Valutazione multimodale del trattamento con elettroagopuntura per l'osteoartrite del ginocchio nei topi

Sommario

Questo studio combina tecniche comportamentali e di imaging per la valutazione multimodale e longitudinale di topi con osteoartrite dopo elettroacupuntura, inclusa la colorazione della cartilagine e il punteggio secondo la Osteoarthritis Research Society International (OARSI).

Abstract

L'artrosi è una malattia cronica degenerativa delle articolazioni che colpisce frequentemente il ginocchio causando dolore, gonfiore, rigidità e limitazione funzionale. L'infiammazione sinoviale e le alterazioni dei muscoli periarticolari contribuiscono all'insorgenza e alla progressione della malattia. Evidenze cliniche suggeriscono che l'elettroagopuntura possa alleviare l'infiammazione locale e modulare il metabolismo della cartilagine. In questo studio, l'artrosi del ginocchio è stata indotta nei topi mediante destabilizzazione chirurgica del menisco mediale. I risultati sono stati valutati attraverso un protocollo multimodale comprendente il test del rotarod, ultrasuoni, termografia a infrarossi, risonanza magnetica e colorazione istologica. Il volume della cavità articolare e la temperatura cutanea sono stati monitorati longitudinalmente, mentre la risonanza magnetica finale e la colorazione con Safranina O-Blu Fast Green sono state utilizzate per valutare le alterazioni del segnale nei muscoli periarticolari e la patologia della cartilagine. L'elettroagopuntura si è associata a un miglioramento della performance motoria, riduzione del gonfiore articolare, aumento della temperatura cutanea locale, attenuazione delle alterazioni del segnale muscolare periarticolare nelle immagini di risonanza magnetica e punteggi più bassi di degenerazione della cartilagine. Questi risultati supportano l'utilizzo di questo protocollo multimodale per valutare gli esiti associati all'elettroagopuntura in un modello preclinico murino.

Introduzione

L'osteoartrite del ginocchio (KOA) è la malattia osteoarticolare più diffusa a livello mondiale, con un'incidenza stimata di 250 milioni di persone¹. I suoi segni patologici caratteristici includono la degenerazione progressiva della cartilagine e la proliferazione sinoviale; clinicamente si manifesta con dolore, gonfiore e compromissione funzionale^2,3.

L'osteoartrite (OA) è stata a lungo considerata un disturbo articolare non infiammatorio, ma oggi è riconosciuta come una condizione con un componente infiammatorio, con sinovite riscontrabile nella maggior parte dei pazienti. Si ritiene che citochine pro-infiammatorie come l'interleuchina (IL)-1β e l'IL-18, insieme alle specie reattive dell'ossigeno e allo stress biomeccanico, contribuiscano al processo patologico⁴. L'infiammazione è spesso accompagnata da un aumento del flusso sanguigno locale, che clinicamente si manifesta come arrossamento, calore e gonfiore⁵. Oltre ad accelerare il degrado della cartilagine e il declino funzionale, l'infiammazione potrebbe essere particolarmente attiva nelle fasi iniziali della malattia. Pertanto, il monitoraggio dello stato infiammatorio nel tempo potrebbe guidare strategie terapeutiche mirate al meccanismo sottostante e consentire una gestione adattata alla fase della malattia^6,7. Studi precedenti che utilizzavano l'ecografia (US) nei ginocchi di topi hanno identificato una regione triangolare tra i condili tibiali e femorali. L'analisi istologica ha confermato che questa area contiene tessuti molli, inclusi il tessuto sinoviale, il menisco e il cuscinetto adiposo, nonché spazi riempiti di liquido sinoviale. Questa regione rilevata all'ecografia è definita volume interarticolare, che comprende le aree di tessuto molle sopra menzionate⁸.

Inoltre, la temperatura è un parametro fisico fondamentale che riflette direttamente l'andamento dell'infiammazione articolare. L'aumento della temperatura locale è uno dei quattro segni cardinali dell'infiammazione, e l'imaging termografico consente una rilevazione precisa e una quantificazione di queste alterazioni termiche⁹. Una recente revisione sistematica ha evidenziato la correlazione tra la temperatura della superficie cutanea e le malattie articolari infiammatorie e degenerative¹⁰, confermando ulteriormente l'utilità della termografia a infrarossi (IRT) nella ricerca sull'artrite e nella gestione clinica¹¹. Inoltre, l'IRT fornisce una misura indiretta associata al flusso ematico tissutale e all'attività metabolica e può risultare utile per il monitoraggio della risposta terapeutica.

