Un modello di angiogenesi tridimensionale basato su perle di microcarrier utilizzando cellule endoteliali della vena ombelicale umana

Sommario

Questo protocollo descrive un modello di angiogenesi tridimensionale basato su perle microportatori, utilizzando cellule endoteliali delle vene ombelicali umane. Il saggio consente la visualizzazione diretta della germinazione endoteliale e della formazione di strutture simili a un lume e può essere applicato a studi sui meccanismi angiogenici e interventi terapeutici.

Abstract

L'angiogenesi è un processo biologico a più fasi che coinvolge attivazione, migrazione, allungamento, formazione del lume, ramificazione e anastomosi delle cellule endoteliali. I sistemi di coltura bidimensionale convenzionali sono utili per la valutazione preliminare di farmaci, geni o condizioni di coltura, ma non riproducono adeguatamente l'organizzazione spaziale della morfogenesi endoteliale all'interno di una matrice extracellulare tridimensionale. Il protocollo attuale descrive un saggio tridimensionale di angiogenesi tridimensionale basato su perle di microportatori utilizzando cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). Gli HUVEC vengono inizialmente seminati su perle di microcarrier contenenti collagene suino di tipo I denaturato chimicamente accoppiato con acidi e poi incorporati in una matrice di membrana basale. I fibroblasti mucosi orali vengono successivamente seminati sopra il gel per fornire supporto paracrino alla germinazione endoteliale e alla formazione di strutture simili a vascoli. Il mezzo di coltura viene sostituito ogni 2 giorni e il comportamento germinativo e i fenotipi angiogenici vengono monitorati tramite microscopia invertita. In condizioni di coltura appropriate, i germogli endoteliali emergono entro pochi giorni, seguiti dalla formazione di strutture simili a lumen e connessioni tra germogli. Questo metodo fornisce una piattaforma comoda e riproducibile per studi in vitro sulla morfogenesi endoteliale e può essere ulteriormente applicato a indagini sulla manipolazione genica, l'intervento farmacologico e la modellizzazione delle malattie.

Introduzione

La germinazione endoteliale è un evento chiave nell'angiogenesi e comporta l'emergenza, la migrazione, la proliferazione e l'allineamento delle cellule endoteliali da strutture vascolari preesistenti, seguita dalla formazione del lume e dall'istituzione di reti vascolari simili^{a quelle interconnesse 1,2}. Sebbene i sistemi di coltura bidimensionale convenzionali e i saggi di formazione a tubo a base di gel siano tecnicamente semplici, sono limitati nella loro capacità di ricapitolare la rimodellazione spaziale delle cellule endoteliali all'interno di un microambiente^{tridimensionale 3,4}. Il classico saggio tridimensionale di germinazione tridimensionale basato su perle di microportatori riproduce diverse fasi di angiogenesi in vitro, tra cui la germinazione endoteliale, l'allungamento, la formazione del lume e l'assemblaggio della rete, ed è quindi diventato un metodo ampiamente utilizzato per la ricerca sull'angiogenesi.

Nel protocollo attuale è stato stabilito un modello tridimensionale di germinazione basato su perle microportanti utilizzando cellule endoteliali normali della vena ombelicale umana. Basandosi su saggi di germinazione di microsfere endoteliali ^{precedentemente riportati 5,6,7}, questo metodo preserva la struttura di base del rivestimento cellulare endoteliale sulle sfere microtrasportanti, l'inserimento in una matrice tridimensionale e la coltura di fibroblasti, sostituendo al contempo il convenzionale gel di fibrina da una matrice basale per semplificare la procedura e facilitare l'imaging di routine. La matrice della membrana basale è stata selezionata in questo protocollo modificato per diverse ragioni pratiche e biologiche. Sperimentalmente, fornisce una matrice tridimensionale pronta all'uso che permette la formazione rapida del gel, l'incastramento semplice delle perle e un'osservazione microscopica di routine senza i passaggi aggiuntivi di polimerizzazione necessari per la preparazione del gel di fibrina. Biologicamente, la matrice della membrana basale contiene componenti della matrice extracellulare che supportano l'adesione cellulare endoteliale, la migrazione, l'estensione dei germogli e la formazione di strutture simili a un lume. Pertanto, questa modifica è adatta a studi che richiedono la visualizzazione diretta del comportamento di germinazione endoteliale, il confronto di fenotipi angiogenici e la valutazione di interventi farmacologici o genetici in un ambiente di coltura tridimensionale. Tuttavia, poiché la matrice della membrana basale differisce dal gel di fibrina per composizione della matrice, proprietà meccaniche, degradabilità e segnali bioattivi, il presente saggio dovrebbe essere interpretato come un modello di germinazione modificato basato su perle microportanti piuttosto che come una sostituzione diretta del classico saggio a base di fibrina. Queste differenze legate alla matrice possono influenzare la cinetica dello spuntare, la stabilità del lume e la morfologia della rete, e dovrebbero essere considerate nel confronto dei risultati tra diversi sistemi di angiogenesi tridimensionali. Questo modello è adatto per osservare il comportamento di germinazione endoteliale in tre dimensioni e può essere ulteriormente applicato a studi di intervento farmacologico, manipolazione genica e meccanismi angiogenici.

