Flusso di lavoro standardizzato per l'imaging ad alto contenuto e l'elaborazione dei dati

Xinyue Liu; Yili Wang; Zhenting Tan

doi:10.3791/71863

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Articolo metodologico

Flusso di lavoro standardizzato per l'imaging ad alto contenuto e l'elaborazione dei dati

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DOI:

10.3791/71863

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21 agosto 2026

Xinyue Liu¹ , Yili Wang² , Zhenting Tan³

¹College of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, ²Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Institute of Interdisciplinary Studies, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, ³School of Life Science and Technology, Southeast University

In questo articolo

Sommario

In questo studio, presentiamo un protocollo per l'acquisizione standardizzata di immagini ad alto contenuto e l'elaborazione dei dati di cellule marcate con ioduro di propidio (PI) e Hoechst 33342, al fine di eseguire analisi riproducibili della vitalità cellulare mediante flussi di lavoro automatizzati per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.

Abstract

Per affrontare le sfide legate alla bassa riproducibilità causata dalle variazioni operative nell'imaging della ricerca scientifica e alla complessità dell'analisi di un elevato numero di campioni mediante metodi convenzionali, presentiamo un protocollo per la colorazione delle cellule HT22 con PI e Hoechst 33342, seguito da imaging e analisi dei dati utilizzando il sistema di imaging ad alto contenuto (High-Content Imaging System). Questo flusso di lavoro mira a stabilire parametri robusti per le impostazioni di imaging e standard rigorosi di controllo qualità. Il protocollo illustra le impostazioni di imaging dello strumento e il flusso operativo per tre diversi metodi di elaborazione delle immagini forniti dallo strumento: Multi-Wavelength Cell Scoring (Multi), Live-Dead (Live) e Custom Module Editor (CME). I metodi di elaborazione delle immagini vengono confrontati e validati rispetto al metodo tradizionale, ImageJ, al fine di verificarne l'efficacia. Lo studio sintetizza infine un flusso di lavoro per l'utilizzo del sistema di imaging ad alto contenuto per determinare la vitalità cellulare mediante il metodo di doppia colorazione con PI e Hoechst. Standardizzando l'intero processo di imaging e di elaborazione dei dati, lo studio migliora in modo significativo la riproducibilità e l'affidabilità dell'imaging nella ricerca scientifica, fornendo così un solido supporto metodologico per il confronto dei dati tra laboratori e contribuendo al progresso della ricerca scientifica.

Introduzione

Il sistema di imaging ad alto contenuto rappresenta uno strumento fondamentale nella ricerca scientifica moderna, consentendo l'acquisizione di immagini ad alta velocità e la valutazione multiparametrica di cellule danneggiate o indenni¹^,²^,³. Svolge un ruolo insostituibile in diverse discipline. Nel campo delle scienze della vita, aiuta i ricercatori ad esplorare il mondo microscopico di cellule e tessuti⁴^,⁵. Ad esempio, la rilevazione precisa di molecole e strutture marcate con fluorocromi permette una visualizzazione chiara delle strutture fini cellulari e dei cambiamenti dinamici⁶. Nella ricerca in neuroscienze, consente l'acquisizione tridimensionale di neuroni, facilitando l'analisi delle complesse connessioni e dei meccanismi di trasduzione del segnale nelle reti neuronali, fornendo indizi cruciali per comprendere le funzioni cerebrali e la patogenesi delle malattie neurologiche⁷^,⁸^,⁹.

Nonostante i significativi vantaggi della tecnologia del sistema di imaging ad alto contenuto, permangono diversi problemi legati al suo processo di acquisizione delle immagini. Nella fase di preparazione del campione, esiste un elevato grado di soggettività. Nella preparazione dei campioni biologici, processi come la manipolazione cellulare e la colorazione mancano di standard appropriati. Per quanto riguarda i parametri di imaging, si osservano differenze notevoli nei tempi di esposizione e nella scelta delle piastre multiwell tra laboratori e modelli di microscopi ad alto contenuto. Nella fase di elaborazione dei dati, manca una standardizzazione, dal riduzione del rumore e regolazione del contrasto delle immagini grezze all'identificazione dei parametri e determinazione delle caratteristiche d'interesse. Questi problemi portano direttamente a bias nei risultati dell'imaging microscopico, causando una crisi di riproducibilità.

