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Articolo metodologico

Progettazione e gestione di un centro interno di microscopia elettronica criogenica con infrastruttura IT e pipeline di elaborazione dati in tempo reale

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DOI:

10.3791/71837

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1 settembre 2026

 , 
1ITS-Technology Engineering, Information Technology Services, Physical & Biological Sciences Division, University of California-Santa Cruz, 2Biomolecular Cryo-Electron Microscopy Facility, University of California-Santa Cruz, 3Chemistry and Biochemistry Department, University of California-Santa Cruz

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce un quadro pratico per la progettazione e l'esercizio dell'infrastruttura informatica di una struttura interna di microscopia elettronica criogenica (cryo-EM). Tratta la pianificazione della struttura, l'architettura di rete, l'archiviazione, il calcolo GPU, l'accesso remoto e l'elaborazione in tempo reale dei dati, consentendo una gestione efficiente di set di dati di diverse terabyte e garantendo operazioni cryo-EM scalabili, sostenibili e ad alte prestazioni.

Abstract

La microscopia crioelettronica (cryo-EM) è diventata un metodo dominante per la determinazione ad alta risoluzione della struttura di macromolecole biologiche. Con l'aumento globale del numero di strutture istituzionali dedicate alla cryo-EM, è emersa una sfida persistente: l'infrastruttura informatica necessaria per supportare queste strutture è spesso pianificata in modo insufficiente. Gli strumenti moderni di cryo-EM abbinati a rivelatori diretti di elettroni (DED) generano tra 2 e 5 TB di dati grezzi al giorno, e una struttura con 20 utenti può accumulare circa 2 PB di dati nell'arco di un singolo anno operativo. L'elaborazione di questi dati richiede nodi di calcolo dedicati con GPU, reti interne ad alta velocità e solide strategie di archiviazione a lungo termine, tutti elementi che devono essere predisposti prima dell'inizio della raccolta dati. Questo protocollo presenta un quadro integrato per la progettazione informatica e computazionale di una struttura interna di cryo-EM. Trattiamo i requisiti della struttura fisica (progettazione delle stanze, alimentazione elettrica, raffreddamento e isolamento dalle vibrazioni), la selezione degli strumenti (microscopi, DED e strumenti ausiliari) e l'intera architettura computazionale: configurazione degli switch di rete, selezione e dimensionamento dei server di archiviazione, provisioning dei nodi di calcolo con GPU e architettura per l'accesso remoto. Forniamo quindi un protocollo dettagliato per l'implementazione di pipeline di elaborazione dati in tempo reale, che includono correzione del movimento, stima della funzione di trasferimento del contrasto (CTF), selezione delle particelle e classificazione 2D in tempo reale durante la raccolta dati, utilizzando strumenti standard del settore. Vengono inoltre affrontate le strategie di trasferimento dati per utenti esterni. Questa guida colma una lacuna critica nella letteratura e consentirà a ricercatori e amministratori di realizzare strutture di cryo-EM pronte dal punto di vista computazionale fin dal primo giorno.

Introduzione

La rivoluzione della risoluzione in microscopia crioelettronica (cryo-EM) ha trasformato la biologia strutturale, permettendo la visualizzazione a risoluzione atomica di proteine, acidi nucleici e complessi macromolecolari senza la necessità di cristallizzazione1,2. Tre avanzamenti tecnici hanno guidato questa trasformazione: lo sviluppo di rivelatori elettronici diretti (DED) con elevate frequenze di acquisizione, miglioramenti nell'ottica elettronica e nella meccanica del microscopio, e l'ottimizzazione di software per l'elaborazione delle immagini accelerati da GPU3,4,5,6. Insieme, questi progressi hanno reso la cryo-EM il metodo preferito per una comunità in espansione di biologi strutturali.

La domanda di accesso alla microscopia crioelettronica ha spinto a investimenti significativi sia in grandi centri nazionali che in strutture istituzionali più piccole. I centri nazionali—come il NCCAT, il S2C2, il PNCC e il MCCET negli Stati Uniti, e l'eBIC, il NeCEN e lo SciLifeLab in Europa3,5,6—forniscono accesso agli strumenti più avanzati per progetti approvati. Le strutture interne integrano queste risorse sostenendo ricerche specifiche per progetto, con tempi di risposta più rapidi e un'interazione più stretta tra utenti e personale. Tuttavia, istituire una struttura interna funzionante richiede molto di più rispetto all'acquisto di un microscopio: l'infrastruttura informatica di supporto è altrettanto fondamentale, e la sua inadeguatezza rappresenta una delle principali cause di fallimento operativo nelle nuove strutture6.

Una singola sessione avanzata di microscopia elettronica criogenica può generare da 2 a 5 TB di dati grezzi sotto forma di filmati in 24 ore. Con l'utilizzo di più microscopi e utenti, il carico di dati raggiunge rapidamente scala petabyte. L'elaborazione di questi dati richiede pipeline accelerate da GPU che devono essere operative in parallelo alla raccolta dei dati7,8. Ritardi nel preelaborazione comportano un feedback ritardato sulla qualità dei dati e uno spreco di tempo strumentale. Nonostante queste evidenze, la maggior parte delle guide pubblicate sulla gestione di strutture di microscopia elettronica criogenica dedica scarsa attenzione ai componenti informatici, e nessuna fornisce un protocollo operativo passo dopo passo per configurare e validare un'infrastruttura dati completa.

Questo protocollo affronta tale lacuna. Vengono descritti i requisiti fisici e tecnici per la costruzione della struttura, i criteri di selezione per microscopi e rivelatori e, cosa più importante, la progettazione e l'implementazione dell'infrastruttura informatica che rende operativamente praticabile una struttura di microscopia elettronica criogenica6. Particolare attenzione è rivolta all'elaborazione dati in tempo reale: la pre-elaborazione automatizzata e concorrente dei dati durante l'acquisizione, che consente un controllo di qualità in tempo reale, orienta le decisioni di acquisizione e riduce in modo significativo il tempo di elaborazione successivo alla sessione9,10,11. Seguendo questo protocollo, coloro che sviluppano strutture saranno in grado di realizzare un'operazione di microscopia elettronica criogenica completa e integrata, in grado di servire in modo sostenibile ed efficiente un'ampia comunità scientifica.

