Un protocollo efficiente di allevamento e microiniezione per la modifica genetica della mosca stabile, Stomoxys calcitrans

Summary

Questo protocollo descrive un metodo affidabile di microiniezione embrionale per integrare materiale genetico estraneo nel genoma della mosca stabile, un sistema di screening fluorescente per il monitoraggio dello sviluppo embrionale post-iniezione e un substrato di allevamento larvale costituito da agar di tuorlo di uovo integrato con carbone attivo inoculato con Escherichia coli che supporta lo sviluppo da uovo a adulto.

Abstract

Le mosche delle stalle sono parassiti che si nutrono di sangue per il bestiame, gli animali da compagnia e gli esseri umani, e si trovano su tutti i continenti tranne l'Antartide. I morsi dolorosi sia di maschi che di femmine adulti inducono comportamenti legati allo stress negli animali allevati, causando perdita di peso e perdite economiche sostanziali per i produttori. Sia i maschi che le femmine di mosca delle scuderie sono obbligati a mangiare sangue, il che rappresenta una sfida per la tecnica degli insetti sterili e altre strategie di gestione dei parassiti che richiedono il rilascio di massa dei maschi. Le attuali strategie stabili di gestione dei parassiti delle mosche spesso non riescono a controllare adeguatamente le popolazioni di mosche. Sebbene numerosi metodi di manipolazione genetica per introdurre materiale genetico esogeno o indurre knockout genici siano stati sviluppati per zanzare, Drosophila e altri gruppi modello di insetti, i metodi per la trasformazione genetica delle mosche stabili restano limitati. Questo protocollo descrive un approccio affidabile e migliorato per introdurre materiale genetico estraneo nelle mosche stabili utilizzando una variante iperattiva della piggyBac transposasi e un nuovo mezzo solido per l'allevamento larvale che supporta il recupero larvale, la schiusa, l'alimentazione e lo screening fluorescente dopo microiniezione embrionale.

Introduction

Le mosche delle scuderie (Stomoxys calcitrans L., 1758) sono parassiti economicamente importanti e vettori patologici del^{bestiame 1,2,3} e hanno una distribuzione cosmopolita a livello globale. Le strategie di gestione integrata dei parassiti (IPM) spesso non riescono a controllare adeguatamente le popolazioni stabili^{di mosche 2,3}, causando perdite annuali stimate superare i 2 miliardi di dollari USA solo^{negli Stati Uniti.} Inoltre, la resistenza agli insetticidi è stata documentata nelle popolazioni stabili di mosche in^{Europa 4,5} ed è stata anche segnalata negli Stati^{Uniti 6}. Di conseguenza, approcci di controllo genetico come la tecnica degli insetti sterili (SIT) e i sistemi di gene drive rappresentano aggiunte desiderabili ai tradizionali programmi IPM.

I precedenti tentativi di sviluppare metodi di controllo genetico nelle mosche stabili, inclusa la generazione di ceppi genetici per il sesso per SIT, si sono basati sulla selezione e sulla traslocazione indotta da^{radiazioni 7,8}. Questi approcci sono laboriosi e limitati a modifiche non transgeniche. Successivamente, O'Brochta et al.⁹ dimostrò che l'uso del sistema trasposasi di Hermes era in grado di integrare i transgeni in S. calcitrans; tuttavia, il protocollo ha prodotto una bassa efficienza di trasformazione, con circa lo 0,11% degli embrioni iniettati che producevano prole transgenica, e ha prodotto una debole espressione del marcatore della proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) sotto il controllo di un promotore^{esogeno 9}.

Altri approcci di manipolazione genetica, inclusi i sistemi CRISPR-Cas, non sono ancora stati ampiamente applicati nelle mosche stabili, in parte a causa della difficoltà di penetrare il corione resiliente degli embrioni di mosca stabili. Il corione esterno duro è paragonabile a quello di altre mosche^{muscose 10,11}. I tentativi di iniettare attraverso il corione usando aghi di quarzo o di rimuovere il corione con nastro adesivo biretro non ebbero successo, richiedendo il trattamento con una soluzione ossidante (ipoclorito di sodio al 3%, NaOCl), che riduce i tassi di schiusa delle uova.

Le mosche stabili possono essere mantenute a lungo termine in condizioni di laboratorio, mentre le fasi immature vengono tipicamente allevate in substrati cellulosici fermentati come trucioli di legno, crusca di grano o paglia integrati con fonti di azoto, inclusi integratori proteici di vitello o scaglie di^{pesce 12}. Tuttavia, questi substrati presentano diversi svantaggi quando vengono utilizzati per l'allevamento di embrioni microiniettati. La loro opacità e l'elevata autofluorescenza rendono difficile identificare le larve GFP-positive dopo la schiusa e l'incavazione nel substrato. Inoltre, sebbene una certa presenza batterica sia necessaria per la sopravvivenza^{larvale 13}, i mezzi fermentati introducono comunità batteriche e fungine imprevedibili che possono danneggiare o consumare gli embrioni prima della schiusa. Queste limitazioni hanno impedito il recupero delle larve trasformate utilizzando metodi di iniezione e allevamento già^{descritti 9}, evidenziando la necessità di un protocollo di iniezione più affidabile che consenta anche lo screening fluorescente durante tutto lo sviluppo.

