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Articolo metodologico

Saggio ELISpot per la quantificazione delle cellule secernenti anticorpi totali e antigeno-specifiche nel sangue e nel midollo osseo di macachi rhesus immunizzati

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DOI:

10.3791/71836

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21 agosto 2026

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1Department of Comparative Medicine, Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas, 2New Iberia Research Center, University of Louisiana at Lafayette, 3Department of Immunology and Microbiology, Scripps Research Institute

In questo articolo

Sommario

L'ELISpot per linfociti B è un metodo validato per quantificare l'entità e la durata delle cellule plasmatiche a lunga vita specifiche per l'antigene IgG, IgM e IgA, nonché delle cellule secernenti anticorpi (ASC) totali, sia nel sangue (che riflette i plasmablasti a vita breve dopo la vaccinazione) sia nelle ASC midollari più durature.

Abstract

La valutazione di nuovi antigeni vaccinali e adjuvanti si basa tradizionalmente sulla misurazione dei titoli anticorpali, che richiedono tempo per svilupparsi dopo la vaccinazione. La quantificazione delle cellule secernenti anticorpi (ASCs) dopo immunizzazioni primarie e di richiamo fornisce una misura più precoce e meccanicamente informativa dell'immunità umorale indotta dal vaccino, consentendo l'ottimizzazione delle formulazioni vaccinali e delle strategie di immunizzazione. Qui viene descritto un protocollo per il conteggio delle ASCs ottenute da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMCs) e da cellule del midollo osseo (BM) di macachi rhesus; questi ultimi rappresentano un modello preclinico fondamentale nella ricerca sui vaccini contro l'HIV. Questo saggio immunoenzimatico su membrana (ELISpot) permette la quantificazione sia delle ASCs specifiche per l'antigene sia delle ASCs totali di IgG, IgM e IgA, misurandone le frequenze assolute e relative. Nel sangue periferico, il saggio rileva il picco della risposta delle plasmablaste successivamente alla vaccinazione, mentre nel midollo osseo permette di osservare l'accumulo di plasmacellule specifiche per l'antigene appartenenti a diversi isotipi, valutando così la durata delle ASCs a lunga vita. Questo protocollo offre un approccio solido e riproducibile per valutare combinazioni di immunogeni e adjuvanti negli studi preclinici sui vaccini, fornendo dati preziosi per sostenere la transizione di candidati vaccinali promettenti allo sviluppo clinico.

Introduzione

Le cellule secernenti anticorpi (ASC) sono componenti chiave dell'immunità adattativa e comprendono sia plasmablasti di breve durata, generati rapidamente dopo la vaccinazione, sia plasmacellule longeve, responsabili della produzione sostenuta di anticorpi. I plasmablasti sono rilevabili in modo transitorio nel sangue periferico e negli organi linfoidi secondari, raggiungendo frequenze di picco in tempi definiti dopo la vaccinazione, che variano a seconda della formulazione del vaccino e della specie ospite (tipicamente giorni 4-5 nei macachi rhesus e circa giorno 7 nell'uomo). Al contrario, le plasmacellule mature sono longeve e risiedono principalmente nei tessuti linfoidi secondari e nel midollo osseo (MO). Un vaccino efficace dovrebbe indurre robuste risposte immunitarie umorali e mediate da cellule. La misurazione delle risposte di richiamo, riflesse dalla rapida espansione dei plasmablasti nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dopo una vaccinazione di richiamo, fornisce informazioni preziose sull'entità della risposta immunitaria indotta dal vaccino. L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire un metodo solido per quantificare le risposte precoci dei plasmablasti e delle plasmacellule longeve dopo una vaccinazione specifica per Env nei macachi rhesus.

In un saggio enzyme-linked immunospot (ELISpot), le ASC vengono coltivate in piastre a 96 pozzetti con fondo in membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF) o in estere di cellulosa mista (MCE), rivestite con antigene (Ag), consentendo alle cellule vitali di secernere proteine che vengono catturate direttamente sulla superficie della membrana. Le proteine catturate vengono successivamente rilevate mediante anticorpi in un formato classico di saggio immunoistochimico a sandwich. Nei saggi cromogenici ELISpot, le macchie si formano attraverso la conversione del substrato 3-ammino-9-etilcarbazolo (AEC) da parte della perossidasi del rafano (HRP) in un precipitato colorato insolubile, permettendo la visualizzazione e il conteggio delle singole ASC. L'ELISpot offre diversi vantaggi importanti, tra cui la capacità di rilevare risposte specifiche per l'antigene ex vivo, una valutazione funzionale altamente sensibile delle singole cellule immunitarie e un monitoraggio quantitativo delle risposte immunitarie dei linfociti T e B sia in studi preclinici che clinici1,2,3.

