Articolo metodologico

Flusso di lavoro standardizzato per l'imaging ad alto contenuto e l'elaborazione dei dati

DOI:

10.3791/71863

⸱

21 agosto 2026

 ,  , 
1College of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Institute of Interdisciplinary Studies, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Life Science and Technology, Southeast University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo studio, presentiamo un protocollo per l'acquisizione standardizzata di immagini ad alto contenuto e l'elaborazione dei dati di cellule marcate con ioduro di propidio (PI) e Hoechst 33342, al fine di eseguire analisi riproducibili della vitalità cellulare mediante flussi di lavoro automatizzati per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per affrontare le sfide legate alla bassa riproducibilità causata dalle variazioni operative nell'imaging della ricerca scientifica e alla complessità dell'analisi di un elevato numero di campioni mediante metodi convenzionali, presentiamo un protocollo per la colorazione delle cellule HT22 con PI e Hoechst 33342, seguito da imaging e analisi dei dati utilizzando il sistema di imaging ad alto contenuto (High-Content Imaging System). Questo flusso di lavoro mira a stabilire parametri robusti per le impostazioni di imaging e standard rigorosi di controllo qualità. Il protocollo illustra le impostazioni di imaging dello strumento e il flusso operativo per tre diversi metodi di elaborazione delle immagini forniti dallo strumento: Multi-Wavelength Cell Scoring (Multi), Live-Dead (Live) e Custom Module Editor (CME). I metodi di elaborazione delle immagini vengono confrontati e validati rispetto al metodo tradizionale, ImageJ, al fine di verificarne l'efficacia. Lo studio sintetizza infine un flusso di lavoro per l'utilizzo del sistema di imaging ad alto contenuto per determinare la vitalità cellulare mediante il metodo di doppia colorazione con PI e Hoechst. Standardizzando l'intero processo di imaging e di elaborazione dei dati, lo studio migliora in modo significativo la riproducibilità e l'affidabilità dell'imaging nella ricerca scientifica, fornendo così un solido supporto metodologico per il confronto dei dati tra laboratori e contribuendo al progresso della ricerca scientifica.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sistema di imaging ad alto contenuto rappresenta uno strumento fondamentale nella ricerca scientifica moderna, consentendo l'acquisizione di immagini ad alta velocità e la valutazione multiparametrica di cellule danneggiate o indenni1,2,3. Svolge un ruolo insostituibile in diverse discipline. Nel campo delle scienze della vita, aiuta i ricercatori ad esplorare il mondo microscopico di cellule e tessuti4,5. Ad esempio, la rilevazione precisa di molecole e strutture marcate con fluorocromi permette una visualizzazione chiara delle strutture fini cellulari e dei cambiamenti dinamici6. Nella ricerca in neuroscienze, consente l'acquisizione tridimensionale di neuroni, facilitando l'analisi delle complesse connessioni e dei meccanismi di trasduzione del segnale nelle reti neuronali, fornendo indizi cruciali per comprendere le funzioni cerebrali e la patogenesi delle malattie neurologiche7,8,9.

Nonostante i significativi vantaggi della tecnologia del sistema di imaging ad alto contenuto, permangono diversi problemi legati al suo processo di acquisizione delle immagini. Nella fase di preparazione del campione, esiste un elevato grado di soggettività. Nella preparazione dei campioni biologici, processi come la manipolazione cellulare e la colorazione mancano di standard appropriati. Per quanto riguarda i parametri di imaging, si osservano differenze notevoli nei tempi di esposizione e nella scelta delle piastre multiwell tra laboratori e modelli di microscopi ad alto contenuto. Nella fase di elaborazione dei dati, manca una standardizzazione, dal riduzione del rumore e regolazione del contrasto delle immagini grezze all'identificazione dei parametri e determinazione delle caratteristiche d'interesse. Questi problemi portano direttamente a bias nei risultati dell'imaging microscopico, causando una crisi di riproducibilità.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo utilizza una linea cellulare commerciale (HT22, ATCC) e non prevede soggetti umani o tessuti umani primari. Nessun animale è stato utilizzato in questo studio.