Protocollo

Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana utilizzate in questo protocollo sono state isolate e coltivate da tessuti del cordone ombelicale umano raccolti dal Dipartimento di Ostetricia del Primo Ospedale Popolare della Provincia dello Yunnan. Il consenso scritto informato di tutti i donatori è stato ottenuto prima della raccolta del campione. Tutte le procedure che coinvolgono materiali di origine umana sono state approvate dal Comitato Etico Medico del Primo Ospedale Popolare della Provincia dello Yunnan (approvazione n. KHLL2023-KY198). I fibroblasti mucosali orali umani (HOMF) sono stati gentilmente forniti dal gruppo di ricerca della Dott.ssa Jiemei Zhai presso l'Ospedale Stomatologico Affiliato dell'Università Medica di Kunming. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione delle celle

1. Coltivare cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) in un mezzo di crescita delle cellule endoteliali integrato con siero bovino fetale aggiuntivo (FBS) fino a una concentrazione finale del 10% a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂. Le cellule utilizzate per il test devono essere prive di contaminazione, mostrare una crescita stabile e trovarsi nella fase logaritmica di crescita. Usa le celle ai passaggi 4–6.
2. Coltivare fibroblasti mucosali orali umani (HOMF) in un mezzo basale ad alto contenuto di glucosio integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂. Usa le celle ai passaggi 4–6.
3. Prima di rivestire con microperle di portaporti, confermare che entrambi i tipi cellulari siano in una confluenza appropriata. Evita colture eccessive o digestione enzimatica eccessiva, poiché queste potrebbero influire negativamente sulla successiva germinazione.

2. Preparazione delle sfere microtrasportatrici

1. Idratare 0,5 g di microperline secche in 50 mL di PBS per almeno 3 ore. Dopo il lavaggio, risospendere le sfere in 50 mL di PBS per ottenere una sospensione microportante da 10 mg/mL, corrispondente a circa 3 × 10⁴ sfere/mL.
2. Trasferisci la sospensione in una bottiglia di vetro siliconato, sterilizzala autoclavando a 115 °C per 15 minuti e conservandola a 4 °C fino all'uso.
3. Prima del rivestimento delle cellule endoteliali, rimuovere la soluzione di conservazione e lavare le sfere con PBS sterile. Bilanciare le sfere nel mezzo di crescita delle cellule endoteliali a 37 °C per almeno 30 minuti.
4. Sospendere delicatamente le perle equilibrate immediatamente prima dell'uso per evitare sedimentazione e aggregazione di perline.
5. Prima di rivestire la cella, esaminare una piccola aliquota della sospensione a perle sotto un microscopio invertito. Procedere solo quando le perle sono completamente idratate, sospese uniformemente e prive di aggregati visibili o particelle frammentate.

3. Rivestimento delle cellule endoteliali su perle microtrasportatrici

1. Distogliere gli HUVEC usando tripsina e risospendere le cellule nel mezzo di crescita delle cellule endoteliali.
2. Rivestire le microperle di portatori a una densità di 1.500 celle per perla. Mescolare 3 × 10⁶ HUVEC con 2.000 microsfere di portatori in 1,5 mL di mezzo di crescita delle cellule endoteliali.
3. Trasferire la miscela cellulare-perla in un tubo microcentrifuga e incubare per 12 ore in un incubatore di colture cellulari. Durante tutto il periodo di incubazione di 12 ore, invertire delicatamente il tubo una volta ogni 20 minuti per mantenere un contatto adeguato tra cellule e sfere e favorire un attacco uniforme delle cellule endoteliali.
4. Dopo 12 ore, trasferire le perle rivestite in una fiaschetta^{di 2} cellule da 25 cm contenente 4 mL di mezzo di crescita endoteliale e continuare l'incubazione durante la notte per consentire un attacco saldo delle cellule endoteliali alla superficie della microsfera portatrice.
5. Prima di immergere, esamina le sfere rappresentative rivestite al microscopio invertito. Procedere all'incastramento della matrice solo quando più dell'80% delle sfere esaminate mostra uno strato cellulare endoteliale continuo e relativamente uniforme sulla superficie della sfera, con cellule libere minime, nessun grumo cellulare evidente e nessuna aggregazione grave delle sfere. Palline con rivestimento irregolare, grandi cluster cellulari o aggregazioni estese non dovrebbero essere utilizzate per l'incorporamento.
6. Se le perle aderiscono al fondo della fiaschetta, scuota delicatamente la fiaschetta per liberarle. Evita la pipettazione vigorosa, che può causare aggregazione delle perle o distacco cellulare.