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Protocollo

I dettagli relativi all'equipaggiamento, al software e ai materiali utilizzati in tutto il protocollo sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Progettazione delle strutture fisiche, del personale e dell'infrastruttura

  1. Eseguire una valutazione del sito. Selezionare un'area edilizia che offra: un pavimento isolato dalle vibrazioni (livelli di vibrazione ambientale, idealmente < 1 µm/s RMS a 1–100 Hz); stabilità del campo magnetico (< 1 mG/m di gradiente spaziale e < 0,1 mG/m di variazione temporale per strumenti da 300 kV); temperatura ambiente stabile (18–22 °C con fluttuazioni < 0,5 °C); controllo dell'umidità (40–60% RH); e rumore acustico ridotto (<50 dB). Consultare tempestivamente le specifiche del produttore del microscopio durante la fase di progettazione.
    NOTA: Il ricondizionamento di una stanza esistente può costare quanto una nuova costruzione. Come regola generale, prevedere un budget pari a circa il 20% del costo d'acquisto del microscopio per la preparazione della stanza.
  2. Progettare la disposizione degli spazi con una chiara separazione tra le diverse aree funzionali: (a) stanza(e) per microscopi elettronici a trasmissione criogenici (cryo-TEM); (b) un'anticamera per la preparazione e lo stoccaggio dei campioni su griglie; (c) una stanza per i sistemi di controllo contenente refrigeratori ad acqua, gruppi di continuità (UPS) e sistemi di raffreddamento del microscopio; e (d) una stanza server o un centro dati separato per l'infrastruttura di archiviazione e calcolo.
    NOTA: Mantenere la temperatura della stanza di controllo sempre al di sotto di 26 °C e prevedere alimentazione e raffreddamento di riserva dedicati. Le escursioni termiche nella stanza di controllo sono una causa frequente di fermo del microscopio.
  3. Pianificare l'infrastruttura elettrica. Installare circuiti elettrici trifase dedicati per cryo-TEM di fascia alta. Collegare tutti i microscopi, le telecamere e le apparecchiature server all'infrastruttura elettrica protetta designata. Coordinarsi con il team tecnico dell'istituto per includere un generatore di emergenza in grado di sostenere il funzionamento del microscopio e il flusso dell'acqua di raffreddamento durante i blackout.
    NOTA: Diversi strumenti all'interno di un impianto di criomicroscopia elettronica richiedono più di un giorno per un corretto riavvio dopo un'interruzione. La perdita di corrente non programmata può danneggiare schede elettroniche sensibili e causare la perdita di sessioni attive di acquisizione dati.
  4. Installare sistemi di raffreddamento ad acqua per il microscopio elettronico e le apparecchiature associate. Realizzare un circuito di raffreddamento ad acqua di riserva con commutazione automatica in caso di guasto. Monitorare continuamente la portata, la temperatura e la conducibilità dell'acqua mediante il sistema integrato di monitoraggio del microscopio o un'apposita serie di sensori.
  5. Installare cavi in fibra ottica che collegano la(e) stanza(e) del microscopio alla stanza server durante la costruzione o la ristrutturazione. Prevedere almeno fibra multimodale OM4 o monomodale OS2, con sufficiente margine di cavo e pannelli di connessione etichettati alle due estremità.
    NOTA: L'installazione anticipata della fibra è notevolmente più economica rispetto a un intervento successivo.
  6. Assegnare operatori specializzati o scienziati del laboratorio incaricati della manutenzione degli strumenti, della formazione degli utenti, della pianificazione, dell'ottimizzazione dei campioni e del supporto all'acquisizione dati. Assegnare personale IT dedicato per gestire l'infrastruttura, le prestazioni di rete, la sicurezza informatica, il backup dei dati, il rilascio del software, le risorse di calcolo GPU e l'accesso remoto degli utenti.
  7. Determinare le esigenze di personale in base al livello di supporto agli utenti fornito e alla complessità dell'infrastruttura informatica. In laboratori più piccoli, come il Biomolecular cryo-EM Facility dell'UCSC, tali responsabilità possono essere condivise da un responsabile del laboratorio con competenze informatiche o dai servizi IT centralizzati dell'istituzione; tuttavia, con l'aumento del numero di microscopi, utenti e sessioni annuali di acquisizione dati, il personale specializzato diventa sempre più necessario.
  8. Fornire supporto IT dedicato per i laboratori che gestiscono più cryo-TEM, al fine di garantire un'acquisizione dati ininterrotta, una gestione efficiente dei dati e risorse di calcolo scalabili. Investire precocemente in un'infrastruttura IT solida e in personale qualificato durante lo sviluppo del laboratorio per ridurre al minimo i tempi di inattività operativi, semplificare eventuali espansioni future e creare un quadro sostenibile in grado di supportare comunità utente in crescita e flussi di lavoro di criomicroscopia elettronica sempre più intensivi dal punto di vista dei dati.