In questo studio viene descritto un protocollo ELISpot per linfociti B finalizzato alla quantificazione di cellule secernenti anticorpi (ASC) IgG, IgM e IgA totali e specifiche per antigene, isolate da PBMC e da cellule del  m.o. di macachi rhesus. Il protocollo illustra tutte le fasi critiche, inclusi rivestimento della piastra, bloccaggio, semina cellulare, sviluppo del saggio, enumerazione delle macchie e analisi dei dati, al fine di caratterizzare la cinetica delle risposte di plasmablasti e cellule plasmatiche totali e specifiche per Env. Questo metodo fornisce un approccio riproducibile per valutare e confrontare l'immunogenicità di diverse formulazioni di antigeni e adiuvanti in studi preclinici sui vaccini, supportando l'ottimizzazione delle strategie vaccinali ai fini della successiva traduzione clinica.

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Protocollo

I macachi rhesus utilizzati in questo protocollo provenivano da colonie libere da agenti patogeni specifici (SPF) del New Iberia Research Center ed erano ospitati presso il Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, dell'Università del Texas MD Anderson Cancer Center. La cura degli animali e tutte le procedure sperimentali erano conformi alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio ed erano state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas MD Anderson Cancer Center (Protocollo #2616RN00).

Questo protocollo rappresenta un'ottimizzazione della tecnica descritta in precedenti studi preclinici di immunizzazione4,5,6,7, sviluppata per rilevare le risposte delle cellule produttrici di anticorpi (ASC). Il protocollo riportato di seguito descrive la procedura ELISpot utilizzando PBMC e preparazioni cellulari di MO fresche provenienti da macachi rhesus coinvolti in un protocollo sperimentale di vaccinazione contro l'HIV.

NOTA: eseguire tutte le procedure delle Sezioni 1–4 all'interno di una cappa biologica certificata di Classe II utilizzando tecniche asettiche. Utilizzare pipette multicanale ogni volta che possibile.

1. Preparazione delle piastre ELISpot

  1. Rivestire le piastre ELISpot
    1. Rivestire le piastre per immunoglobuline totali (Ig) 1 e 3 con 100 µL/pozzetto di 5 µg/mL di anticorpo caprino anti-scimmia IgG + IgM + IgA non coniugato, diluito in DPBS sterile. Incubare le piastre a 4 °C per almeno 8 h, preferibilmente durante la notte (Figura 1A,C).
    2. Rivestire le piastre per anticorpi specifici per l'antigene 2 e 4 con 100 µL/pozzetto di lectina di Galanthus nivalis (GNL) a 20 µg/mL, diluita in DPBS. Incubare le piastre a 4 °C per almeno 8 h, preferibilmente durante la notte (Figura 1B,D).
    3. Conservare le piastre rivestite a 4 °C fino all'uso.
  2. Lavare e bloccare le piastre per immunoglobuline totali
    1. Rimuovere la soluzione di rivestimento dalle piastre 1 e 3 capovolgendo rapidamente ciascuna piastra sopra un contenitore per rifiuti. Battere con decisione la piastra capovolta sulla carta assorbente per rimuovere il liquido residuo.
    2. Lavare ogni piastra due volte con 200 µL/pozzetto di PBS contenente 0,05% di Tween 20. Successivamente lavare le piastre due volte con 200 µL/pozzetto di DPBS per rimuovere il detergente residuo.
      NOTA: Il Tween 20 è citotossico. Rimuoverlo completamente prima di seminare le cellule.
    3. Aggiungere 200 µL/pozzetto di RPMI-10 in ogni pozzetto. Incubare le piastre per 2 h a 37 °C in un incubatore umidificato.
  3. Lavare e bloccare le piastre per anticorpi specifici per l'antigene
    1. Rimuovere la soluzione di rivestimento GNL dalle piastre 2 e 4 capovolgendo rapidamente ciascuna piastra sopra un contenitore per rifiuti. Battere con decisione le piastre capovolte sulla carta assorbente per rimuovere il liquido residuo.
    2. Lavare ogni piastra quattro volte con 200 µL/pozzetto di DPBS.
      NOTA: Non utilizzare PBS contenente Tween 20 per le piastre rivestite con GNL.
    3. Aggiungere 200 µL/pozzetto di RPMI-10 in ogni pozzetto. Incubare le piastre per 2 h a 37 °C in un incubatore umidificato.
    4. Eliminare la soluzione di bloccaggio. Lavare ogni piastra quattro volte con 200 µL/pozzetto di DPBS.
    5. Aggiungere 100 µL/pozzetto di antigene CH505 SOSIP a una concentrazione finale di 5 µg/mL. Incubare le piastre per 2 h a 37 °C.
    6. Eliminare la soluzione antigene e lavare ogni piastra quattro volte con DPBS sterile.
      NOTA: Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare il DPBS nei pozzetti per evitare che la membrana MCE si secchi prima della semina delle cellule.

