Un metodo definito a base di idrogel per generare organoidi mammari umani tridimensionali che riproducono la morfogenesi mammaria

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo definito a base di idrogel per generare organoidi mammari umani che riproducono caratteristiche chiave della morfogenesi mammaria in un sistema di coltura tridimensionale controllato.

Abstract

Lo sviluppo di sistemi modello umani fisiologicamente rilevanti che riproducano l'architettura tissutale e la dinamica dello stato cellulare rimane una sfida importante nello studio dello sviluppo del seno e degli eventi precoci nella carcinogenesi. Le colture bidimensionali convenzionali e molti sistemi tridimensionali non riescono a catturare l'organizzazione strutturale e i segnali microambientali che definiscono la ghiandola mammaria umana. Qui descriviamo un metodo riproducibile per generare organoidi mammari umani tridimensionali a partire da cellule epiteliali primarie incorporate in una matrice idrogel definita composta da collagene di tipo I, laminina, fibronectina e acido ialuronico. Questo sistema supporta la progressione delle singole cellule attraverso fasi chiave della morfogenesi mammaria, inclusa l'espansione dei progenitori, la modellazione epiteliale e la formazione di strutture terminali lobulari simili a unità, nonché l'emergere di un compartimento simile a mesenchima durante un periodo di coltura di 21 giorni. Forniamo un protocollo passo dopo passo per la preparazione dell'idrogel, la semina cellulare e le condizioni di coltura. Il metodo è compatibile con l'imaging ad alto contenuto e l'analisi quantitativa del numero di organoidi, della distribuzione delle dimensioni e della complessità architettonica. Questa piattaforma consente studi meccanicistici sulla plasticità epiteliale e sulle perturbazioni ambientali, fornendo un sistema scalabile e biologicamente rilevante per indagare i primi cambiamenti ai livelli tissutali associati al rischio di cancro al seno.

Introduzione

Comprendere lo sviluppo delle ghiandole mammarie umane e gli eventi precoci che predispongono i tessuti alla trasformazione maligna richiede sistemi sperimentali che riproducano fedelmente l'architettura tissutale, la gerarchia cellulare e la segnalazione microambientale. Sebbene le culture epiteliali bidimensionali abbiano fornito importanti intuizioni meccanicistiche, mancano del contesto strutturale necessario per modellare l'organizzazione epiteliale e la^{morfogenesi 1}. I sistemi di coltura tridimensionale esistenti, inclusi quelli basati su estratti di membrana basale, hanno fatto avanzare il campo ma rimangono limitati da composizioni variabili, controllo incompleto sui componenti della matrice extracellulare e supporto incoerente dell'architettura tissutale^{di ordine superiore 1}. Inoltre, molti sistemi organoidi basati su estratti di membrana basale sono vincolati dalla loro incapacità di supportare costantemente l'emergere di un'organizzazione simile a^{tessuto 1}. In particolare, molti sistemi si affidano a componenti stromali esogeni piuttosto che a favorire lo sviluppo endogeno di microambienti di supporto, limitando così la loro capacità di modellare le interazioni epiteliali–mesenchemi che sono centrali per lo sviluppo tissutale e le malattie. Queste limitazioni limitano lo studio riproducibile dei processi di sviluppo, della plasticità epiteliale e degli effetti delle perturbazioni ambientali o molecolari sull'organizzazione dei tessuti.

Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un modello tridimensionale di organoide umano tridimensionale definito a base di idrogel che consente alle cellule epiteliali primarie di generare strutture organizzate all'interno di una matrice extracellulare^definita 2,3,4,5,8. L'idrogel è composto da collagene di tipo I, laminina, fibronectina e acido ialuronico, componenti selezionati in base ai loro ruoli consolidati nello sviluppo delle ghiandole mammari e nella morfogenesi epiteliale. Queste molecole della matrice extracellulare coinvolgono recettori cellulari distinti, tra cui integrine, recettori del dominio discoidinale, CD44 e RHAMM, e sono note per regolare la polarità epiteliale, la morfogenesi ramificata, il mantenimento delle cellule staminali, la meccanotrasduzione e l'organizzazione dei tessuti nella ghiandola mammaria ^6,7. Studi precedenti che descrivevano questo sistema idrogel hanno dimostrato che l'incorporazione di questi componenti della matrice extracellulare ha migliorato notevolmente la morfogenesi ductal-lobulare e la maturazione epiteliale rispetto alle condizioni basate solo sul collagene o basate su^{Matrigel 3,8}. Inoltre, le proprietà fisiche di questa formulazione idrogel erano precedentemente caratterizzate dalla microscopia a forza atomica, dimostrando che l'idrogel composito a matrice extracellulare mostrava una rigidità inferiore e un aumento del gonfiore rispetto ai gel a base di collagene (modulo di Young: 256,7 ± 20,0 Pa contro 559,2 ± 204,0 Pa, rispettivamente), coerente con un ambiente matriciale più morbido e^{idratato 8}.

