Elettroagopuntura assistita da isoflurano in un modello ratto di oligoastenozoospermia

Sommario

Questo protocollo dettaglia l'istituzione di un modello di oligoastenozoospermia indotto dall'adenina nei ratti e la successiva somministrazione di elettroagopuntura a CV3, CV4, ST36 e SP6 sotto anestesia isoflurana. Gli esiti sono stati verificati tramite analisi spermatozoica assistita da computer per conteggio e motilità, insieme all'istologia testicolare con colorazione di ematossilina ed eosina.

Abstract

L'oligoastenozoospermia è una delle forme più comuni di disfunzione riproduttiva maschile. Negli studi su roditori, somministrare elettroagopuntura (EA) in modo coerente durante le sessioni ripetute rappresenta una sfida tecnica, soprattutto quando si combinano punti di agopuntura della linea mediana addominale e degli arti posteriori, dove il contatto stabile con gli elettrodi è fondamentale. Zhongji (CV3), Guanyuan (CV4), Zusanli (ST36) e Sanyinjiao (SP6) sono stati selezionati perché questi punti sono frequentemente utilizzati nei protocolli di agopuntura per infertilità e anomalie del seme, e la configurazione addominale mediana più arto posteriore si adatta a un abbinamento standardizzato di elettrodi. Questo rapporto descrive un protocollo pratico per stabilire un modello di oligoastenozoospermia indotto dall'adenina e per somministrare EA assistita da isoflurano con stimolazione accoppiata di CV3–CV4 e ST36–SP6. I maschi di ratti Sprague-Dawley ricevevano adenina per gara quotidiana per 28 giorni per indurre una distruzione riproduttiva. Successivamente, l'EA è stata somministrata quotidianamente per 28 giorni sotto anestesia inalazionale, utilizzando il 3% di isoflurano per l'induzione e l'1,5% per il mantenimento della maschera, per consentire un posizionamento stabile degli ago e l'accoppiamento degli elettrodi (CV3–CV4 e ST36–SP6) con parametri di stimolazione definiti (2 Hz, 1,5 mA, 30 min). Gli effetti del trattamento sono stati valutati tramite analisi del seme assistita da computer per il numero di spermatozoi e la motilità, integrati da istologia di ematossilina e eosina (HE) testicolare. I risultati rappresentativi indicano che l'esposizione all'adenina ha ridotto il numero e la motilità degli spermatozoi e ha interrotto l'architettura dei tubuli seminiferi, mentre l'EA è stata associata a un recupero parziale sia nei parametri dello sperma che nella morfologia testicolare. Questo protocollo offre un riferimento pronto per studi che richiedono una consegna consistente di EA e una verifica di sperma/istologica in un modello ratto di oligoastenozoospermia.

Introduzione

I fattori maschili contribuiscono in modo sostanziale all'infertilità, rappresentando circa la metà di tutte le coppie infertili, con anomalie nel numero di spermatozoi e nella motilità tra i risultati clinici più^{comuni 1,2}. L'oligoastenozoospermia, caratterizzata da una riduzione della concentrazione di spermatozoi e una motilità compromessa, è una delle forme più comuni di disfunzione riproduttiva^{maschile 3,4}. Nonostante la disponibilità di tecniche di riproduzione assistita e terapie mediche empiriche, strategie efficaci per migliorare la qualità dello sperma rimangono limitate, evidenziando la necessità di ulteriori indagini^{precliniche 5,6,7}. Queste esigenze cliniche e traslazionali spingono lo sviluppo di flussi di lavoro sperimentali riproducibili per studiare la distruzione riproduttiva maschile in condizioni controllate.

Interventi di agopuntura sono stati studiati per anomalie seminali e infertilità maschile sia in contesti clinici che^{sperimentali 8}. Sebbene studi clinici suggeriscano potenziali benefici per alcuni parametri dello sperma, i loro disegni, protocolli di intervento e misure di esito variano^{notevolmente 9}. L'elettroagopuntura (EA) è particolarmente adatta alla ricerca di laboratorio perché offre parametri di stimolazione controllati e una regolazione più uniforme rispetto all'agopuntura manuale, facilitando la valutazione dei cambiamenti correlati al trattamento negli esiti riproduttivi^misurabili 10,11,12. Questo vantaggio procedurale rende EA particolarmente adatta a flussi di lavoro preclinici strutturati nella ricerca riproduttiva maschile.