2. Preparazione dei campioni: isolamento di PBMC e cellule mononucleate del midollo osseo

  1. Isolare le PBMC dal sangue intero
    1. Centrifugare i tubi di sangue con EDTA da 10 mL a 450 x g per 20 min a temperatura ambiente senza applicare il freno.
    2. Rimuovere il plasma e aggiungere 4 mL di DPBS senza Ca2+ e Mg2+. Mescolare delicatamente utilizzando una pipetta siringa da 10 mL.
    3. Stratificare con attenzione il sangue diluito su 4 mL di Ficoll in un tubo da centrifuga da 15 mL. Centrifugare a 800 x g per 30 min a temperatura ambiente con accelerazione e decelerazione lente.
    4. Trasferire il buffy coat contenente le cellule mononucleate del sangue periferico in un nuovo tubo da 15 mL. Aggiungere 8–10 mL di DPBS e centrifugare a 450 x g per 10 min a temperatura ambiente.
    5. Eliminare il soprannatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare.
    6. Aggiungere 2 mL di buffer di lisi di cloruro di ammonio potassico (ACK) alla sospensione cellulare. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
      ATTENZIONE: Non superare il periodo di incubazione di 5 min, poiché un'esposizione prolungata al buffer di lisi ACK riduce la vitalità cellulare.
    7. Interrompere la lisi degli eritrociti aggiungendo 10 mL di DPBS contenente il 2% di siero bovino fetale (FBS). Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 min a temperatura ambiente.
    8. Eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in RPMI-10.
    9. Contare le PBMC utilizzando un metodo di conteggio cellulare appropriato e verificare che la vitalità sia >90%, ad esempio mediante colorazione con blu di tripano.
    10. Regolare un'aliquote a 5 × 106 cellule/mL per saggi ELISpot specifici per antigene. Regolare una seconda aliquote a 1 × 106 cellule/mL per saggi ELISpot per immunoglobuline totali.
  2. Isolare le cellule mononucleate del midollo osseo
    1. Posizionare un filtro cellulare da 70 µm in un tubo da centrifuga da 50 mL. Inumidire preventivamente il filtro con 1 mL di DPBS.
    2. Aggiungere 4 mL di DPBS a 1 mL di aspirato midollare. Mescolare accuratamente utilizzando una pipetta siringa.
    3. Filtrare la sospensione midollare attraverso il filtro cellulare da 70 µm. Risciacquare il filtro con 2 mL di DPBS prima di scartarlo.
    4. Stratificare la sospensione filtrata su 4 mL di Ficoll in un tubo da centrifuga da 15 mL. Centrifugare a 800 x g per 30 min a temperatura ambiente con accelerazione e decelerazione lente.
    5. Trasferire lo strato di cellule mononucleate in un nuovo tubo da 15 mL. Aggiungere 8–10 mL di DPBS e centrifugare a 450 x g per 10 min a temperatura ambiente.
    6. Eliminare il soprannatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare.
    7. Aggiungere 2 mL di buffer di lisi ACK alla sospensione cellulare. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
      ATTENZIONE: Non superare il tempo di lisi raccomandato per preservare la vitalità cellulare.
    8. Interrompere la lisi degli eritrociti aggiungendo 10 mL di DPBS contenente il 2% di FBS. Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 min a temperatura ambiente.
    9. Eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in RPMI-10.
    10. Contare le cellule mononucleate del midollo osseo utilizzando un metodo di conteggio cellulare appropriato e verificare che la vitalità sia >90%, ad esempio mediante colorazione con blu di tripano.
    11. Regolare un'aliquote a 5 × 106 cellule/mL per saggi ELISpot specifici per antigene. Regolare una seconda aliquote a 1 × 106 cellule/mL per saggi ELISpot per immunoglobuline totali.