È importante sottolineare che questo modello supporta l'emergere di un compartimento simile a mesenchima che sorge accanto alle strutture epiteliali, fornendo supporto strutturale e di segnalazione endogeno che riflette più da vicino l'organizzazione tissutale^{nativa 3}. La rilevanza fisiologica di questo sistema idrogel è stata valutata tramite confronti diretti con colture organoidi convenzionali basate su Matrigel utilizzando sia analisi morfologiche che trascridemiche. Studi precedenti hanno dimostrato che le colture idrogel supportavano una formazione più organizzata del tessuto ductal-lobulare e una differenziazione multilineage rispetto alle colture basate su Matrigel, preservando al contempo la risposta^{ormonale 8}. Più recentemente, analisi integrate di sequenziamento RNA unicellulare che confrontano organoidi derivati dall'idrogel, organoidi coltivati in Matrigel e tessuto mammario umano primario hanno dimostrato che gli organoidi coltivati in idrogel riproducono più fedelmente la gerarchia epiteliale, la diversità cellulare e le interazioni epiteliali–mesenchimale presenti nel tessuto mammario umano^{nativo 3}. Al contrario, gli organoidi coltivati con Matrigel erano arricchiti per stati basale ibridi proliferattivi e privi di popolazioni simili a stromi, compatibili con l'autoassemblaggio epiteliale piuttosto che con un'organogenesi diretta.

Il protocollo qui descritto fornisce un metodo riproducibile e scalabile per generare organoidi a partire dal tessuto umano primario, con passaggi opzionali per la deplezione e la dissociazione dei fibroblasti verso singole cellule. Poiché questa piattaforma è compatibile con imaging live, imaging ad alto contenuto, analisi morfometrica quantitativa, tracciamento cellulare e studi di perturbazione genetica, può essere integrata con approcci a valle che valutano il numero di organoidi, la dimensione, l'architettura e la dinamica della crescita. Questa piattaforma fornisce quindi un sistema biologicamente rilevante per studiare lo sviluppo del seno umano, la plasticità epiteliale, le interazioni epiteliali-microambiente e le risposte a livello tissutale a perturbazioni dello sviluppo, molecolari o ambientali.

Una panoramica schematica del flusso di lavoro, inclusa la lavorazione dei tessuti, la preparazione dell'idrogel, la coltura organoide, la progressione dello sviluppo e le analisi a valle, è fornita nella Figura 1, mentre morfologie organoidi rappresentative generate tramite questa piattaforma sono mostrate nella Figura 2.

Figura 1. Panoramica del flusso di lavoro di generazione di organoidi a base di idrogel. (A) Diagramma di flusso che riassume il flusso di lavoro del protocollo, inclusa raccolta di tessuti, lavorazione dei tessuti, crioconservazione, recupero e preparazione opzionale delle cellule, preparazione di idrogel, coltura di organoidi, sviluppo di organoidi e applicazioni analitiche a valle. (B) Schema visivo che raffigura le principali fasi del protocollo di generazione organoide a base di idrogel, inclusi l'elaborazione e la preparazione dei tessuti, il recupero e la preparazione opzionale delle cellule, e la preparazione dell'idrogel e la semina degli organoidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Morfologie organoidi rappresentative generate nel sistema idrogel definito. Immagini rappresentative in campo chiaro di organoidi derivate da diversi tessuti umani coltivati nella matrice di idrogel definita. Gli organoidi mammari generati da singole cellule epiteliali derivate da mamoplastica di riduzione sono stati fotografiati al giorno 21 della coltura. Gli organoidi xenoinnesti derivati dal paziente generati da frammenti tumorali sono stati fotografiati al giorno 16 di coltura. Gli organoidi delle ghiandole salivare generati da frammenti epiteliali sono stati fotografiati al terzo giorno di coltura. Gli organoidi renali generati dai frammenti epiteliali sono stati fotografiati al giorno 17 di coltura. Barre della scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