I modelli animali sono centrali per tale valutazione, ma la selezione dei modelli rimane una questione metodologica chiave nella ricerca sull'oligoastenozoospermia. Una recente revisione sistematica ha rilevato che i metodi di modellazione indotti dal busulfano sono controversi e mostrano un'eterogeneità sostanziale negli indici di valutazione, evidenziando la necessità di procedure più chiare e letture più^{coerenti 13}. I modelli basati sull'adenina offrono un approccio sperimentale pratico perché il gavage dell'adenina può indurre compromissione riproduttiva nei ratti, inclusi ridotti degli endpoint legati agli spermatozoi e danni istologici nel tessuto^{testicolare 14,15}. Nel nostro lavoro precedente, un modello di ratto oligoastenozoospermico indotto dall'adenina è stato trattato con EA in un insieme di punti di agopuntu Shu-Mu cervello-rene (Epangsanxian, BL23, GB25 e KI3), insieme a condizioni di controllo non basate su punti di agopuntu e a farmaci positivi, con misure di esito ampliate che includevano coefficienti d'organo e livelli ormonali sierici quantificati da ELISA¹⁶. Basandosi su questa base sperimentale e riconoscendo l'eterogeneità nella selezione dei punti di agopuntura, nel design dei controlli, nei parametri di stimolazione e nelle misure di esito tra gli studi esistenti di EA, il presente protocollo è stato progettato per affinare ed estendere il flusso di lavoro metodologico per una consegna stabile dell'EA.

Di conseguenza, l'attuale protocollo si concentra sulla consegna, affrontando due variabili pratiche critiche per le sessioni EA ripetute nei roditori. Innanzitutto, per prevenire lo spostamento dell'ago e il contatto intermittente con gli elettrodi causato dal movimento degli animali e dalla trazione del filo di piombo, descriviamo una procedura mantenuta con isoflurano che stabilizza la posizione durante la stimolazione e garantisce un contatto affidabile con gli elettrodi tra le sedute; Questo è particolarmente importante quando si combinano i punti della linea mediana addominale con i punti degli arti posteriori. In secondo luogo, sulla base di revisioni precedenti e analisi di punti di agopuntu ^9,17, che identificano CV4, SP6, ST36 e CV3 come punti di agopuntura riproduttiva comuni nei protocolli di infertilità e anomalie del seme, abbiamo selezionato CV3, CV4, ST36 e SP6 e applicato stimolazione a coppie a CV3-CV4 e ST36-SP6. Questa configurazione, che combina i punti addominali della linea mediana e degli arti posteriori, standardizza le connessioni degli elettrodi, minimizza la variabilità causata dall'attacco instabile del caviglio e supporta la somministrazione riproducibile di EA attraverso sessioni di trattamento ripetute. Per mantenere un ambito orientato al protocollo ed evitare di duplicare moduli endocrini, meccanicistici o di controllo positivo precedentemente segnalati, la verifica dell'esito è limitata a un set primario di lettura di sperma e testicoli. Questo insieme comprende l'analisi degli spermatozoi assistita da computer e la colorazione dell'HE, sufficienti a confermare l'induzione del fenotipo e i cambiamenti associati al trattamento all'interno di questo flusso di lavoro.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali rispettavano le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e furono approvate dal Comitato Etico dell'Università Medica di Ningxia (approvazione n. IACUC-NYLAC-2021-130). I maschi di ratti Sprague-Dawley, di 8 settimane e con un peso di 180–220 g, sono stati ottenuti dall'Experimental Animal Center della Ningxia Medical University (licenza n. SYXK (Ning) 2020-0001). Gli animali venivano alloggiati in condizioni standard di laboratorio a 22–24 °C e umidità relativa 52%–56%, con un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio, e avevano libero accesso a cibo e acqua.

