendo 1 idrossido di sodio in acqua sterile.
   6. Calcola il volume del supplemento della matrice extracellulare (V_ES) usando la seguente formula:
      
   7. Calcola il volume rimanente da riempire con il substrato di crescita usando la seguente formula:
      _{Mezzo di crescita} V = _{V totale} - (V_collagene + V_NaOH + _{V ES} + _{Vcellule/tessuto} V)
      NOTA: Determinare il volume di cellule o frammenti di tessuto per ogni esperimento singolarmente. Utilizzare un intervallo tipico di 10–100 μL all'interno del volume consentito. Il conteggio preciso dei frammenti non viene effettuato perché la dimensione e la composizione dei frammenti variano sostanzialmente tra le preparazioni. Standardizzare la semina tramite la valutazione visiva dell'abbondanza e distribuzione dei frammenti.
2. Preparazione del Hydrogel Master Mix
   1. Posizionare collagene I, integratore di matrice extracellulare, idrossido di sodio (0,1 N) e mezzo di crescita sul ghiaccio a 0°C–4°C. Mantieni tutti i componenti a bassa temperatura per prevenire una polimerizzazione prematura.
   2. Aggiungi il volume calcolato di collagene I a un tubo microcentrifugo raffreddato.
   3. Aggiungi il volume calcolato del mezzo di crescita pre-raffreddato alla soluzione di collagene.
   4. Aggiungi il volume calcolato di 0,1 idrossido di sodio N per neutralizzare la soluzione.
      NOTA: L'ottimizzazione precedente ha stabilito che queste condizioni producono il pH del gel appropriato; pertanto, non è necessario un test di pH di routine della miscela di idrogel.
      NOTA: Esegui rapidamente tutti i passaggi successivi per prevenire la polimerizzazione prematura del collagene.
   5. Mescola la soluzione scuotendo vigorosamente il tubo a una velocità di circa una scuotita al secondo per almeno 6 scosse.
   6. Aggiungi il volume calcolato dell'integratore della matrice extracellulare alla miscela.
   7. Aggiungi il volume calcolato di singole cellule o frammenti di tessuto usando una pipetta P1000 o una punta a larga cane. Mescola immediatamente scuotendo come descritto nel Passaggio 3.2.5 e procedi immediatamente al passaggio successivo.
3. Deposizione di idrogel
   1. Pipetta la miscela di idrogel in vasi di coltura al volume desiderato per pozzo. Utilizzare 200 μL di idrogel per pozzo per le venature a camera a 4 pozzi, 100 μL per pozzo per le vetri a camera a 8 pozzi e 20 μL per pozzo per piastre da 96 pozzi.
   2. Distribuisci l'idrogel in un sottile pad sulla superficie quando usi i vetrini della camera. Posiziona la punta della pipetta sul bordo centrale superiore della camera e trascina la punta sulla superficie mentre dispensi il gel per creare un tampone uniforme. Per piastre a 96 pozzi, posizionare la punta della pipetta al centro del pozzo mantenendo il contatto con la superficie e dispensare il gel centralmente per mantenere una struttura a cupola. Evita di pipettare aria nel gel perché questo creerebbe bolle.
   3. Incubare i vasi di coltura a 37°C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ per 60 minuti per consentire la polimerizzazione completa.
      NOTA: Le condizioni di polimerizzazione descritte qui sono state ottimizzate per i formati di coltura utilizzati in questo studio. Possono essere necessari piccoli aggiustamenti nel tempo di polimerizzazione a seconda della geometria dei recipienti di coltura, del volume di idrogel e delle condizioni di incubazione.
4. Cultura e manutenzione
   1. Aggiungi MEGM preriscaldato in ogni pozzo. Regola il volume in base al formato culturale utilizzato.
   2. Stacca delicatamente l'idrogel dalla superficie della coltura usando una punta di pipetta per permettere al gel di galleggiare. Fai scorrere la punta della pipetta intorno al perimetro del gel e solleva delicatamente sotto l'idrogel polimerizzato per liberarlo dalla superficie.
   3. Sostituisci il MEGM due volte a settimana con un substrato fresco e preriscaldato. Mantenere le colture in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ per circa 3–4 settimane e interrompere le colture prima che si verifichi il collasso completo dell'idrogel. Identificare gli idrogel collassati dall'aspetto di strutture dense, opache, simili a plug, risultanti da un'estesa crescita cellulare all'interno del gel (vedi esempi rappresentativi nella Figura Supplementare 1).