In questo studio, abbiamo combinato il test del rotarod, l'ecografia (US), la termografia a infrarossi (IRT) e la risonanza magnetica (MRI) per valutare gli effetti dell'elettroagopuntura (EA) in un modello murino di OA. Questo approccio multimodale ha permesso la valutazione simultanea della performance motoria, della morfologia articolare, delle variazioni termiche e dell'infiammazione dei tessuti molli, parametri che non sono ottenibili tramite istologia soltanto. In particolare, questo approccio fornisce informazioni complementari a più livelli biologici con un costo o sforzo aggiuntivo minimo. È pertanto particolarmente adatto per studi preclinici che richiedono un monitoraggio ripetuto e non invasivo nel tempo, specialmente quando l'intervento in esame è atteso produca effetti modesti o quando il profilo temporale della risposta è incerto. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio a impiegare questa specifica combinazione di tecniche, comprendente il volume della cavità articolare, l'infiammazione muscolare e la temperatura locale, per monitorare la risposta terapeutica all'elettroagopuntura nell'OA. Il protocollo descritto è pratico e riproducibile, e riteniamo possa rappresentare un utile riferimento per future valutazioni longitudinali ed in tempo reale dell'efficacia in contesti sperimentali simili.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state esaminate e approvate dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale di Wuchuang Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. (Numero di Approvazione Etica: WTPZ20260209001). Tutti gli animali utilizzati in questo studio erano topi C57BL/6 di 8 settimane di età, del peso di circa 20 g, acquistati da un fornitore commerciale (vedere la Tabella dei Materiali). L'esperimento ha incluso 24 topi. Dopo un periodo di adattamento di 1 settimana, gli animali sono stati assegnati casualmente, con sei topi assegnati a ciascuna delle quattro condizioni sperimentali. Tali condizioni comprendevano intervento fittizio (sham surgery), destabilizzazione del menisco mediale (DMM), agopuntura fittizia (SA) e elettroagopuntura (EA). Il numero di animali utilizzati non è stato determinato mediante un calcolo preventivo della dimensione del campione; invece, la dimensione dei gruppi è stata scelta in base a studi precedenti sull'elettroagopuntura che utilizzavano modelli e punti finali comparabili di osteoartrite e in conformità con il principio delle 3R.

1. Cura preoperatoria e modellizzazione

NOTA: Tutte le procedure di modellizzazione sono state eseguite da un tecnico chirurgo esperto. Restituire gli animali alle loro gabbie solo dopo che hanno ripreso conoscenza su un tappetino riscaldato.

1. Acclimatare i topi all'ambiente sperimentale per almeno 7 giorni prima dell'inizio dell'esperimento.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima dell'intervento. Disinfettare accuratamente l'area chirurgica.
3. Accendere l'apparecchiatura per l'anestesia gassosa. Posizionare il topo nella camera di induzione e indurre l'anestesia generale con iloflurano al 2–3% per 5 minuti.
4. Al termine dell'induzione anestetica, trasferire il topo sul tavolo operatorio. Mantenere l'anestesia somministrando continuamente iloflurano al 1–1,5% tramite maschera anestetica fino al completamento della procedura chirurgica.
5. Posizionare il topo in posizione supina con l'articolazione del ginocchio rivolta verso l'alto. Assicurarsi che la posizione sia stabile e che l'area chirurgica sia completamente esposta. Utilizzare il DMM per creare un modello sull'arto posteriore destro¹². Per il gruppo Sham, effettuare un'incisione nella stessa posizione e quindi suturarla.
   1. Procedura chirurgica DMM
      1. Praticare un'incisione longitudinale mediale parapatellare di 1 cm per esporre l'articolazione del ginocchio.
      2. Attraverso l'incisione parapatellare mediale creata al punto 1.5.1.1, praticare un'apertura longitudinale nella capsula articolare. Utilizzare una pinzetta per separare adeguatamente la capsula dal tessuto circostante. Successivamente, sostenere la zampa posteriore distale con la mano sinistra senza esercitare pressione eccessiva e usare la pinzetta per spostare lateralmente la rotula e il legamento rotuleo, esponendo così l'articolazione del ginocchio. Manipolare la zampa con attenzione durante tutta la procedura per prevenire lesioni.
         NOTA: Un adeguato rilascio della capsula articolare consente lo spostamento della rotula con minima forza.
      3. Applicare gocce di soluzione salina sterile sulla superficie della cartilagine articolare durante l'intervento per prevenire la disidratazione.
      4. Individuare il menisco mediale nello spazio tra il condilo femorale mediale e la piastra tibiale mediale. Partendo dal suo aspetto laterale, seguire il legamento menisco-tibiale mediale fino al suo punto di inserzione sull'eminza intercondilare della tibia. Stabilizzare delicatamente la zampa posteriore con la mano e sezionare il legamento con una lama chirurgica n. 10, avendo cura di non toccare la cartilagine sottostante al menisco mediale. NOTA: Assicurarsi che la cartilagine articolare e gli altri legamenti non vengano danneggiati. In molti casi, è necessario retrarre ma non rimuovere il cuscinetto adiposo sovrastante per identificare il legamento.
      5. Avvicinare i margini della capsula articolare del ginocchio e fissarli utilizzando materiale da sutura riassorbibile 6-0.
      6. Chiudere la cute con sutura in seta 6-0¹².
6. Per le cure postoperatorie, instillare una goccia di bupivacaina allo 0,25% nel sito chirurgico per analgesia locale e mantenere i topi con libero accesso a cibo e acqua.
   NOTA: Durante l'anestesia, mantenere la portata di ossigeno nell'intervallo di 0,5–1 NL/min. L'anestesia efficace è confermata dalla perdita del riflesso di raddrizzamento, dall'assenza di risposte di ritrazione alla compressione delle dita dei piedi e da una respirazione stabile e regolare. Durante l'intervento chirurgico, utilizzare soluzione salina tamponata al fosfato sterile (PBS) come soluzione di irrigazione per mantenere l'idratazione della cartilagine. Le dimensioni e le specifiche precise del materiale da sutura riassorbibile per la chiusura della capsula articolare e della sutura in seta per la chiusura della cute sono riportate nella Tabella dei Materiali.