I tessuti primari che altrimenti sarebbero stati scartati come rifiuti medici dopo l'intervento chirurgico sono stati prelevati in conformità con tutte le leggi pertinenti utilizzando protocolli approvati dai comitati di revisione istituzionale del Maine Medical Center e del Tufts Medical Center. Tutti i tessuti sono stati anonimizzati prima del trasferimento e non sono stati ricondotti a pazienti specifici. Per questo motivo, questa ricerca ha ottenuto lo status di esenzione dal Committee on the Use of Humans as Experimental Subjects presso il Massachusetts Institute of Technology e presso la Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Tutti i pazienti iscritti a questo studio hanno firmato un modulo di consenso informato accettando di partecipare allo studio e alla pubblicazione dei risultati.

1. Elaborazione e preparazione dei tessuti

NOTA: Eseguire tutte le procedure che coinvolgono tessuti umani in conformità con le linee guida istituzionali per la biosicurezza e le etiche. Consulta gli schemi del flusso di lavoro mostrati nelle Figure 1A e 1B per una panoramica visiva dei passaggi del protocollo e della preparazione degli organoidi prima di iniziare la procedura.

1. Prepara MEGM utilizzando un mezzo basale epiteliale mammario integrato con estratto di ipofisi bovina da 52 μg/mL, 10 ng/mL di fattore di crescita epidermica umana, 5 μg/mL di insulina, 500 ng/mL di idrocortisone, 1% (v/v) di GlutaMAX e 1% (v/v) di antibiotico-antimicotico (100X).
2. Prepara il mezzo di dissociazione aggiungendo 1,5 mg/mL di collagenasi A (conservata a −20°C) e 100 U/mL di ialuronidasi (conservata a 4°C) al mezzo epiteliale mammario (MEGM).
3. Ricevere tessuto mammario umano ottenuto da mastectomie profilattiche e mammoplastiche di riduzione entro 24 ore dall'escissione, non fissato in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e mantenuto a 4°C. Pesa il tessuto su un bilanciamento di precisione per determinare il peso totale del tessuto.
4. Metti il tessuto in un armadietto sterile per la biosicurezza. Trita meccanicamente il tessuto^{in 3–} 5 mm 3 frammenti usando bisturi sterili. Trasferire circa 2–3 g di tessuto tritato in un tubo conico da 15 mL. Aggiungi 10 mL di mezzo dissociativo a ogni tubo.
5. Incubare i tubi a 37°C su un rotatore orbitale a 8 giri al minuto per 12–18 ore per digerire enzimaticamente il tessuto. Si considera la digestione completa quando non rimangono grandi frammenti di tessuto e una sospensione omogenea di materiale frammentato uniformemente è visibile in tutto il mezzo.
6. Lascia sedimentare i frammenti epiteliali per gravità per 5 minuti. Confermare che non restino frammenti visibili sospesi nel mezzo e che sia presente un pellet distinto. Scartare con cura e scartare il soprannatante senza disturbare il pellet.
   NOTA: Il sovrantantante contiene cellule stromali e componenti della matrice, e può essere lavato e utilizzato o conservato per altri studi.
7. Risospendere il pellet in un mezzo di lavaggio da 10 mL composto dal 5% di siero bovino fetale (FBS) in PBS. Centrifuga a 250 × g per 5 minuti in una centrifuga a secchio oscillante a temperatura ambiente.
8. Ripeti il passaggio di lavaggio altre tre volte o finché il sovrantantante non è pulito e privo di detriti visibili.
9. Risospendere il pellet finale in un mezzo congelante composto dal 10% di dimetilsolfosdo (DMSO) in MEGM a un volume di 1 mL per grammo di peso tissutale iniziale.
   ATTENZIONE: Il DMSO è dannoso al contatto o all'inalazione. Utilizzare l'uso di dispositivi di protezione individuale adeguati e lavorare con un cappuccio di sicurezza chimica se richiesto dalle linee guida istituzionali.
10. Aliquota 1 mL della sospensione in ogni cryoviale. Posizionare i cryovials a −80°C in un contenitore congelante prima di conservarli a lungo termine in azoto liquido.
    NOTA: Questo passaggio rappresenta un punto di pausa. Conservare i campioni a −80°C prima di trasferirli in condizioni di conservazione a lungo termine.