1. Preparazione standardizzata del campione

  1. Preparare le cellule HT22
    1. Quando la confluenza delle cellule HT22 raggiunge l'80%10,11, scartare il vecchio mezzo. Utilizzare tripsina allo 0,25% per staccare le cellule, incubando per 1–2 min a temperatura ambiente.
    2. Aggiungere il mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) in un volume pari a 3 volte quello della tripsina allo 0,25% per arrestare il distacco. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL.
    3. Centrifugare a 175 x g per 3 min a temperatura ambiente, quindi scartare il soprannatante. Ri-sospendere le cellule in DMEM completo per ottenere una sospensione monocellulare.
    4. Contare le cellule utilizzando una camera di conta. Seminare 5.000 cellule per pozzetto in 100 µL di mezzo completo in una piastra a 96 pozzetti12.
    5. Incubare la piastra a 37 °C con 5% di CO2 per 24 h. Eseguire il raggruppamento dei campioni, la somministrazione dei trattamenti e le operazioni di colorazione nella piastra a 96 pozzetti in base al disegno sperimentale.
      ​NOTA: Utilizzare una piastra a 96 pozzetti compatibile con il sistema di imaging. Scegliere una piastra con spessore e geometria del fondo adeguati, secondo le specifiche del produttore. Si raccomandano piastre con fondo in vetro (spessore del fondo 130–170 µm) quando è richiesta una qualità d'immagine superiore13,14,15,16.
  2. Procedura di colorazione
    1. Assicurarsi che le cellule formino un monostrato singolo e ben disperso e che la confluenza non superi il 70% per minimizzare il sovrapposizione cellulare (Figura 1B).
    2. Raggruppare i campioni in base ai requisiti sperimentali e procedere con la colorazione dopo il trattamento. Preparare le soluzioni di colorante lavorative con una concentrazione finale di 6,684 µg/mL per il PI e 10 µg/mL per l’Hoechst 3334217,18.
    3. Scartare il vecchio mezzo dalla piastra a 96 pozzetti e lavare ogni pozzetto due volte con 100 µL di PBS. Aggiungere la soluzione di colorante lavorativa e incubare a temperatura ambiente al buio per 30 min per la colorazione.
    4. Lavare ogni pozzetto due volte con 100 µL di PBS, quindi aggiungere il DMEM.
      NOTA: Diversi disegni sperimentali possono presentare variazioni nei parametri di carico del campione e di colorazione.

2. Specifiche di imaging e impostazioni dei parametri

  1. Standard dei parametri di imaging
    ​NOTA: Questo studio illustra esclusivamente il flusso di lavoro di imaging a campo ampio per lo strumento dopo la colorazione con PI e Hoechst 33342.
    1. Accendere lo strumento e quindi avviare il computer. Aprire il software di analisi fornito con il dispositivo.
    2. Caricare la piastra a 96 pozzetti nello strumento. Selezionare il campo visivo con i campioni da acquisire.
    3. Nelle impostazioni di obiettivo e fotocamera, impostare l'ingrandimento su "20XPh1SPlanFluorELWDADM" (Nikon, S Plan Fluor, ELWD, 20X/0.45, ∞/0-2, WD 8.2-6.9, OFN22, Ph1, AMD, MRH48230), il binning della fotocamera su "2" e la modalità di acquisizione su "Widefield".
    4. In modalità piastra, selezionare i parametri corrispondenti della piastra a 96 pozzetti e regolare i parametri della piastra in base ai dati dimensionali del prodotto.
    5. Nelle opzioni del sito, selezionare tipicamente 9 campi per pozzetto per un imaging denso. Nelle opzioni di messa a fuoco automatica, selezionare Abilita messa a fuoco basata su laser.
    6. Regolare i parametri di messa a fuoco automatica con laser nella sezione Autofocus, in base allo spessore medio del fondo della piastra misurato in almeno tre pozzetti campione. Regolare di conseguenza lo spessore del fondo, la variazione massima dello spessore del fondo, la variazione massima tra pozzetti adiacenti, la variazione massima all'interno del pozzetto e la variazione massima della piastra.
    7. Nella sezione Lunghezze d'onda, impostare il numero di lunghezze d'onda a 3. Per la prima illuminazione, selezionare DAPI. Nella correzione dell'illuminazione, scegliere "Correzione automatica per FL" (Figura 2B).
    8. Dopo aver trovato l'immagine, impostare l'esposizione iniziale (ms) a 20–30. Osservare le immagini acquisite e regolare continuamente l'esposizione per ottenere un'intensità di fluorescenza moderata senza sovraesposizione, e impostare la profondità in bit a 16 (Figura 2A).
    9. Scegliere il laser con offset z per l'aggiustamento della messa a fuoco. Se la messa a fuoco non è nitida, selezionare Usa stack Z, fare clic su Calcola offset e selezionare una distanza focale appropriata. Selezionare Confocale digitale (info) e impostare i parametri di regolazione per Aumenta nitidezza e Riduci rumore a 0.200.
      NOTA: Se l'esposizione o la chiarezza dell'immagine non sono soddisfacenti, regolare l'esposizione e ricalcolare i parametri di offset.
    10. Per la seconda illuminazione, selezionare Cy3. Seguire le stesse impostazioni dei passaggi 2.1.7-2.1.9.
    11. Per la terza illuminazione, selezionare TL 25. Seguire le stesse impostazioni dei passaggi 2.1.7-2.1.9.
      NOTA: Impostare la correzione dell'illuminazione in base al canale, e TL 25 deve selezionare Correzione automatica per TL. Nella sezione Lunghezze d'onda, il canale TL deve essere impostato per la localizzazione cellulare e l'osservazione della morfologia.
    12. Nella scheda Esegui, assegnare un nome alla piastra secondo la convenzione: nome della piastra-tipo cellulare-ID dell'esperimento-data-ingrandimento dell'obiettivo-tipo di imaging. Confermare i parametri relativi al canale di imaging nella sezione Descrizione.
    13. Fare clic su Acquisisci piastra per iniziare l'imaging. Al termine dell'imaging, spegnere in sequenza il software, lo strumento e il computer.
      ​NOTA: Successivamente, il computer potrà essere acceso solo per l'esportazione delle immagini, l'elaborazione dei dati e l'analisi dei risultati.
  2. Standard e requisiti operativi per l'imaging
    1. Centrare il campo visivo nel pozzetto per evitare effetti di bordo (Figura 1A). Durante la configurazione dei parametri di imaging, utilizzare il controllo positivo con l'intensità di fluorescenza più elevata come riferimento. Inoltre, durante la messa a fuoco, scegliere un campo visivo con uno strato singolo di cellule, pulito e privo di detriti.
    2. Per la fotocamera, mantenere rigorosamente i valori dei pixel al di sotto di 60000 (il valore massimo è 65535) per evitare la saturazione, che può causare una perdita permanente di informazioni. Se compaiono macchie o aree luminose saturate, ridurre l'esposizione. Allo stesso tempo, non mantenere il tempo di esposizione troppo basso; altrimenti, il rumore dominerà l'immagine.
    3. Per segnali di fluorescenza deboli, si consiglia di aumentare leggermente l'esposizione piuttosto che alzare forzatamente i parametri, per evitare danni irreversibili causati dallo sbiancamento fotolitico.
      NOTA: Per l'imaging in campo chiaro, questi principi possono essere adeguatamente attenuati, ma il focus principale rimane sull'integrità del segnale e sulla protezione del campione.
    4. Assicurarsi che i contorni periferici del campione siano chiaramente distinguibili e che le strutture interne fini (come granuli, fibre, organelli) presentino una trama distinta, senza sfocature, e che la luce diffusa di fondo sia distribuita uniformemente, senza macchie luminose locali o aloni sfocati. Evitare rigorosamente la sovramessa a fuoco e la sottomessa a fuoco.
    5. Assicurarsi che siano presenti gruppi normali, positivi, negativi e sperimentali, e che ogni gruppo di trattamento abbia almeno 3 pozzetti paralleli. Si raccomanda di disporre i pozzetti paralleli in senso verticale.