3. Semina e incubazione delle cellule

  1. Sezionare le piastre per immunoglobuline totali
    1. Rimuovere il mezzo di blocco dalle piastre 1 e 3 capovolgendo rapidamente ciascuna piastra sopra un contenitore per rifiuti. Battere con decisione le piastre capovolte sulla carta assorbente per rimuovere il mezzo residuo.
    2. Aggiungere 100 µL di RPMI-10 in ogni pozzetto della prima riga e 133 µL di RPMI-10 in ogni pozzetto delle seconda e terza riga. Queste operazioni vengono eseguite in duplicati tecnici.
    3. Aggiungere 100 µL di sospensione di PBMC (1 × 106 cellule/mL) nel primo pozzetto di ogni colonna della piastra 1. Disporre i campioni secondo lo schema della piastra [ad esempio, pozzetti A1–A6 per macaco reso 1 (RM1) e A7–A12 per macaco reso 2 (RM2)].
    4. Aggiungere 100 µL di sospensione di cellule del midollo osseo (1 × 106 cellule/mL) nel primo pozzetto di ogni colonna della piastra 3. Disporre i campioni secondo lo schema della piastra.
    5. Preparare diluizioni seriali tripliche trasferendo 67 µL da un pozzetto al successivo, mescolando accuratamente dopo ogni trasferimento. Proseguire la diluizione seriale nei pozzetti designati, quindi scartare gli ultimi 67 µL per mantenere un volume finale di 133 µL per pozzetto.
    6. Incubare le piastre per tutta la notte a 37 °C in un incubatore umidificato contenente 5% CO2.
      ​NOTA: Evitare di spostare o disturbare le piastre durante l'incubazione per prevenire la formazione di doppie macchie.
  2. Sezionare le piastre per anticorpi specifici per l'antigene
    1. Rimuovere il DPBS dalle piastre 2 e 4 capovolgendo rapidamente ciascuna piastra sopra un contenitore per rifiuti. Battere con decisione le piastre capovolte sulla carta assorbente per rimuovere il tampone residuo.
    2. Aggiungere 100 µL di RPMI-10 in ogni pozzetto della prima riga e 133 µL di RPMI-10 in ogni pozzetto delle seconda e terza riga.
    3. Aggiungere 100 µL di sospensione di PBMC (5 × 106 cellule/mL) nel primo pozzetto di ogni colonna della piastra 2. Aggiungere i campioni secondo lo schema della piastra.
    4. Aggiungere 100 µL di sospensione di cellule del midollo osseo (5 × 106 cellule/mL) nel primo pozzetto di ogni colonna della piastra 4. Aggiungere i campioni secondo lo schema della piastra.
    5. Preparare diluizioni seriali tripliche trasferendo 67 µL da un pozzetto al successivo, mescolando accuratamente dopo ogni trasferimento. Proseguire la diluizione seriale nei pozzetti designati, quindi scartare gli ultimi 67 µL per mantenere un volume finale di 133 µL per pozzetto.
    6. Incubare le piastre per tutta la notte a 37 °C in un incubatore umidificato contenente 5% CO2.
      NOTA: Evitare di disturbare l'incubatore durante l'incubazione, poiché le vibrazioni possono causare doppie macchie o artefatti a coda di cometa.