Results

L'esecuzione con successo di questo protocollo porta alla formazione di strutture organoidi tridimensionali che mostrano una morfologia epiteliale organizzata e caratteristiche architettoniche specifiche per i tessuti. Gli organoidi iniziano a formarsi entro 3–7 giorni dalla semina e continuano a svilupparsi durante il periodo di coltivazione. La precedente caratterizzazione di questo sistema organoide idrogel ha dimostrato la formazione di organoidi riproducibili su più donatori umani primari^{indipendenti 3}. In quello studio, sono state valutate cellule epiteliali primarie isolate da 12 donatori di mammoplastica di riduzione prive di malattia, e 11 dei 12 campioni di donatore hanno generato con successo organoidi nelle condizioni di coltura descritte. Tra i donatori, il numero mediano di strutture organoidi formate ogni 100 cellule semiate era di 1,775 (IC 95%: 0,45–4,10). Sebbene fosse stata osservata una sostanziale variabilità tra donatori nell'efficienza della formazione degli organoidi e nella dinamica della crescita, morfologie complesse ductale-lobulare e acinar sono state generate in modo riproducibile tra i donatori.

Gli organoidi mammari derivati da singole cellule epiteliali mostrano una morfogenesi progressiva, formando strutture ramificate entro il giorno 21 della coltura (Figura 2). Queste strutture sono caratterizzate da proiezioni allungate e organizzazione multicellulare. Gli organoidi hanno mostrato aree proiettate che variavano da 10.000 a 90.000^{μm 2} entro il giorno 18, con valori di circolarità inferiori a 0,3, calcolati come 4π × (Area/Perimetro²)^3,9. Gli organoidi derivati da frammenti di tessuto formavano tipicamente strutture superiori a 90.000^μm2 entro il giorno 18, mentre gli organoidi derivati da frammenti tumorali formavano strutture più dense e irregolari con organizzazione ridotta e proiezioni radiali aumentate, coerenti con un comportamento di crescita alterato.

Anche gli organoidi derivati da frammenti epiteliali di ghiandole salivari e reni mostrano morfologie distinte nelle stesse condizioni di idrogel (Figura 2). Gli organoidi delle ghiandole salivari formano strutture compatte nei primi momenti (giorno 3), mentre gli organoidi renali sviluppano morfologie allungate e asimmetriche entro il giorno 17. Queste osservazioni sono incluse per dimostrare la più ampia adattabilità del sistema organoide a base di idrogel oltre al tessuto mammario e illustrarne la capacità di supportare la formazione di organoidi da molteplici fonti di tessuto epiteliale.

Immunocolorazioni e analisi molecolari precedentemente ^{effettuate 3,5,8} hanno dimostrato la presenza di marcatori di linea epiteliale, inclusi i marcatori luminali KRT8, KRT18, KRT19, E-cadherina, GATA3, JAG1, Notch1 e MUC1, nonché i marcatori basale o mioepiteliali KRT5, KRT14, Slug, SOX9 e TP63, indicando la conservazione dell'eterogeneità epiteliale all'interno degli organoidi. Le caratteristiche strutturali compatibili con l'organizzazione terminale lobulare simile a unità sono state osservate tramite microscopia confocale e ricostruzione tridimensionale e definite come strutture contenenti regioni duttali allungate collegate a gemmi terminali simili a lobuli o alveolari che ricordano l'organizzazione delle unità lobulari terminali native umane. Queste strutture hanno inoltre mostrato un'organizzazione epiteliale stratificata con pattern cellulari luminali e basale coerenti con analisi precedentemente pubblicate su questa^{piattaforma 3}.

È stato osservato un compartimento simile a mesenchima in associazione e tra le strutture epiteliali ed è stato caratterizzato da comportamento migratorio ed espressione di marcatori tra cui VIM, SNAI1, ZEB1, S100A, CD90 e FAPα. Insieme alle analisi microscopiche a time-lapse, queste osservazioni supportano l'emergere di un microambiente di supporto all'interno del sistema di^{coltura 3}.