Qui è presentato un protocollo di microiniezione riproducibile che incorpora miglioramenti nella selezione della trasposasi, nella metodologia di iniezione e nei mezzi di screening e allevamento. Queste modifiche facilitano lo sviluppo di mosche stabili geneticamente modificate per applicazioni che includono ceppi di sessazione genetica per SIT, gene drive e knockout genetici mediati da CRISPR-Cas. I miglioramenti chiave includono l'uso della piggyBac transposasi^{iperattiva 14} sotto il controllo del promotore stabile della proteina dello shock termico (hsp)83, la disidratazione embrionale per minimizzare la perdita di ooplasma dopo l'iniezione e l'eliminazione di nastro adesivo e olio di alocarburi durante l'iniezione dell'embrione.

Il recupero degli embrioni iniettati è stato ulteriormente migliorato sostituendo il substrato di allevamento in massa con piastre piatte e pigmentate di agar nutritivo inoculate con un prato di Escherichia coli. Questa formulazione dell'agar offre due principali vantaggi. Innanzitutto, fornisce una fonte di cibo batterica monogenica prevedibile per lo sviluppo larvale. In secondo luogo, fornisce un fondo ad alto contrasto e bassa autofluorescenza che facilita l'osservazione della morfologia, dello sviluppo e dell'espressione della GFP nelle larve di prima generazione (G0). Le mosche domestiche e le mosche delle stalle si sviluppano e si pupano normalmente su piastre agar a base di tuorlo e uovo inoculate con E. coli ^13,15. La formulazione descritta qui incorpora polvere di carbone attivo come additivo non reattivo e sicuro per il cibo per ridurre ulteriormente la fluorescenza di fondo.

Protocol

Tutti gli esperimenti e le operazioni sono stati condotti con l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Biosicurezza di Texas A&M (protocollo IBC2019-081). I reagenti, le sostanze chimiche e gli strumenti utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Allevamento delle mosche per la produzione di uova