2. Recupero e preparazione opzionale delle cellule

1. Scongelamento e recupero iniziale
   1. Rimuovere il tessuto criopriservato dalla conservazione a −80°C dopo il congelamento per almeno 24 ore, o dalla conservazione a lungo termine dell'azoto liquido. Immergi immediatamente il cryovial fino al tappo in un bagno d'acqua a 37°C e scongela rapidamente per 1 minuto per minimizzare la morte cellulare.
      NOTA: Agitare delicatamente il cryovial durante lo scongelamento per garantire un riscaldamento uniforme.
   2. Una volta completamente scongelato, trasferire immediatamente il contenuto del cryovial in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di MEGM. Centrifuga a 250 × g per 5 minuti.
2. Esaurimento opzionale dei fibroblasti
   NOTA: La deplezione dei fibroblasti tramite pre-placcatura è un passaggio opzionale di arricchimento utilizzato per ridurre le popolazioni stromali o fibroblastiche rapidamente aderenti quando si desidera una popolazione iniziale più arricchita epiteliale. Questo passaggio non è richiesto per la formazione dell'organoide e può essere adattato a seconda dell'obiettivo sperimentale.
   1. Risospendere il pellet con 10 mL di MEGM.
   2. Trasferire il tessuto sospeso in una ciotola di coltura cellulare da 10 cm. Incubare a 37°C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ per 90 minuti per consentire l'attacco dei fibroblasti.
      NOTA: Non disturbare la ciotola di coltura durante l'incubazione per garantire un'adegua efficiente ai fibroblasti.
   3. Raccogliere le cellule non aderenti contenenti il surnatante utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, inclinando delicatamente la tavola di coltura a circa 45°. Sciacquare delicatamente il piatto con 5 mL di PBS e unire il risciacquo con il surnadante raccolto.
   4. Centrifugare la sospensione combinata a 250 × g per 5 minuti per recuperare materiale arricchito epiteliale.
      NOTA: Le cellule che si sono attaccate alla piastra sono arricchite per i fibroblasti delle ghiandole mammarie e possono essere propagate separatamente aggiungendo un mezzo composto da DMEM + 10% FBS e antibiotici.
3. Dissociazione opzionale alle singole cellule
   1. Risospendere il pellet in 500 μL di soluzione enzimatica dissociativa preriscaldata (37°C) composta dallo 0,25% di tripsina. I reagenti di dissociazione alternativi possono richiedere ottimizzazione. Trasferire la sospensione su un tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Tritura il campione 20 volte usando una pipetta P1000 per favorire la dissociazione.
      ATTENZIONE: I reagenti enzimatici, dissociati, possono essere dannosi. Maneggiare l'uso di attrezzature di protezione personale adeguate ed evitare il contatto con la pelle o lo sguardo.
   2. Incubare il tubo a 37°C per 3-5 minuti. Dissociare meccanicamente il campione immediatamente dopo l'incubazione triturando 20 volte con una pipetta P1000.
   3. Aggiungi 1 mL di mezzo di lavaggio contenente siero per neutralizzare la reazione enzimatica. Centrifuga a 500 × g per 5 minuti.
   4. Risospendere il pellet in una soluzione dispasica da 300 μL (5 U/mL) e una soluzione di DNasi da 30 μL (1 mg/mL). Incubare a 37°C per 3–5 minuti.
   5. Dissocia meccanicamente il campione pipettando 15–20 volte. Aggiungere 700 μL di mezzo di lavaggio contenente siero alla sospensione.
   6. Filtra la sospensione della cella attraverso un filtro a 40 μm in un tubo pulito. Si può utilizzare un colino standard a celle da 40 μm o un colino a punta di pipetta Flowmi. I filtri Flowmi possono ridurre la perdita di campioni quando si lavora con numeri cellulari limitati.
   7. Determina il numero di cellule vitali usando l'esclusione blu di tripano. Mescolare 10 μL della sospensione cellulare con blu di tripano a un rapporto 1:1 e caricare 10 μL della miscela in una camera di conteggio cellulare o in un vetrione di conteggio. Determina la vitalità cellulare utilizzando un contatore cellulare automatico o un emocitometro.
   8. Centrifuga la sospensione a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   9. Risospendere la pellet cellulare nel MEGM alla concentrazione desiderata per la semina dell'idrogel.
      NOTA: Per gli esperimenti di semina a singola cellula, gli input tipici variano da circa 1.000 a 5.000 cellule per idrogel da 200 μL, a seconda dell'obiettivo sperimentale e delle caratteristiche del campione donatore. Le densità di semina più basse sono generalmente utilizzate per l'imaging dal vivo e studi di morfogenesi per facilitare il tracciamento dello sviluppo dei singoli organoidi, mentre densità più alte sono comunemente impiegate per analisi molecolari di endpoint, inclusa la raccolta di RNA e proteine.