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Protocollo

Questo protocollo utilizza una linea cellulare commerciale (HT22, ATCC) e non prevede soggetti umani o tessuti umani primari. Nessun animale è stato utilizzato in questo studio.

1. Preparazione standardizzata del campione

Preparare le cellule HT22
1. Quando la confluenza delle cellule HT22 raggiunge l'80%¹⁰^,¹¹, scartare il vecchio mezzo. Utilizzare tripsina allo 0,25% per staccare le cellule, incubando per 1–2 min a temperatura ambiente.
2. Aggiungere il mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) in un volume pari a 3 volte quello della tripsina allo 0,25% per arrestare il distacco. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL.
3. Centrifugare a 175 x g per 3 min a temperatura ambiente, quindi scartare il soprannatante. Ri-sospendere le cellule in DMEM completo per ottenere una sospensione monocellulare.
4. Contare le cellule utilizzando una camera di conta. Seminare 5.000 cellule per pozzetto in 100 µL di mezzo completo in una piastra a 96 pozzetti¹².
5. Incubare la piastra a 37 °C con 5% di CO₂ per 24 h. Eseguire il raggruppamento dei campioni, la somministrazione dei trattamenti e le operazioni di colorazione nella piastra a 96 pozzetti in base al disegno sperimentale.
  NOTA: Utilizzare una piastra a 96 pozzetti compatibile con il sistema di imaging. Scegliere una piastra con spessore e geometria del fondo adeguati, secondo le specifiche del produttore. Si raccomandano piastre con fondo in vetro (spessore del fondo 130–170 µm) quando è richiesta una qualità d'immagine superiore¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶.
Procedura di colorazione
1. Assicurarsi che le cellule formino un monostrato singolo e ben disperso e che la confluenza non superi il 70% per minimizzare il sovrapposizione cellulare (Figura 1B).
2. Raggruppare i campioni in base ai requisiti sperimentali e procedere con la colorazione dopo il trattamento. Preparare le soluzioni di colorante lavorative con una concentrazione finale di 6,684 µg/mL per il PI e 10 µg/mL per l’Hoechst 33342¹⁷^,¹⁸.
3. Scartare il vecchio mezzo dalla piastra a 96 pozzetti e lavare ogni pozzetto due volte con 100 µL di PBS. Aggiungere la soluzione di colorante lavorativa e incubare a temperatura ambiente al buio per 30 min per la colorazione.
4. Lavare ogni pozzetto due volte con 100 µL di PBS, quindi aggiungere il DMEM.
  NOTA: Diversi disegni sperimentali possono presentare variazioni nei parametri di carico del campione e di colorazione.