1. Preparazione delle gabbie per adulti
   1. Imposta il termostato di una camera incubatrice a 28°C e mescola 3 kg di cloruro di sodio con ~5 L di acqua del rubinetto in una teglia da 10 L, dissolvendo il ~50% del sale.
   2. Posiziona questa vaschetta di salamoia scoperta sul fondo della camera incubatrice per mantenere un'umidità di circa l'80% di umidità relativa relativa. Mantieni un ciclo giorno-notte 16:8 nella camera o nella stanza.
   3. Foderete il fondo delle gabbie per insetti (gabbie in acciaio inox/alluminio da 30 x 30 cm con rete a rete) con due strati di carta assorbente e posizionate un bicchiere usa e getta da 45 mL riempito di zucchero da cucina granulato sopra lo strato di carta assorbente (Figura 1A).
      NOTA: Gli asciugamani di carta aiutano ad assorbire i punti di mosca e lo zucchero fornisce una fonte di cibo prima dell'alimentazione del sangue.
   4. Riempi un becher Griffin da 250 mL con circa 100 mL di acqua del rubinetto a temperatura ambiente e inserisci un quadrato di cotone nero da 20 cm x 20 cm (tagliato da semplice federa o lenzuola nere semplici) nell'acqua finché il tessuto non si inumidifica. Regola il tessuto nero in modo che i suoi bordi si estendano di 1-2 cm oltre il bordo del becher (Figura 1B).
      NOTA: Questo tessuto umido fornisce sia acqua liquida sia una superficie di oviposizione per le mosche adulte. La morte può verificarsi rapidamente se gli adulti non hanno accesso a una fonte di umidità.
   5. Trasferisci 500-1.500 pupe di mosche stabili in un piccolo piatto o becher e mettile nella gabbia degli insetti. Posiziona la gabbia degli adulti nella camera di allevamento umida (passo 1.1.1) e monitora quotidianamente l'eclosione. Una volta emersi gli adulti, iniziare l'alimentazione quotidiana con sangue bovino citato (sezione 1.2).
2. Alimentazione delle mosche adulte
   1. Prepara il sangue bovino citratto aggiungendo una concentrazione finale di 10,9 mM di disidrato trisodico al sangue bovino appena raccolto.
   2. In breve, sospendere ~12,8 grammi di sale citrato in un volume minimo di acqua deionizzata e aggiungere 4 litri di sangue raccolti al macello locale.
      NOTA: I contenitori di sangue dovrebbero avere coperchi a vite (ad esempio, bottiglie quadrate, a bocca larga, da 4L) e essere puliti accuratamente con acqua e sapone caldo prima dell'uso. Al mattatoio, evita di raccogliere il primo ~1 litro di sangue bovino da un animale macellato per minimizzare la contaminazione da pelo, sudore, sporco e altri coagulanti.
   3. Congelare il sangue bovino citato in 200 mL di aliquote e scongelare al bisogno, mantenendo le aliquote scongelate in frigorifero a 4°C per fino a una settimana.
   4. Fornire ~40 mL di sangue a temperatura ambiente ogni 600 mosche a ogni gabbia per adulti.
   5. Il sangue può essere offerto in un contenitore di condimenti o in un becher, e una spugna di garza di cotone piegata e non sterile dovrebbe essere inserita nel vaso per assorbire il sangue. Agita lo stoppino finché il cotone non è completamente saturo e inseriscilo nella gabbia.
      NOTA: Il sangue dovrebbe essere cambiato quotidianamente a partire da 24 ore dopo l'eclosione.
3. Raccolta delle uova
   1. Una volta osservate le uova sul tessuto di cotone nero, rimuovere il panno dal vaso e lavare le uova in un contenitore di plastica poco profondo separato da ~700 mL usando una bottiglia (Figura 2A). L'oviposizione si verifica tipicamente quando le mosche hanno 7-10 giorni di vita.
      NOTA: Controlla anche le coppe di sangue per le uova e raccogli eventuali uova vaganti che potrebbero essere depositate lì.
   2. Raccogli le uova su carta filtro tramite filtrazione a vuoto. Questo avviene posizionando una carta filtro nera in un imbuto Buchner, applicando un vuoto e poi versando le uova dal passaggio 1.3.1. sull'installazione.
   3. Successivamente, trasferire le uova in un cilindro graduato o in un tubo microcentrifuga graduato da 1,7 mL utilizzando una bottiglia di lavaggio e annota il volume delle uova raccolte (Figura 2B).
      NOTA: Evita un'immersione prolungata delle uova in acqua, poiché la mortalità inizia a aumentare ~10 minuti dopo l'immersione.
4. Preparazione di substrati larvari in massa
   1. Raccogliere materiali per substrati larvali sfusi (Figura 3A), come illustrato nella Tabella 1.
   2. In un becher da 1000 mL, aggiungi l'integratore di proteine del vitello e tutta l'acqua del rubinetto. Lascia reidratare tutta la notte a temperatura ambiente.
   3. Aggiungi la crusca di grano e la vermiculite in un contenitore separato e più grande.
   4. Dopo una reidratazione notturna, mescola accuratamente l'integratore di vitello reidratato per rompere i grumi, poi versa la miscela nel contenitore con crusca di grano e vermiculite. Mescola accuratamente finché non diventa omogeneo e tutta la crusca di grano è stata ricoperta con la miscela di integratori per vitelli.
   5. Trasferire il materiale sfuso in un contenitore di conservazione alimentare in polipropilene in uno strato profondo ~8 cm che copre l'intero fondo del contenitore (Figura 3B).
   6. Aggiungete ~1.000 embrioni (circa 0,2 mL di uova per 2,2 L di mezzo sfuso) raccogliendo embrioni tramite .filtrazione sottovuoto su una carta filtrante circolare di 90 mm di diametro e poi posizionare la carta filtrante con le uova coperte verso il basso al centro del contenitore del mezzo (Figura 3B, C).
   7. Copri la carta filtrante con ~1 cm di materiale per trattenere l'umidità (Figura 3C) e copri il contenitore con un rettangolo sovradimensionato di tessuto nero di cotone, con 5 cm di tessuto di cotone sporgente che si estendono oltre il bordo del contenitore.
   8. Taglia un grande foro (~12 cm di diametro) nel coperchio del contenitore per permettere lo scambio di gas e fissa il coperchio sul contenitore del materiale mentre intrappoli il panno di cotone nero tra il contenitore e il coperchio (Figura 3D).
      NOTA: Questo funge da guarnizione, impedendo che lo spazio tra coperchio e contenitore intrappoli le larve di^{primo stadio} nelle gocce di condensa.
   9. Posizionare il contenitore del substrato finito nella camera di allevamento degli adulti fino alla pupazione e monitorare lo sviluppo larvale (Figura 4) (la pupazione avviene in ~10 giorni a seconda della temperatura del mezzo e della densità larvale).
      NOTA: La copertura in tessuto dovrebbe essere abbastanza sottile da impedire il passaggio delle larve di primo stadio, ma abbastanza permeabile da impedire la formazione di condensa sulle pareti interne dei contenitori del materiale, che può intrappolare e annegare le larve.
5. Separazione delle pupe
   1. Rimuovi la copertura di stoffa dai contenitori pupale e raccogli le pupe con un cucchiaio o un cucchiaio.
      NOTA: Le pupe stabili delle mosche appaiono come cilindri rossi-marroni non mobili, lunghi 4-7 mm, in contrasto con le larve mobili giallo-bianche. Le pupe si accumulano tipicamente sul perimetro esterno delle pareti del contenitore o su posizioni umide e elevate all'interno del contenitore del materiale mentre le mosche iniziano la metamorfosi da larve a pupe fino ad adulti.
   2. Sovrapporre 500-1.500 pupe con una profondità di ~1 cm su un piatto e posizionarle in una nuova gabbia pulita come descritto nella sezione 1.1 per propagare la generazione successiva.