2. Trattamento con elettroagopuntura

NOTA: Gli interventi nei gruppi SA ed EA sono iniziati 1 settimana dopo la creazione del modello (Figura 1A). Entrambi i gruppi hanno ricevuto il trattamento ogni due giorni, per tre volte alla settimana, per 15 minuti per sessione, per un totale di 4 settimane. I gruppi Sham e DMM hanno subito le stesse procedure di anestesia e immobilizzazione secondo la stessa tempistica, senza agopuntura né stimolazione elettrica. Tutti gli operatori hanno ricevuto un'adeguata formazione prima dell'esperimento per garantire coerenza nella selezione dei punti, nell'angolo e nella profondità di inserzione.

1. Posizionare i topi nella camera di induzione e rimuoverli dopo l'induzione dell'anestesia con isoflurano.
2. Mantenere i topi in posizione supina sotto anestesia inalatoria continua con isoflurano (1,5–2,0% in O₂ al 100%) per tutta la durata della sessione di elettroacopuntura, al fine di garantire uno stato tranquillo e stabile.
3. Individuare con precisione i punti di agopuntura sui topi. Inserire due aghi sterili monouso (0,16 mm × 25 mm) nei punti di agopuntura ST36 (Zusanli) e SP10 (Xuehai) degli arti inferiori fino a una profondità cutanea di 5 mm¹³ (Figura 1B).
   ​NOTA: Il punto ST36 si trova 1 mm lateralmente rispetto al tubercolo anteriore della tibia, 3 mm al di sotto della testa del perone e direttamente al di sotto dell'articolazione del ginocchio. Il punto SP10 si trova sulla coscia mediale, 3 mm sopra il margine supero-mediale della rotula, nel rilievo mediale del muscolo quadricipite quando il ginocchio è flesso.
   1. Nel gruppo SA, inserire gli aghi in modo superficiale, fino a una profondità di circa 1 mm, in aree adiacenti non corrispondenti a punti di agopuntura, invece che nei punti ST36 o SP10, e collegarli al dispositivo di EA senza somministrare corrente¹⁴.
      NOTA: Pertanto, il gruppo SA differisce dal gruppo EA per il posizionamento degli aghi, la profondità di inserimento e l'assenza di stimolazione elettrica, ma è abbinato per tutti gli altri parametri procedurali. Rispetto al gruppo DMM, il gruppo SA riceve una stimolazione superficiale in punti non di agopuntura e il collegamento al dispositivo senza corrente, mentre il gruppo DMM riceve soltanto anestesia e immobilizzazione.
4. Collegare l'ago al dispositivo di elettroagopuntura e applicare una stimolazione a 2/100 Hz e 2 mA per indurre lievi tremori muscolari. Iniziare la stimolazione con EA per 15 minuti, 3 volte alla settimana, a partire da 7 giorni dopo la modellizzazione, e proseguire per 4 settimane.
5. Dopo il trattamento, posizionare il topo su un tappetino riscaldante e riportarlo nella gabbia una volta ripresa coscienza.

3. Valutazione dinamica dell'efficacia dell'EA

NOTA: Tutte le valutazioni (test del rotarod, US, IRT, MRI e punteggio OARSI) sono state eseguite da ricercatori in cieco rispetto all'assegnazione ai gruppi, con le identità dei gruppi nascoste fino al completamento di tutte le analisi dei dati. L'acquisizione delle immagini e l'analisi dei dati sono state gestite da soggetti diversi, e la valutazione istologica è stata effettuata indipendentemente da due patologi che non conoscevano l'appartenenza ai gruppi di trattamento. Nessuno dei valutatori ha partecipato all'assegnazione degli animali o all'intervento di elettroagopuntura.