2. Selezione del microscopio e del rilevatore

  1. Definire la missione scientifica principale della struttura prima di selezionare un microscopio. Considerare: (a) se il flusso di lavoro principale sarà l'analisi di singole particelle (SPA), la tomografia crioelettronica (cryo-ET), la microdiffrazione elettronica (microED) o una combinazione di questi; (b) la dimensione prevista del gruppo di utenti e la diversità dei progetti; (c) i vincoli di bilancio sia per l'acquisizione che per i contratti di assistenza continuativa.
  2. Valutare le piattaforme di criomicroscopia elettronica a trasmissione (cryo-TEM) disponibili in base alle applicazioni previste. Per analisi SPA ad alta risoluzione e mediazione di sottotomogrammi (STA), prendere in considerazione strumenti a 300 kV. Per attività di screening e acquisizione dati a risoluzione media, considerare strumenti a 200 kV. Per un'opzione iniziale a costo ridotto con capacità di screening, valutare strumenti a 100–120 kV (riassunti nella Tabella 1).
    NOTA: Le schede tecniche cambiano frequentemente. Richiedere sempre informazioni aggiornate sulle configurazioni e sui prezzi direttamente al produttore prima di finalizzare le decisioni sull'equipaggiamento.
  3. Selezionare un rivelatore elettronico diretto (DED) compatibile con il microscopio e l'applicazione. Per analisi SPA ad alta risoluzione su strumenti Thermo Fisher Scientific (TFS), il Falcon 4i è attualmente l'opzione principale per le serie Krios e Glacios.
  4. Per strumenti JEOL CryoARM, il Gatan K3 offre un'elevata sensibilità e velocità di acquisizione dei fotogrammi. Per strutture che prevedono sia SPA che microED, verificare la compatibilità del rivelatore con le modalità di acquisizione dati per diffrazione elettronica (Tabella 2).
    NOTA: Il DED è uno dei componenti più costosi della struttura e influenza in modo significativo la qualità dei dati e i requisiti di archiviazione. La modalità Electron Event Register (EER), ad esempio, produce file grezzi notevolmente più grandi rispetto ai formati compressi tradizionali, richiedendo proporzionalmente maggiore capacità di archiviazione e larghezza di banda di rete.
  5. Valutare il ruolo di un filtro energetico durante la selezione della configurazione dello strumento di criomicroscopia elettronica, poiché può influenzare in modo significativo la qualità delle immagini, la scelta del rivelatore e le prestazioni complessive del sistema. Rimuovendo gli elettroni dispersi in modo anelastico, i filtri energetici migliorano il contrasto e il rapporto segnale-rumore, il che è particolarmente vantaggioso per campioni difficili, applicazioni di SPA ad alta risoluzione (vantaggiosa), cryo-ET (critica) e microED (vantaggiosa).
  6. Valutare i sistemi di filtro energetico disponibili durante la selezione dello strumento. I sistemi Gatan Bioquantum e Biocontinuum o i sistemi Thermo Fisher Scientific Selectris e SelectrisX hanno tipicamente un costo compreso tra 0,3 e 1,5 milioni di dollari USA, a seconda della configurazione.
  7. Valutare attentamente il costo aggiuntivo e la complessità associati ai filtri energetici in combinazione con le capacità del rivelatore, gli obiettivi della struttura e le applicazioni previste dagli utenti prima di scegliere la configurazione finale dello strumento.
  8. Considerare i contratti di assistenza nel calcolo del costo totale di acquisizione. I contratti di assistenza coprono tipicamente il microscopio, il filtro energetico, il rivelatore e il sistema di raffreddamento ad acqua.
  9. Negozia i termini del contratto di assistenza—compresi i tempi di intervento garantiti e la disponibilità di componenti sostitutivi—al momento dell'acquisto dello strumento. Prevedere un budget annuo pari all'8–15% del prezzo di acquisto dello strumento per la copertura dell'assistenza.

3. Progettazione e implementazione dell'architettura della rete

  1. Progettare la rete interna dell'installazione intorno a uno switch centrale ad alta velocità. Collegare direttamente a questo switch tutti i dispositivi che generano o utilizzano dati alla velocità più elevata supportata: controller del microscopio, controller della telecamera (spesso una workstation separata), server di archiviazione e nodi di calcolo GPU.
  2. Fornire una connessione minima di 10 Gbps per ogni dispositivo. Prevedere collegamenti in uscita (uplink) da 25 Gbps o superiori tra lo switch e i nodi di archiviazione e calcolo, laddove il budget lo consenta.
    NOTA: A 1 Gbps, il trasferimento di 20 TB di dati grezzi richiederebbe 2–3 giorni. A 10 Gbps, lo stesso trasferimento richiede 5–6 ore. A 25 Gbps, richiede circa 2 ore. La velocità della rete determina direttamente se l'elaborazione in tempo reale può mantenere il passo con l'acquisizione dei dati.
  3. Definire le specifiche dello switch centrale. Requisiti: (a) matrice di commutazione non bloccante alla massima velocità di linea; (b) numero sufficiente di porte SFP+ o QSFP per tutti i dispositivi dell'installazione; (c) funzionalità di switch gestito (supporto VLAN, monitoraggio del traffico, mirror delle porte per la diagnostica); (d) moduli di alimentazione ridondanti. Selezionare uno switch gestito di livello enterprise che offra una matrice di commutazione non bloccante, un numero adeguato di porte ad alta velocità, funzioni di gestione del traffico e alimentatori ridondanti.
  4. Segmentare la rete utilizzando VLAN per separare: (a) la VLAN di acquisizione dati (controller del microscopio e della telecamera, server di archiviazione); (b) la VLAN di calcolo (workstation e nodi cluster GPU); (c) la VLAN di gestione (accesso remoto, monitoraggio, amministrazione).
    NOTA: La segmentazione della rete riduce il traffico broadcast, migliora la sicurezza e consente la risoluzione dei problemi di ciascun sottosistema in modo indipendente.
  5. Collegare la rete dell'installazione alla WAN istituzionale tramite una porta uplink dedicata sullo switch centrale. Un uplink da 1–10 Gbps verso la rete del campus è sufficiente per l'accesso remoto e il trasferimento esterno dei dati.
  6. Coordinarsi con l'ufficio IT istituzionale per predisporre indirizzi IP statici, voci DNS e regole firewall appropriate per tutti i dispositivi accessibili dall'installazione (Figura 1).
  7. Installare e etichettare tutti i cavi di rete. Utilizzare cavi diretti o cavi ottici attivi per connessioni a 10+ Gbps fino a 100 m (cavi Cat6A schermati funzionano anche per 10 Gbps fino a 100 m); utilizzare cavi in fibra pre-terminati (LC-LC o MTP) per collegamenti tra rack a 25+ Gbps.
  8. Documentare completamente lo schema di cablaggio con un diagramma di rete che specifichi nomi dei dispositivi, indirizzi IP, assegnazione delle porte e appartenenza alle VLAN.
    NOTA: Fare riferimento alla Figura 2 per lo schema della topologia di rete minima consigliata per una piccola struttura di microscopia criogenica.