3. Preparazione dell'idrogel e semina di organoidi

1. Preparazione delle scorte e calcoli di volume
   1. Mettere sulla ghiaccio la soluzione di laminina (1,18 mg/mL), la soluzione di acido ialuronico (1 mg/mL in acqua sterile), la soluzione di fibronectina (2 mg/mL in acqua sterile) e PBS 1× prima dell'uso. Conservare aliquote di laminina e fibronectina a −80°C e conservare la soluzione di acido ialuronico a 4°C. Scongelare lentamente i componenti congelati sul ghiaccio a 0°C–4°C prima dell'uso.
   2. Prepara una soluzione di integratore a matrice extracellulare al 25×. Per preparare 1 mL, si combinano 425 μL di laminina, 250 μL di acido ialuronico, 250 μL di fibronectina e 75 μL di PBS in un tubo mantenuto sul ghiaccio. Mescola delicatamente invertendo il tubo 3–4 volte. Conserva la soluzione a 4°C per un massimo di 1 mese.
   3. Determinare il volume e la composizione finale dell'idrogel desiderato prima della preparazione. Prepara almeno il 20% di volume in eccesso per compensare le perdite di materiale durante la pipettura e il trasferimento.
      NOTA: La formulazione idrogel consiste in collagene I, una concentrazione finale di 1× di integratori della matrice extracellulare (da uno stock al 25×) e 12,5% (v/v) di idrossido di sodio 0,1 N rispetto al volume di collagene I per neutralizzazione del pH e polimerizzazione.
      NOTA: Le concentrazioni finali di idrogel sono 1,7 mg/mL di collagene I, 20 μg/mL laminina, 20 μg/mL di fibronectina e 10 μg/mL di acido ialuronico.
   4. Calcola il volume richiesto di collagene I (_{V collagene}) utilizzando la seguente formula:
      
      Qui, C_finale  = 1,7 mg/mL, V_totale è il volume finale di idrogel desiderato, e C_stock è la concentrazione della soluzione di collagene. Usa concentrazioni di stock di collagene comprese tra 2 e 12 mg/mL.
      NOTA: La concentrazione di stock di collagene può variare tra i lotti. Concentrazioni più elevate aumentano la viscosità e devono essere pipettate lentamente.
   5. Calcola il volume di idrossido di sodio (V_NaOH) di 0,1 N utilizzando la seguente formula:
      V_NaOH = 0,125 x _{V collagene}
      Prepara una soluzione lavorativa a idrossido di sodio a 0,1 N diluendo 1 idrossido di sodio in acqua sterile.
   6. Calcola il volume del supplemento della matrice extracellulare (V_ES) usando la seguente formula:
      