1. Preparazione animale, assegnazione di gruppo e creazione di modelli indotti dall'adenina

1. Acclimata i ratti per 7 giorni prima dell'esperimento e monitora quotidianamente le loro condizioni generali.
2. Dopo l'acclimatazione, assegnare a nove ratti numeri di identificazione unici e assegnarli casualmente con un rapporto 1:1:1 in tre gruppi utilizzando una sequenza di randomizzazione generata al computer: un gruppo di controllo (n = 3), un gruppo modello (n = 3) e un gruppo EA (n = 3). Utilizzare ogni ratto come unità sperimentale e includere tutti gli animali e i campioni nell'analisi finale a meno che non vengano soddisfatti criteri di esclusione predefiniti.
3. Tenere i ricercatori che eseguono analisi seminale assistita da computer e valutazione istologica sono ciechi rispetto all'allocazione dei gruppi.
   NOTA: Gli investigatori che erogano l'EA non possono essere accecati perché l'intervento prevede procedure visibili specifiche per gruppo.
4. Prepara una sospensione di adenina da 20 mg/mL in soluzione salina normale contenente gomma arabica allo 0,5% (p/v) come agente sospendente, e mescola accuratamente sia prima che durante la gaffe per prevenire la sedimentazione.
5. Somministrare soluzione fisiologica normale al gruppo di controllo e sospensione di adenina al modello e ai gruppi EA tramite gavage a 10 mL/kg, equivalenti a 1 mL/100 g di peso corporeo, una volta al giorno per 28 giorni consecutivi. Usa una dose di adenina di 200 mg/kg/giorno.
6. Registra il peso corporeo e le condizioni generali durante tutto il periodo di modellazione.
   NOTA: L'adenina viene somministrata come sospensione e si occupa dei sedimenti durante la manipolazione. Mantieni un'agitazione continua durante il gaffe per minimizzare le precipitazioni, che altrimenti potrebbero causare incoerenza nel dosaggio e ostruzione dell'ago del gavage. Se si verifica un ostruzione, sospendere completamente la soluzione e sostituire l'ago del gavage prima di continuare.

2. Anestesia isoflurana per l'erogazione tramite elettroagopuntura (Figura 1)

1. Prepara un sistema anestesico a isoflurano con una camera di induzione, una maschera nasale e un cuscinetto riscaldante.
2. Indurre l'anestesia con isoflurano al 3% nella camera di induzione fino a quando l'attività spontanea diminuisce notevolmente.
3. Trasferire il ratto sulla borsa riscaldante in posizione supina e mantenere l'anestesia con isoflurano all'1,5% tramite maschera nasale durante tutta la fascia epicolare.
4. Confermare un'anestesia adeguata riducendo i movimenti spontanei e la perdita del riflesso di battito di ciglia mantenendo una respirazione regolare.

3. Fedeltà della consegna della stimolazione e controllo qualità

1. Usa una borsa riscaldante per mantenere la temperatura corporea durante tutta la seduta e ridurre la variabilità fisiologica dovuta all'ipotermia.
2. Applicare regolazioni anestesiche costanti su tutti gli animali e le sedute, utilizzando il 3% di isoflurano per l'induzione e l'1,5% di isoflurano per il mantenimento. Mantieni la profondità dell'anestetico al minimo necessario per evitare difficoltà, mantenendo la respirazione regolare.
3. Inserire aghi di agopuntura sterili usa e getta (0,25 mm × 13 mm) verticalmente ai punti selezionati. Inserire gli aghi a profondità di circa 2 mm a CV3 e CV4, 7 mm a ST36 e 5 mm a SP6.
4. Dopo l'inserimento dell'ago e il collegamento dell'elettrodo, confermare visivamente che ogni ago rimanga stabilmente posizionato, senza allentamento osservabile dovuto alla respirazione o al movimento degli arti. Se si verifica uno spostamento, reinserire l'ago verticalmente alla profondità originale e verificare il contatto stabile con l'elettrodo prima di riprendere la stimolazione.
5. Agganciare i terminali dell'elettrodo vicino all'estremità prossimale del manico dell'ago, poi instradarli e fissarli per minimizzare la trazione, poiché il peso del piombo e la trazione sono cause comuni di distacco.
6. Conferma la stimolazione efficace osservando un lieve tremore muscolare locale al punto di agopuntura senza movimenti grossi del corpo. Se non c'è tremore, ricontrollare e confermare il contatto con l'elettrodo e la posizione dell'ago.
7. Esegui un singolo controllo standardizzato a metà sessione di 15 minuti. Se necessario, riaggiusta gli aghi e conferma un lieve tremore locale prima di procedere per ridurre la variabilità nella stimolazione tra gli animali.
   NOTA: Quando si collega il dispositivo EA, agganciare i terminali all'estremità prossimale del manico dell'ago per ridurre la trazione dovuta al peso del cavo. Se necessario, fissa il guinzo e/o l'ago con del nastro adesivo per evitare distacco durante la sessione.

