Un metodo definito a base di idrogel per generare organoidi mammari umani tridimensionali che riproducono la morfogenesi mammaria

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo definito a base di idrogel per generare organoidi mammari umani che riproducono caratteristiche chiave della morfogenesi mammaria in un sistema di coltura tridimensionale controllato.

Abstract

Lo sviluppo di sistemi modello umani fisiologicamente rilevanti che riproducano l'architettura tissutale e la dinamica dello stato cellulare rimane una sfida importante nello studio dello sviluppo del seno e degli eventi precoci nella carcinogenesi. Le colture bidimensionali convenzionali e molti sistemi tridimensionali non riescono a catturare l'organizzazione strutturale e i segnali microambientali che definiscono la ghiandola mammaria umana. Qui descriviamo un metodo riproducibile per generare organoidi mammari umani tridimensionali a partire da cellule epiteliali primarie incorporate in una matrice idrogel definita composta da collagene di tipo I, laminina, fibronectina e acido ialuronico. Questo sistema supporta la progressione delle singole cellule attraverso fasi chiave della morfogenesi mammaria, inclusa l'espansione dei progenitori, la modellazione epiteliale e la formazione di strutture terminali lobulari simili a unità, nonché l'emergere di un compartimento simile a mesenchima durante un periodo di coltura di 21 giorni. Forniamo un protocollo passo dopo passo per la preparazione dell'idrogel, la semina cellulare e le condizioni di coltura. Il metodo è compatibile con l'imaging ad alto contenuto e l'analisi quantitativa del numero di organoidi, della distribuzione delle dimensioni e della complessità architettonica. Questa piattaforma consente studi meccanicistici sulla plasticità epiteliale e sulle perturbazioni ambientali, fornendo un sistema scalabile e biologicamente rilevante per indagare i primi cambiamenti ai livelli tissutali associati al rischio di cancro al seno.

Introduzione

Comprendere lo sviluppo delle ghiandole mammarie umane e gli eventi precoci che predispongono i tessuti alla trasformazione maligna richiede sistemi sperimentali che riproducano fedelmente l'architettura tissutale, la gerarchia cellulare e la segnalazione microambientale. Sebbene le culture epiteliali bidimensionali abbiano fornito importanti intuizioni meccanicistiche, mancano del contesto strutturale necessario per modellare l'organizzazione epiteliale e la^{morfogenesi 1}. I sistemi di coltura tridimensionale esistenti, inclusi quelli basati su estratti di membrana basale, hanno fatto avanzare il campo ma riman....

Protocollo

I tessuti primari che altrimenti sarebbero stati scartati come rifiuti medici dopo l'intervento chirurgico sono stati prelevati in conformità con tutte le leggi pertinenti utilizzando protocolli approvati dai comitati di revisione istituzionale del Maine Medical Center e del Tufts Medical Center. Tutti i tessuti sono stati anonimizzati prima del trasferimento e non sono stati ricondotti a pazienti specifici. Per questo motivo, questa ricerca ha ottenuto lo status di esenzione dal Committee on the Use of Humans as Experimental Subjects presso il Massachusetts Institute of Technology e presso la Tufts University Health Sciences (IRB #13....

Risultati

L'esecuzione con successo di questo protocollo porta alla formazione di strutture organoidi tridimensionali che mostrano una morfologia epiteliale organizzata e caratteristiche architettoniche specifiche per i tessuti. Gli organoidi iniziano a formarsi entro 3–7 giorni dalla semina e continuano a svilupparsi durante il periodo di coltivazione. La precedente caratterizzazione di questo sistema organoide idrogel ha dimostrato la formazione di organoidi riproducibili su più donatori umani p.......