2. Specifiche di imaging e impostazioni dei parametri

Standard dei parametri di imaging
NOTA: Questo studio illustra esclusivamente il flusso di lavoro di imaging a campo ampio per lo strumento dopo la colorazione con PI e Hoechst 33342.
1. Accendere lo strumento e quindi avviare il computer. Aprire il software di analisi fornito con il dispositivo.
2. Caricare la piastra a 96 pozzetti nello strumento. Selezionare il campo visivo con i campioni da acquisire.
3. Nelle impostazioni di obiettivo e fotocamera, impostare l'ingrandimento su "20XPh1SPlanFluorELWDADM" (Nikon, S Plan Fluor, ELWD, 20X/0.45, ∞/0-2, WD 8.2-6.9, OFN22, Ph1, AMD, MRH48230), il binning della fotocamera su "2" e la modalità di acquisizione su "Widefield".
4. In modalità piastra, selezionare i parametri corrispondenti della piastra a 96 pozzetti e regolare i parametri della piastra in base ai dati dimensionali del prodotto.
5. Nelle opzioni del sito, selezionare tipicamente 9 campi per pozzetto per un imaging denso. Nelle opzioni di messa a fuoco automatica, selezionare Abilita messa a fuoco basata su laser.
6. Regolare i parametri di messa a fuoco automatica con laser nella sezione Autofocus, in base allo spessore medio del fondo della piastra misurato in almeno tre pozzetti campione. Regolare di conseguenza lo spessore del fondo, la variazione massima dello spessore del fondo, la variazione massima tra pozzetti adiacenti, la variazione massima all'interno del pozzetto e la variazione massima della piastra.
7. Nella sezione Lunghezze d'onda, impostare il numero di lunghezze d'onda a 3. Per la prima illuminazione, selezionare DAPI. Nella correzione dell'illuminazione, scegliere "Correzione automatica per FL" (Figura 2B).
8. Dopo aver trovato l'immagine, impostare l'esposizione iniziale (ms) a 20–30. Osservare le immagini acquisite e regolare continuamente l'esposizione per ottenere un'intensità di fluorescenza moderata senza sovraesposizione, e impostare la profondità in bit a 16 (Figura 2A).
9. Scegliere il laser con offset z per l'aggiustamento della messa a fuoco. Se la messa a fuoco non è nitida, selezionare Usa stack Z, fare clic su Calcola offset e selezionare una distanza focale appropriata. Selezionare Confocale digitale (info) e impostare i parametri di regolazione per Aumenta nitidezza e Riduci rumore a 0.200.
  NOTA: Se l'esposizione o la chiarezza dell'immagine non sono soddisfacenti, regolare l'esposizione e ricalcolare i parametri di offset.
10. Per la seconda illuminazione, selezionare Cy3. Seguire le stesse impostazioni dei passaggi 2.1.7-2.1.9.
11. Per la terza illuminazione, selezionare TL 25. Seguire le stesse impostazioni dei passaggi 2.1.7-2.1.9.
  NOTA: Impostare la correzione dell'illuminazione in base al canale, e TL 25 deve selezionare Correzione automatica per TL. Nella sezione Lunghezze d'onda, il canale TL deve essere impostato per la localizzazione cellulare e l'osservazione della morfologia.
12. Nella scheda Esegui, assegnare un nome alla piastra secondo la convenzione: nome della piastra-tipo cellulare-ID dell'esperimento-data-ingrandimento dell'obiettivo-tipo di imaging. Confermare i parametri relativi al canale di imaging nella sezione Descrizione.
13. Fare clic su Acquisisci piastra per iniziare l'imaging. Al termine dell'imaging, spegnere in sequenza il software, lo strumento e il computer.
  NOTA: Successivamente, il computer potrà essere acceso solo per l'esportazione delle immagini, l'elaborazione dei dati e l'analisi dei risultati.
Standard e requisiti operativi per l'imaging
1. Centrare il campo visivo nel pozzetto per evitare effetti di bordo (Figura 1A). Durante la configurazione dei parametri di imaging, utilizzare il controllo positivo con l'intensità di fluorescenza più elevata come riferimento. Inoltre, durante la messa a fuoco, scegliere un campo visivo con uno strato singolo di cellule, pulito e privo di detriti.
2. Per la fotocamera, mantenere rigorosamente i valori dei pixel al di sotto di 60000 (il valore massimo è 65535) per evitare la saturazione, che può causare una perdita permanente di informazioni. Se compaiono macchie o aree luminose saturate, ridurre l'esposizione. Allo stesso tempo, non mantenere il tempo di esposizione troppo basso; altrimenti, il rumore dominerà l'immagine.
3. Per segnali di fluorescenza deboli, si consiglia di aumentare leggermente l'esposizione piuttosto che alzare forzatamente i parametri, per evitare danni irreversibili causati dallo sbiancamento fotolitico.
  NOTA: Per l'imaging in campo chiaro, questi principi possono essere adeguatamente attenuati, ma il focus principale rimane sull'integrità del segnale e sulla protezione del campione.
4. Assicurarsi che i contorni periferici del campione siano chiaramente distinguibili e che le strutture interne fini (come granuli, fibre, organelli) presentino una trama distinta, senza sfocature, e che la luce diffusa di fondo sia distribuita uniformemente, senza macchie luminose locali o aloni sfocati. Evitare rigorosamente la sovramessa a fuoco e la sottomessa a fuoco.
5. Assicurarsi che siano presenti gruppi normali, positivi, negativi e sperimentali, e che ogni gruppo di trattamento abbia almeno 3 pozzetti paralleli. Si raccomanda di disporre i pozzetti paralleli in senso verticale.

3. Elaborazione e analisi delle immagini

NOTA: Questo documento descrive tre metodi di elaborazione delle immagini forniti dal software associato allo strumento, tutti adatti al protocollo di colorazione utilizzato in questo studio. Sebbene questi metodi condividano lo stesso principio fondamentale di riconoscimento, differiscono per le tecniche di elaborazione specifiche e per i tipi di risultati ottenuti. Il flusso di lavoro comune per l'elaborazione delle immagini è stato il seguente: aprire il file → caricare l'immagine originale con il metodo di elaborazione corrispondente → impostare i parametri del canale appropriati → generare una maschera → impostare il tipo di dati da misurare in Measure → eseguire l'analisi → osservare i risultati → esportare i dati.