3. Elaborazione e analisi delle immagini

NOTA: Questo documento descrive tre metodi di elaborazione delle immagini forniti dal software associato allo strumento, tutti adatti al protocollo di colorazione utilizzato in questo studio. Sebbene questi metodi condividano lo stesso principio fondamentale di riconoscimento, differiscono per le tecniche di elaborazione specifiche e per i tipi di risultati ottenuti. Il flusso di lavoro comune per l'elaborazione delle immagini è stato il seguente: aprire il file → caricare l'immagine originale con il metodo di elaborazione corrispondente → impostare i parametri del canale appropriati → generare una maschera → impostare il tipo di dati da misurare in Measure → eseguire l'analisi → osservare i risultati → esportare i dati.

  1. Aprire il software di analisi fornito con il dispositivo → Esamina la piastra → Selezionare la piastra.
  2. Nella vista Data, selezionare Disposizione dei pozzetti e scegliere un campo visivo dal gruppo positivo come riferimento.
  3. Sotto Esegui analisi, selezionare il programma di elaborazione corrispondente e impostare i parametri di elaborazione delle immagini oppure esportare l'immagine.
  4. Dopo aver impostato e salvato i parametri, selezionare Esegui su tutti i pozzetti / Esegui sulle selezioni / Esegui sul sito visualizzato in base all'oggetto di impostazione dei parametri.
  5. Al termine dell'elaborazione dei dati da parte del computer, nella scheda Misure, selezionare il programma di elaborazione dati corrispondente in Analisi e scegliere diversi risultati di misurazione in Misura per verificare i dati.
  6. Fare clic su Apri registro per iniziare l'esportazione dei dati. Impostare i seguenti dettagli nelle impostazioni dei parametri per i tre metodi di elaborazione delle immagini:
    1. Metodo di elaborazione delle immagini uno: Valutazione cellulare multilunghezza d'onda
      1. Selezionare il programma Valutazione cellulare multilunghezza d'onda e configurare le impostazioni. Impostare il Numero di lunghezze d'onda. Scegliere Standard per l'Algoritmo.
      2. Impostare i parametri di riconoscimento per tutti i nuclei in base ai risultati della colorazione con PI. L'immagine sorgente W1 predefinita è il canale DAPI.
      3. Impostare la Larghezza minima approssimativa a 8–10 µm e la Larghezza massima approssimativa a 30–35 µm, in base alle dimensioni degli oggetti singoli da riconoscere.
      4. Impostare l'intensità al di sopra dello sfondo locale a 2.000–10.000 livelli di grigio. Utilizzare l'Anteprima per testare e regolare le impostazioni in base ai risultati del riconoscimento.
      5. Impostare i parametri W2 in base ai risultati della colorazione con Hoechst 33342. Assegnare un nome a questo canale. L'immagine sorgente W2 è Cy3.
      6. Nella sezione Area colorata, selezionare la regione colorata da questo canale come Nucleo. Seguire le stesse impostazioni dei punti 3.6.1.3–3.6.1.4 per le impostazioni successive. In Configura registro riepilogativo o Configura registro dati (Cellule), selezionare la configurazione del parametro corrispondente in base ai parametri di risultato desiderati.
        NOTA: Generalmente, Configura registro riepilogativo viene utilizzato per impostare i tipi di dati richiesti, mentre Configura registro dati (Cellule) viene utilizzato quando è necessario un'etichettatura specifica delle singole cellule.
      7. Eseguire una prova preliminare per osservare il riconoscimento. Se i risultati del riconoscimento sono soddisfacenti, salvare le impostazioni.
    2. Metodo di elaborazione delle immagini due: Vivo-Morto
      1. Selezionare il programma Vivo-Morto e iniziare a configurare le impostazioni. Impostare i parametri della Lunghezza d'onda 1 e i parametri della Lunghezza d'onda 2 in sequenza.
      2. Sotto Parametri lunghezza d'onda 1, impostare la Sorgente lunghezza d'onda 1 su DAPI. L'Algoritmo predefinito è "Standard".
      3. Impostare il Tipo di cellula colorata su Tutte le cellule e l'Area colorata su Nucleo in base alle condizioni di colorazione. Impostare la Larghezza minima approssimativa, la Larghezza massima approssimativa e l'intensità al di sopra dello sfondo locale utilizzando le stesse impostazioni del metodo Valutazione cellulare multilunghezza d'onda.
      4. Selezionare Dividi oggetti contigui e utilizzare l'Anteprima per testare.
      5. Sotto Parametri lunghezza d'onda 2, impostare la Sorgente lunghezza d'onda 2 su Cy3.
      6. Impostare il Tipo di cellula colorata su Morte e l'Area colorata su Nucleo in base alla colorazione specifica. Impostare la Larghezza minima approssimativa, la Larghezza massima approssimativa e l'intensità al di sopra dello sfondo locale utilizzando le stesse impostazioni del metodo Valutazione cellulare multilunghezza d'onda.
      7. Fare clic su Configura registro riepilogativo e selezionare la configurazione del parametro in base ai tipi di dati richiesti. Eseguire una prova preliminare per osservare il riconoscimento. Se i risultati del riconoscimento sono soddisfacenti, salvare le impostazioni.
    3. Metodo di elaborazione delle immagini tre: modalità sviluppatore CME
      1. Selezionare il programma Modulo personalizzato (CME) e iniziare a configurare le impostazioni. Configurare i Nomi immagine e i canali.
        NOTA: Per facilitare le impostazioni successive dei parametri, impostarli generalmente sui nomi dei canali utilizzati durante l'acquisizione delle immagini.
      2. In Trova oggetti, aprire Soglia semplice per impostare il riconoscimento per l'intero set.
      3. Impostare Sorgente in corrispondenza del Nome immagine. In base all'intervallo di valori di grigio a 16 bit, inserire 0 in Soglia bassa e 65535 in Soglia alta.
