Un saggio di complementazione con luciferasi divisa per la misurazione temporalmente risolta della clearance dei tau nella microglia

Sommario

Descriviamo una piattaforma quantitativa sensibile e risolta nel tempo per misurare la clearance della tau extracellulare nella microglia derivata da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) utilizzando un sistema di luminescenza basato su microplacche. Questo approccio consente una rilevazione sensibile della cinetica di degradazione della tau in formato micropozzo, consentendo un'interrogazione ad alta produttività della gestione della tau in varie condizioni sperimentali.

Abstract

In quanto cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale, la microglia è regolatore centrale dell'omeostasi cerebrale e mediatori chiave delle malattie neurodegenerative. Queste cellule ispezionano continuamente l'ambiente neurale e svolgono un ruolo fondamentale nel riconoscimento, interiorizzazione e degradazione dei substrati extracellulari, incluse proteine mal ripiegate e aggregate come i tau patologici. Nonostante le crescenti evidenze che implicano la microglia nella liberazione dei tau, gli approcci esistenti per misurare l'assorbimento e il degrado dei tau mancano della risoluzione temporale e della sensibilità necessarie per catturare pienamente questi processi dinamici. Qui, abbiamo sviluppato un saggio basato sulla luminescenza per monitorare quantitativamente la clearance delle tau nelle microglie derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC). Questa piattaforma sfrutta un sistema di complementazione basato sulla luciferasi divisa per consentire una rilevazione altamente sensibile e in tempo reale dei tau nelle cellule vive, consentendo un tracciamento preciso del suo processo intracellulare. Questo saggio è scalabile e adattabile a più tipi cellulari, fornendo uno strumento versatile per esaminare le vie endolisosomiche e i meccanismi cellulari che regolano la gestione delle tau nelle malattie neurodegenerative, inclusa la malattia di Alzheimer.

Introduzione

Le tauopatie, inclusa la malattia di Alzheimer (AD), sono caratterizzate dall'aggregazione e diffusione della proteina tau associata ai microtubuli attraverso i circuiti^{neurali 1,2}. Le glia sono diventate sempre più apprezzate come regolatori della dinamica delle malattie tau, inclusi assorbimento, degrado e^diffusione 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Comprendere come la glia contribuisca alle tauopatie è una preoccupazione urgente per risolvere dinamiche chiave della malattia, inclusi neuroinfiammazione e diffusione della tau. Tra le popolazioni gliali, la microglia - i fagociti residenti del cervello - è posizionata in modo unico per mediare la pulizia dei tau.

Nonostante la necessità urgente di chiarire i meccanismi di gestione delle tau nelle microglia, il campo rimane limitato nella risoluzione e nella portata degli saghi disponibili. Le questioni chiave riguardanti l'internalizzazione dei tau, il traffico intracellulare e la clearance cellulare restano irrisolte. Ognuno di questi passaggi rappresenta un processo meccanicisticamente distinto: l'assorbimento si riferisce all'interiorizzazione delle tau extracellulari nella membrana plasmatica; Il traffico comprende la selezione e il trasporto di tau internizzati attraverso compartimenti endosomali, lisosomici e altri compartimenti intracellulari; e la degradazione indica la degradazione proteolitica della tau, principalmente tramite vie lisosomale e proteasomiche. Sebbene questi passaggi siano sequenziali per il processamento extracellulare della tau, poiché la tau interiorizzata deve transitare tra i compartimenti intracellulari prima di raggiungere la macchina degradativa, sono regolati indipendentemente e una data perturbazione sperimentale può influenzare un passaggio senza alterarne altri. Ad esempio, una riduzione del segnale tau intracellulare potrebbe riflettere una ridotta assorbimento, un instradamento errato lontano dai compartimenti degradanti o un aumento del degrado. La risoluzione di questi processi richiede nuove piattaforme di analisi in grado di rilevare la presenza proteica e di essere abbinate a misure esistenti per determinare il destino proteico nel tempo.