Aprire il software di analisi fornito con il dispositivo → Esamina la piastra → Selezionare la piastra.
Nella vista Data, selezionare Disposizione dei pozzetti e scegliere un campo visivo dal gruppo positivo come riferimento.
Sotto Esegui analisi, selezionare il programma di elaborazione corrispondente e impostare i parametri di elaborazione delle immagini oppure esportare l'immagine.
Dopo aver impostato e salvato i parametri, selezionare Esegui su tutti i pozzetti / Esegui sulle selezioni / Esegui sul sito visualizzato in base all'oggetto di impostazione dei parametri.
Al termine dell'elaborazione dei dati da parte del computer, nella scheda Misure, selezionare il programma di elaborazione dati corrispondente in Analisi e scegliere diversi risultati di misurazione in Misura per verificare i dati.
Fare clic su Apri registro per iniziare l'esportazione dei dati. Impostare i seguenti dettagli nelle impostazioni dei parametri per i tre metodi di elaborazione delle immagini:
1. Metodo di elaborazione delle immagini uno: Valutazione cellulare multilunghezza d'onda
  1. Selezionare il programma Valutazione cellulare multilunghezza d'onda e configurare le impostazioni. Impostare il Numero di lunghezze d'onda. Scegliere Standard per l'Algoritmo.
  2. Impostare i parametri di riconoscimento per tutti i nuclei in base ai risultati della colorazione con PI. L'immagine sorgente W1 predefinita è il canale DAPI.
  3. Impostare la Larghezza minima approssimativa a 8–10 µm e la Larghezza massima approssimativa a 30–35 µm, in base alle dimensioni degli oggetti singoli da riconoscere.
  4. Impostare l'intensità al di sopra dello sfondo locale a 2.000–10.000 livelli di grigio. Utilizzare l'Anteprima per testare e regolare le impostazioni in base ai risultati del riconoscimento.
  5. Impostare i parametri W2 in base ai risultati della colorazione con Hoechst 33342. Assegnare un nome a questo canale. L'immagine sorgente W2 è Cy3.
  6. Nella sezione Area colorata, selezionare la regione colorata da questo canale come Nucleo. Seguire le stesse impostazioni dei punti 3.6.1.3–3.6.1.4 per le impostazioni successive. In Configura registro riepilogativo o Configura registro dati (Cellule), selezionare la configurazione del parametro corrispondente in base ai parametri di risultato desiderati.
    NOTA: Generalmente, Configura registro riepilogativo viene utilizzato per impostare i tipi di dati richiesti, mentre Configura registro dati (Cellule) viene utilizzato quando è necessario un'etichettatura specifica delle singole cellule.
  7. Eseguire una prova preliminare per osservare il riconoscimento. Se i risultati del riconoscimento sono soddisfacenti, salvare le impostazioni.
2. Metodo di elaborazione delle immagini due: Vivo-Morto
  1. Selezionare il programma Vivo-Morto e iniziare a configurare le impostazioni. Impostare i parametri della Lunghezza d'onda 1 e i parametri della Lunghezza d'onda 2 in sequenza.
  2. Sotto Parametri lunghezza d'onda 1, impostare la Sorgente lunghezza d'onda 1 su DAPI. L'Algoritmo predefinito è "Standard".
  3. Impostare il Tipo di cellula colorata su Tutte le cellule e l'Area colorata su Nucleo in base alle condizioni di colorazione. Impostare la Larghezza minima approssimativa, la Larghezza massima approssimativa e l'intensità al di sopra dello sfondo locale utilizzando le stesse impostazioni del metodo Valutazione cellulare multilunghezza d'onda.
  4. Selezionare Dividi oggetti contigui e utilizzare l'Anteprima per testare.
  5. Sotto Parametri lunghezza d'onda 2, impostare la Sorgente lunghezza d'onda 2 su Cy3.
  6. Impostare il Tipo di cellula colorata su Morte e l'Area colorata su Nucleo in base alla colorazione specifica. Impostare la Larghezza minima approssimativa, la Larghezza massima approssimativa e l'intensità al di sopra dello sfondo locale utilizzando le stesse impostazioni del metodo Valutazione cellulare multilunghezza d'onda.
  7. Fare clic su Configura registro riepilogativo e selezionare la configurazione del parametro in base ai tipi di dati richiesti. Eseguire una prova preliminare per osservare il riconoscimento. Se i risultati del riconoscimento sono soddisfacenti, salvare le impostazioni.
3. Metodo di elaborazione delle immagini tre: modalità sviluppatore CME
  1. Selezionare il programma Modulo personalizzato (CME) e iniziare a configurare le impostazioni. Configurare i Nomi immagine e i canali.
    NOTA: Per facilitare le impostazioni successive dei parametri, impostarli generalmente sui nomi dei canali utilizzati durante l'acquisizione delle immagini.
  2. In Trova oggetti, aprire Soglia semplice per impostare il riconoscimento per l'intero set.
  3. Impostare Sorgente in corrispondenza del Nome immagine. In base all'intervallo di valori di grigio a 16 bit, inserire 0 in Soglia bassa e 65535 in Soglia alta.
  4. Assegnare un nome al risultato dell'elaborazione in Risultato, applicare e osservare la situazione di marcatura. In Trova oggetti, aprire Trova blob per generare un risultato Maschera.