      4. Assegnare un nome al risultato dell'elaborazione in Risultato, applicare e osservare la situazione di marcatura. In Trova oggetti, aprire Trova blob per generare un risultato Maschera.
      5. Impostare Sorgente in corrispondenza del Nome immagine, come in Soglia semplice. Impostare la Larghezza minima approssimativa, la Larghezza massima approssimativa e l'intensità al di sopra dello sfondo locale come nelle impostazioni del metodo Valutazione cellulare multilunghezza d'onda.
      6. Assegnare un nome al risultato dell'elaborazione in Risultato, applicare e osservare il risultato di marcatura. Per il risultato di riconoscimento Trova blob, utilizzare lo strumento Modifica oggetti per filtrare, espandere, ridurre e invertire.
      7. Sotto Misura, impostare Modificato. Negli Ingressi di misura, inserire 1 per Valore area standard e selezionare Crea sovrapposizione oggetti.
      8. In Oggetti da misurare, selezionare la sorgente degli oggetti marcati in Maschera degli oggetti e l'immagine sorgente da misurare in Immagine da misurare. Scegliere il Nome di misura corrispondente in base ai parametri del risultato di elaborazione richiesti, applicare e osservare il risultato del riconoscimento del parametro.
      9. Dopo aver confermato le impostazioni dei parametri, salvare la configurazione.
    4. Metodo generale: ImageJ
      ​NOTA: Analizzare i risultati di imaging utilizzando il metodo ImageJ per immagini fluorescenti19 e quindi eseguire un'analisi comparativa con i tre metodi di questo strumento.
      1. Aprire il software ImageJ. Importazione immagine: File → Apri → Selezionare l'immagine originale in scala di grigi da analizzare.
      2. Convertire l'immagine in 8 bit: Immagine → Tipo → 8 bit. Riconoscimento valore di grigio: Immagine → Regola → Soglia → Predefinito, Rosso → Selezionare Sfondo scuro → Imposta → OK.
        NOTA: Se il riconoscimento dell'area rossa non è soddisfacente, sostituire Predefinito con uno dei 16 modelli di riconoscimento ImageJ integrati oppure regolare il cursore nella finestra di dialogo.
      3. Impostare parametri: Analizza → Imposta misure. Nella finestra di dialogo che appare, selezionare Area, Valore medio di grigio, Densità integrata, Limita alla soglia, Mostra etichetta, Reindirizza a Nessuno per impostazione predefinita e inserire 2 per Cifre decimali (0-9). Fare clic su OK.
      4. Analizzare i risultati di riconoscimento: Analizza → Misura. Salvare i risultati: Nella finestra di dialogo risultati che appare, File → Salva con nome e selezionare la posizione di salvataggio.
  7. Esportazione immagine
    1. Selezionare un campo visivo di un pozzetto positivo di alta qualità come standard di riferimento.
      NOTA: I requisiti di base di qualità sono autenticità, messa a fuoco accurata, esposizione adatta (16 bit) e contrasto appropriato (un rapporto segnale-rumore più elevato è preferibile). I requisiti di alta qualità includono caratteristiche distinte, contrasto, praticità, cambiamenti morfologici intuitivi e punti chiave evidenziati.
    2. Sotto Esegui analisi, selezionare ExportPro nella sezione Analisi e avviare Configurazione esecuzione per analisi. In Seleziona opzioni di output, scegliere Canale singolo, Sovrapposizione a colori, riduci immagine (opzionale) e Barra di scala (opzionale) in base ai requisiti dell'immagine.
    3. Selezionare le immagini dei canali fluorescenti da esportare per ogni campo visivo. In Canale singolo, selezionare un colore per ogni canale, ad esempio Blu per il canale DAPI e Scala di grigi per il canale TL.
    4. In Sovrapposizione a colori, selezionare in ordine i canali corrispondenti a CAMPO LUMINOSO, ROSSO, BLU e VERDE (Selezionare la lunghezza d'onda del colore per la sovrapposizione a colori). Impostare il Numero a 100; osservare l'anteprima dell'immagine e accettare il risultato dell'anteprima.
    5. In output, selezionare la cartella in cui verranno memorizzate le immagini esportate in Esporta nella cartella. Avviare l'esecuzione.
      NOTA: Le immagini di uno stesso lotto non devono essere esportate separatamente; un lotto di immagini si riferisce a un insieme di immagini provenienti da quattro campioni principali: controllo negativo, controllo positivo, gruppo di controllo di base e gruppo sperimentale target, tutti ottenuti in condizioni sperimentali completamente identiche.
  8. Confronto dei metodi di elaborazione delle immagini
    1. Selezionare 9 campi visivi e confrontare il conteggio manuale tradizionale di cellule morte e vive con i metodi Valutazione cellulare multilunghezza d'onda, Vivo-Morto, CME e ImageJ per il conteggio di cellule vive, cellule morte e del rapporto tra cellule morte e vive. Utilizzare GraphPad Prism versione 10.1 per eseguire un'ANOVA a un fattore, accompagnata dal test di confronti multipli di Tukey, per analizzare le differenze.
    2. Selezionare 81 campi visivi e confrontare le differenze nel conteggio cellulare, area e intensità tra i metodi Valutazione cellulare multilunghezza d'onda, Vivo-Morto, CME e ImageJ. Utilizzare GraphPad Prism versione 10.1 per eseguire un'ANOVA a un fattore, accompagnata dal test di confronti multipli di Tukey, per analizzare le differenze.
      NOTA: Gli esperimenti di coltura cellulare e colorazione devono essere eseguiti all'interno di un armadio a sicurezza biologica. Smaltire i liquidi di scarto, le punte e gli altri rifiuti sperimentali secondo le normative di laboratorio. Assicurarsi una protezione completa per tutta la durata dell'esperimento.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Impatto della preparazione standardizzata sulla qualità dell'immagine