4. Progettazione e implementazione del server di archiviazione

  1. Calcolare le esigenze di archiviazione prima dell'acquisto dell'hardware. Come riferimento: una singola sessione avanzata di microscopia elettronica criogenica genera 2–5 TB di dati grezzi al giorno.
  2. Stimare le esigenze di archiviazione a lungo termine in base all'utilizzo previsto della struttura. Una struttura con 20 utenti che gestisce due microscopi può generare circa 2 PB di dati entro 3–6 mesi di funzionamento. Pianificare sia l'archiviazione dei dati grezzi (a breve termine, ad alta velocità) sia quella dei dati elaborati (a medio termine, volume maggiore), poiché i dataset elaborati sono spesso 10–20 volte più grandi dei dati grezzi originali.
  3. Scegliere un'architettura di archiviazione affidabile. I server autonomi basati su ZFS rappresentano il punto di partenza consigliato per la maggior parte delle strutture, offrendo un rapporto costo-capacità vantaggioso, verifica integrata dell'integrità dei dati (checksum), configurazioni flessibili equivalenti al RAID (RAIDZ, RAIDZ2) e supporto per snapshot. I sistemi di file distribuiti in cluster (Gluster, Ceph, GPFS/IBM Spectrum Scale) possono offrire prestazioni e scalabilità superiori, ma richiedono più server fisici e una gestione più complessa.
  4. Configurare pool di archiviazione ZFS. Configurazione iniziale consigliata: due vdev RAIDZ2 (ciascuno composto da 6–8 dischi rigidi SAS ad alta capacità, da 16–20 TB ciascuno), che forniscono circa il 60–70% di capacità utilizzabile con protezione contro due guasti simultanei dei dischi.
  5. Aggiungere un vdev dedicato di cache di scrittura SSD (L2ARC) utilizzando 2–4 SSD NVMe per accelerare le prestazioni di lettura casuale durante i lavori di elaborazione attivi.
    NOTA: Non utilizzare dischi SATA per uso consumer negli array di archiviazione produttivi. Sono essenziali dischi enterprise SAS o NL-SAS con capacità di carico di lavoro certificata (ad esempio, 550 TB/anno) per gestire i modelli di I/O casuale sostenuto dei flussi di lavoro della microscopia elettronica criogenica.
  6. Configurare esportazioni NFS (per client Linux) e condivisioni SMB (per client Windows) sul server di archiviazione ZFS. Montare la condivisione dati principale su tutti i nodi di calcolo GPU e sulla workstation del controller della telecamera per consentire un accesso diretto ai dati senza copie intermedie.
  7. Stabilire una politica di conservazione e ciclo di vita dei dati. Definire: (a) periodo di conservazione dei filmati grezzi (tipicamente 3–6 mesi dopo l'acquisizione); (b) conservazione dei micrografici corretti per movimento; (c) conservazione dei dataset elaborati finali (indefinita fino alla pubblicazione); (d) procedura di archiviazione per i progetti completati.
  8. Implementare avvisi automatici quando l'utilizzo dell'archiviazione supera il 70% della capacità, per consentire l'acquisto tempestivo di ulteriore spazio di archiviazione.
    NOTA: L'archiviazione è il costo più frequentemente sottovalutato nella pianificazione di una struttura per microscopia elettronica criogenica. Non confondere l'approvazione per l'acquisto del microscopio con un finanziamento adeguato per l'archiviazione. L'acquisto di sistemi di archiviazione deve essere pianificato in parallelo all'installazione dello strumento, non dopo l'inizio dell'acquisizione dati.

5. Infrastruttura di calcolo GPU

  1. Determinare i requisiti computazionali in base al throughput previsto. Per un singolo microscopio che genera da 3.000 a 5.000 micrografie per sessione di 24 ore, sono necessari almeno due nodi di calcolo, ciascuno dotato di 4 schede GPU NVIDIA (architettura Maxwell o successiva, con almeno 11 GB di VRAM, ad esempio RTX 3090, RTX 4090 o A100), per sostenere la pre-elaborazione in tempo reale alla velocità di acquisizione.
  2. Per impianti più grandi o flussi di lavoro di cryo-ET con elevati volumi di serie di inclinazione, prevedere nodi aggiuntivi.
  3. Specificare l'hardware dei nodi di calcolo GPU. Ogni nodo dovrebbe includere: (a) 4 GPU NVIDIA con supporto CUDA (minimo 24 GB di VRAM per GPU per i raffinamenti 3D in CryoSPARC e RELION); (b) una CPU ad alto numero di core (AMD EPYC o Intel Xeon, ≥32 core) per supportare passaggi paralleli dipendenti dalla CPU (stima del CTF, I/O dei file); (c) ≥256 GB di RAM di sistema; (d) uno spazio locale di scratch su SSD NVMe da 2–4 TB per i dati intermedi dei lavori attivi; (e) una scheda di interfaccia di rete (NIC) da 10/25 Gbps; (f) spazio di archiviazione locale sufficiente per i set di dati in elaborazione (tipicamente un volume RAID). NOTA: Le GPU di fascia consumer (RTX 4090) possono offrire prestazioni paragonabili a quelle delle alternative aziendali (A100) a un costo significativamente inferiore per carichi di lavoro di cryo-EM. Valutare i benchmark specifici per CryoSPARC e RELION, poiché i loro schemi di accesso alla memoria favoriscono GPU con elevata larghezza di banda della memoria.
  4. Installare su ogni nodo di calcolo il pacchetto di driver NVIDIA, il toolkit CUDA (versione compatibile con CryoSPARC e RELION) e cuDNN. Utilizzare uno strumento di gestione della configurazione per standardizzare gli ambienti software su tutti i nodi e semplificare gli aggiornamenti futuri.
  5. Distribuire CryoSPARC in configurazione autonoma o in cluster. Per un impianto multi-nodo, installare CryoSPARC-master su un nodo principale dedicato e CryoSPARC-worker su ciascun nodo di calcolo GPU.
  6. Configurare la pianificazione dei lavori in modo da consentire a più utenti di inviare lavori di elaborazione in parallelo. Seguire la documentazione ufficiale dell'architettura di CryoSPARC per i requisiti minimi di sistema e la configurazione di rete.
  7. Installare RELION accanto alla piattaforma principale di elaborazione per offrire agli utenti entrambi gli ecosistemi di elaborazione. Configurare il software per utilizzare i nodi di calcolo locali tramite un pianificatore (SLURM o PBS/Torque).
  8. Installare strumenti ausiliari: MotionCor2 (correzione del movimento), CTFFIND4 e Gctf (stima del CTF), TOPAZ (selezione di particelle basata su apprendimento automatico), crYOLO (selettore di particelle basato su reti neurali) e cryoDRGN (analisi dell'eterogeneità). Fare riferimento alla Tabella 3 per una panoramica dei pacchetti software disponibili per SPA, cryo-ET, STA e microED. 
  9. Utilizzare la distribuzione del consorzio SBGrid o la gestione software basata su container (Singularity/Apptainer per ambienti HPC; Docker per workstation) per mantenere ambienti software riproducibili e con versioni controllate.
    NOTA: SBGrid fornisce versioni precompilate e validate di tutti i principali strumenti software per cryo-EM, con gestione automatica degli aggiornamenti per istituzioni accademiche.