È importante sottolineare che questo protocollo è inteso a fornire un quadro metodologico ampiamente adattabile, piuttosto che stabilire un unico punto di riferimento biologico fisso. Gli esiti quantitativi, inclusi efficienza nella formazione degli organoidi, dimensioni, complessità di ramificazione e composizione cellulare, possono variare a seconda della fonte donatrice, dello stato menopausale, del materiale di partenza (ad esempio, frammenti di tessuto rispetto a singole cellule) e delle condizioni sperimentali.

Esiti subottimali includono una riduzione dell'efficienza nella formazione di organoidi (<1 organoide ogni 500 cellule seminate), eccessivo detrito cellulare, fallimento della polimerizzazione del collagene o mancato stabilimento di strutture organizzate. Questi esiti sono comunemente associati a bassa vitalità cellulare, dissociazione tessutale incompleta, composizione errata dell'idrogel o neutralizzazione impropria del pH.

L'analisi quantitativa dello sviluppo degli organoidi può essere effettuata utilizzando approcci di imaging dal vivo e ad alto contenuto per misurare il numero di organoidi, la distribuzione delle dimensioni, il comportamento di ramificazione, la complessità strutturale e la dinamica cellulare. Studi precedenti che utilizzavano questa piattaforma hanno effettuato immagini longitudinali live, tracciamento cellulare, analisi morfometrica e studi di perturbazione genetica per quantificare la dinamica della crescita degli organoidi e il comportamento della linea di discendenza nel^{tempo 3,5}. L'imaging è stato effettuato tramite microscopia confocale e l'analisi delle immagini è stata effettuata con il software NIS-Elements.

Figura supplementare 1. Esempio rappresentativo di un idrogel collassato durante una coltura organoide a lungo termine al giorno 18. Gli idrogel collassati appaiono come strutture dense, opache e simili a tappi dovute a un'estesa crescita cellulare e contrazione della matrice. Queste caratteristiche morfologiche venivano utilizzate come criteri per terminare le colture prima del collasso completo dell'idrogel. Barra di scala = 500 μm. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Il protocollo descritto qui consente la generazione riproducibile di organoidi mammari umani tridimensionali all'interno di un microambiente idrogel definito che supporta caratteristiche chiave della morfogenesi^{mammaria 3}. Diversi passaggi sono fondamentali per il successo di questo metodo. Innanzitutto, il processamento tissutale e la dissociazione enzimatica devono essere controllati con attenzione per preservare la vitalità epiteliale minimizzando la sovradigestione, che può ridurre la resa cellulare e compromettere la morfogenesi^{successiva 10}. In particolare, trattamenti enzimatici brevi e sequenziali, combinati con una dissociazione meccanica delicata, sono essenziali per mantenere le popolazioni epiteliali funzionali. In secondo luogo, la preparazione dell'idrogel richiede un controllo preciso della concentrazione di collagene, del pH e del^{tempismo 11}. La neutralizzazione del collagene avvia la polimerizzazione; Pertanto, tutti i passaggi successivi all'aggiunta di idrossido di sodio devono essere eseguiti rapidamente e su ghiaccio per garantire una formazione costante del gel. Una polimerizzazione incompleta o ritardata può portare a idrogel mal strutturati o collassati che non supportano lo sviluppo degli organoidi. Infine, la densità di semina deve essere ottimizzata empiricamente per ogni campione donatore, poiché un carico eccessivo di tessuto o cellula può portare a una rapida contrazione del gel e alla perdita di integrità^{strutturale 12}.

Diverse considerazioni di troubleshooting possono migliorare la riproducibilità. Una scarsa formazione di organoidi può derivare da bassa vitalità cellulare, composizione subottimale degli idrogel o una gestione impropria del gel durante la deposizione¹³. Garantire che le scorte di collagene siano mantenute a 4°C e non subiscono una polimerizzazione prematura è essenziale per garantire una qualità costante del gel¹¹. Inoltre, il risuccesso nel distacco degli idrogel dalla superficie di coltura dopo la polimerizzazione funge da indicatore della corretta formazione del gel; Il mancato stacco tipicamente riflette una polimerizzazione incompleta o condizioni superficiali^{inappropriate 14}. La variabilità nella dimensione e nella morfologia dell'organoide è attesa tra i campioni donatori e riflette eterogeneità biologica piuttosto che fallimento tecnico. Studi precedenti che utilizzavano questa piattaforma hanno dimostrato la formazione di organoidi riproducibili su un ampio insieme di donatori umani primari indipendenti, nonostante una sostanziale variabilità tra donatori nell'efficienza della formazione degli organoidi e nella^{morfogenesi 3}.