I parametri della piastra sono stati configurati per garantire che lo strumento potesse individuare in modo affidabile il livello dell'immagine cellulare. Campioni preparati come un singolo strato di cellule con una confluenza moderata hanno facilitato il messa a fuoco dell'immagine a diverse ingrandimenti dell'obiettivo e migliorato il riconoscimento delle immagini e l'analisi quantitativa. Una preparazione standardizzata dei campioni e parametri della piastra ottimizzati hanno efficacemente ridotto al minimo gli effetti ai bordi, il sovrapposizione cellulare e altri fattori che contribuiscono a un imaging di scarsa qualità (Figura 1).

Confronto delle funzioni del metodo di calcolo dell'immagine

È stato utilizzato il metodo di doppia colorazione con PI/Hoechst 33342 per distinguere le cellule vive da quelle morte. I metodi Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead e CME hanno elaborato con successo queste immagini identificando gli oggetti in base all'intensità di fluorescenza e alle dimensioni degli oggetti, mentre ImageJ ha identificato gli oggetti in base ai valori di scala di grigi. I risultati della marcatura ottenuti con questi metodi sono stati generalmente confrontabili (Figura 3A–E).

Il metodo Multi-Wavelength Cell Scoring richiedeva una colorazione nucleare per identificare tutte le cellule (Figura 4A). Può elaborare fino a 7 canali di imaging e calcolare parametri come il numero di cellule, l'area e la densità ottica.