1. Test di affaticamento sul rotarod
   1. Addestrare preventivamente i topi per familiarizzarli con l'apparato sperimentale prima del test formale.
   2. Durante il test formale, posizionare ogni topo singolarmente sul rotarod, che accelera a un ritmo di 4 giri al minuto fino a quando il topo non cade.
   3. Registrare immediatamente la durata per cui ogni topo rimane sul cilindro. Consentire un intervallo di 30 min tra una prova e l'altra per ciascun topo e calcolare il valore medio ottenuto da tre prove ripetute.
      NOTA: Utilizzare il test del rotarod per valutare la coordinazione motoria prima della creazione del modello di OA e dopo il completamento del trattamento con EA. Per ridurre il dolore postoperatorio, limitare la raccolta dei dati sul rotarod durante la prima settimana successiva all'intervento chirurgico.
2. Esame ecografico su piccoli animali
   ​NOTA: La procedura passo dopo passo per l'imaging ecografico e la delimitazione della cavità articolare è mostrata in Figura 2.
   1. Prima dell'acquisizione formale dei dati, posizionare il topo in una camera di anestesia fino alla perdita della funzione motoria, quindi utilizzare una crema depilatoria per rimuovere i peli dall'articolazione del ginocchio destro. Durante la rimozione del pelo, agire con la massima delicatezza; pulire delicatamente con acqua tiepida per minimizzare l'irritazione al topo.
      NOTA: Mantenere la cecità durante l'analisi visualizzando solo i codici degli animali e i punti temporali fino al completamento di tutte le misurazioni volumetriche, dopodiché rivelare le informazioni di gruppo per l'analisi statistica.
   2. Accendere il sistema ecografico, installare la sonda per piccoli animali e configurare il protocollo di esame appropriato per il topo. Contemporaneamente, posizionare il topo in una gabbia per mantenere l'anestesia continua.
   3. Una volta raggiunta l'anestesia, trasferire il topo sulla piattaforma di controllo e somministrare anestesia inalatoria con isoflurano tramite maschera nasale. Posizionare il topo con la testa rivolta lontano dall'operatore e la coda rivolta verso l'operatore.
   4. Flettere l'articolazione del ginocchio, fissare il topo e applicare un agente di accoppiamento ecografico sulla pelle sovrastante il legamento patellare.
   5. Regolare la sonda e posizionarla in modo che sia parallela all'articolazione del ginocchio.
   6. Impostare la distanza di scansione a 4 mm e la dimensione del passo a 0,04 mm. Individuare la cavità articolare nell'immagine in base alla sua posizione anatomica. Non muovere l'animale durante la scansione della sonda.
   7. Acquisire le immagini. Identificare la cavità articolare: una regione triangolare con confini ben definiti tra femore, tibia e i tessuti cutanei e muscolari sovrastanti.
   8. Assegnare un nome e salvare i risultati della scansione, quindi esportarli sul computer di analisi mantenendo la struttura originale delle cartelle.
   9. Analizzare il volume della cavità articolare del ginocchio utilizzando un software. Accedere al modulo Study e fare clic sulla funzione Import.
   10. Sfogliare e selezionare la cartella dati, verificare i file da importare e fare doppio clic per aprirli.
   11. In modalità display, selezionare in sequenza Image Processing | Load to 3D | Cross-sectional View | Volume Measurement | Start.
   12. Utilizzare la rotellina del mouse o il cursore delle sezioni per scorrere le fette dalla parte prossimale a quella distale, individuando la sezione in cui la cavità articolare appare per la prima volta (tipicamente come una regione triangolare con confini chiari tra femore, tibia e tessuto muscolare e cutaneo sovrastante).
   13. Iniziare il tracciamento sulla sezione in cui la cavità articolare appare per la prima volta. Fare clic con il tasto sinistro per iniziare a disegnare il contorno.
   14. Tracciare punto per punto lungo il bordo della cavità articolare per disegnare un contorno chiuso fino a quando la cavità articolare scompare completamente.
   15. Fare clic su Finish; il sistema genererà un volume segmentato in 3D e fornirà i risultati della misurazione del volume.
   16. Selezionare il tipo di file desiderato per esportare l'immagine come file di area in formato TIFF (.tif).
3. Termografia infrarossa su piccoli animali
   ​NOTA: Le misurazioni sono state effettuate 1 giorno prima dell'intervento chirurgico, 7 giorni dopo e al termine del trattamento nei topi con OA. Eseguire la IRT 6 h dopo il trattamento in una stanza a temperatura controllata (22–24 °C), dopo aver acclimatato i topi per 30 min prima dell'imaging.
   1. Posizionare l'animale in posizione supina con gli arti posteriori estesi e fissare tutti gli arti al banco con del nastro adesivo per garantire un'esposizione costante del ginocchio. Posizionare il topo in una camera di induzione e somministrare continuamente isoflurano fino al completo anestetico.
   2. Fissare il topo anestetizzato in posizione supina sul tavolo operatorio e mantenere una temperatura ambiente costante.
   3. Afferrare delicatamente l'arto posteriore del topo per estendere l'articolazione del ginocchio destro, quindi utilizzare un termocamera a infrarossi per acquisire immagini e misurare le temperature nella zona.
   4. Utilizzare l'emissività cutanea predefinita (0,98). Acquisire le immagini 3 min dopo l'anestesia profonda. Definire la regione di interesse (ROI) del ginocchio come la linea articolare mediale all'articolazione femoro-tibiale e la ROI della caviglia come la superficie dorsale dell'articolazione tibio-tarsica. Delimitare manualmente tutte le ROI da parte di un singolo operatore addestrato in base a questi punti di riferimento.
   5. Analizzare le immagini utilizzando il software fornito con il dispositivo per leggere i dati di temperatura dall'articolazione del ginocchio e dalla pelle circostante e impostare punti di controllo di misurazione alle articolazioni della caviglia e del ginocchio in cui i gradienti di temperatura diminuiscono.
4. Risonanza magnetica su piccoli animali
   ​NOTA: Dopo il trattamento con EA, la risonanza magnetica su piccoli animali è stata utilizzata per valutare l'infiammazione locale nelle articolazioni del ginocchio dei topi in ciascun gruppo.
   1. Posizionare il topo in una camera di anestesia. Una volta persa la funzione motoria, applicare crema depilatoria su entrambe le articolazioni del ginocchio.
   2. Dopo 1 min, rimuovere la crema depilatoria con una garza inumidita con acqua tiepida per completare la depilazione su entrambe le articolazioni del ginocchio.
      ​NOTA: Assicurarsi di rimuovere il più possibile il pelo del topo ed eseguire la procedura sotto anestesia.
   3. Configurare il protocollo appropriato utilizzando un apparato adatto alle dimensioni del topo.
      1. Assicurarsi che il dispositivo di posizionamento utilizzi una sequenza rapida a gradiente eco in tre piani (TR/TE = 50/3 ms, campo visivo (FOV) = 30 × 30 mm, spessore della fetta 1 mm) per centrare l'articolazione del ginocchio nell'immagine; utilizzare una sequenza eco a spin pesata in T2 (T2WI) per scansionare l'articolazione del ginocchio del topo.
      2. Utilizzare i seguenti parametri di scansione: tempo di ripetizione (TR) di 2.500 ms, tempo d'eco (TE) di 8 ms, campo visivo (FOV) di 20 × 20 mm, matrice di 256 × 256, spessore della fetta di 0,5 mm, nessuna spaziatura tra le fette, e 10 fette consecutive che coprono la regione dal condilo femorale al plateau tibiale; prevedere una durata di una singola scansione di circa 8 min e 20 s.
      3. Esaminare le immagini pesate in T2 ottenute per osservare i cambiamenti morfologici nella cartilagine del ginocchio, nel sinovio, nella cavità articolare e nei tessuti molli circostanti, e valutare l'effusione articolare, l'ispessimento sinoviale e l'infiammazione locale.
   4. Posizionare il topo sull'apparato, indurre l'anestesia inalatoria con isoflurano tramite maschera e fissare gli arti con nastro medico per garantire un posizionamento costante dei ginocchi verso l'alto.
   5. Far scivolare l'apparato all'interno dello scanner MRI per l'acquisizione delle immagini.
      1. Sul localizzatore a tre piani, verificare che lo spazio articolare del ginocchio sia parallelo al piano coronale, che il centro del blocco sia allineato con lo spazio articolare e che anse intestinali o cavità d'aria siano escluse dal FOV per evitare artefatti di suscettibilità; se il posizionamento non è corretto, rilocalizzare e rieseguire la scansione.
   6. Esportare le immagini pesate in T2 multi-eco acquisite in formato DICOM o NIfTI per una valutazione qualitativa.
   7. Valutare le immagini RM esaminando visivamente l'intensità del segnale e la distribuzione delle aree iperintense all'interno dell'articolazione del ginocchio e dei tessuti molli periarticolari e confrontare i segnali infiammatori tra i gruppi in base a queste immagini esportate.