4. Elaborare le piastre ELISpot

  1. Elaborare le piastre per immunoglobuline totali
    1. Rimuovere le piastre dall'incubatore dopo circa 18 h di incubazione.
    2. Eliminare le cellule e il mezzo di coltura capovolgendo rapidamente ogni piastra su un contenitore per rifiuti contenente candeggina al 10%. Battere con decisione le piastre capovolte sulla carta assorbente per rimuovere il liquido residuo.
      NOTA: Eseguire i passaggi successivi di elaborazione in condizioni non sterili.
    3. Lavare ogni piastra quattro volte con 200 µL/pozzetto di DPBS contenente Tween 20 allo 0,05%.
      NOTA: Lasciare il tampone dell'ultimo lavaggio nei pozzetti per evitare che le membrane si secchino.
    4. In alternativa, lavare le piastre utilizzando un lavatore automatico di micropiastre quando si elaborano grandi quantità di piastre.
    5. Preparare la soluzione dell'anticorpo di rilevamento diluendo gli anticorpi biotinilati anti-scimmia IgG e IgM 1:1.000 e l'anticorpo biotinilato anti-scimmia IgA 1:500 in DPBS contenente Tween 20 allo 0,05% e FBS all'1%.
    6. Rimuovere il tampone dell'ultimo lavaggio battendo le piastre sulla carta assorbente. Aggiungere 100 µL/pozzetto di anticorpo anti-IgG diluito nelle colonne 1 e 2, 7 e 8, anticorpo anti-IgM nelle colonne 3 e 4, 9 e 10, e anticorpo anti-IgA nelle colonne 5 e 6, 11 e 12.
      NOTA: Elaborare una piastra alla volta per evitare che le membrane si secchino.
    7. Incubare le piastre per 2 h a temperatura ambiente.
    8. Eliminare la soluzione dell'anticorpo di rilevamento e lavare le piastre quattro volte con DPBS contenente Tween 20 allo 0,05%.
    9. Preparare il coniugato enzimatico diluendo HRP-avidina 1:1.000 in DPBS contenente Tween 20 allo 0,05% e FBS all'1%.
    10. Aggiungere 100 µL/pozzetto di HRP-avidina diluita in ogni pozzetto. Incubare le piastre per 2 h a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
    11. Eliminare la soluzione di HRP-avidina e lavare le piastre quattro volte con DPBS contenente Tween-20 allo 0,05%.
      ​NOTA: Lasciare il tampone dell'ultimo lavaggio nei pozzetti fino al completamento dello sviluppo del substrato.
  2. Elaborare le piastre specifiche per l'antigene
    NOTA: La procedura è simile a quella utilizzata per le piastre per immunoglobuline totali. Tuttavia, eseguire tutti i passaggi di lavaggio usando DPBS senza Tween 20 per preservare il rivestimento di GNL.
    1. Rimuovere le piastre dall'incubatore dopo circa 18 h di incubazione.
    2. Eliminare le cellule e il mezzo di coltura capovolgendo rapidamente ogni piastra su un contenitore per rifiuti contenente candeggina al 10%. Battere con decisione le piastre capovolte sulla carta assorbente per rimuovere il liquido residuo.
      NOTA: Eseguire i passaggi successivi di elaborazione in condizioni non sterili.
    3. Lavare ogni piastra quattro volte con 200 µL/pozzetto di DPBS.
      NOTA: Lasciare il tampone dell'ultimo lavaggio nei pozzetti per evitare che le membrane si secchino.
    4. Preparare la soluzione dell'anticorpo di rilevamento diluendo gli anticorpi biotinilati anti-scimmia IgG e IgM 1:1.000 e l'anticorpo biotinilato anti-scimmia IgA 1:500 in DPBS contenente FBS all'1%.
    5. Rimuovere il tampone dell'ultimo lavaggio battendo le piastre sulla carta assorbente. Aggiungere 100 µL/pozzetto di anticorpo anti-IgG diluito nelle colonne 1 e 2, 7 e 8, anticorpo anti-IgM nelle colonne 3 e 4, 9 e 10, e anticorpo anti-IgA nelle colonne 5 e 6, 11 e 12.
      NOTA: Elaborare una piastra alla volta per evitare che le membrane si secchino.
    6. Incubare le piastre per 2 h a temperatura ambiente.
    7. Eliminare la soluzione dell'anticorpo di rilevamento e lavare le piastre quattro volte con 200 µL/pozzetto di DPBS.
    8. Preparare il coniugato enzimatico diluendo HRP-avidina 1:1.000 in DPBS contenente FBS all'1%.
    9. Aggiungere 100 µL/pozzetto di HRP-avidina diluita in ogni pozzetto. Incubare le piastre per 2 h a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
    10. Eliminare la soluzione di HRP-avidina e lavare le piastre quattro volte con 200 µL/pozzetto di DPBS.
      NOTA: Lasciare il tampone dell'ultimo lavaggio nei pozzetti fino al completamento dello sviluppo del substrato.
  3. Eseguire il lavaggio automatico (facoltativo)
    1. Priming del lavatore automatico di micropiastre con DPBS secondo le istruzioni del produttore.
    2. Selezionare il programma di lavaggio ELISpot predefinito ed eseguire tutti i passaggi di lavaggio usando DPBS.
      NOTA: Utilizzare DPBS per tutti i lavaggi automatici per evitare di dover ripetutamente effettuare il priming dello strumento con diversi tamponi di lavaggio.
    3. Utilizzare le impostazioni del lavatore elencate in Tabella 1 per il lavatore di micropiastre.