   7. Calcola il volume rimanente da riempire con il substrato di crescita usando la seguente formula:
      _{Mezzo di crescita} V = _{V totale} - (V_collagene + V_NaOH + _{V ES} + _{Vcellule/tessuto} V)
      NOTA: Determinare il volume di cellule o frammenti di tessuto per ogni esperimento singolarmente. Utilizzare un intervallo tipico di 10–100 μL all'interno del volume consentito. Il conteggio preciso dei frammenti non viene effettuato perché la dimensione e la composizione dei frammenti variano sostanzialmente tra le preparazioni. Standardizzare la semina tramite la valutazione visiva dell'abbondanza e distribuzione dei frammenti.
2. Preparazione del Hydrogel Master Mix
   1. Posizionare collagene I, integratore di matrice extracellulare, idrossido di sodio (0,1 N) e mezzo di crescita sul ghiaccio a 0°C–4°C. Mantieni tutti i componenti a bassa temperatura per prevenire una polimerizzazione prematura.
   2. Aggiungi il volume calcolato di collagene I a un tubo microcentrifugo raffreddato.
   3. Aggiungi il volume calcolato del mezzo di crescita pre-raffreddato alla soluzione di collagene.
   4. Aggiungi il volume calcolato di 0,1 idrossido di sodio N per neutralizzare la soluzione.
      NOTA: L'ottimizzazione precedente ha stabilito che queste condizioni producono il pH del gel appropriato; pertanto, non è necessario un test di pH di routine della miscela di idrogel.
      NOTA: Esegui rapidamente tutti i passaggi successivi per prevenire la polimerizzazione prematura del collagene.
   5. Mescola la soluzione scuotendo vigorosamente il tubo a una velocità di circa una scuotita al secondo per almeno 6 scosse.
   6. Aggiungi il volume calcolato dell'integratore della matrice extracellulare alla miscela.
   7. Aggiungi il volume calcolato di singole cellule o frammenti di tessuto usando una pipetta P1000 o una punta a larga cane. Mescola immediatamente scuotendo come descritto nel Passaggio 3.2.5 e procedi immediatamente al passaggio successivo.
3. Deposizione di idrogel
   1. Pipetta la miscela di idrogel in vasi di coltura al volume desiderato per pozzo. Utilizzare 200 μL di idrogel per pozzo per le venature a camera a 4 pozzi, 100 μL per pozzo per le vetri a camera a 8 pozzi e 20 μL per pozzo per piastre da 96 pozzi.
   2. Distribuisci l'idrogel in un sottile pad sulla superficie quando usi i vetrini della camera. Posiziona la punta della pipetta sul bordo centrale superiore della camera e trascina la punta sulla superficie mentre dispensi il gel per creare un tampone uniforme. Per piastre a 96 pozzi, posizionare la punta della pipetta al centro del pozzo mantenendo il contatto con la superficie e dispensare il gel centralmente per mantenere una struttura a cupola. Evita di pipettare aria nel gel perché questo creerebbe bolle.
   3. Incubare i vasi di coltura a 37°C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ per 60 minuti per consentire la polimerizzazione completa.
      NOTA: Le condizioni di polimerizzazione descritte qui sono state ottimizzate per i formati di coltura utilizzati in questo studio. Possono essere necessari piccoli aggiustamenti nel tempo di polimerizzazione a seconda della geometria dei recipienti di coltura, del volume di idrogel e delle condizioni di incubazione.
4. Cultura e manutenzione
   1. Aggiungi MEGM preriscaldato in ogni pozzo. Regola il volume in base al formato culturale utilizzato.
   2. Stacca delicatamente l'idrogel dalla superficie della coltura usando una punta di pipetta per permettere al gel di galleggiare. Fai scorrere la punta della pipetta intorno al perimetro del gel e solleva delicatamente sotto l'idrogel polimerizzato per liberarlo dalla superficie.
   3. Sostituisci il MEGM due volte a settimana con un substrato fresco e preriscaldato. Mantenere le colture in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ per circa 3–4 settimane e interrompere le colture prima che si verifichi il collasso completo dell'idrogel. Identificare gli idrogel collassati dall'aspetto di strutture dense, opache, simili a plug, risultanti da un'estesa crescita cellulare all'interno del gel (vedi esempi rappresentativi nella Figura Supplementare 1).

Risultati

L'esecuzione con successo di questo protocollo porta alla formazione di strutture organoidi tridimensionali che mostrano una morfologia epiteliale organizzata e caratteristiche architettoniche specifiche per i tessuti. Gli organoidi iniziano a formarsi entro 3–7 giorni dalla semina e continuano a svilupparsi durante il periodo di coltivazione. La precedente caratterizzazione di questo sistema organoide idrogel ha dimostrato la formazione di organoidi riproducibili su più donatori umani p...