4. Osservazioni patologiche e morfologiche

1. Fissazione e sezione dei ginocchi di topo
   1. Fissare entrambi i campioni di ginocchio di topo in paraformaldeide al 10% per 48 h. Successivamente, immergere i campioni in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) per 30 min e risciacquare.
   2. Dopo aver asciugato l'eccesso di umidità, trasferire immediatamente i campioni in una soluzione di decalcificazione appena preparata (pH 7,2–7,4) e sostituire la soluzione ogni 3 giorni;
   3. Proseguire la decalcificazione per 2 settimane, risciacquare i campioni sotto acqua corrente, quindi immergerli in etanolo al 75% per 2 h.
   4. Eseguire la disidratazione automatica a gradiente in un processore per tessuti per 18 h.
   5. Dopo la disidratazione, immergere il campione in paraffina preriscaldata per 2 h in un inclusore per paraffina, quindi procedere con l'inclusione;
   6. Durante l'inclusione sagittale dell'articolazione del ginocchio, posizionare la superficie articolare mediale verso il basso in modo che questa venga sezionata per prima.
   7. Montare il blocco di tessuto sul microtomo ed effettuare sezioni continue di 4 µm. Dopo aver raggiunto la separazione mediale del menisco, raccogliere 21 sezioni consecutive.
   8. Stendere le sezioni su un distenditore di sezioni. Utilizzare pinzette per separare i campioni sulla superficie dell'acqua e raccoglierli con coprioggetti, raccogliendo due campioni per ogni coprioggetto;
   9. Posizionare i vetrini in piano in un essiccatore per oltre 1 h per garantire l'evaporazione completa dell'umidità. Collocare i vetrini in una scatola per campioni e disincoccarli in un forno a 60 °C per 8 h. Mettere da parte per un uso successivo.
      ​NOTA: Tutti i rifiuti di fissativo a base di paraformaldeide, soluzione di decalcificazione e lavaggi con etanolo devono essere raccolti come rifiuti pericolosi e smaltiti in conformità con le linee guida istituzionali.
2. Colorazione con Safranina O-Fast Green
   1. Posizionare le sezioni non colorate su un supporto per colorazione e riscaldarle in forno per 5 min. Nel frattempo, preparare la soluzione di colorazione in una cappa aspirante.
   2. Lasciare che le sezioni raggiungano la temperatura ambiente, quindi eseguire la disincoccazione abituale fino all'acqua.
   3. Trasferire le sezioni in una scatola umida e colorarle con soluzione di Weigert fresca (Parte A + Parte B) per 5 min.
   4. Risciacquare con acqua per 3 x 1 s.
   5. Effettuare la differenziazione con acido cloridrico all'1% in etanolo per 15 s, quindi risciacquare con acqua distillata per 10 min.
   6. Colorare con soluzione di Fast Green per 4 min e 55 s.
   7. Lavare rapidamente le sezioni con soluzione di acido acetico all'1% per 10-15 s per rimuovere il Fast Green residuo, quindi farle asciugare all'aria.
   8. Immergere nella colorazione con Safranina O per 4 min e 35 s.
   9. Disidratare rapidamente le sezioni con etanolo al 95% per 3-5 s, seguito da lavaggi con etanolo assoluto per 2 x 1 min.
   10. Chiarificare con xilene, montare con resina neutra e collocare in una cappa aspirante per 4 h per far evaporare il xilene.
   11. Visualizzare in anteprima e scansionare la sezione con uno scanner per vetrini interi.
       NOTA: Il xilene, l'alcool acido, l'acido acetico, la paraformaldeide e le soluzioni di colorazione utilizzate in questo studio, inclusa la soluzione di Weigert, il Fast Green e la Safranina O, sono materiali pericolosi. Tutte le manipolazioni devono essere eseguite in una cappa aspirante indossando dispositivi di protezione individuale adeguati, tra cui guanti in nitrile, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. I rifiuti pericolosi, inclusi i reagenti e i lavaggi usati, devono essere separati, con i rifiuti di xilene mantenuti distinti dai rifiuti acquosi, raccolti in contenitori designati e smaltiti in conformità con le normative istituzionali.