6. Infrastruttura per l'accesso remoto

  1. Stabilire l'accesso remoto basato su VPN come punto di ingresso principale e sicuro per tutti gli utenti e il personale fuori sede. Collaborare con l'ufficio IT istituzionale per configurare un profilo o un tunnel VPN specifico per la struttura, che consenta l'accesso alla rete di calcolo e archiviazione della struttura senza esporre i dispositivi a Internet pubblico.
  2. Implementare l'autenticazione a due fattori (2FA) su tutti i punti di accesso remoto (Figura 2).
  3. Installare un software per desktop remoto per accedere graficamente ai controller del microscopio e alle workstation GPU. Opzioni consigliate: (a) TeamViewer (commerciale, multipiattaforma, attraversa NAT—adatto per l'accesso ai controller del microscopio); (b) NoMachine (commerciale, multipiattaforma, supporta il reindirizzamento grafico OpenGL 3D—consigliato per workstation GPU che eseguono strumenti di visualizzazione); (c) TurboVNC con VirtualGL (open source, solo Linux, supporta la resa remota 3D).
    NOTA: Molti strumenti di visualizzazione per microscopia criogenica utilizzano OpenGL per la resa 3D. Il reindirizzamento X11 standard non supporta OpenGL con accelerazione hardware. Utilizzare NoMachine o VirtualGL/TurboVNC per queste applicazioni.
  4. Configurare l'accesso remoto al software di acquisizione dati del microscopio. Utilizzare Leginon o SerialEM per l'operazione remota tramite la VPN istituzionale. Il software di acquisizione del microscopio può essere accessibile da remoto attraverso un'applicazione desktop remoto approvata.
  5. Verificare la connettività remota da posizioni fuori sede rappresentative (reti domestiche, istituzioni collaboratrici) prima di avviare le operazioni per gli utenti (Tabella 4).
  6. Configurare una dashboard web per il monitoraggio della struttura, in modo che personale e utenti possano controllare a distanza lo stato della raccolta dati, gli output del preelaborazione, l'utilizzo dello spazio di archiviazione e lo stato delle code di calcolo. Leginon include un'interfaccia web integrata per il monitoraggio.
  7. Per il flusso di lavoro CryoSPARC, configurare Grafana o una dashboard web personalizzata alimentata dagli output dei log della pipeline e da strumenti di monitoraggio del sistema (Prometheus, node_exporter).
  8. Stabilire un meccanismo di consegna dati per gli utenti esterni. Configurare un servizio di trasferimento dati autenticato, come Globus Connect Server, sullo storage della struttura.
  9. Per gli utenti privi di accesso a Globus, predisporre procedure per la spedizione di dischi rigidi USB con checksum documentati. È necessaria una connessione Internet in upload da 10 Gbps per consentire il download diretto pratico di dataset di diverse TB da parte di utenti esterni.

7. Flusso di lavoro per l'elaborazione dei dati in tempo reale: implementazione

  1. Configurare preventivamente il percorso del flusso di dati prima di ogni sessione di raccolta dati. Verificare che: (a) il controller della telecamera scriva direttamente i filmati grezzi sulla memoria ad alte prestazioni montata NFS del laboratorio; (b) la condivisione NFS sia montata e accessibile da tutti i nodi di calcolo GPU; (c) sia disponibile capacità di archiviazione libera sufficiente per la sessione prevista (minimo 5 TB liberi per una sessione SPA di 24 h); (d) i nodi di calcolo GPU siano disponibili e che non ci siano lavori a lunga durata che competano per le risorse.
  2. Configurare una correzione di riferimento del guadagno. Prima di ogni sessione, acquisire un'immagine di riferimento del guadagno come specificato dal produttore del rivelatore (tipicamente un'esposizione a fascio vuoto su un'area vuota della griglia).
  3. Posizionare il file di riferimento del guadagno nella directory di input designata per la pre-elaborazione. Tutti i software di correzione del movimento (MotionCor2, l'implementazione integrata di RELION) applicheranno automaticamente questo riferimento se correttamente configurati.
  4. Avviare la pipeline di pre-elaborazione in tempo reale utilizzando CryoSPARC-Live (preferito per la visualizzazione in tempo reale). La pipeline deve essere avviata non appena i primi filmati compaiono nella directory di output—tipicamente entro i primi 5–10 minuti della raccolta dati automatizzata.
    NOTA: CryoSPARC-Live continua a monitorare una directory designata alla ricerca di nuovi file video ed elabora i file man mano che arrivano. La differenza principale è che CryoSPARC-Live fornisce un'interfaccia web interattiva in tempo reale per il monitoraggio.
  5. Flusso di lavoro di CryoSPARC-Live
    1. Nell'interfaccia web, accedere a un progetto nuovo o esistente e creare una nuova sessione live11,36.
    2. Configurare la sorgente di input: specificare il percorso della directory in cui scrive il controller della telecamera (la "cartella di monitoraggio"), il modello di file che corrisponde ai filmati grezzi (ad esempio, *.tif, *.mrc o *.eer per dati Falcon 4i in formato EER) e il percorso del file di riferimento del guadagno.
    3. Impostare i parametri di correzione del movimento: numero di fotogrammi da utilizzare, correzione del movimento basata su porzioni (consigliato: 5x5 porzioni), fattore di binning in uscita (tipicamente 1 per la raccolta dati vicina al limite di Nyquist; 2 per la selezione iniziale) e dose di elettroni per fotogramma (calcolata dalla dose totale e dal numero di fotogrammi).
    4. Impostare i parametri di stima della CTF: risoluzione minima e massima per l'adattamento (tipicamente 30 Å e 4 Å), intervallo di ricerca della defocalizzazione (0,5–5 µm consigliato per SPA) e astigmatismo massimo accettabile. Abilitare la stima della CTF per singolo tilt per dataset di criotomografia elettronica (cryo-ET).
    5. Configurare la selezione delle particelle: scegliere il metodo di selezione (selettore a blob per le sessioni iniziali; selettore basato su modello dopo la disponibilità delle prime buone classi 2D; selettore TOPAZ per campioni difficili). Impostare il diametro atteso delle particelle e la distanza minima/massima tra le particelle.
    6. Per ridurre sostanzialmente i requisiti di archiviazione, il carico di trasferimento dati e i costi computazionali, si raccomanda il ritaglio in Fourier durante l'estrazione delle particelle con un fattore di 4 (ottenendo una dimensione fisica del pixel 4 volte maggiore). Per la valutazione routinaria della qualità dei dati, risoluzioni intermedie di 3–5 Å sono generalmente sufficienti durante l'elaborazione in tempo reale.
    7. Abilitare la classificazione 2D all'interno della sessione live. Impostare il numero di classi 2D (tipicamente 50–200), la dimensione del batch per aggiornamenti incrementali (200–500 particelle) e il limite di risoluzione per la classificazione (6–8 Å per la valutazione iniziale).
    8. Avviare la sessione live. Monitorare la dashboard in tempo reale per: numero e frequenza di arrivo dei filmati, qualità della correzione del movimento (movimento totale per filmato—rigettare i filmati con movimento totale >30 Å come regola generale), qualità dell'adattamento della CTF (rigettare micrografie con risoluzione di adattamento della CTF >6–8 Å), resa di particelle per micrografia e qualità in evoluzione delle medie delle classi 2D.
    9. Impostare soglie di accettazione per la cura automatica. Nel pannello Filtri, definire criteri di rigetto per il movimento (soglia di movimento totale), qualità della CTF (soglia di risoluzione di adattamento) e intervallo di defocalizzazione (escludere micrografie fortemente sotto- o sovra-focalizzate). Le particelle curate vengono automaticamente indirizzate al successivo lavoro di classificazione 2D.