4. Trattamento con elettroagopuntura (Figura 2)

1. Avvia l'EA il giorno successivo al periodo di 28 giorni di gavage dell'adenina e somministrala una volta al giorno per 28 giorni consecutivi.
2. Sotto anestesia isoflurana, espone la parte inferiore dell'addome e gli arti posteriori, e localizza Zhongji (CV3), Guanyuan (CV4), Zusanli (ST36) e Sanyinjiao (SP6) utilizzando punti di riferimento anatomici superficiali.
3. Inserire aghi di agopuntura sterili usa e getta (0,25 mm × 13 mm) verticalmente fino a profondità di 2 mm a CV3 e CV4, 7 mm a ST36 e 5 mm a SP6.
4. Collega una coppia di elettrodi a CV3 e CV4, e collega l'altra coppia a ST36 e SP6.
5. Somministra stimolazione elettrica a 2 Hz e 1,5 mA per 30 minuti. Utilizzare questi parametri per corrispondere a quelli precedentemente impiegati sull'oligoastenozoospermia indotta^{dall'adenina 16}.
6. Applica i controlli di qualità descritti nella Sezione 3, incluso un unico controllo a metà sessione di 15 minuti.
   NOTA: Localizzare i punti di agopuntura dei ratti con riferimento all'Experimental Acupuncture and Moxibustion Science¹⁸, Appendice II di Yong Tang ("Punti di agopuntura comunemente usati negli animali da sperimentazione"), insieme a punti di riferimento anatomici comparativi. Poiché i punti di agopuntura dei ratti rappresentano regioni anatomiche distinte piuttosto che punti geometrici fissi, si utilizza una posizione corporea coerente, punti di riferimento anatomici fissi e misurazioni di superficie basate su millimetri tra animali e sessioni. Localizza Zhongji (CV3) sulla linea mediana ventrale circa 33 mm caudale al centro dell'ombelico. Localizza Guanyuan (CV4) sulla linea mediana ventrale a circa 25 mm caudale al centro dell'ombelico, vicino alle arterie superficiali sottocutanee della parete addominale. Localizza Zusanli (ST36) sul lato posterolaterale del ginocchio, circa 3 mm distale rispetto alla testa fibulare. Individuare Sanyinjiao (SP6) sul lato mediale del ramo posteriore, circa 10 mm prossimali alla punta del malleolo mediale. Applica sempre gli stessi riferimenti di localizzazione, posizione del corpo, angolo di inserimento e profondità di inserimento in modo coerente su tutti gli animali e le sessioni di trattamento.

5. Raccolta di campioni

1. Fast i ratti per 24 ore dopo l'ultima sessione EA.
2. Indurre anestesia profonda tramite iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio al 2% a 2 mL/kg prima della raccolta del tessuto. Confermare l'anestesia profonda con l'assenza del riflesso di ritiro del pedale e del movimento spontaneo.
3. Eutanasia del ratto con decapitazione sotto anestesia profonda, seguendo i protocolli istituzionalmente approvati.
4. Espone immediatamente gli organi riproduttivi in modo asettico. Isolare un epididime della cauda per l'analisi degli spermatozoi ed escludere un testicolo per l'esame istologico.
5. Fissare il testicolo con paraformaldeide al 4% per almeno 24 ore prima dell'elaborazione istologica.

6. Analisi dello spermatozoo

1. Rimuovere il grasso circostante dall'epididime della cauda e inserire immediatamente il tessuto in 2 mL di soluzione salina normale preriscaldata a 37 °C.
2. Incubare il tessuto in un bagno d'acqua a 37 °C per 5 minuti, tritarlo con forbici oftalmiche, filtrare la sospensione attraverso uno schermo da 200 mesh e mescolare delicatamente il filtrato.
3. Carica un'aliquota da 10 μL della sospensione spermatozoida in una camera di conteggio preriscaldata e analizza il numero e la motilità degli spermatozoi utilizzando un sistema di analisi del seme assistito da computer (CASA).
4. Utilizzare lo stesso tipo di camera, condizioni di riscaldamento e impostazioni di acquisizione per tutti i campioni all'interno di un determinato esperimento.