I metodi attuali per risolvere l'internalizzazione e la degradazione dei tau si basano su immunocitochimica, citometria a flusso, western blotting e marcature fluorescenti per quantificare l'assorbimento, la localizzazione subcellulare e l'elaborazione intracellulare delle specie^tau 13,14,15,16,17,18 . Tuttavia, ciascuno di questi approcci presenta limitazioni fondamentali quando applicato allo studio della dinamica della clearance proteica. L'immunocitochimica e il western blot non hanno la sensibilità per rilevare specie tau a bassa abbondanza e richiedono molta fadiva. La citometria a flusso e gli saggi basati su fluorescenza non riportano fedelmente la clearance proteica perché i fluorofori possono persistere dopo che la proteina coniugata è stata^{degradata 19}, disaccoppiando così il segnale fluorescente dal destino effettivo della proteina di interesse. Insieme, questi vincoli lasciano un divario critico, senza che nessun metodo esistente fornisca simultaneamente la sensibilità, la risoluzione temporale e la scalabilità necessarie per tracciare quantitativamente la dinamica di clearance dei tau. Pertanto, un ostacolo importante ai progressi nella comprensione delle dinamiche di gestione della tau nella microglia è stata la mancanza di saggi quantitativi, risolti nel tempo e ad alta produttività per misurare la clearance della tau nelle cellule vive.

Per colmare la mancanza di una piattaforma quantitativa per monitorare la dinamica delle tau vive, abbiamo sviluppato un saggio sensibile basato sulla luminescenza che può essere utilizzato per rilevare la dinamica delle proteine tau intracellulari. Questo approccio impiega un sistema di complementazione basato su luciferasi divisa, in cui un piccolo tag peptidico (High Affinity Binary Technology o HiBiT) viene fuso a tau, consentendo misurazioni cinetiche nelle cellule viventi. All'interazione con il suo partner di legame complementare (Large Binary Technology o LgBiT), la proteina marcata ricostituisce un enzima attivo di luciferasi, generando un segnale bioluminescente^quantitativo 20,21,22. Questo segnale luminescente fornisce una lettura diretta e sensibile dell'abbondanza proteica, permettendo il monitoraggio dinamico delle variazioni dei livelli intracellulari nel tempo. Di conseguenza, la luminescenza può essere utilizzata come un robusto segnalatore della presenza o della perdita di proteine, come nel caso della degradazione intracellulare. Insieme, questa piattaforma consente una misurazione precisa e temporalmente risolta della gestione dei tau e offre una strategia ampiamente applicabile per studiare il ricambio proteico.

Protocollo

Tutti gli esperimenti cellulari sono stati condotti in un laboratorio appropriato di Biosicurezza Livello 2, approvato dai Servizi Ambientali e Sanitari dell'Università del Massachusetts Amherst.

1. Espressione, purificazione e rimozione di endotossine della proteina Tau-SLP

1. Aggiungere il peptide di luciferasi divisa o il tag SLP (VSGWRLFKKIS) su una costruzione Tau per creare una costruzione marcata (Tau-SLP) utilizzando metodi standard di clonazione, come l'assemblaggio^{Gibson 23}.
   NOTA: La complementarizzazione del tag peptidico della luciferasi divisa genera un segnale robusto quando posizionata sia al C-terminale, al N-terminale o nei domini interni di 2N4R Tau²⁴.
2. Esprimi e purifica la Tau-SLP utilizzando i metodi precedentemente^{descritti 25,26} e assicura la purezza tramite SDS-PAGE e immunoblotting.
3. Per l'uso con le cellule microgliali, si seguono i protocolli pubblicati per rimuovere l'endotossina batterica dopo la purificazione con Tau-SLP al fine di limitare la reattività di^{confusione 27}.
4. Quantificare la concentrazione di proteine Tau-SLP utilizzando un saggio standard sull'acido bicinconinico (BCA) o il saggio^{di Bradford 28,29}.
5. Se desiderato, aggregare la Tau-SLP seguendo i protocolli²⁴ precedentemente descritti.
6. Validare la luminescenza funzionale della Tau-SLP generando una curva standard utilizzando un substrato di luciferasi e un reagente di complementazione commercialmente disponibile, seguendo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali).

2. Cultura microglia derivata da iPSC (iTF-Microglia)

1. Coltivare cellule microgliali al 5% di CO₂ a 37 °C nel terreno di coltura appropriato.
2. Differenziare una linea di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) che contiene sei fattori di trascrizione indotti dalla doxiciclina per produrre una cellula simile a una microglia (fattore di trascrizione indotta microglia-Like o iTF-Microglia) utilizzando un protocollo³⁰ validato (vedi Tabella dei Materiali).
   NOTA: Questo saggio non è limitato alla microglia iTF e può essere utilizzato con qualsiasi linea cellulare aderente. Può essere necessaria ottimizzazione dei tempi di clearance quando si lavora con altre linee cellulari.