5. Rilevamento

  1. Preparare la soluzione del substrato
    1. Preparare immediatamente prima dell'uso il substrato lavorativo AEC aggiungendo una goccia di soluzione cromogenica a ogni 1 mL di soluzione del substrato. Mescolare accuratamente mediante vortex.
      NOTA: Preparare circa 40 mL di substrato lavorativo per quattro piastre a 96 pozzetti.
  2. Sviluppare le piastre ELISpot a temperatura ambiente
    1. Processare una piastra alla volta. Eliminare il tampone di lavaggio finale e aggiungere immediatamente 100 µL/pozzetto di substrato lavorativo AEC.
    2. Monitorare visivamente lo sviluppo delle macchie finché non appaiono macchie rosse distinte, tipicamente entro 2–4 min.
      ATTENZIONE: Non sviluppare eccessivamente le piastre, poiché uno sviluppo prolungato aumenta la colorazione di fondo e compromette la risoluzione delle macchie.
    3. Interrompere la reazione enzimatica lavando accuratamente la piastra sotto acqua corrente del rubinetto.
    4. Lavare la piastra da quattro a cinque volte con acqua del rubinetto. Rimuovere l'acqua in eccesso utilizzando carta assorbente.
    5. Rimuovere il fondo della piastra e lasciare asciugare le piastre all'aria per circa 24 h prima di contare le macchie.
      NOTA: Interrompere la reazione non appena le macchie diventano visibili nei pozzetti contenenti le concentrazioni cellulari più elevate per evitare uno sviluppo eccessivo.
    6. Ripetere i passaggi 5.2.1–5.2.5 per ciascuna piastra rimanente.

6. Quantificazione delle macchie

  1. Acquisire le immagini ELISpot
    1. Scansionare ogni piastra utilizzando un lettore ELISpot dotato di software per l'acquisizione delle immagini.
    2. Selezionare il modello di piastra appropriato, definire le pozzette da analizzare e acquisire le immagini seguendo le istruzioni del software.
    3. Salvare i dati grezzi ed esportare le immagini della piastra in formato TIFF per scopi di archiviazione.
  2. Contare le cellule secernenti anticorpi
    1. Esaminare i conteggi automatici delle macchie per ogni pozzetta.
    2. Verificare manualmente ogni pozzetta per identificare macchie unite erroneamente o divise in modo errato. Contrassegnare manualmente le singole macchie quando necessario per ottenere conteggi accurati.
      NOTA: Si raccomanda la verifica manuale poiché le macchie grandi possono essere conteggiate più volte dal software di analisi automatica.
    3. Registrare i conteggi delle macchie insieme ai corrispondenti fattori di diluizione in un foglio elettronico come descritto nella Tabella 2.
    4. Analizzare separatamente le pozzette duplicate per IgG, IgM e IgA prima di calcolare il conteggio medio delle macchie per ogni diluizione.
    5. Calcolare il numero di cellule secernenti anticorpi per milione di cellule iniziali moltiplicando il conteggio medio delle macchie per il corrispondente fattore di diluizione.
      NOTA: Utilizzare fattori di diluizione di 15×, 45× e 135× per i saggi di immunoglobuline totali e 3×, 9× e 27× per i saggi specifici per antigene.
    6. Eseguire tutti i calcoli mediante software per fogli elettronici e generare grafici utilizzando software statistici per la creazione di grafici.