Il metodo Live-Dead era più flessibile rispetto al metodo Multi-Wavelength Cell Scoring. Entrambi i canali forniscono moduli per la colorazione nucleare, la colorazione citoplasmatica o la colorazione combinata nucleo-citoplasmatica per identificare tutte le cellule, le cellule vive o le cellule morte. La funzione di separazione degli oggetti sovrapposti consente di separare gli oggetti sovrapposti, permettendo il calcolo del numero di cellule, dell'area e della densità ottica. Tuttavia, poiché elaborava solo dati a doppio canale, era particolarmente adatto per saggi di vitalità cellulare con doppia colorazione PI/Hoechst 33342 (Figura 4B).

Il metodo CME dipendeva dalla logica di elaborazione delle immagini definita dall'utente. Il numero di canali elaborati corrispondeva al numero di canali acquisiti. I risultati del riconoscimento sono stati affinati mediante funzioni come Riempimento dei Buchi, Inversione degli Oggetti, Espansione degli Oggetti, Riduzione degli Oggetti, Operazioni Logiche, Rimozione degli Oggetti ai Bordi, Mantenimento degli Oggetti Marcati, Espansione degli Oggetti senza Contatto, Marcatura dei Centri degli Oggetti, Watershed, Rimozione degli Oggetti Marcati e Filtro della Maschera per eliminare impurità e altre fonti di interferenza. Questo metodo ha inoltre permesso il calcolo di numerosi parametri degli oggetti per l'analisi multidimensionale.

ImageJ non ha elaborato contemporaneamente più canali. Per serie di immagini con variazioni significative dello sfondo, è stata necessaria un'elaborazione manuale e l'adeguamento della soglia, il che ha aumentato la soggettività e ridotto la riproducibilità.

Analisi delle differenze nei risultati dell'elaborazione

Un'analisi comparativa dei metodi di elaborazione delle immagini non ha evidenziato differenze significative nei conteggi totali delle cellule, nei conteggi delle cellule morte o nel rapporto tra cellule morte e cellule totali tra i metodi di conteggio cellulare multilunghezza d'onda, Live-Dead, CME, ImageJ e il metodo tradizionale manuale in 9 campi visivi (Figura 5A–C, File Supplementare 1).

Analogamente, nessuna differenza significativa è stata osservata nel rapporto tra l'area delle cellule morte e l'area cellulare totale tra i metodi Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME e ImageJ. Tuttavia, una differenza significativa è stata osservata nel rapporto tra l'intensità media di fluorescenza delle cellule morte e quella di tutte le cellule tra i metodi Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead e CME, in base ai dati ottenuti da 81 campi di osservazione (Figura 5D–F).

Sulla base di questi risultati, è stato stabilito un flusso di lavoro standardizzato per il sistema di imaging ad alto contenuto (Figura 6).

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Figura 1: Risultati di imaging di bassa qualità. (A) Il campo visivo è vicino al bordo della pozzetta, mostrando ombre causate dal bordo stesso (in questo caso cellule BV2). (B) Le frecce a e b indicano sovrapposizione di cellule nel canale DAPI e nel canale TL, con eccessiva confluenza cellulare, e persino una seconda sovrapposizione o alcune cellule in sospensione. (C) Il campo visivo non presenta cellule; i parametri della piastra sono errati; il fuoco non è sullo strato cellulare, oppure le cellule non sono state colorate, con conseguente assenza di immagine in questo campo visivo. Barra della scala = 100 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Impostazioni dei parametri di acquisizione delle immagini. (A) La freccia a indica l'icona della profondità di bit. (B) La freccia b indica la posizione della correzione dell'ombreggiatura. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: Risultati dello stesso campo visivo identificato mediante diversi metodi. (A) Risultati della maschera Multi-Wavelength Cell Scoring: le aree grigie e rosse rappresentano tutti i nuclei cellulari identificati nel canale DAPI, con le aree rosse che indicano i nuclei di cellule morte identificati nel canale Cy3. (B) Risultati della maschera Live-Dead: le aree verdi e rosse rappresentano tutti i nuclei cellulari identificati nel canale DAPI, con le aree rosse corrispondenti ai nuclei di cellule morte identificati nel canale Cy3. (C) Risultato della maschera CME: le aree gialle e blu rappresentano tutti i nuclei cellulari identificati nel canale DAPI, con l'area blu corrispondente ai nuclei di cellule morte identificati nel canale Cy3. (D) Risultato della maschera ImageJ nel canale DAPI. (E) Risultato della maschera ImageJ nel canale Cy3. Barra della scala = 100 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Pagine parziali di impostazione dei parametri. (A) La posizione indicata da a mostra che il primo canale della valutazione cellulare multicanale può selezionare esclusivamente il nucleo; (B) b e c indicano che l’analisi Vita-Morte può elaborare solo due canali, supportando la doppia colorazione con PI/Hoechst 33342 per cellule morte e vive. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 5: Differenze nei risultati dell'elaborazione delle immagini di fluorescenza. (A) Differenze nel conteggio totale delle cellule tra i cinque metodi di elaborazione. (B) Differenze nel conteggio delle cellule morte tra i cinque metodi di elaborazione. (C) Differenze nel rapporto tra cellule morte e cellule totali tra i cinque metodi di elaborazione. (D) Differenze nel rapporto tra cellule morte e cellule totali tra i quattro metodi di elaborazione. (E) Differenze nel rapporto tra l'area delle cellule morte e l'area totale delle cellule tra i quattro metodi di elaborazione. (F) Differenze nel rapporto tra l'intensità media di fluorescenza delle cellule morte e quella di tutte le cellule nei quattro metodi di elaborazione. Tutte le barre di errore nei grafici rappresentano deviazioni standard. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 6: Processo operativo standardizzato. Flusso di lavoro che riassume la procedura standardizzata per la preparazione del campione, la colorazione mediante fluorescenza, l'acquisizione di immagini ad alto contenuto informativo, l'elaborazione delle immagini, l'esportazione delle immagini e l'analisi dei dati. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File Supplementare 1. Dati grezzi per l'analisi del conteggio cellulare, dell'area e dell'intensità di fluorescenza presentata nella Figura 5. Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