Figura 1: Materiali per l'allevamento delle mosche adulte. (A) Gabbia per l'allevamento delle mosche adulte che mostra la coppa di saccarosio (S) e la coppa di oviposizione (O). (B) Coppa di oviposizione preparata con un panno nero di cotone saturato d'acqua che si estende leggermente oltre il bordo del becher. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Raccolta delle uova. (A) Raccolta delle uova dal panno di oviposizione usando una bottiglia. (B) Recupero delle uova tramite filtrazione a vuoto su carta filtrante ad alto contrasto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materiali per substrati larvari sfusi
Reagente	Messa (g)
Acqua	900
Crusca di grano	230
Integratore per polpacci	100
Vermiculite (grossolana A4)	70
Materiali per soluzioni di de-corionazione
Soluzione	Composizione
Bagno ossidante	Ipoclorito di sodio al 3% in acqua deionizzata
Bagno di lavaggio	Triton X-100 soluzione 0,02% in acqua deionizzata
Sciacquare	Acqua deionizzata
Materiali per la schermatura e le piastre di allevamento dell'agar nero
Reagente	Messa (g)
Acqua	500
Tuorli in polvere	18
Carbone attivo	4
Cloruro di sodio	1

Tabella 1: Reagenti per substrati larvali sfusi, soluzioni di decorionazione e piastre di agar nere. Reagenti utilizzati per la preparazione di substrati larvari sfusi per la manutenzione della colonia, così come per la composizione delle soluzioni usate per indebolire e rimuovere il corione dagli embrioni stabili di mosca, e materiali necessari per preparare 500 mL di mezzo di schermatura e allevamento di agar nero.

Figura 3: Preparazione di substrati larvari sfusi. (A) Materiali utilizzati per la preparazione del substrato larvale sfuso: integratore proteico di vitello (CM), crusca di grano (WB), vermiculite (VM), contenitore di conservazione (SC), coperchio (L) e guarnizione in tessuto (FG). (B) Miscelazione approfondita dei componenti del supporto. (C) Posizionamento della carta filtrante (EP) coperta di uovo coperta verso il basso sulla superficie del supporto e copertura con materiale aggiuntivo per prevenire la disidratazione. (D) Installazione della guarnizione in pallone tra il contenitore e il coperchio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Sviluppo larvale in mezzi sfusi. I contenitori trasparenti permettono di monitorare lo sviluppo larvale e le condizioni del substrato. Le larve (L) sono visibili sulle pareti del contenitore, sul coperchio e all'interno del substrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Preparazione per l'iniezione: de-corionazione e disidratazione

1. Mettere un panno di cotone nero inumidito in un becher come descritto nel passo 1.1.4 e trasferirlo in una gabbia per adulti per 25 minuti per raccogliere le uova. Sciacquare le uova su un setaccio in acciaio inossidabile da 106 μm usando una bottiglia di lavaggio.
   NOTA: Un periodo di raccolta di 25 minuti produce tipicamente circa 400 uova.
2. Lascia riposare gli embrioni senza disturbo sul setaccio per altri 30 minuti.
3. Durante l'invecchiamento, preparare 150 mL ciascuna delle soluzioni ossidanti, lavanti e risciacqui descritte nella sezione "Materiali per le soluzioni di de-chorionazione" della Tabella 1 (Figura 5). Utilizzare un volume sufficiente per coprire gli embrioni con circa 1 cm di soluzione.
4. Immergi il setaccio contenente embrioni nel bagno ossidante per 2 minuti e agita delicatamente gli embrioni usando una pipetta Pasteur (Figura 6A).
   NOTA: L'aspirazione ripetuta e la dispensazione di soluzione per creare un vortice circolare aiutano a concentrare gli embrioni al centro del setaccio e impediscono agli embrioni appena decorionati di aderire alle pareti del setaccio.
5. Rimuovi il setaccio dal bagno ossidante e rimuovi la soluzione in eccesso. Trasferisci il setaccio nella soluzione di lavaggio e agita per aspirazione e dispensazione per 2 minuti.
6. Trasferire il setaccio contenente embrioni nella soluzione di risciacquo e agitare come descritto nel passo 2.4 per 2 minuti. Rimuovi il setaccio dalla soluzione di risciacquo e rimuovi l'acqua in eccesso.
7. Posizionare un copricapo sterile sul setaccio e, al microscopio disseczionale, utilizzare un pennello in nylon a punta fine per trasferire gli embrioni (Figura 6B) dal setaccio al bordo del copricapo. Posizionare gli embrioni vicini senza permetterli di toccarsi, con il polo posteriore più largo rivolto verso il bordo della copertura. Evita di piegare, deformare o strappare gli embrioni durante il trasferimento.
8. Prepara una camera di essiccazione coprendo il fondo di una fiaschetta da 1 L con 100 mL di disidratante di solfato di calcio e sigillando la fiaschetta con un tappo di gomma.
   NOTA: Dopo 24 ore di equilibrio, la camera di essiccazione raggiunge tipicamente un'umidità relativa del <5% a 23 °C.
9. Rimuovere l'acqua in eccesso dal copertore e posizionare il copertore contenente embrioni decorionati sul desicante. Richiude la fiaschetta con un tappo di gomma e secca gli embrioni per 8 minuti.
10. Rimuovere il copertura dalla camera di essiccazione e posizionarlo sul palco del microscopio sotto un obiettivo del 20× per la microiniezione.