3. Test di Clearance Tau

1. In una piastra a 24 pozzi, le cellule a piastra a densità di 1 x 10⁵ cellule per pozzo, in triplicazione per condizione, con mezzo di coltura (250 μL) e incubano durante la notte a 37 °C e 5% di_CO2 (Figura 1A).
2. Rimuovere il mezzo di coltura, lavare le cellule una volta con PBS (250 μL) e sostituire con un mezzo da 250 μL.
3. Per misurare temporaneamente la clearance della Tau-SLP, espone le cellule alla Tau-SLP in modo sfasonato in modo che tutti i pozzi vengano prelevati simultaneamente e differiscono solo nel tempo di liberazione. Ad esempio, per i gruppi di clearance 0, 2 h e 4 h, aggiungere prima un mezzo contenente Tau-SLP a 100 nM al gruppo delle 4 h, poi 1 ora dopo al gruppo delle 2 h e infine 1 ora dopo al gruppo delle 0 h (vedi Figura 1B per le raccomandazioni temporali). Una volta completato il periodo finale di internalizzazione, tutti i pozzi avranno subito lo stesso periodo di esposizione Tau-SLP ma differiranno solo per durata di pulizia (Figura 1B).
4. Includere i pozzi che non ricevono alcun trattamento Tau-SLP per la sottrazione di fondo (Figura 1C).
5. Al termine del periodo di internalizzazione, rimuovere il mezzo contenente Tau-SLP. Lavare le cellule tre volte con PBS per rimuovere la Tau-SLP extracellulare e sostituirla con un mezzo di coltura senza Tau-SLP.
6. Incubare le cellule per il periodo di clearance designato (Figura 1A). Il gruppo di clearance a 0 h, prelevato immediatamente dopo il periodo di internalizzazione, rappresenta la quantità totale di Tau-SLP internalizzata all'inizio della fase di clearance.
7. Seguendo tutti i punti di tempo di liberazione, rimuovere il materiale materiale dai pozzi e lavare con PBS da 250μL.
8. Trattare ogni pozzo con 250 μL di tripsina-EDTA 0,25% per 5 minuti a 37 °C. Questo passaggio rimuove i tau legati alla superficie per garantire che la luminescenza rifletta la Tau-SLP interiorizzata. Neutralizza ogni pozzetto con un inibitore della tripsina da 250 μL (5 mg/mL).
9. Raccogli ogni pozzo in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL correttamente etichettato e in un pellet tramite centrifugazione (500 x g, 5 min).
10. Preparare una quantità appropriata di tampone di lisi contenente substrato luciferasi e componenti di complementazione (vedi Tabella dei materiali; 50 μL x # dei pozzi + 10%).
11. Rimuovere ogni soprantantante con una pipetta aspirante e risospendere il pellet cellulare in 50 μL di tampone di lisi contenente substrato luciferasi e componenti di complementazione. Questo produrrà un complesso di complementazione a luciferasi divisa e genererà luminescenza (Figura 1D).
12. Trasferire le cellule lisate su una piastra bianca a mezzo volume da 96 pozzi.
13. Leggi la luminescenza su un lettore di micropiastre con scossione orbitale per 10 secondi a temperatura ambiente (~23 °C) prima della lettura per garantire la lisi completa dei pellet cellulari.
14. Determinare l'abbondanza normalizzata di Tau-SLP sottraendo prima il valore medio di luminescenza ottenuto da pozzi non esposti a Tau-SLP. Normalizzare ogni valore al segnale medio sottratto dal fondo del gruppo di clearance 0 h.
15. Il grafico ha normalizzato l'abbondanza di Tau-SLP in funzione del tempo di liberazione. Una riduzione progressiva della luminescenza indica una diminuzione dell'abbondanza intracellulare di Tau-SLP ed è interpretata come clearance Tau-SLP, mentre valori di luminescenza stabili indicano un clearance compromesso o ritardato. Calcola la percentuale di clearance come: % Clearance = [1 − (RLUt / RLUt = 0)] x 100.