4. Incorporare le perle rivestite in una matrice tridimensionale

1. Trasferire le microsfere portanti rivestite di cellule endoteliali in un tubo centrifuga da 15 mL e lasciare che le sfere si depositino per gravità. Rimuovi il substrato in eccesso e aggiungi un volume appropriato di substrato fresco.
2. Mescola la sospensione delle microsfere con la matrice di membrana basale pre-raffreddata in un rapporto 1:1 (v/v) per ottenere una concentrazione finale di 500 sfere/mL.
3. Aggiungere 100 μL della sospensione a perle a matrice al centro di ogni pozzo di una piastra a 24 pozzi, permettendo alla miscela di formare una singola goccia di gel a cupola senza toccare la parete del pozzo. Mescola delicatamente la sospensione subito prima di erogare ed evita di introdurre bolle d'aria.
4. Lasciare la piastra a 24 pozzi a temperatura ambiente per 5 minuti per permettere la gelificazione iniziale e la stabilizzazione della goccia di gel. Poi incubare la piastra in posizione verticale a 37 °C al 5% di CO₂ per 15 minuti, seguita da un'incubazione aggiuntiva di 15 minuti in posizione invertita per garantire una gelificazione completa e una corretta formazione del gel.
5. Dopo che il gel si è completamente solidificato, procedere immediatamente con la coltura di sovrapposizione di fibroblasti.

5. Cultura di sovrapposizione di fibroblasti

1. Sospendere 3 × 10⁴ fibroblasti mucosali orali umani (HOMF) in 1 mL di mezzo di crescita delle cellule endoteliali e aggiungere delicatamente la sospensione cellulare lungo la parete di ciascun pozzo, permettendo alle cellule di distribuirsi sulla superficie del gel senza disturbare direttamente la cupola del gel.
2. Continuare l'incubazione in un mezzo di crescita cellulare endoteliale a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂. I fibroblasti mucosi orali umani sono utilizzati come cellule di supporto perché forniscono segnali paracrini derivati dallo stromale che favoriscono l'estensione dei germogli endoteliali, la stabilizzazione e il rimodellamento simile a quello vascolare nel sistema di coltura tridimensionale.

6. Mantenimento della coltura e osservazione microscopica

1. Sostituisci il substrato di coltura ogni 2 giorni. Durante i cambi del mezzo, aspira lentamente il substrato esausto e aggiungi un substrato di coltura fresco lungo la parete del pozzo per evitare di disturbare il gel.
2. Osserva le colture quotidianamente o a giorni alterni al microscopio rovesciato usando la modalità campo chiaro o contrasto di fase. Per l'analisi quantitativa longitudinale, selezionare più campi visivi in ciascun pozzo al giorno 7 e fotografare gli stessi campi predefiniti nei giorni 9 e 11.
3. In condizioni ottimali di coltura, si osserva tipicamente un evidente germoglio endoteliale nei giorni 4–6, compaiono strutture simili a lumen nei giorni 5–7 e si formano gradualmente reti microvascolari interconnesse dopo il giorno 7.
4. Definire la germinazione di successo come la presenza di molteplici estensioni endoteliali che crescono radialmente dalla superficie della perla nella matrice tridimensionale circostante. Un germoglio dovrebbe essere contato solo quando si estende chiaramente oltre la superficie della perla e rimane collegato allo strato cellulare endoteliale associato alla perla.
5. Definisci la formazione di strutture simili a lumeni come l'apparizione di strutture endoteliali allungate con uno spazio centrale visibile e chiaro o una morfologia tubolare. Le connessioni tra germogli sono definite come contatti diretti o strutture continue formate tra germogli adiacenti.
6. Colture con morte cellulare estesa, aggregazione severa delle perle, struttura gelificata interrotta, bolle abbondanti, collasso della matrice o solo protuberanze cellulari brevi e irregolari devono essere considerate subottimali ed escluse dall'analisi quantitativa.