7. Esame istologico del tessuto testicolare

1. Fissare il tessuto testicolare nel 4% di paraformaldeide per almeno 24 ore. Taglia l'area target e mettila in cassette etichettate.
2. Disidratare i campioni tramite una serie di etanolo graduato, eliminarli nello xilene, infiltrarli con paraffina, incastrarli e sezionarli a 4 μm.
3. Fai galleggiare le sezioni su un bagno d'acqua a 40 °C, montale su delle scivolette e asciugale in un forno a 60 °C.
4. Per la colorazione di ematossilina ed eosina, si dewax le sezioni in xilene, si reidratano con etanolo graduato, si colorano con ematossilina per 5–10 minuti ed eosina per 1–5 minuti, poi si disidratano, si trasparentano e si montano.
5. Esaminare l'organizzazione dei tubuli seminifari e la disposizione delle cellule spermatogeniche sotto impostazioni di ingrandimento costanti in tutti i gruppi.

8. Valutazione dell'istituzione del modello e dei cambiamenti associati al trattamento

1. Confermare l'istituzione del modello con una riduzione del numero e della motilità degli spermatozoi, insieme a una struttura disorganizzata dei tubuli seminiferi, rispetto al gruppo di controllo.
2. Confermare i cambiamenti associati al trattamento tramite aumento del numero di spermatozoi e della motilità, insieme a un parziale ripristino della morfologia dei tubuli seminiferi, nel gruppo EA rispetto al gruppo modello.
3. Predefinire come criteri di esclusione campioni tecnicamente compromessi, come quelli con ritardo nel processamento dello spermatozoi, fallimento del carico in camera o sezioni di bassa qualità non correlate alla modellazione. Documenta eventuali esclusioni durante l'analisi.

Risultati

Analisi degli spermatozoi (Figura 3)
Le sospensioni degli spermatozoi epididimali sono state analizzate utilizzando un sistema di analisi dello sperma assistito da computer per quantificare il numero e la motilità degli spermatozoi. In questo dataset rappresentativo, la somministrazione di adenina ha ridotto notevolmente entrambi i parametri rispetto al gruppo di controllo, confermando il successo dell'istituzione del modello. L'intervento EA ha successivamente aumentato il numero di spermatozoi e la ...

Discussione

Data l'eziologia multifattoriale dell'oligoastenozoospermia e l'efficacia limitata dei trattamenti farmacologici disponibili, agopuntura e EA hanno attirato l'attenzione come interventi ripetibili e non^{farmacologici 19}. La letteratura clinica e preclinica esistente suggerisce diversi meccanismi plausibili attraverso cui l'agopuntura o l'EA possono influenzare la funzione riproduttiva maschile, tra cui la modulazione della regolazione neuroendocrina, il miglioramen...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Adenina	Beijing Solarbio Science & Technology Co.Ltd.	A8330
Sistema di analisi del seme assistito da computer CASA	Nanning Songjing Tianlun Biotechnology Co.,Ltd	VICOS-SPERM
Centrifughe	Sartorius	A-14C
Fluido di differenziazione	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co.,Ltd	C0163M
Aghi di agopuntura sterili monouso	Marchio Hanyi		0,25 mm ´ 13 mm
Macchina per asciugare	Leica	HI1220
Stimolatore elettrico	Changzhou Yingdi Electronic Medical Device Co., Ltd	KWD-808I
Bilancia elettronica	Hangzhou Youheng Weighing Equipment Co.,Ltd	HLD-6002
Soluzione di colorazione Eosina Y	Lanke Biotech	BS248
Soluzione di colorazione all'ematoxilina	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4041
Isoflurano	RWD Life Science Co., Ltd.	R510-22-10
Microtomo	Leica	RM2255
Balsamo neutro	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.,Ltd	Zli-9555
Macchina per l'incorporazione di paraffina	Leica	HistoCore Arcadia H
Rat SD	Centro Animali dell'Università Medica di Ningxia		8 settimane, Maschio, 180-220 g
Scanner per diapositive	Leica	Aperio LV1
Macchina per l'anestesia di animali piccoli	RWD Life Science Co., Ltd.	R500
Oscillatore a vortice	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co.,Ltd	QL-902
Cuscino riscaldante	Dongguan Hongda Electronics Co., Ltd.	45W-80X28CM