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Utilizzando il metodo di doppia colorazione con PI e Hoechst per determinare la vitalità cellulare, ad esempio, lo strumento ad alta capacità può calcolare rapidamente e in modo ad alto rendimento la vitalità cellulare all'interno dello stesso lotto mediante moduli algoritmici integrati. Questo metodo presenta diversi vantaggi, tra cui basso volume del campione, costo ridotto, minimo danno cellulare, debole sbiancamento della fluorescenza, resistenza allo spegnimento e capacità di acquisire immagini multiple. Inoltre, il tempo di acquisizione immagini per una piastra a 96 pozzetti è generalmente di soli 30–45 min20.

Nel protocollo sperimentale, per garantire la qualità dell'immagine, concentrarsi sui seguenti passaggi: in primo luogo, assicurarsi di avere una densità della piastra adeguata per evitare una densità cellulare eccessiva, che potrebbe riempire l'immagine di cellule, o una densità insufficiente, che potrebbe causare il distacco delle cellule durante la colorazione e i lavaggi. In secondo luogo, lavare accuratamente il colorante per evitare che residui di colorante influenzino l'acquisizione delle immagini. Per le cellule con bassa adesività, gestire con delicatezza e lentezza l'aggiunta e la rimozione del liquido prima e dopo la colorazione, evitando aggiunte verticali. Utilizzare un'aggiunta laterale per evitare la perdita di cellule al centro del campo visivo, prestando particolare attenzione al distacco delle cellule morte durante i saggi di vitalità. Valutare la possibilità di centrifugare la piastra campione per ridurre gli errori sperimentali, se necessario. In terzo luogo, scegliere un tempo di esposizione appropriato. Un'esposizione troppo lunga aumenterà il tempo totale di acquisizione e potrebbe far perdere la finestra di rilevamento, causando potenzialmente sovraesposizione di alcune cellule o riconoscimento dello sfondo. Un'esposizione troppo breve potrebbe portare a informazioni incomplete nell'immagine, con perdita di alcuni dettagli caratteristici.

Se durante l'acquisizione dell'immagine non è possibile ottenere un'immagine nitida, identificare la causa verificando lo stato delle cellule, la presenza di residui di colorante, le impostazioni dei parametri e altri fattori. Durante l'esperimento, se non sono presenti cellule sul fondo della pozzetta, nell'immagine non verrà rilevata alcuna cellula. Se si formano due o più strati cellulari irregolari sul fondo della pozzetta, la messa a fuoco diventa difficoltosa, causando un'immagine sfocata. Un eccesso di residui di colorante può provocare uno sfondo intenso, riducendo la visibilità dell'immagine desiderata. Aree estese di residui di colorante possono oscurare le cellule nel campo visivo, mentre piccole particelle di residuo, simili per dimensione alle cellule, possono interferire con il successivo riconoscimento e la segmentazione delle immagini. Se l'altezza della piastra e quella delle pozzette non sono impostate secondo le specifiche del produttore per la piastra a 96 pozzette, non verrà acquisita alcuna immagine nel campo visivo oppure la posizione del campione potrebbe spostarsi, con il rischio di danneggiare l'obiettivo.

Considerando la flessibilità e la semplicità di utilizzo, nonché i buoni risultati nell'elaborazione dei dati, il modulo di elaborazione delle immagini ottimale per il metodo di doppia colorazione con PI e Hoechst è Live-Dead. Questo programma è specificamente ottimizzato per i coloranti PI e Hoechst e, rispetto ad altri metodi e software, è semplice da utilizzare, calcola rapidamente e consente un caricamento batch agevole delle immagini nel database con impostazioni dei parametri costanti. I risultati sono più confrontabili rispetto a quelli ottenuti con il software comunemente usato attualmente, ImageJ. Diversi modi sperimentali possono utilizzare metodi proprietari specifici o la modalità generale di calcolo Multi-Wavelength Cell Scoring; i metodi proprietari sono più comodi, mentre la modalità di calcolo generale presenta meno restrizioni riguardo ai metodi di colorazione. Diversi protocolli di colorazione richiedono diversi moduli ottimali di elaborazione delle immagini. Sviluppare metodi computazionali personalizzati in base agli obiettivi sperimentali. Il metodo ExportPro per l'esportazione delle immagini è semplice e facile da apprendere, consentendo l'anteprima di oggetti di riferimento. È adatto ai principianti, con un'interfaccia grafica che spiega chiaramente il significato dei parametri e semplifica le misurazioni, abbattendo le barriere dell'analisi multi-software e risparmiando tempo sull'apprendimento degli strumenti.