7. Acquisizione di immagini e analisi quantitativa

1. Seleziona più campi visivi in ciascun pozzo al giorno 7 e acquisisci immagini dagli stessi campi predefiniti nei giorni 9 e 11. Le immagini devono essere raccolte utilizzando ingrandimenti, impostazioni di esposizione e condizioni di imaging identiche in ogni momento.
2. Quantifica il numero di germogli per ogni microsfera portatrice e l'area vascolarizzata.
   1. Per la misurazione dell'area vascolarizata, utilizza software open source per l'analisi delle immagini. Apri l'immagine acquisita e delinea manualmente il confine della regione vascolarizzata di interesse (ROI) usando lo strumento di selezione poligonale o a mano libera. Aggiungi il ROI selezionato al gestore ROI.
   2. Per la visualizzazione, utilizza un plugin di visualizzazione a regione di interesse per visualizzare il ROI indicato. Abilita la misurazione dell'area nelle impostazioni di misurazione e misura il ROI selezionato per ottenere l'area vascolarizzata. Applica le stesse impostazioni di analisi a tutte le immagini.
   3. Per l'analisi del tasso angiogenico, si utilizza l'area vascolarizzata al giorno 7 come base e calcola la variazione relativa dell'area vascolarizzata nei giorni 9 e 11.
3. Contare il numero di singoli germogli indipendentemente da tre osservatori e utilizzare il valore medio per l'analisi.

Risultati

Angiogenesi nel modello tridimensionale HUVEC

Nelle colture consolidate con successo, le cellule endoteliali sono distribuite uniformemente sulla superficie delle microsfere portanti, e non si osserva alcuna aggregazione evidente delle perle. L'osservazione dinamica ha mostrato una progressiva germinazione endoteliale e la formazione di reti simili a microvascolari nei giorni 7, 9 e 11 (Figura 1A). L'analisi quant...

Discussione

Il protocollo attuale descrive un modello modificato di germoglio endoteliale tridimensionale basato su microperle portanti. La Figura 3 fornisce una panoramica schematica del flusso di lavoro sperimentale. Il protocollo è stato adattato dal classico saggio di angiogenesi riportato da Nakatsu e Hughes ed ottimizzato per raggiungere gli obiettivi del presente studio ^8,9. Nel sistema classico, ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1.5 mL microcentrifuge tube	Beyotime	FTUB306	Trasparente, privo di nucleasi
15 mL centrifuge tube	Haier	311005	A fondo conico, sterile, confezionate in sacchetto
24-well cell culture plate	Haier	612003	A fondo piatto, trattate per coltura cellulare, confezionate singolarmente, per coltura cellulare aderente
Automated cell counting slide	Countstar	12-0005-50	Slide monouso per contatore cellulare automatizzato, 50 slide/scatola
CO2 cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	3110	Usato per la coltura cellulare a 37 °C con 5% CO2
Cytodex 3 microcarriers	Cytiva	17048503	Polvere secca; perle di microcarrier in destrosio rivestite di collagene
Dotted Line plugin	N/A	N/A	Plugin di visualizzazione della regione di interesse utilizzato per visualizzare aree vascolarizzate delineate
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM base (1×), contenente 4,5 g/L di D-glucosio, L-glutammina e 110 mg/L di sodio piruvato, 500 mL
Endothelial Cell Medium (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Medium di coltura cellulare endoteliale supplementato con FBS aggiuntivo per una concentrazione finale del 10% prima dell'uso
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C	Qualificato, formato monouso, origine Australia, 500 mL
Human oral mucosal fibroblasts (HOMFs)	Jiemei Zhai research group, The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University	N/A	Fibroblasti primari isolati dalla mucosa orale umana; gentilmente forniti da un altro laboratorio
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	In-house	N/A	Cellule endoteliali primarie isolate dalle vene ombelicali umane; nessun numero di catalogo
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH), USA	N/A	Software open-source; versione 1.54p
Inverted microscope	Olympus, Japan	N/A	Per imaging in campo chiaro, contrasto di fase e fluorescenza
Laser scanning confocal microscope	Nikon, Japan	N/A	Per imaging confocale; modello non specificato
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354262	Alta concentrazione (HC), privo di phenol red, privo di LDEV, 10 mL
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Soluzione di penicillina-streptomicina per coltura cellulare, 100×, 100 mL
Phosphate-buffered saline (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, sterile, 500 mL
T25 cell culture flask	ABCBIO	ABC707008	T25, tappo ventilato, trattate per coltura cellulare, per coltura cellulare aderente
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056	Soluzione di 0,25% di tripsina-EDTA, 100 mL