Risultati

Utilizzando questo saggio sensibile basato su luminescenza, l'abbondanza intracellulare di Tau-SLP potrebbe essere monitorata nel tempo dopo un periodo sincronizzato di assorbimento nelle microglie umane derivate da iPSC. Dopo il lavaggio della Tau-SLP, la luminescenza è diminuita costantemente, coerente con la clearance intracellulare della Tau-SLP. Questa piattaforma era sufficientemente sensibile da rilevare differenze nella gestione delle specie monomeriche e fibrillari di Tau-SLP tramite microglia. La Tau-SLP monomerica è stata completamente eliminata nella iTF-Microglia entro 60 minuti, mentre la Tau-SLP fibrillare è rimasta attiva per oltre 240 minuti (Figura 2A). Inoltre, abbiamo eseguito il test con tau mutanti (ad esempio, N279K) per valutare la cinetica di clearance e abbiamo riscontrato che TauN279K-SLP mostra una cinetica di clearance significativamente ridotta solo in brevi momenti di clearance (15 min) (Figura 2B). Questi risultati suggeriscono che il degrado osservato potrebbe essere evidente solo grazie all'elevata sensibilità di questo saggio. Abbiamo condotto l'esperimento di degradazione della Tau-SLP utilizzando la piccola molecola L-Leucil-L-Leucine metilestere (LLOMe) per confermare il coinvolgimento lisosomico. LLOMe è un substrato di catepsina C che permeabilizza le membrane lisosomiali, interrompendo l'attività^lisosomica. Con il trattamento LLOMe, abbiamo osservato livelli di Tau-SLP in stato stazionario significativamente aumentati a t=0 (Figura 3A) e un tasso di degradazione significativamente ridotto (Figura 3B) con un aumento di 4 volte della Tau-SLP residua dopo un tempo di clearance di 60 minuti. Infine, abbiamo eseguito il saggio di eliminazione Tau-SLP in neuroni derivati da iPSC per confermare la compatibilità del saggio tra i tipi cellulari. Qui abbiamo scoperto che i neuroni derivati da iPSC hanno una cinetica di clearance ridotta sia per la forma monomerica (Figura 4A) che per quella fibrilica (Figura 4B) della Tau-SLP. In particolare, i livelli di fibrilla Tau-SLP rimangono stabili a ~100% per un tempo di eliminazione di 240 minuti, mentre nello stesso periodo i livelli di fibrilla Tau-SLP sono scesi sotto il 50% nell'iTF-Microglia. Questi risultati dimostrano che la nostra piattaforma di complementazione basata sulla luciferasi divisa offre una rilevazione robusta e affidabile della clearance endolisosomale intracellulare della Tau-SLP e dimostra un design di analisi altamente adattabile che potrebbe essere applicato a numerose altre proteine o tipi cellulari.