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Risultati

In questo saggio ELISpot per linfociti B, le cellule secernenti anticorpi (ASC) sono state rilevate utilizzando CH505 SOSIP, un trimero solubile della glicoproteina dell'involucro (Env) di HIV-1, come antigene di rivestimento in uno studio vaccinale volto a indurre anticorpi neutralizzanti ampiamente reattivi (bnAbs) contro HIV-1. Figura 1 illustra la disposizione delle piastre ELISpot utilizzata per quantificare le ASC totali e quelle specifiche per antigene su piastre separate. La disposiz...

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Discussione

L'ELISpot per cellule B è un metodo sensibile per rilevare le risposte delle cellule secernenti anticorpi (ASC) totali e specifiche per antigene nel sangue, nel plasma e nelle cellule del midollo osseo8,9,10,11. Diversi passaggi sono fondamentali per garantire la riproducibilità del protocollo. In primo luogo, le membrane devono essere rivestite con precisione alla concentrazione ottimale dell'...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari da dichiarare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare gli animali e il personale addetto alle cure presso il Keeling Center for Comparative Medicine and Research per le cure prestate, e molti ex membri del team e collaboratori per i continui miglioramenti apportati alla procedura. Il finanziamento per questo progetto relativo a un vaccino contro l'HIV in primati non umani è stato fornito da sovvenzioni NIH 5R01AI183472 a MBZ e R24OD010947 a FJV.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Lisi ACKQuality Biological118-156-101500 ml
Filtro da 70µmFisher22363548Filtro sterile per cellule, adatto per provette coniche da 50 mL
Sottostrato lavorato AECBD Biosciences551951Reagenti per 10 piastra(e)
Analisi: ExcelMicrosoft OfficeVersione 2508 Build 16.0.19127.20678Microsoft Excel per Microsoft 365
Analisi: GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersione 10.6.1 (892) GraphPad Prism 10
Anti Rhesus IgA biotinilataNHPRRAB-3086851linfofilizzata
Anti-macaque IgG biotinilataRocklandP/N 617-106-012linfofilizzata
Anti-macaque IgM biotinilataRocklandP/N 617-106-007linfofilizzata
Mezzo di bloccoReagenti preparati in laboratorioformulato in sedeRPMI-10
Tampone per la diluizione dell'anticorpo secondario e della HRPReagenti preparati in laboratorioformulato in sedeDPBS 1X con 1% FBS
Centrifuga Thermo Scientific75004521Sorvall Legend XTR, Produzione: 2013, rotore TX-750 e 75003608 (secchio rotondo)
Tampone di rivestimentoReagenti preparati in laboratorioformulato in sedeDPBS 1X
DPBSGibco14190-1361X
Piastre ELISpotMillipore SigmaMSHAN4B50Confezione da 50 piastre
Serum Fetale Bovino (FBS)Omega ScientificFB-011X
FicollSTEMCELL Technologies18061500 ml
GNL non coniugataVector LaboratoriesL-1240-5linfofilizzata
Avidina - Peroxidasi di Rapa (HRP)Vector LaboratoriesA-20045 mg/ml, pronto all'uso
Lettore Mabtech IRIS Fluorospot/ELISpotMabtech ABP/N: 2000Imaging e analisi automatizzati per saggi ELISpot e Fluorospot
Penicillina/StreptomicinaGibco15140-122100X
Lavatrice per piastreBioTek Instruments, Inc.REF# 405TSRS405 TS Microplate washer
RPMI-10Reagenti preparati in laboratorioformulato in sedeRPMI-1640 + 10% Serum Fetale Bovino e 1% Penicillina/Streptomicina 
RPMI-1640Gibco22400-0711X
Tween20Sigma Life SciencesP7949500 ml
Anticorpo policlonale caprino non coniugato anti-macaque IgG+IgA+IgM IgG/IgM/IgALS-BioC347340linfofilizzato
Tampone di lavaggio (piastre specifiche per antigene)Reagenti preparati in laboratorioformulato in sede(solo DPBS 1X)
Tampone di lavaggio (piastre per Ig totale)Reagenti preparati in laboratorioformulato in sede(DPBS 1X + 0,05% Tween 20)

Riferimenti

  1. Hwai H, Chen YY, Tzeng SJ. B-Cell ELISpot Assay to Quantify Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Methods Mol Biol. 2018;1808:133-141.
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