5. Analisi statistica

1. Riportare i dati continui come media ± deviazione standard (SD) se non diversamente indicato; i punteggi OARSI sono riportati come mediana (P25, P75).
2. Per gli esiti riportati come media ± SD, eseguire confronti tra più gruppi utilizzando l'analisi della varianza a un fattore (ANOVA) seguita dai test post hoc di Tukey. I punteggi OARSI sono stati analizzati utilizzando il test di Kruskal-Wallis, seguito da post hoc test utilizzando il test di Mann-Whitney unilaterale per confronti a coppie tra i due gruppi¹⁵.
3. Considerare P valori < 0,05 significativo dal punto di vista statistico"ns" indica nessuna differenza significativa).

Risultati

Il test del rotarod ha mostrato una latenza maggiore alla caduta nel gruppo EA rispetto al gruppo DMM (P < 0,05), mentre il gruppo SA non differiva in modo significativo dal gruppo DMM (Figura 1C e Tabella 1). Prima della modellizzazione, scansioni ecografiche longitudinali dell'articolazione del ginocchio (distanza di scansione, 4 mm; passo, 0,04 mm) non hanno evidenziato differenze significative nel volume della cavità articolare tra i gruppi (Figura 3A,B e Tabella 2). Una settimana dopo la modellizzazione, la ricostruzione tridimensionale ha mostrato un volume della cavità articolare significativamente maggiore nei gruppi DMM, SA ed EA rispetto al gruppo Sham (P < 0,05), senza differenze significative tra i gruppi DMM, SA ed EA (P > 0,05) (Figura 3A,C). Dopo 4 settimane di trattamento con EA, il volume della cavità articolare era significativamente inferiore nel gruppo EA rispetto al gruppo DMM (P < 0,05) (Figura 3A,D), in accordo con una riduzione del gonfiore della cavità articolare.

L'IRT è una tecnica utilizzata per raccogliere informazioni sulla temperatura del piano focale all'interno di un campo visivo e per visualizzare le distribuzioni della temperatura superficiale in formato pseudocromatico¹⁶. Non sono state osservate differenze significative nella temperatura superficiale della pelle tra i gruppi prima della modellizzazione o a una settimana dalla modellizzazione (Figura 4A-C e Tabella 3). Tuttavia, dopo il trattamento con EA, la temperatura superficiale della pelle nel gruppo DMM era significativamente più bassa rispetto al gruppo Sham. Al contrario, la temperatura superficiale della pelle nel gruppo EA era significativamente più alta rispetto al gruppo DMM (Figura 4A,D), dimostrando che l'EA era associata a una temperatura superficiale locale più elevata rispetto al DMM, mentre l'SA non lo era.

Le immagini di risonanza magnetica non hanno mostrato alterazioni del segnale muscolare periarticolare visibili nel gruppo Sham, cambiamenti del segnale più evidenti nel gruppo DMM, alterazioni meno evidenti nel gruppo EA e cambiamenti simili nei gruppi SA e DMM (Figura 5A). Dopo il trattamento con EA, le articolazioni del ginocchio destro sono state prelevate, incluse in paraffina e sezionate in senso sagittale a 4 µm. I campioni sono stati colorati con Safranina O-Fast Green e valutati utilizzando il sistema istopatologico OARSI. Rispetto al gruppo Sham, il gruppo DMM ha mostrato un maggiore usura della cartilagine articolare e un punteggio OARSI più elevato. Il gruppo EA ha mostrato una minore degenerazione della cartilagine e un punteggio OARSI più basso rispetto al gruppo DMM (P < 0,05), mentre il gruppo SA non ha mostrato differenze significative rispetto al gruppo DMM (Figura 5B,C e Tabella 4).