8. Controllo qualità in tempo reale e feedback durante la raccolta dati

  1. Monitorare continuamente le statistiche CTF durante tutta la sessione. Riportare in grafico i valori di defocus per ciascuna microfotografia: la distribuzione dovrebbe concentrarsi entro l'intervallo di defocus previsto (tipicamente −0,5 a −3.0 µm per SPA).
  2. Una deriva sistematica verso valori di defocus più elevati può indicare una deriva dello stadio o una miscalibrazione dell'altezza eucentrica. Informare immediatamente il personale della struttura se la risoluzione dell'adattamento della CTF degrada al di sotto di 6 Å, poiché ciò indica generalmente una contaminazione da ghiaccio, un'instabilità del fascio o una deriva del fuoco che richiedono un intervento.
  3. Monitorare gli output della correzione del movimento. Il movimento totale all'interno del frame per ogni filmato dovrebbe essere inferiore a 10–30 Å per dati di alta qualità. È previsto un movimento elevato sistematico nei primi fotogrammi, che viene corretto; tuttavia, un movimento elevato che persiste per tutta la durata del filmato (>40 Å totale) può indicare instabilità del palchetto meccanico o accumulo di carica sul campione e deve essere investigato.
  4. Esaminare le medie delle classi 2D man mano che vengono aggiornate durante la sessione (ogni 30–60 min). Indici di un dataset di alta qualità: medie delle classi che mostrano caratteristiche della struttura secondaria, multiple vedute distinte della particella e assenza di artefatti da impilamento o aggregazione.
  5. Monitorare gli indicatori che richiedono intervento: tutte le particelle classificate in classi informi definite "junk" (indicative di scarsa qualità del campione o del ghiaccio), assenza completa di alcune proiezioni (indicativa di orientamento preferenziale, che potrebbe richiedere un'ottimizzazione della griglia) o rese estremamente basse di particelle per micrografia.
  6. Registra tutte le osservazioni in un registro strutturato della sessione. Registrare: orari di inizio e fine della sessione, impostazioni del microscopio e della telecamera, riepilogo statistico in tempo reale (numero totale di filmati raccolti, frazione superata il filtro CTF, frazione superata il filtro per il movimento, numero totale di particelle selezionate, valutazione delle classi 2D) e qualsiasi intervento effettuato. Questo registro è essenziale per la valutazione retrospettiva della qualità e per la relazione sulle prestazioni della struttura.
  7. Al termine della sessione, generare un rapporto riassuntivo sulla qualità dei dati. La piattaforma di elaborazione in tempo reale esporta automaticamente un riepilogo della sessione.
    NOTA: Un'altra opzione per generare riepiloghi e report consiste nell'utilizzare strumenti di intelligenza artificiale come Vitreum. Nella UCSC Biomolecular Cryo-EM Facility, la piattaforma Vitreum viene impiegata per gestire i flussi di lavoro di laboratorio e la documentazione sperimentale. Vitreum registra i passaggi sperimentali man mano che vengono eseguiti, applica vincoli a livello di protocollo, verifica l'esecuzione dei flussi di lavoro rispetto a criteri di qualità predefiniti e fornisce una tracciabilità verificabile delle attività di laboratorio. Integrando le operazioni di laboratorio con l'infrastruttura computazionale e di gestione dei dati della struttura, la piattaforma riduce al minimo la registrazione manuale, migliora la riproducibilità, facilita la comunicazione tra il personale della struttura e gli utenti e consente un monitoraggio coerente degli esperimenti, dalla preparazione del campione fino alla raccolta dati e all'analisi computazionale successiva.