Figura 1: Disegno sperimentale rappresentativo del test di clearance Tau-SLP. (A) Immagine rappresentativa del campo chiaro della microglia iTF utilizzata per questo saggio (barra di scala = 100μm) (B) Microglia umana (microglia iTF) viene esposta a SLP ricombinante 2N4R-SLP in modo sfasato, consentendo una rilevazione robusta basata sulla luminescenza. Dopo un'incubazione di 1 ora, il tau extracellulare viene rimosso tramite scambio di mezzi e le cellule vengono lavate con PBS. Le cellule vengono mantenute in mezzo basale durante il rispettivo periodo di eliminazione (0 h, 2 h, 4 h) prima del raccolto. All'estremità, le cellule vengono lisate e viene misurata la luminescenza. (C) Proposta di progettazione della lastra per misurare il rilascio Tau-SLP confrontando la degradazione monomerica con quella fibrillare. (D) La proteina Tau-SLP viene internalizzata nelle cellule e instradata per la degradazione lisosomica. L'aggiunta di LgBiT fornisce una lettura quantitativa della quantità di Tau-SLP rimasta nella cellula tramite complementazione e produzione di luminescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: iTF-Microglia chiara Tau-SLP extracellulare. (A) iTF-Microglia sono stati esposti a Tau-SLP monomerica (100nM) o Tau-SLP fibrillare (50nM), i campioni sono stati normalizzati alla rispettiva assorbimento iniziale (t = 0; 100%) e alle cellule non esposte a Tau-SLP (0%) (media ± SD; n = 9 da tre differenziazioni indipendenti). (B) iTF-Microglia sono state incubate con Tau-SLP monomerica o TauN279K-SLP (100nM), e i campioni sono stati normalizzati in base all'assorbimento iniziale rispettivo (t = 0; 100%) e alle cellule non esposte a Tau-SLP (0%) (media ± SD; n ≥ 7 da tre differenziazioni indipendenti; ∗ p < 0,05 usando il test t di Welch non abbinato). Dati ristampati da Shultz et al., 2025²⁴, e utilizzati sotto licenza Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: L'inibizione lisosomica compromette la clearance della Tau-SLP. (A) Il trattamento con inibitore lisosomale L-Leucil-L-Leucina (LLOMe) per 24 ore ha aumentato l'assorbimento iniziale di Tau-SLP (t = 0) nelle cellule neurogliomali H4 (media ± SD; n = 9 colture indipendenti; ∗ p < 0,05 utilizzando il test t di Welch non abbinato). (B) Il trattamento con LLOMe (1 mM) per 24 ore ha aumentato la percentuale di normalizzazione della RLU Tau-SLP dopo un tempo di liberazione di 60 minuti (t = 60 min) rispetto al veicolo (DMSO). Il segnale luminescente viene normalizzato ai rispettivi livelli iniziali di assorbimento (100%) e alle cellule non esposte a Tau-SLP (0%) (media ± SD; n = 9 colture indipendenti; ∗∗∗∗ p < 0,0001, ∗ p < 0,05 usando il test t di Welch non accoppiato). Dati ristampati da Shultz et al., 2025²⁴, e utilizzati sotto licenza Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: iTF-Microglia e iNeuroni mostrano differenze nella clearance Tau-SLP. (A) iTF-Microglia o iNeuroni sono stati incubati con Tau-SLP monomerica (100nM), i campioni sono stati normalizzati alla rispettiva captazione iniziale (t=0; 100%) e le cellule non esposte alla Tau-SLP (0%) (media±SD; n ≥ 6 da due-tre differenziazioni indipendenti; ∗∗ p < 0,01, ∗∗∗∗ p < 0,0001 usando una ANOVA bidirezionale; tempo: F(1, 28) = 7,489, p = 0,0107; tipo cellulare: F(1, 28) = 46,61, p < 0,0001; interazione: F(1, 28) = 3,229, p = 0,0831; Il test di confronti multipli di Sidak, i valori p indicati nella figura, valori t=0 sono mostrati come riferimento ma sono stati esclusi dall'analisi statistica). (B) iTF-Microglia o iNeuroni sono stati incubati con Tau-SLP fibrillare (50nM), i campioni sono stati normalizzati alla rispettiva captazione iniziale (t=0; 100%) e le cellule non esposte alla Tau-SLP (0%) (media±SD; n ≥ 6 da due a tre differenziazioni indipendenti; ∗∗ p < 0,01, ∗∗∗∗ p < 0,0001 usando un'ANOVA a due vie; tempo: F(1, 26) = 0,3888, p = 0,5384; Tipo di cella: F(1, 26) = 43,09, p < 0,0001; interazione: F(1, 26) = 1,209, p = 0,2816; Il test di confronti multipli di Sidak, i valori p indicati nella figura, valori t=0 sono mostrati come riferimento ma sono stati esclusi dall'analisi statistica). Dati ristampati da Shultz et al., 2025²⁴, e utilizzati sotto licenza Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo saggio fornisce una piattaforma scalabile e quantitativa per misurare la clearance extracellulare della Tau-SLP tramite microglia con alta sensibilità e risoluzione temporale. A differenza degli approcci tradizionali basati sull'imaging, che spesso richiedono un laborioso processamento del campione e sono limitati in capacità e campionamento temporale, questo sistema basato sulla luminescenza consente la quantificazione diretta e a livello di popolazione della gestione delle tau in formato microplacca. La lettura risultante fornisce una misurazione quantitativa della clearance della Tau-SLP dopo l'esposizione a tau extracellulare. Poiché le misurazioni possono essere ottenute ripetutamente su più punti temporali e con periodi di incubazione più lunghi, il saggio consente un'analisi ad alta produttività e risolta cineticamente della dinamica di assorbimento e clearance della tau. Inoltre, i cambiamenti nella luminescenza nel tempo sono coerenti con variazioni nell'abbondanza intracellulare di Tau-SLP, ma non distinguono tra traffico, degrado o secrezione senza approcci complementari. Sebbene il marcatore Tau-SLP non abbia modificato in modo significativo l'assorbimento o l'aggregazione di tau nel nostro studio^{compagno 24}, i tag esogeni possono influenzare il comportamento di altre proteine. Pertanto, i risultati del saggio dovrebbero essere integrati utilizzando approcci ortogonali e confrontati con le preparazioni tau non marcate, ove possibile. Un'ulteriore limitazione è che questo saggio utilizza specie Tau-SLP ricombinanti invece di tau endogeni o aggregati tau patologici derivati dal paziente. Sebbene il tau ricombinante 2N4R fornisca un substrato sperimentale riproducibile, non riproduce completamente l'eterogeneità endogena (cioè modifiche post-traduzionali) delle specie tau isolate dal cervello dei pazienti umani. Esistono molti protocolli per la fosforilazione in vitro della proteina tau ricombinante e potrebbero essere facilmente incorporati in questo flusso di lavoro. Questa piattaforma potrebbe anche essere adattata allo studio della tau endogena; ciò richiederebbe l'uso dell'ingegneria genetica per incorporare una sequenza di tag SLP nel loco tau (MAPT).