Questo studio ha validato solo un protocollo di colorazione di base. A titolo di riferimento, altri protocolli sperimentali che differiscono in modo significativo da questo devono ancora essere validati rispetto al nuovo standard.

Il sistema di imaging ad alto contenuto funge da piattaforma tecnologica fondamentale che integra imaging ad alta risoluzione, rilevamento sincrono multiparametrico, analisi quantitativa automatizzata e screening ad alto rendimento21,22,23. La progettazione integrata delle capacità di imaging e di calcolo del dispositivo dovrebbe consentire lo sviluppo e l'istituzione di protocolli sperimentali e modelli computazionali appropriati per un numero maggiore di esperimenti di imaging esistenti7,24, migliorando infine la coerenza e la confrontabilità dei dati ottenuti da diversi operatori, in momenti diversi e tra diversi lotti.

Dichiarazioni

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Tutti gli autori dichiarano l'assenza di conflitti di interessi. Durante la traduzione del manoscritto, Zhipu AI è stato utilizzato esclusivamente per la traduzione e non per la generazione di dati di ricerca, risultati sperimentali o contenuti accademici principali. Gli autori si assumono piena responsabilità per il contenuto del manoscritto.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano il sostegno fornito dalla Fondazione della Scuola di Medicina Tradizionale Cinese dell'Università di Chengdu. Gli autori ringraziano il sostegno ottenuto dal finanziamento MPRC2022034. Questo finanziamento è utilizzato per sviluppare un metodo di imaging dinamico 3D per i batteri intestinali nella Decozione Erchen nel trattamento di topi obesi semplici. Gli autori riconoscono la piattaforma di ricerca fornita dall'Istituto Innovativo di Medicina e Farmacia Cinese dell'Università di Chengdu di Medicina Tradizionale Cinese e dall'Istituto di Studi Interdisciplinari.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubo da centrifuga da 1,5 mLLabigic Technology Co., Ltd.MCT-001-150
Punte per pipetta da 1000 µLLabigic Technology Co., Ltd.35423003E
Tubo da centrifuga da 15 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-15A
Punte per pipetta da 2,5 µLQingdao Haier Biomedical Co., Ltd.B10T
Punte per pipetta da 200 µLLabigic Technology Co., Ltd.T-001-200
Tubo da centrifuga da 50 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-50A
Piastra per coltura cellulare a 96 pozzettiCorning Incorporated3599
Pipetta monocanale regolabile, 0,1–2,5 μLEppendorf SE3120000216
Pipetta monocanale regolabile, 100–1000 μLEppendorf SE3120000267
Pipetta monocanale regolabile, 20–200 μLEppendorf SE3120000259
Pipetta monocanale regolabile, 2–20 μLEppendorf SE3120000232
Piatto per coltura cellulareCorning Incorporated430167
Flaconi criogeniciLabigic Technology Co., Ltd.BS-20-ST
Dimetilsolfossido (DMSO)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.D8371
Mezzo Dulbecco modificato di Eagle (DMEM)Life Technologies Limited11966-025In questo studio, il DMEM completo è stato preparato utilizzando il 10% di FBS, l'1% di soluzione di penicillina-streptomicina e l'89% di DMEM.
Incubatore CO2 ESCO CelCultureEsco Micro Pte. Ltd.CCL-170B-8
Serum fetale bovino (FBS, Superfine)Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.164210-50
Coloranti fluorescenti Hoechst 33342Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.B8040
Cellule HT22Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.CL-0697
ImageJNational Institutes of HealthImageJ è uno dei software di elaborazione delle immagini utilizzati nel manoscritto.
Sistema di imaging ad alto contenuto confocale ImageXpress MicroMolecular Devices, LLCImageXpress Micro ConfocalNel manoscritto, utilizzare "Sistema di imaging ad alto contenuto" come sostituto del nome dello strumento.
Centrifuga refrigerata a bassa velocitàHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.L530R
Software di acquisizione e analisi delle immagini ad alto contenuto MetaXpressMolecular Devices, LLCIl software è un componente abbinato al sistema di imaging ad alto contenuto confocale ImageXpress® Micro. Nel manoscritto, "Il software fornito con lo strumento" si riferisce a questo software.
Cappa a flusso laminare verticale OptiMairEsco Micro Pte. Ltd.ACB-4E1
Parafilm MPechiney Plastic Packaging Inc.PM996
PBS Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd YC-5013
Soluzione di penicillina-streptomicinaProcell Life Science & Technology Co.,Ltd.PB180120
Soluzione di ioduro di propidio (PI)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.C0080
Soluzione di tripsina-EDTABasalMedia Technology Co.,Ltd.S310KJ

Riferimenti

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