Figura 5: Soluzioni di decorionazione. Da sinistra a destra: setaccio in acciaio inossidabile, soluzione ossidante, soluzione per lavaggio e soluzione per risciacquo usati per la decorionazione embrionale. L'ipoclorito di sodio viene mantenuto come soluzione stock al 6% protetta dalla luce, mentre il Triton X-100 viene mantenuto come soluzione stock al 10× e diluito a una concentrazione finale dello 0,02% prima dell'uso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Decorionazione embrionale. (A) L'aspirazione delicata e la distribuzione della soluzione generano un vortice che concentra gli embrioni al centro del setaccio e riduce l'adesione alle pareti del crivello. (B) Embrione decorionato che emerge dal corione traslucido dopo il risciacquo. Il polo anteriore (estremità più stretta) emerge tipicamente prima del polo posteriore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Microiniezione

1. Estrarre aghi di microiniezione di quarzo da capillari di vetro filamentati da 100 mm (I.D. 0,7 mm, O.D. 1,0 mm) utilizzando i parametri elencati nella Tabella 2. Conserva gli aghi in un luogo privo di polvere fino all'uso.
   NOTA: Possono essere utilizzati anche aghi borosilicato con geometria simile.
2. Prepara il tampone per iniezione (0,1% w/v di fenolo rosso in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4) e filtra la sterilizzazione tramite un filtro a siringa da 0,22 μm.
3. Preparare 20 μL di miscela di iniezione combinando 10 μg ciascuno di plasmide helper e plasmide donatore di piggyBac, che contiene il carico genetico tra le ripetizioni terminali invertite sinistra e destra di PiggyBac, con 4 μL di buffer di iniezione. Diluire fino a una concentrazione finale di 500 ng/μL usando acqua priva di nucleasi.
   NOTA: Il plasmide helper comprende la sequenza promotrice hsp83 da 3,1 kb a monte del codone iniziale hsp83. e della sequenza codificante iperattiva della trasposasi piggyBac.
4. Trasferire la miscela di iniezione in un filtro a basso volume da siringa PTFE da 0,20 μm e posizionare il filtro nell'apertura di un tubo microcentrifuga da 0,5 mL (Figura 7A). Centrifugare a ≥11.000 x g per 10 minuti o finché tutta la miscela di iniezione non è passata attraverso il filtro. Conserva la miscela di iniezione non utilizzata a -20 °C.
5. Riempire un ago di microiniezione al quarzo con circa 2 μL di miscela di iniezione utilizzando una punta di pipetta a micro-gel (Figura 7B). Evita di introdurre bolle d'aria durante il carico.
   NOTA: Orientare l'ago di microiniezione parallelo all'asse lungo dell'embrione e mantenere uno spostamento angolare orizzontale e verticale zero per minimizzare lacerazioni e taglio.
6. Batti delicatamente la punta dell'ago contro il bordo di un vetrino di vetro finché la miscela di iniezione non scorre attraverso la punta dell'ago (Figura 7C).
   NOTA: Rompi gradualmente la punta dell'ago per creare l'apertura più piccola e netta che permetta comunque il flusso di iniezione-miscela.
7. Iniettare l'embrione attraverso il polo posteriore immediatamente dopo la disidratazione, utilizzando circa 700 hPa di pressione di iniezione e 300 hPa di contropressione.
8. Perforare delicatamente l'embrione e iniettare circa un decimo del volume embrionale con la miscela di iniezione (Figura 7D–F).
   NOTA: Minimizzare la penetrazione dell'ago per ridurre il disturbo della membrana vitellina e prevenire la perdita di ooplasma durante il ritiro dell'ago.
9. Trasferire il copertino in una piastra di Petri foderata con una carta filtro nera sterile e umidita di 90 mm immediatamente dopo l'iniezione e incubare a temperatura ambiente per 48 ore.
   NOTA: Completare tutte le iniezioni entro 2 ore dalla posizione dell'oviposizione per attaccare gli embrioni prima della fase sinciziale.
10. Esaminare gli embrioni per la schiusa ogni 12–16 ore. Trasferire le larve appena schiuse e il vetrato di vetro su una piastra agar inoculata e condizionata preparata come descritto nella sezione 4.

Parametro	Calore	Fil	Vel	Del	Tira
Valore	825	5	60	150	175

Tabella 2: Parametri di estrazione dell'ago. Parametri utilizzati per generare aghi di microiniezione al quarzo.