  5. Impostare Sorgente in corrispondenza del Nome immagine, come in Soglia semplice. Impostare la Larghezza minima approssimativa, la Larghezza massima approssimativa e l'intensità al di sopra dello sfondo locale come nelle impostazioni del metodo Valutazione cellulare multilunghezza d'onda.
  6. Assegnare un nome al risultato dell'elaborazione in Risultato, applicare e osservare il risultato di marcatura. Per il risultato di riconoscimento Trova blob, utilizzare lo strumento Modifica oggetti per filtrare, espandere, ridurre e invertire.
  7. Sotto Misura, impostare Modificato. Negli Ingressi di misura, inserire 1 per Valore area standard e selezionare Crea sovrapposizione oggetti.
  8. In Oggetti da misurare, selezionare la sorgente degli oggetti marcati in Maschera degli oggetti e l'immagine sorgente da misurare in Immagine da misurare. Scegliere il Nome di misura corrispondente in base ai parametri del risultato di elaborazione richiesti, applicare e osservare il risultato del riconoscimento del parametro.
  9. Dopo aver confermato le impostazioni dei parametri, salvare la configurazione.
4. Metodo generale: ImageJ
  NOTA: Analizzare i risultati di imaging utilizzando il metodo ImageJ per immagini fluorescenti¹⁹ e quindi eseguire un'analisi comparativa con i tre metodi di questo strumento.
  1. Aprire il software ImageJ. Importazione immagine: File → Apri → Selezionare l'immagine originale in scala di grigi da analizzare.
  2. Convertire l'immagine in 8 bit: Immagine → Tipo → 8 bit. Riconoscimento valore di grigio: Immagine → Regola → Soglia → Predefinito, Rosso → Selezionare Sfondo scuro → Imposta → OK.
    NOTA: Se il riconoscimento dell'area rossa non è soddisfacente, sostituire Predefinito con uno dei 16 modelli di riconoscimento ImageJ integrati oppure regolare il cursore nella finestra di dialogo.
  3. Impostare parametri: Analizza → Imposta misure. Nella finestra di dialogo che appare, selezionare Area, Valore medio di grigio, Densità integrata, Limita alla soglia, Mostra etichetta, Reindirizza a Nessuno per impostazione predefinita e inserire 2 per Cifre decimali (0-9). Fare clic su OK.
  4. Analizzare i risultati di riconoscimento: Analizza → Misura. Salvare i risultati: Nella finestra di dialogo risultati che appare, File → Salva con nome e selezionare la posizione di salvataggio.
Esportazione immagine
1. Selezionare un campo visivo di un pozzetto positivo di alta qualità come standard di riferimento.
  NOTA: I requisiti di base di qualità sono autenticità, messa a fuoco accurata, esposizione adatta (16 bit) e contrasto appropriato (un rapporto segnale-rumore più elevato è preferibile). I requisiti di alta qualità includono caratteristiche distinte, contrasto, praticità, cambiamenti morfologici intuitivi e punti chiave evidenziati.
2. Sotto Esegui analisi, selezionare ExportPro nella sezione Analisi e avviare Configurazione esecuzione per analisi. In Seleziona opzioni di output, scegliere Canale singolo, Sovrapposizione a colori, riduci immagine (opzionale) e Barra di scala (opzionale) in base ai requisiti dell'immagine.
3. Selezionare le immagini dei canali fluorescenti da esportare per ogni campo visivo. In Canale singolo, selezionare un colore per ogni canale, ad esempio Blu per il canale DAPI e Scala di grigi per il canale TL.
4. In Sovrapposizione a colori, selezionare in ordine i canali corrispondenti a CAMPO LUMINOSO, ROSSO, BLU e VERDE (Selezionare la lunghezza d'onda del colore per la sovrapposizione a colori). Impostare il Numero a 100; osservare l'anteprima dell'immagine e accettare il risultato dell'anteprima.
5. In output, selezionare la cartella in cui verranno memorizzate le immagini esportate in Esporta nella cartella. Avviare l'esecuzione.
  NOTA: Le immagini di uno stesso lotto non devono essere esportate separatamente; un lotto di immagini si riferisce a un insieme di immagini provenienti da quattro campioni principali: controllo negativo, controllo positivo, gruppo di controllo di base e gruppo sperimentale target, tutti ottenuti in condizioni sperimentali completamente identiche.
Confronto dei metodi di elaborazione delle immagini
1. Selezionare 9 campi visivi e confrontare il conteggio manuale tradizionale di cellule morte e vive con i metodi Valutazione cellulare multilunghezza d'onda, Vivo-Morto, CME e ImageJ per il conteggio di cellule vive, cellule morte e del rapporto tra cellule morte e vive. Utilizzare GraphPad Prism versione 10.1 per eseguire un'ANOVA a un fattore, accompagnata dal test di confronti multipli di Tukey, per analizzare le differenze.
2. Selezionare 81 campi visivi e confrontare le differenze nel conteggio cellulare, area e intensità tra i metodi Valutazione cellulare multilunghezza d'onda, Vivo-Morto, CME e ImageJ. Utilizzare GraphPad Prism versione 10.1 per eseguire un'ANOVA a un fattore, accompagnata dal test di confronti multipli di Tukey, per analizzare le differenze.
  NOTA: Gli esperimenti di coltura cellulare e colorazione devono essere eseguiti all'interno di un armadio a sicurezza biologica. Smaltire i liquidi di scarto, le punte e gli altri rifiuti sperimentali secondo le normative di laboratorio. Assicurarsi una protezione completa per tutta la durata dell'esperimento.