9. Pipeline di elaborazione dei dati post-prelievo

  1. Al termine della preelaborazione in tempo reale, lo stack di particelle raggruppate e curato viene esportato insieme ai filmati preelaborati e curati.
  2. Staccare il progetto CryoSPARC dalla workstation principale e riattaccarlo a un'altra workstation condivisa e accessibile da remoto. Questo consente un rapido scaricamento e riutilizzo per iniziare la successiva sessione di acquisizione dati.
    NOTA: Una tipica raccolta dati può variare da 1 a 2 giorni, facilmente monitorabile tramite CryoSPARC-Live. Tuttavia, i passaggi di elaborazione tridimensionale possono richiedere settimane o mesi, giustificando così il trasferimento del progetto tra workstation e server di archiviazione.
  3. In CryoSPARC, esportare le particelle raggruppate curate dalla sessione attiva in un progetto standard per l'elaborazione 3D offline36. 
  4. Eseguire una ricostruzione tridimensionale ab initio. In CryoSPARC, utilizzare il processo di Ricostruzione Ab Initio (si consigliano da 3 a 5 modelli iniziali per campioni eterogenei). Generare da 1 a 4 modelli iniziali per valutare l'eterogeneità strutturale.
  5. Una volta che i valori ricostruiti sono soddisfacenti, rieseguire l'estrazione delle particelle non raggruppate per migliorare la risoluzione complessiva.
  6. Eseguire un'affinamento 3D mediante affinamento eterogeneo (se si sospettano conformazioni o classi multiple), seguito da un'affinamento omogeneo per la migliore classe. In CryoSPARC, utilizzare l'affinamento eterogeneo seguito da affinamento non uniforme. 
  7. Applicare la lucidatura bayesiana in RELION13 oppure utilizzare la correzione del movimento per particella e il perfezionamento della CTF (job di perfezionamento della CTF in CryoSPARC) per migliorare il segnale per particella, tenendo conto del movimento indotto dal fascio e della defocalizzazione per particella, a seconda delle preferenze dell'utente. Questo passaggio migliora di routine la risoluzione della mappa finale di 0,2–0,5 ÅInoltre, la correzione del movimento basata su riferimento (RBMC) in CryoSPARC può rappresentare un'opzione utile per migliorare la risoluzione e la qualità della mappa.
  8. Convalidare la mappa finale utilizzando il procedimento standard dorato della correlazione tra gusci di Fourier (Fourier shell correlation, FSC). Suddividere lo stack di particelle in due insiemi indipendenti, affinarli separatamente e calcolare la FSC tra le due mappe parziali. Riportare la risoluzione finale al valore di FSC = 0,143.
  9. Calcolare il FSC tra mappa e modello (FSC-Q) e i punteggi Q dopo l'adattamento del modello atomico come metriche indipendenti di validazione37.
  10. Eseguire la costruzione e la validazione del modello atomico. Utilizzare ModelAngelo per la costruzione automatica *de novo* del modello a partire dalla mappa di densità20Affinare il modello utilizzando l'affinamento nello spazio reale di PHENIX e convalidarlo con MolProbity.
  11. Utilizzare COOT35 dopo aver generato il modello iniziale per visualizzare la mappa di densità, adattare o regolare le coordinate atomiche, correggere gli errori di modellizzazione, costruire le regioni mancanti e ottimizzare le strutture di proteine, acidi nucleici o ligandi. Consente la modifica interattiva di residui, conformazioni delle catene laterali, strutture secondarie e assegnazioni di sequenza, seguita da un affinamento nello spazio reale per migliorare la concordanza tra il modello atomico e la densità sperimentale.
  12. Infine, depositare il modello atomico finale nel Protein Data Bank (PDB), la mappa di densità nell'Electron Microscopy Data Bank (EMDB) e i dati grezzi o preelaborati nell'Electron Microscopy Public Image Archive (EMPIAR).

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Risultati

A successfully implemented facility IT infrastructure and on-the-fly data processing pipeline will produce the following verifiable outcomes at each stage:

Network and storage
Internal data transfer between the camera controller and storage server should sustain ≥800 MB/s (approaching theoretical 10 Gbps throughput) when measured with tools such as iperf3 or fio. This throughput is sufficient to transfer a 10–12 GB movie stack from the detector in under 15 seconds, ensurin...