Figura 7: Microiniezione embrionale. (A) Filtrazione della miscela iniettabile utilizzando un filtro a siringa immerso in un tubo microcentrifuga da 0,5 mL. (B) Caricamento della miscela filtrata di iniezione in un ago per microiniezione utilizzando una punta di pipetta a caricamento gel. (C) Geometria terminale di un ago di microiniezione al quarzo. (D) Allineamento dell'ago con il polo posteriore dell'embrione. (E) Penetrazione della superficie dell'embrione minimizzando il disturbo della membrana vitellina. (F) Iniezione di circa un decimo del volume embrionale seguita da ritiro con ago. Un aumento della trasparenza indica lo spostamento dell'ooplasma dalla miscela iniettabile. Barra della scala = 400 μm (D–F) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Preparazione della piastra trattata

1. Formulazione del mezzo per agar
   1. Prepara il mezzo descritto nella sezione "Materiali per la Schermatura e le Piastre di Allevamento dell'Agar Nero" della Tabella 1 e l'autoclave per 15 minuti a 121 °C. Versare l'agar a 40 °C oppure conservarlo a temperatura ambiente prima di riscaldarlo e dispensarlo in piastre di Petri da 90 mm.
      NOTA: Agita vigorosamente prima di versare per sospendere le particelle solide.
2. Inoculazione a placche
   1. Diluire una coltura di 24 ore di K12 Escherichia coli a OD600 = 0,200 nel brodo Luria-Bertani e dispensare 200 μL su una piastra di agar raffreddata e solidificata. Distribuisci la coltura in modo uniforme usando perline di vetro sterili o uno sparpagatore di vetro e lascia che la piastra assorba l'umidità in eccesso (Figura 8A, B).
      NOTA: Usa le piastre di agar entro 1 mese dal versamento o scartale per garantire una crescita affidabile di batteri e larve.
3. Condizionamento delle placche
   1. Piega 6 × 6 cm di carta filtro nera per creare 6-10 scanalature ondulate e sterilizza tramite cottura o autoclavaggio. Posiziona una carta filtrante ondulata sterile asepticamente sulla piastra di Petri inoculata e inumidila con diverse gocce d'acqua sterile (Figura 8C).
   2. Sterilizzare in superficie le larve di primo stadio di tipo selvatico (WT) non trattate e non iniettate e trasferire 10 larve sulla carta filtrante inumida.
      NOTA: Sterilizza gli embrioni WT immergendoli in candeggina al 10% (0,6% NaOCl) per 1 minuto, seguito dal risciacquo in acqua sterile deionizzata per 2 minuti.
   3. Posizionare una carta filtrante da 90 mm tra il coperchio e il corpo della piastra di Petri per fungere da guarnizione.
   4. Lasciare che le larve di WT condizionino le placche per 24 ore prima di aggiungere embrioni iniettati su coperture di vetro (Figura 8C). Rimuovere le larve WT dopo la schiusa dei primi embrioni iniettati.

Figura 8: Preparazione delle placche d'agar e recupero post-iniezione. (A) Inoculazione delle placche di agar con una coltura OD600 = 0,2 di Escherichia coli utilizzando perline di vetro sterili. (B) Assorbimento dell'eccesso di umidità superficiale prima del trasferimento dell'embrione. (C) Posizionamento di una guarnizione di carta filtrante da 90 mm tra il coperchio e il corpo della piastra di Petri. (D) Screening delle larve per marcatori fluorescenti su piastre agar condizionate. Gli embrioni iniettati vengono recuperati su una carta filtrante di 90 mm satura d'acqua deionizzata, posta nel coperchio di una piastra di Petri invertita e incubati per 48 ore prima di essere trasferiti su placche di schermo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Results

Utilizzando questo protocollo, 431 embrioni stabili di mosca sono stati decorionati e iniettati con plasmide donatore piggyBac-Hsp83 e plasmide helper Hsp83 a una concentrazione finale di 500 ng/μL. Dei 431 embrioni iniettati, 18 larve ZsGreen-positive (4,2%) e 8 ZsGreen-negative (1,9%) si sono schiuse 48-76 ore dopo l'iniezione quando sono state screenate su piastre di agar nero al carbonio (Tabella 3). In totale, 26 su 431 embrioni iniettati sono schiusi (6,0%) e 16 delle 26 larve schiuse sono sopravvissute fino all'età adulta (61,5%).

Specie	Tipo di iniezione	Costrutto	# iniettato	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	ZsGreen(+) Pupae	ZsGreen(-) Pupe	ZsGreen(+) Adulti	ZsGreen(-) Adulti	# Adulti che producono discende ZsGreen(+)
Stomoxys calcitrans	Inserimento della trasposasi	Hsp83:hy-pBac (aiutante, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (donatore, 500 ng/uL)	226	5	8	5	6	3	6	1
Stomoxys calcitrans	Inserimento della trasposasi	Hsp83:hy-pBac (aiutante, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (donatore, 500 ng/uL)	205	13	0	7	0	7	0	5

Tabella 3: Statistiche sulle iniezioni. Tassi di sopravvivenza, trasformazione e recupero dopo microiniezione embrionale.

Delle 18 larve G0 ZsGreen-positive, 12 sono sopravvissute fino alla pupazione (66,7%) e 10 sono eclose da adulte. Sei adulti ZsGreen positivi (1,4% degli embrioni iniettati, 60% dei fertili sopravvissuti a G0) hanno prodotto discendenti ZsGreen-positivi. Questi discendenti (Figura 9A–E) erano autoincrociati e mantenevano fluorescenza per sei generazioni al momento della stesura.

Tra le otto larve ZsGreen-negative, sei sono sopravvissute fino all'età adulta (75%). Nessuno degli adulti non fluorescenti ha prodotto prole fluorescente.