Questo metodo presenta diverse limitazioni. Sebbene il modello supporti l'emergere di un compartimento simile a mesenchima insieme alle strutture epiteliali, non ricapitola pienamente la complessità del microambiente stromale, immunitario e vascolare in vivo. La composizione dell'idrogel, sebbene definita, rappresenta una matrice extracellulare semplificata e potrebbe non catturare tutti i segnali biomeccanici o biochimici presenti nei tessuti^{nativi 15,16}. Inoltre, la variabilità da donatore a donatore può influenzare la dinamica della crescita degli organoidi e la morfologia, rendendo necessaria un'ottimizzazione empirica per applicazioni specifiche. Nonostante queste limitazioni, la capacità di questo sistema di supportare l'auto-organizzazione e le interazioni endogene epiteliali–mesenchimali rappresenta un progresso significativo rispetto a molti modelli di coltura^{esistenti 3}.

Rispetto ai sistemi a base di estratti di membrana basali comunemente usati, questo approccio offre un maggiore controllo sulla composizione della matrice extracellulare e riduce la variabilità associata a materiali^{indefiniti 17}. Studi precedenti che confrontavano direttamente questa piattaforma idrogel con sistemi organoidi basati su Matrigel hanno mostrato differenze sostanziali nell'organizzazione dei tessuti e nella composizione^{cellulare 3,8}. Gli organoidi coltivati con idrogel somigliavano di più al tessuto mammario umano nativo sia a livello morfologico che trascritomico, preservando popolazioni epiteliali multilineamentali, inclusi compartimenti luminali, basali, progenitori e mesenchimali, mentre gli organoidi coltivati in Matrigel erano dominati da stati ibridi proliferativi simili alla base e privi di popolazioni stromali. Inoltre, a differenza dei sistemi di co-coltura che si basano sull'aggiunta di cellule stromali esogene, questo modello consente l'emergere intrinseco di un compartimento di supporto simile a mesenchima, consentendo lo studio delle interazioni epiteliale–microambiente in un contesto più rilevante dal punto di vista fisiologico e meno artificialmente ingegnerizzato. Le popolazioni emergenti simili a mesenchimi all'interno degli idrogel erano state precedentemente validate tramite imaging vivo complementare, immunocolorazione e analisi trascricomiche a singola^{cellula 3}. Questi studi hanno dimostrato l'emergere di cellule stromali altamente mobili che esprimono marcatori associati alla transizione mesenchimale ed epiteliale-mesenchimale tra cui Vimentin, THY1/CD90, FAP, S100A4, ZEB1 e Snail, insieme a interazioni reciproce di segnalazione epiteliale–mesenchimale identificate tramite analisi ligando-recettore. Queste caratteristiche rendono il sistema particolarmente adatto a studiare processi che dipendono dall'architettura tissutale e dalla comunicazione cellula-cellula, inclusi morfogenesi, plasticità epiteliale e rimodellamento tissutale^{precoce 4,5}.