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Discussione

L'infrastruttura IT di un laboratorio di microscopia crioelettronica non è un accessorio secondario, ma un prerequisito operativo. I laboratori che iniziano la raccolta dati senza una capacità adeguata di archiviazione, rete ed elaborazione si trovano inevitabilmente di fronte alla scelta tra eliminare i dati grezzi, interrompere la raccolta dati o accettare ritardi di mesi nella determinazione della struttura. I protocolli descritti qui sono progettati per evitare tali esiti, garantendo che il supporto computazionale ve...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano la struttura di microscopia elettronica criogenica biomolecolare presso il Dipartimento di Chimica e Biochimica dell'Università della California–Santa Cruz (RRID: SCR_021755) per il supporto scientifico e tecnico (programma NIH High-End Instrumentation, S10OD02509).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Krios 5ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/it/it/home/microscopia-elettronica/prodotti/microscopi-elettronici-a-trasmissione/krios-5-cryo-tem.htmlMicroscopio elettronico a trasmissione
Krios G4ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/it/it/home/microscopia-elettronica/prodotti/microscopi-elettronici-a-trasmissione/krios-g4-cryo-tem.htmlMicroscopio elettronico a trasmissione
GlaciosThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/it/it/home/microscopia-elettronica/prodotti/microscopi-elettronici-a-trasmissione/glacios-cryo-tem.htmlMicroscopio elettronico a trasmissione
Glacios 2ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/it/it/home/microscopia-elettronica/prodotti/microscopi-elettronici-a-trasmissione/glacios-2-cryo-tem.htmlMicroscopio elettronico a trasmissione
Glacios 3ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/ (nuova generazione; la pagina del prodotto può variare in base alla regione)Microscopio elettronico a trasmissione
Talos ArcticaThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/it/it/home/microscopia-elettronica/prodotti/microscopi-elettronici-a-trasmissione/talos-arctica.htmlMicroscopio elettronico a trasmissione
Talos L120CThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/it/it/home/microscopia-elettronica/prodotti/microscopi-elettronici-a-trasmissione/talos-l120c.htmlMicroscopio elettronico a trasmissione
CRYO ARM 300 II (JEM-Z300FSC)JEOLhttps://www.jeol.com/products/scientific/tem/cryoarm300ii.phpMicroscopio elettronico a trasmissione
CRYO ARM 200JEOLhttps://www.jeol.com/products/scientific/tem/cryoarm200.phpMicroscopio elettronico a trasmissione
JEM-3200FSCJEOLhttps://www.jeol.com/products/scientific/tem/jem3200fsc.phpMicroscopio elettronico a trasmissione
HF8300Hitachihttps://www.hitachi-hightech.com/global/en/products/microscopes/tem/hf8300.htmlMicroscopio elettronico a trasmissione
HT7800Hitachihttps://www.hitachi-hightech.com/global/en/products/microscopes/tem/ht7800.htmlMicroscopio elettronico a trasmissione
SU9000 (TEM/STEM)Hitachihttps://www.hitachi-hightech.com/global/en/products/microscopes/sem-tem/su9000.htmlMicroscopio elettronico a trasmissione
Falcon 4iThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/it/it/home/microscopia-elettronica/prodotti/detettori-elettronici-diretti/falcon-4i.htmlRivelatore Diretto di Elettroni
Gatan K3Gatan (AMETEK)https://gatan.com/products/tem-cameras/k3-is-cameraRivelatore Diretto di Elettroni
Gatan K2Gatanhttps://gatan.com/products/tem-cameras/k2-cameraRivelatore Diretto di Elettroni
ApolloElettroni direttihttps://directelectron.com/apollo/Rivelatore Diretto di Elettroni
DE64Elettroni direttihttps://directelectron.com/de-64/Rivelatore Diretto di Elettroni
RELIONMRC Laboratory of Molecular Biology (MRC-LMB), Università di Cambridgehttps://relion.readthedocs.iopacchetto software SPA
cryoSPARCStructura Biotechnologyhttps://cryosparc.compacchetto software SPA
EMAN2Baylor College of Medicine (sviluppato dal laboratorio di Steven Ludtke)https://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2pacchetto software SPA
cisTEMConsiglio Nazionale delle Ricerche del Canada (sviluppato da Tim Grant e colleghi)https://cistem.orgpacchetto software SPA
SPHIREIstituto Max Planck di Fisiologia Molecolare e Baylor College of Medicinehttps://sphire.mpg.depacchetto software SPA
cryoDRGNUniversità di Princeton (sviluppato dal laboratorio di Ellen Zhong)https://cryodrgn.cs.princeton.edupacchetto software SPA
TopazHarvard Medical School (sviluppato dal laboratorio di Travis Bepler)https://github.com/tbepler/topazpacchetto software SPA
crYOLOIstituto Max Planck di Biofisicahttps://cryolo.readthedocs.iopacchetto software SPA
DeformazioneMRC Laboratory of Molecular Biology (sviluppato da Dmitry Tegunov)http://www.warpem.compacchetto software per cryo-ET e STA
ModelAngeloMRC Laboratory of Molecular Biologyhttps://www.modelangelo.orgpacchetto software per cryo-ET e STA
IMODUniversità del Colorado a Boulderhttps://bio3d.colorado.edu/imodpacchetto software per cryo-ET e STA
DynamoCentro Nacional de Biotecnologíaía (CNB-CSIC)https://www.dynamo-em.orgpacchetto software per cryo-ET e STA
emClarityUniversità della California, San Franciscohttps://github.com/StochasticAnalytics/emClaritypacchetto software per cryo-ET e STA
RELION (modulo ET)MRC Laboratory of Molecular Biology (MRC-LMB), Università di Cambridgehttps://relion.readthedocs.iopacchetto software per cryo-ET e STA
EMAN2 (SPT)Baylor College of Medicinehttps://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2pacchetto software per cryo-ET e STA
Deformazione/MMRC Laboratory of Molecular Biologyhttps://warpem.github.iopacchetto software per cryo-ET e STA
AreTomoUniversità di Stanford (sviluppato dai gruppi di Fei Sun e Wah Chiu)https://github.com/czimaginginstitute/AreTomo2pacchetto software per cryo-ET e STA
PEETUniversità del Colorado Boulderhttps://bio3d.colorado.edu/PEETpacchetto software per cryo-ET e STA
PyTomIstituto Max Planck di Biochimicahttps://pytom.orgpacchetto software per cryo-ET e STA
Tomo3DCentro Nazionale Spagnolo di Biotecnologia (CNB-CSIC)https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3dpacchetto software per cryo-ET e STA
crYOLO (3D)Istituto Max Planck di Biofisicahttps://cryolo.readthedocs.iopacchetto software per cryo-ET e STA
AITomCarnegie Mellon Universityhttps://github.com/xulabs/aitompacchetto software per cryo-ET e STA
DIALSDiamond Light Source e collaboratorihttps://dials.github.iopacchetto software microED
XDSIstituto Max Planck per la Ricerca Medica (sviluppato da Wolfgang Kabsch)https://xds.mr.mpg.depacchetto software microED
MOSFLMMRC Laboratory of Molecular Biology (MRC-LMB), Università di Cambridgehttps://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/mosflmpacchetto software microED
SHELXUniversità di Göttingen (sviluppato da George M. Sheldrick)https://shelx.uni-goettingen.depacchetto software microED
PhenixLaboratorio Nazionale Lawrence Berkeley (Consorzio PHENIX)https://phenix-online.orgpacchetto software microED
CootMRC Laboratory of Molecular Biology (MRC-LMB), Università di Cambridgehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/cootpacchetto software microED
Linux (Ubuntu, CentOS/Rocky)Ubuntu: Canonical Ltd.; CentOS: Progetto CentOS; Rocky Linux: Rocky Enterprise Software Foundation (RESF)https://ubuntu.com / https://www.centos.org (legacy) /  https://rockylinux.orgSistema operativo
WindowsMicrosofthttps://www.microsoft.com/windowsSistema operativo
ZFSOracle Corporation (originariamente Sun Microsystems); OpenZFS mantenuto dalla comunità OpenZFShttps://openzfs.orgSistema di file
NFSSun Microsystems (ora mantenuto come standard IETF)https://www.rfc-editor.org/rfc/rfc8881Protocollo
SMB (CIFS)Microsofthttps://learn.microsoft.com/windows-server/storage/file-server/file-server-smb-overviewProtocollo
Microsoft Remote Desktop (RDP)Microsofthttps://learn.microsoft.com/windows-server/remote/remote-desktop-servicesAccesso remoto
NoMachineNoMachinehttps://www.nomachine.comAccesso remoto
TeamViewerTeamViewer SEhttps://www.teamviewer.comAccesso remoto
VirtualGL + TurboVNCVirtualGL: Il progetto VirtualGL; TurboVNC: Il progetto TurboVNChttps://virtualgl.org e https://turbovnc.orgAccesso remoto
CUDANVIDIAhttps://developer.nvidia.com/cuda-toolkitStruttura informatica

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