Figura 9: Screening fluorescente delle mosche transgeniche. (A) Confronto tra larve di F1 che esprimono ZsGreen e larve WT. (B) Fluorescenza visibile attraverso la cuticola pupale, che consente lo screening transgenico allo stadio pupale. (C,D) Confronto tra tre larve e pupe che esprimono ZsGreen (a sinistra) con tre larve e pupe WT (a destra) sotto illuminazione a luce bianca (C) e fluorescenza (D). (E) Mosca adulta transgenica F1 che esprime ZsGreen (sinistra) rispetto a una mosca adulta WT (destra). Barre in scala = 1 mm (A), 2 mm (B,E) e 3 mm (C,D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

La trasformazione genetica delle specie di insetti non modello rimane un importante collo di bottiglia nello sviluppo e nella valutazione delle strategie di controllo genetico per i parassiti e i vettori artropodi.

Per le mosche stabili, il protocollo descritto qui riduce il tempo, le risorse, il lavoro e la variabilità associati all'iniezione e all'allevamento delle mosche G0 dopo la microiniezione embrionale. Inoltre, l'uso di piastre di schermatura per agar nero consente l'osservazione diretta dello sviluppo durante tutto il ciclo vitale, facilitando l'identificazione e la correzione dei problemi che sorgono durante l'iniezione, il recupero e l'allevamento larvale. Utilizzando i costrutti plasmidiali valutati in questo studio, il protocollo ha generato linee di mosca stabili transgeniche con meno embrioni iniettati rispetto ai metodi precedentemente^{riportati 9}. Sebbene oltre l'ambito di questo articolo sui metodi, la conferma e la localizzazione dei siti di inserimento del transgene possono essere effettuate utilizzando approcci consolidati come la PCR inversa e la PCR a splinkerette.

Un protocollo di iniezione efficiente facilita anche studi futuri in genomica funzionale, inclusa la caratterizzazione dei promotori tramite segnalatori fluorescenti; competenza vettoriale, attraverso analisi genetiche inverse dei geni associati alla trasmissione di patogeni; caratterizzazione delle nucleasi, inclusa la valutazione di CRISPR-Cas9 e di altre nucleasi programmabili nelle mosche stabili; ricerche sulla resistenza agli insetticidi attraverso la modifica degli alleli candidati alla resistenza; e indagini sulla biologia di base, inclusi geni coinvolti nell'alimentazione del sangue, nell'accoppiamento e nello sviluppo. Il nostro protocollo elimina inoltre la necessità di iniezioni embrionali immerse in olio e camere di umidità ossigenate per il recupero post-iniezione dell'embrione, come documentato nella precedente letteratura sulla trasformazione domestica di Musca e Lucilia cuprina ^{piggyBac 16,17}.

Diversi parametri sono fondamentali per una transgenesi di successo. La disidratazione embrionale e il momento dell'iniezione sono particolarmente importanti perché il DNA plasmidico deve essere introdotto prima della cellularizzazione per garantire l'incorporazione nelle cellule precursori della linea germinale. Tuttavia, il momento preciso della formazione del sincizio negli embrioni di mosche stabili rimane sconosciuto. Inoltre, il tasso di sviluppo embrionale è influenzato dalla temperatura e la tempistica di sviluppo degli embrioni stabili di mosca in diverse condizioni ambientali non è stata completamente caratterizzata. Future ricerche sui tassi di sviluppo e sull'embriogenesi di ceppi di mosca stabili da laboratorio potrebbero fornire spunti sull'ottimizzazione dei protocolli di microiniezione e trasformazione, aumentando così ulteriormente l'efficienza e la riproducibilità dei protocolli. Tuttavia, fino ad allora, determinare la finestra ottimale di iniezione rimane una limitazione metodologica che può influire sull'efficienza della trasformazione. Quando i tassi di sopravvivenza sono bassi, la risoluzione dei problemi può essere effettuata confrontando i tassi di schiusa e quelli degli adulti tra embrioni non trattati, embrioni decorionati, embrioni iniettati con PBS sterilizzato con filtro e embrioni WT allevati su placche di agar. La letteratura precedente che descriveva la trasformazione della Musca domestica ha prodotto 14 eventi di integrazione su 1.668 iniezioni (0,84% delle iniettate)¹⁶, e la trasformazione del parassita ovino Lucilia cuprina ha stabilito 3 linee transgeniche da circa 900 iniezioni embrionali (0,33% delle iniettate⁾¹⁷, suggerendo che il protocollo di trasformazione della mosca stabile descritto in questo protocollo (6 eventi di integrazione in 431 iniezioni, l'1,4% delle injettate) offre un miglioramento dell'efficienza dell'iniezione rispetto ad altre specie di divitri infestanti presenti in letteratura.