È importante sottolineare che l'interpretazione della riduzione del segnale come degradazione dipende dall'effettiva rimozione di tau extracellulari e legati alla superficie, ad esempio, tramite tripsinizzazione o passaggi equivalenti di stripping (stripping). Potrebbero verificarsi falsi negativi se non si ottiene una rimozione efficace. È possibile anche una perdita apparente di segnale che sarebbe interpretata come un falso positivo di degrado tau. Questo potrebbe derivare da distacco cellulare o morte, secrezione di Tau-SLP o clivagge proteolitico che separa la SLP da tau senza degradare la proteina. Di conseguenza, le diminuzioni della luminescenza dovrebbero essere interpretate come riduzioni dell'abbondanza intracellulare di Tau-SLP piuttosto che come misurazioni dirette della degradazione lisosomiale. Per attribuire in modo più definitivo i cambiamenti del segnale alla degradazione lisosomica, si raccomandano strategie di validazione ortogonali. Questi possono includere la perturbazione farmacologica della funzione lisosomica, come il trattamento con bafilomicina A1 o LLOMe (Figura 3), nonché disegni sperimentali a impulsi per risolvere la cinetica tra assorbimento e degradazione.

La flessibilità di questo saggio lo rende particolarmente adatto per esaminare i meccanismi che regolano l'assorbimento delle tau, il traffico intracellulare e la degradazione, nonché per lo screening dei modulatori farmacologici o genetici della clearance delle tau nei sistemi cellulari umani. Sebbene dimostrata qui nelle microglie derivate da iPSC, la piattaforma è facilmente adattabile ad altri tipi cellulari (Figura 4), permettendo un'ampia applicazione in modelli di biologia tau e malattie neurodegenerative, inclusi il morbo di Alzheimer e altre tauopatie primarie e secondarie. Poiché questo saggio si basa sull'esposizione extracellulare della Tau-SLP e sulla rilevazione basata sulla luminescenza, dovrebbe essere facilmente adattabile ad astrociti, oligodendrociti o linee cellulari comunemente utilizzate, anche se potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione delle condizioni di assorbimento. Collettivamente, questo approccio fornisce uno strumento potente per dissezionare i percorsi cellulari coinvolti nella proteostasi e per far progredire la comprensione meccanicistica dei processi neurodegenerativi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Accutase	Thermo Scientific	A1110501
Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-268
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231
DMEM/F-12, HEPES	Thermo Scientific	11330057
Doxyciclina	Clontech	631311
DPBS	Thermo Scientific	14-190-250
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061
Software di grafica	GraphPad Prism (o simile)	n/a
Human GM-CSF	Thermo Scientific	300-03
KnockOut DMEM	Thermo Scientific	10829018
Lettore di piastre luminescente	SpectraMax i3x (o simile) - Molecular Devices	n/a
Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-682-002
Microplate, 96 Well, PS, Half-area, White	Greiner	675075
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System	Promega	N3030
Poly-L-Lysine hydrobromide	Fisher Scientific	ICN15017750
Recombinant Human IL-34	Thermo Scientific	200-34
Recombinant Human M-CSF	Thermo Scientific	300-25
Recombinant Human TGF-β1	Thermo Scientific	100-21C
Surface Treated Sterile Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012927
Proteina Tau-HiBiT	In house	n/a	Proteina Tau con un tag peptidico VSGWRLFKKIS
Trypsin Inhibitor	Sigma Aldrich	T9128
Trypsin-EDTA	Thermo Scientific	5-200-072
Y-27632 dihydrochloride	Bio-techne	1254