Figura 1: Cronologia sperimentale, diagramma dei punti di agopuntura e test del rotarod nei topi con OA. (A) Cronologia sperimentale. (B) Diagramma dei punti di agopuntura. (C) Test del rotarod. n = 6 per gruppo. Ogni topo ha completato tre prove. I dati sono espressi come media ± DS. ### Falso vs DMM, P < 0,001; ns, SA vs DMM, P > 0,05; ** EA vs DMM, P < 0,01. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Esame ecografico passo dopo passo. (A) Posizionare il topo in una camera di induzione per l’anestesia. (B) Applicare una crema depilatoria all’arto posteriore. (C) Dopo aver applicato uniformemente la crema, attendere 1 minuto. (D) Rimuovere con una garza l’eccesso di crema depilatoria e i peli residui. (E) Ispezionare l’arto posteriore depilato. (F) Prima dell’acquisizione delle immagini, riportare il topo nella camera di induzione per l’anestesia. (G) Applicare un gel acustico sull’arto posteriore e ruotare la sonda finché non risulti parallela all’asse longitudinale dell’arto. (H) Acquisire le immagini ecografiche. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Immagini rappresentative e risultati quantitativi ottenuti da esami ecografici in animali di piccola taglia in topi con OA. (A) Ricostruzioni ecografiche tridimensionali dell'articolazione del ginocchio prima dell'intervento chirurgico, 1 settimana dopo l'intervento chirurgico e dopo il trattamento con EA (distanza di scansione, 4 mm; dimensione del passo, 0,04 mm). Le barre della scala = 2 mm. (B) Volume della cavità articolare preoperatorio (n = 6 per gruppo). (C) Volume della cavità articolare 1 settimana dopo l'intervento chirurgico (n = 6 per gruppo). (D) Volume della cavità articolare dopo l'intervento con EA (n = 6 per gruppo). ### Sham vs DMM, P < 0,001; ns, SA vs DMM, P > 0,05; *** EA vs DMM, P < 0,001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Termogrammi infrarossi rappresentativi e risultati quantitativi della temperatura cutanea in topi con OA. (A) Termogrammi degli arti inferiori prima dell'intervento chirurgico, una settimana dopo l'intervento chirurgico e dopo il trattamento con EA. Ogni termogramma è stato visualizzato utilizzando l'intervallo di temperatura automatico del software della telecamera a infrarossi; pertanto, i colori non sono direttamente confrontabili tra i diversi pannelli. I confronti quantitativi devono basarsi sui grafici a dispersione nei pannelli da B a D. (B–D)  Analisi quantitativa della temperatura cutanea della regione di interesse (ROI) a livello dell'articolazione del ginocchio, definita come la linea articolare mediale all'articolazione femorotibiale. (B) Temperatura cutanea degli arti inferiori prima dell'intervento chirurgico (n = 6 per gruppo). (C) Temperatura cutanea degli arti inferiori una settimana dopo l'intervento chirurgico (n = 6 per gruppo). (D) Temperatura cutanea degli arti inferiori dopo l'intervento con EA (n = 6 per gruppo). I dati sono espressi come media ± DS. ### Sham vs DMM, P < 0,001; ns, SA vs DMM, P > 0,05; ** EA vs DMM, P < 0,01. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Immagini rappresentative di risonanza magnetica relative ai cambiamenti del segnale muscolare periarticolare, sezioni istologiche dell'articolazione del ginocchio e risultati quantitativi in topi con OA. (A) Immagini rappresentative di risonanza magnetica di ciascun gruppo. (B) Sezioni representative del ginocchio colorate con Safranina O-Verde Fast. Le barre della scala = 1 mm. (C) Punteggi di patologia cartilaginea OARSI (n = 6 per gruppo). I punteggi OARSI sono espressi come mediana (P25, P75). ### Sham vs DMM, P < 0,001; ns, SA vs DMM, P > 0,05; ** EA vs DMM, P < 0,01. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gruppo	N	Settimana 5
Sham	6	101,300 ± 5,416
DMM	6	70,280 ± 3,363###
SA	6	70,060 ± 7,796
EA	6	84,390 ± 9,504**
Nota: ### Sham rispetto a DMM, P < 0,001; ** EA rispetto a DMM, P < 0,01.

Tabella 1: Test sul rotarod (media ± DS; n = 6 per gruppo). ### Sham vs DMM, P < 0,001; ** EA vs DMM, P < 0,01.

Gruppo	N	Settimana 0	Settimana 1	Settimana 5
Sham	6	2,029 ± 0,055	2,056 ± 0,071	2,061 ± 0,079
DMM	6	2,058 ± 0,068	2,591 ± 0,056###	2,926 ± 0,088###
SA	6	2,056 ± 0,045	2,592 ± 0,076	2,915 ± 0,112
EA	6	2,032 ± 0,059	2,548 ± 0,074	2,177 ± 0,110***
Nota: ### Sham rispetto a DMM, P < 0,001; *** EA rispetto a DMM, P < 0,001.