La piattaforma descritta ha ampie applicazioni nella ricerca di base e traslazionale. Può essere utilizzato per studiare lo sviluppo del seno umano, modellare eventi precoci nell'inizio della malattia e valutare gli effetti di perturbazioni molecolari o ambientali sull'organizzazione dei tessuti. Studi precedenti che utilizzano questa piattaforma hanno dimostrato che la perturbazione funzionale dei regolatori dello sviluppo come DDR1 e RUNX1 altera la differenziazione della linea, l'organizzazione epiteliale e la morfogenesi ductale-lobulare nella cultura^{tridimensionale 5,18}. La compatibilità con l'imaging quantitativo e l'analisi ad alto contenuto consente ulteriormente l'interrogazione sistematica degli esiti fenotipici, inclusi cambiamenti nella dimensione, struttura e complessità degli organoidi. In quanto tale, questo metodo fornisce una piattaforma scalabile e biologicamente rilevante per studiare l'organizzazione dei tessuti umani e la sua interruzione in contesti rilevanti per le malattie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubi conici da 15 mL	VWR	89039-664	Tubi sterili per l'elaborazione e centrifugazione dei tessuti
40 & mu; Filtro per cellule M	VWR	732-2757	Dispositivo di filtrazione per la preparazione della sospensione a cella singola
40 & mu; Filtro a cellule M per volumi bassi	Bel-Art	136800040	Dispositivo di filtrazione per la preparazione della sospensione a cella singola
Contatore automatico delle celle	Bio-Rad	1450102	Dispositivo utilizzato per contare le celle e determinare la vitalità
Estratto ipofisario bovino	Thermo Scientific	13028014	Integratore per mezzi cellulari epiteliali
Slide di conteggio delle celle	Bio-Rad	145-0011	Vettoni a doppia camera utilizzati per il conteggio delle cellule
Centrifuga	N/A	N/A	Le centrifughe da banco devono avere almeno una velocità di 500 g e una capacità di alloggio di tubi da 15 mL e 1,5 mL.
Collagene I	Millipore Sigma	08-115	Proteina della matrice extracellulare utilizzata per la formazione di idrogel
Collagenasi A	Sigma-Aldrich	11088793001	Enzima utilizzato per la dissociazione dei tessuti
Cryovials	Corning	976171	Fiale sterili per la conservazione criogenica di campioni
Recipienti di coltura (ad esempio, lamelle a camera di camera, piastre multipozzo)	Corning	354104 354108 3603	Piattaforme per la deposizione di idrogel e la coltura di organoidi.
Dimetilsolfossido	Millipore Sigma	317275	Crioprotettivo usato nel mezzo congelante
Dispase II	Roche	4942078001	Enzima usato per la dissociazione secondaria dei tessuti
DNasi I	Roche	10104159001	Enzima usato durante la dissociazione cellulare.
Siero bovino fetale	Gibco	10437	Integratore siero usato nei mezzi di lavaggio e neutralizzazione
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F2006	Componente proteica della matrice extracellulare
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	Integratore per mezzi cellulari epiteliali
Fattore di crescita epidermica umana	Sigma-Aldrich	E9644	Integratore per mezzi cellulari epiteliali
Idrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Integratore per mezzi cellulari epiteliali
Acido ialuronico	Millipore Sigma	385908	Componente della matrice extracellulare per la formulazione di idrogel
Hialuronidasi	Sigma-Aldrich	H3506	Enzima utilizzato per la dissociazione dei tessuti
Incubatore	Thermo Scientific	3598	Dispositivo utilizzato per l'incubazione in coltura tissutale
Insulina	Sigma-Aldrich	I9278	Integratore per mezzi cellulari epiteliali
Laminina	Gibco	23017-015	Componente proteica della matrice extracellulare
Mezzo basale epiteliale mammario	Thermo Scientific	M171500	Mezzo di crescita per cellule epiteliali
Tubi microcentrifughe (1,5 mL)	Thermo Scientific	3451	Tubi utilizzati per reazioni di piccolo volume
Rotatore orbitale	Thermo Scientific	400110	Rotatore utilizzato per la dispersione dei tessuti durante la dissociazione enzimatica
Pipetta P1000	Gilson	P1000	Dispositivo utilizzato per miscelare e trasferire volumi fino a 1.000 μ L
Penicillina-streptomicina	Thermo Scientific	15140122	Integratore antibiotico per substrati cellulari epiteliali
Soluzione salina tamponata con fosfato	Gibco	20012-027	Soluzione tampone usata per lavare e risciacquare
Bilanciamento di precisione	Mettler Toledo	ML303E	Bilancia utilizzata per la pesatura dei tessuti
Pipetta sierologica	Nunc	170356N	Pipetta utilizzata per il prelievo di cellule epiteliali non aderenti
Idrossido di sodio (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Reagente usato per la neutralizzazione del collagene
Bisturi sterili	Bard-Parker	372615	Strumenti utilizzati per la triturazione meccanica dei tessuti
Soluzione blu di tripano	Gibco	15250061	Colorante utilizzato per la valutazione della vitalità cellulare
Tripsina (0,25%)	Gibco	25200056	Reagente enzimatico usato per la dissociazione cellulare
Bagno d'acqua (37 & deg; C)	VWR	10LA	Dispositivo utilizzato per lo scongelamento controllato dei campioni