Discussione

Il protocollo descritto qui consente la generazione riproducibile di organoidi mammari umani tridimensionali all'interno di un microambiente idrogel definito che supporta caratteristiche chiave della morfogenesi^{mammaria 3}. Diversi passaggi sono fondamentali per il successo di questo metodo. Innanzitutto, il processamento tissutale e la dissociazione enzimatica devono essere controllati con attenzione per preservare la vitalità epiteliale minimizzando la sovradiges.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
15 mL conical tubes	VWR	89039-664	Tubi sterili per lavorazione dei tessuti e centrifugazione
40 μm cell strainer	VWR	732-2757	Dispositivo di filtrazione per la preparazione di sospensioni di cellule singole
40 μm cell strainer for low volumes	Bel-Art	136800040	Dispositivo di filtrazione per la preparazione di sospensioni di cellule singole
Automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Dispositivo utilizzato per contare le cellule e determinare la vitalità
Bovine pituitary extract	Thermo Scientific	13028014	Supplemento per i media delle cellule epiteliali
Cell counting slides	Bio-Rad	145-0011	Diapositive a doppia camera utilizzate per il conteggio delle cellule
Centrifuge	N/A	N/A	La centrifuga/le centrifughe da banco devono avere una capacità di velocità di almeno 500 x g e la possibilità di accogliere tubi da 15 mL e 1,5 mL.
Collagen I	Millipore Sigma	08-115	Proteina della matrice extracellulare utilizzata per la formazione dell'idrogel
Collagenase A	Sigma-Aldrich	11088793001	Enzima utilizzato per la dissociazione dei tessuti
Cryovials	Corning	976171	Fialette sterili per la conservazione criogenica dei campioni
Culture vessels (e.g., chamber slides, multiwell plates)	Corning	354104 354108 3603	Piastrelle per la deposizione dell'idrogel e la coltura degli organuli.
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	317275	Crioprotettore utilizzato nel mezzo di congelamento
Dispase II	Roche	4942078001	Enzima utilizzato per la dissociazione secondaria dei tessuti
DNase I	Roche	10104159001	Enzima utilizzato durante la dissociazione cellulare.
Fetal bovine serum	Gibco	10437	Supplemento di siero utilizzato nei mezzi di lavaggio e neutralizzazione
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006	Componente della matrice extracellulare
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	Supplemento per i media delle cellule epiteliali
Human epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	Supplemento per i media delle cellule epiteliali
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Supplemento per i media delle cellule epiteliali
Hyaluronic acid	Millipore Sigma	385908	Componente della matrice extracellulare per la formulazione dell'idrogel
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Enzima utilizzato per la dissociazione dei tessuti
Incubator	Thermo Scientific	3598	Dispositivo utilizzato per l'incubazione dei tessuti
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	Supplemento per i media delle cellule epiteliali
Laminin	Gibco	23017-015	Componente della matrice extracellulare
Mammary epithelial basal medium	Thermo Scientific	M171500	Mezzo di crescita per le cellule epiteliali
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Thermo Scientific	3451	Tubi utilizzati per reazioni a piccolo volume
Orbital rotator	Thermo Scientific	400110	Rotatore utilizzato per la dispersione dei tessuti durante la dissociazione enzimatica
P1000 pipette	Gilson	P1000	Dispositivo utilizzato per miscelare e trasferire volumi fino a 1.000 μL
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	15140122	Supplemento antibiotico per i media delle cellule epiteliali
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012-027	Soluzione tampone utilizzata per il lavaggio e il risciacquo
Precision balance	Mettler Toledo	ML303E	Bilancia utilizzata per il pesaggio dei tessuti
Serological pipette	Nunc	170356N	Pipetta utilizzata per la raccolta delle cellule epiteliali non aderenti
Sodium hydroxide (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Reattivo utilizzato per la neutralizzazione del collagene
Sterile scalpels	Bard-Parker	372615	Strumenti utilizzati per il taglio meccanico dei tessuti
Trypan blue solution	Gibco	15250061	Colorante utilizzato per la valutazione della vitalità cellulare
Trypsin (0.25%)	Gibco	25200056	Reattivo enzimatico utilizzato per la dissociazione cellulare
Water bath (37 °C)	VWR	10LA	Dispositivo utilizzato per il disgelo controllato dei campioni