Il promotore costitutivo della mosca stabile hsp83 ha fornito un'espressione robusta di ZsGreen durante tutto lo sviluppo e ha supportato l'espressione della trasposasi iperattiva piggyBac durante l'embriogenesi precoce, migliorando così la visibilità dei marcatori fluorescenti e l'efficienza della trasformazione rispetto a^{un protocollo} di trasformazione 9 precedentemente segnalato. Il plasmide aiutante utilizzato in questo studio è stato generato subclonando 3,1 kb di DNA genomico immediatamente a monte del codone iniziale di hsp83 in un vettore plasmidico minimo a monte della sequenza codificante della transposasi iperattiva piggyBac. Il rapporto tra aiutanti e plasmidi di carico è stato stabilito empiricamente a 1:1 in massa ed è stato utilizzato durante tutto lo studio. Sebbene non siano stati valutati rapporti plasmidiali aggiuntivi, anche rapporti alternativi potrebbero rivelarsi efficaci.

I miglioramenti qui descritti potrebbero essere applicabili ai protocolli di transgenesi per altri artropodi. Inoltre, il sistema di screening e allevamento basato sull'agar è attualmente applicato all'iniezione e allo screening di embrioni di mosca soldato nero (Hermetia illucens). Il protocollo può essere particolarmente utile per gli sforzi di transgenesi in altre mosche muscidi, tra cui Musca domestica e Haematobia irritans, grazie alla loro simile ecologia larvale e allo sviluppo di substrati fibrosi in decomposizione. L'uso di placche agar inoculate con Escherichia coli può offrire un approccio pratico per il monitoraggio post-iniezione, consentendo ai ricercatori di valutare lo sviluppo embrionale, la morfologia larvale, l'espressione dei marcatori, i tassi di schiusa e il recupero complessivo. Adattare la componente batterica del mezzo alla biologia della specie bersaglio può ulteriormente aumentare l'utilità di questo approccio nello sviluppo e nell'ottimizzazione dei protocolli di transgenesi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L flask with rubber stopper (desiccation chamber)	VWR	214-1134	Camera di desidicazione
Bacto Agar	Difco	281230	Agar per piastre agar nere
Black pillowcases	Aisawate	3.45496E+11	Tessuto di cotone nero per coppe di raccolta uova e guarnizione in tessuto per scatole di allevamento larve
Calcium sulfate desiccant	Drierite	21001	Dessiccante per camera di desidicazione
Calf Manna Performance Supplement	Manna Pro	095668940010	Media larvale sfusa
Compound microscope	Leica Microsystems	DM750M	Microscopio per iniezioni
Dried Egg Yolks	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	Fonte di nutrienti per piastre agar nere
E. coli	New England Biolabs	C2987H	Batteri utilizzati su piastre agar nere
Femtojet 4i microinjection pressure supply	Eppendorf	5252000021	Fornitura di pressione per microiniezione
Fine-tipped nylon paintbrush	Transon	7.42298E+11	Trasferimento di embrioni
Fire-polished quartz capillaries with filament, OD 1.0 mm, ID 0.70 mm, 10 cm length	World Precision Instruments	QF100-70-10	Capillari per tirare gli aghi
Forceps	Fine Science tools	11251-20	Manipolazione del campione
Full height seive, 3” dia, No. 140 ASTM-E11 Standard test sieve (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	Ritengo gli embrioni durante la decoriolazione
Germicidal Ultra Bleach (6% sodium hypochlorite)	Pure Bright	59647-21014	Soluzione di candeggina per rimuovere il corion
GladWare Family Size Food Storage Containers, XL 104 oz	Glad	012587701294	Contenitore per media larvale sfusa
Grade 8613, 9cm Black qualitative filter papers	Ahlstrom	8613-0550	Raccolta degli embrioni
LB Broth	BD Difco	DF0446-17-3	Brodo LB per coltura di E.coli
M60 zoom stereo dissecting microscope with Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	Microscopio per spostare e allineare gli embrioni
Microloader tips 0.5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	Usato per caricare il mix per iniezione negli aghi
Micromanipulator	Leica Microsystems	11520137	Micromanipolatore per l'iniezione
Millex Syringe Filter, Hydrophilic PTFE, 0.2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	Usato per filtrare il mix per iniezione
Nuclease-free water	Corning	46-000-CM	Buffer per iniezione
Organic coconut activated charcoal powder	Belle Chemical	B073BSNLJ3	Pigmento per piastre agar nere
P-2000 Laser-based pipette puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Dispositivo per tirare gli aghi dai capillari
PBS, pH 7.4	Gibco	10-010-023	Buffer per iniezione
Petri plates	VWR	391-0609	Piatti Petri per piastre agar nere
Phenol red, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	Colorante per l'iniezione
Rubber stoppers	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	Tappo per camera di desidicazione
Soft wheat bran (soft red winter wheat) 50 lb	Siemer	55600050500000	Media larvale sfusa
Square Glass Coverslips, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	Coverslip in vetro per microiniezione
Stereo microscope fluorescent adapter	Nightsea	SFA-RB	Lampada fluorescente e filtri per lo screening delle larve
Sterile glass beads	VWR	1.04016.0500	Distribuzione di batteri sulle piastre
Transfer Pipette Disposable 5mL	LabAid	BP1200	Lavaggio degli embrioni durante la decoriolazione
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	Decoriolazione degli embrioni
Wash bottle	Safetyware	Z423335	Lavaggio degli embrioni dalle superfici