Discussione

Il protocollo descritto qui consente la generazione riproducibile di organoidi mammari umani tridimensionali all'interno di un microambiente idrogel definito che supporta caratteristiche chiave della morfogenesi^{mammaria 3}. Diversi passaggi sono fondamentali per il successo di questo metodo. Innanzitutto, il processamento tissutale e la dissociazione enzimatica devono essere controllati con attenzione per preservare la vitalità epiteliale minimizzando la sovradiges...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
15 mL conical tubes	VWR	89039-664	Tubi sterili per lavorazione dei tessuti e centrifugazione
40 μm cell strainer	VWR	732-2757	Dispositivo di filtrazione per la preparazione di sospensioni di cellule singole
40 μm cell strainer for low volumes	Bel-Art	136800040	Dispositivo di filtrazione per la preparazione di sospensioni di cellule singole
Automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Dispositivo utilizzato per contare le cellule e determinare la vitalità
Bovine pituitary extract	Thermo Scientific	13028014	Supplemento per i media delle cellule epiteliali
Cell counting slides	Bio-Rad	145-0011	Diapositive a doppia camera utilizzate per il conteggio delle cellule
Centrifuge	N/A	N/A	La centrifuga/le centrifughe da banco devono avere una capacità di velocità di almeno 500 x g e la possibilità di accogliere tubi da 15 mL e 1,5 mL.
Collagen I	Millipore Sigma	08-115	Proteina della matrice extracellulare utilizzata per la formazione dell'idrogel
Collagenase A	Sigma-Aldrich	11088793001	Enzima utilizzato per la dissociazione dei tessuti
Cryovials	Corning	976171	Fialette sterili per la conservazione criogenica dei campioni
Culture vessels (e.g., chamber slides, multiwell plates)	Corning	354104 354108 3603	Piastrelle per la deposizione dell'idrogel e la coltura degli organuli.
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	317275	Crioprotettore utilizzato nel mezzo di congelamento
Dispase II	Roche	4942078001	Enzima utilizzato per la dissociazione secondaria dei tessuti
DNase I	Roche	10104159001	Enzima utilizzato durante la dissociazione cellulare.
Fetal bovine serum	Gibco	10437	Supplemento di siero utilizzato nei mezzi di lavaggio e neutralizzazione
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006	Componente della matrice extracellulare
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	Supplemento per i media delle cellule epiteliali
Human epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	Supplemento per i media delle cellule epiteliali
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Supplemento per i media delle cellule epiteliali
Hyaluronic acid	Millipore Sigma	385908	Componente della matrice extracellulare per la formulazione dell'idrogel
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Enzima utilizzato per la dissociazione dei tessuti
Incubator	Thermo Scientific	3598	Dispositivo utilizzato per l'incubazione dei tessuti
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	Supplemento per i media delle cellule epiteliali
Laminin	Gibco	23017-015	Componente della matrice extracellulare
Mammary epithelial basal medium	Thermo Scientific	M171500	Mezzo di crescita per le cellule epiteliali
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Thermo Scientific	3451	Tubi utilizzati per reazioni a piccolo volume
Orbital rotator	Thermo Scientific	400110	Rotatore utilizzato per la dispersione dei tessuti durante la dissociazione enzimatica
P1000 pipette	Gilson	P1000	Dispositivo utilizzato per miscelare e trasferire volumi fino a 1.000 μL
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	15140122	Supplemento antibiotico per i media delle cellule epiteliali
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012-027	Soluzione tampone utilizzata per il lavaggio e il risciacquo
Precision balance	Mettler Toledo	ML303E	Bilancia utilizzata per il pesaggio dei tessuti
Serological pipette	Nunc	170356N	Pipetta utilizzata per la raccolta delle cellule epiteliali non aderenti
Sodium hydroxide (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Reattivo utilizzato per la neutralizzazione del collagene
Sterile scalpels	Bard-Parker	372615	Strumenti utilizzati per il taglio meccanico dei tessuti
Trypan blue solution	Gibco	15250061	Colorante utilizzato per la valutazione della vitalità cellulare
Trypsin (0.25%)	Gibco	25200056	Reattivo enzimatico utilizzato per la dissociazione cellulare
Water bath (37 °C)	VWR	10LA	Dispositivo utilizzato per il disgelo controllato dei campioni