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Risultati

Impatto della preparazione standardizzata sulla qualità dell'immagine

I parametri della piastra sono stati configurati per garantire che lo strumento potesse individuare in modo affidabile il livello dell'immagine cellulare. Campioni preparati come un singolo strato di cellule con una confluenza moderata hanno facilitato il messa a fuoco dell'immagine a diverse ingrandimenti dell'obiettivo e migliorato il riconoscimento delle immagini e l'analisi quantitativa. Una preparazione...

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Discussione

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Dichiarazioni

Tutti gli autori dichiarano l'assenza di conflitti di interessi. Durante la traduzione del manoscritto, Zhipu AI è stato utilizzato esclusivamente per la traduzione e non per la generazione di dati di ricerca, risultati sperimentali o contenuti accademici principali. Gli autori si assumono piena responsabilità per il contenuto del manoscritto.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il sostegno fornito dalla Fondazione della Scuola di Medicina Tradizionale Cinese dell'Università di Chengdu. Gli autori ringraziano il sostegno ottenuto dal finanziamento MPRC2022034. Questo finanziamento è utilizzato per sviluppare un metodo di imaging dinamico 3D per i batteri intestinali nella Decozione Erchen nel trattamento di topi obesi semplici. Gli autori riconoscono la piattaforma di ricerca fornita dall'Istituto Innovativo di Medicina e Farmacia Cinese dell'Università di Chengdu di Medicina Tradizionale Cinese e dall'Istituto di Studi Interdisciplinari.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubo da centrifuga da 1,5 mL	Labigic Technology Co., Ltd.	MCT-001-150
Punte per pipetta da 1000 µL	Labigic Technology Co., Ltd.	35423003E
Tubo da centrifuga da 15 mL	Labigic Technology Co., Ltd.	CT-002-15A
Punte per pipetta da 2,5 µL	Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.	B10T
Punte per pipetta da 200 µL	Labigic Technology Co., Ltd.	T-001-200
Tubo da centrifuga da 50 mL	Labigic Technology Co., Ltd.	CT-002-50A
Piastra per coltura cellulare a 96 pozzetti	Corning Incorporated	3599
Pipetta monocanale regolabile, 0,1–2,5 μL	Eppendorf SE	3120000216
Pipetta monocanale regolabile, 100–1000 μL	Eppendorf SE	3120000267
Pipetta monocanale regolabile, 20–200 μL	Eppendorf SE	3120000259
Pipetta monocanale regolabile, 2–20 μL	Eppendorf SE	3120000232
Piatto per coltura cellulare	Corning Incorporated	430167
Flaconi criogenici	Labigic Technology Co., Ltd.	BS-20-ST
Dimetilsolfossido (DMSO)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	D8371
Mezzo Dulbecco modificato di Eagle (DMEM)	Life Technologies Limited	11966-025	In questo studio, il DMEM completo è stato preparato utilizzando il 10% di FBS, l'1% di soluzione di penicillina-streptomicina e l'89% di DMEM.
Incubatore CO₂ ESCO CelCulture	Esco Micro Pte. Ltd.	CCL-170B-8
Serum fetale bovino (FBS, Superfine)	Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.	164210-50
Coloranti fluorescenti Hoechst 33342	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	B8040
Cellule HT22	Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.	CL-0697
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ è uno dei software di elaborazione delle immagini utilizzati nel manoscritto.
Sistema di imaging ad alto contenuto confocale ImageXpress Micro	Molecular Devices, LLC	ImageXpress Micro Confocal	Nel manoscritto, utilizzare "Sistema di imaging ad alto contenuto" come sostituto del nome dello strumento.
Centrifuga refrigerata a bassa velocità	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.	L530R
Software di acquisizione e analisi delle immagini ad alto contenuto MetaXpress	Molecular Devices, LLC		Il software è un componente abbinato al sistema di imaging ad alto contenuto confocale ImageXpress® Micro. Nel manoscritto, "Il software fornito con lo strumento" si riferisce a questo software.
Cappa a flusso laminare verticale OptiMair	Esco Micro Pte. Ltd.	ACB-4E1
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging Inc.	PM996
PBS	Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd	YC-5013
Soluzione di penicillina-streptomicina	Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.	PB180120
Soluzione di ioduro di propidio (PI)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	C0080
Soluzione di tripsina-EDTA	BasalMedia Technology Co.,Ltd.	S310KJ

Riferimenti

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Menduti G, Boido M. Recent advances in high-content imaging and analysis in iPSC-based modelling of neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 2023;24(19).
Park JC, Mook-Jung I. Toward brain organoid-based precision medicine in neurodegenerative diseases. Organoid. 2022;2.
Geyer M, Schreyer D, Gaul LM, Pfeffer S, Pilarsky C, Queiroz K. A microfluidic-based PDAC organoid system reveals the impact of hypoxia in response to treatment. Cell Death Discovery. 2023;9:20.
Huang CJ, Shieh PC, Yang JS, et al. Pterostilbene suppressed cell viability, induced apoptosis and autophagy of cisplatin-resistant gastric cancer cells. Anticancer Res. 2025;45(2):511-523.
Wang G, Li Y, Sun T, et al. BMSC affinity peptide-functionalized β-tricalcium phosphate scaffolds promoting repair of osteonecrosis of the femoral head. J Orthop Surg Res. 2019;14(1):204.
Uzoechi SC, Collins BE, Badeaux CJ, et al. Effects of amyloid beta (aβ) oligomers on blood–brain barrier using a 3D microfluidic vasculature-on-a-chip model. Appl Sci. 2024;14(9). doi:10.3390/app14093917
Pereira JD, DuBreuil DM, Devlin AC, et al. Human sensorimotor organoids derived from healthy and amyotrophic lateral sclerosis stem cells form neuromuscular junctions. Nat Commun. 2021;12(1):4744.
Cromwell EF, Leung M, Hammer M, Thai A, Rajendra R, Sirenko O. Disease modeling with 3D cell-based assays using a novel flowchip system and high-content imaging. SLAS Technol. 2021;26(3):237-248.
Tabęcka-Łonczyńska A, Skóra B, Szlachcikowska D, et al. Impact of Hericium erinaceus and Ganoderma lucidum metabolites on AhR activation in neuronal HT-22 cells. Pharmacol Rep. 2025;77(6):1557-1572.
Tang J, Chen R, Wang L, et al. Melatonin attenuates thrombin-induced inflammation in BV2 cells and then protects HT22 cells from apoptosis. Inflammation. 2020;43(5):1959-1970.
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