Tabella 2: Volume della cavità articolare (media ± DS; n = 6 per gruppo). ### Sham vs DMM, P < 0,001; *** EA vs DMM, P < 0,001.

Gruppo	N	Settimana 0	Settimana 1	Settimana 5
Sham	6	35,517 ± 1,366	35,717 ± 0,546	35,650 ± 0,701
DMM	6	35,783 ± 1,292	35,033 ± 0,781	32,967 ± 1,223###
SA	6	35,583 ± 1,780	35,283 ± 0,861	33,267 ± 0,501
EA	6	35,500 ± 1,510	35,417 ± 0,882	34,533 ± 0,929**
Nota: ### Sham rispetto a DMM, P < 0,001; ** EA rispetto a DMM, P < 0,01.

Tabella 3: Temperatura cutanea (media ± DS; n = 6 per gruppo). ### Sham vs DMM, P < 0,001; ** EA vs DMM, P < 0,01.

Gruppo	N	Settimana 5	Mediana
Sham	6	0,000 (0,000; 0,250)	0
DMM	6	4,000 (3,000; 4,250)###	4
SA	6	4,000 (3,000; 4,250)	4
EA	6	2,500 (1,750; 3,000)**	2,5
Nota: ### Sham rispetto a DMM, P < 0,001; ** EA rispetto a DMM, P < 0,01.

Tabella 4: punteggio OARSI [mediana (P25, P75); n = 6 per gruppo]. ### Sham vs DMM, P < 0,001; ** EA vs DMM, P < 0,01.

Discussione

L'artrosi del ginocchio (KOA) è una malattia degenerativa progressiva e gli attuali interventi terapeutici offrono un'efficacia limitata nell'arrestarne il decorso sottostante¹⁷. Un'alterata funzione muscolare e una ridotta prestazione fisica sono predittori clinicamente significativi della gravità dei sintomi. Di conseguenza, è essenziale gestire attivamente i fattori di rischio modificabili per ritardare la progressione della KOA¹⁸. Mediante un sistema di valutazione multimodale, questo studio ha dimostrato che l'elettroacupuntura (EA) era associata a un miglioramento della prestazione motoria, a un ridotto volume della cavità articolare, a una temperatura più elevata della superficie cutanea locale, a modifiche meno pronunciate del segnale muscolare periarticolare in risonanza magnetica (MRI) e a punteggi OARSI più bassi nei topi con artrosi (OA).

I risultati dell'IRT sostengono ulteriormente questa visione integrata. A una settimana dal trattamento chirurgico, le temperature cutanee non differivano tra i gruppi, inclusa la condizione Sham, il che probabilmente riflette una risposta uniforme al trauma chirurgico, caratterizzata da vasocostrizione transitoria e edema superficiale che riduce temporaneamente l'emissione di calore dalla superficie cutanea. Al contrario, la significativa divergenza termica osservata dopo il trattamento suggerisce che le azioni anti-infiammatorie e microcircolatorie dell'EA siano cumulative piuttosto che immediate, diventando evidenti solo dopo sessioni ripetute. Queste misurazioni di esito potrebbero essere interconnesse. Il gonfiore della cavità articolare riflette generalmente l'entità dell'infiammazione sinoviale e dell'effusione, mentre lo stato microcircolatorio locale è strettamente legato ai cambiamenti nella permeabilità vascolare durante l'infiammazione¹⁹. Nei nostri esperimenti, la riduzione del volume articolare dopo l'amministrazione dell'EA ha coinciso con un aumento della temperatura locale. Sebbene l'IRT non misuri direttamente il flusso ematico, i cambiamenti concomitanti suggeriscono che un flusso ematico locale potenziato possa facilitare l'eliminazione dei mediatori infiammatori, riducendo così l'infiltrazione infiammatoria all'interno del tessuto sinoviale e dei muscoli circostanti. Il successivo miglioramento della funzione motoria potrebbe derivare dai benefici combinati della riduzione del gonfiore e dell'attenuazione dell'infiammazione. Nel complesso, i cambiamenti osservati in questi parametri sembrano essere risposte interconnesse piuttosto che eventi isolati. Questo andamento suggerisce che l'EA possa modulare più processi patologici in modo integrato, piuttosto che agire attraverso un singolo meccanismo²⁰.

Rispetto alle valutazioni istologiche tradizionali a punto fisso, il sistema multimodale di monitoraggio dinamico impiegato in questo studio offre vantaggi pratici distinti. L'ecografia in piccoli animali consente un monitoraggio longitudinale e non invasivo dell'effusione articolare senza esposizione alle radiazioni, evitando la variabilità interanimale insita nel prelievo tissutale a punto fisso²¹. La risonanza magnetica in piccoli animali integra l'ecografia fornendo una visualizzazione dettagliata dei cambiamenti di segnale nei muscoli periarticolari. Ciò permette una valutazione qualitativa dell'infiammazione muscolare che l'ecografia da sola potrebbe non cogliere completamente. Affiancata dalla termografia a infrarossi (IRT) per la misurazione in tempo reale della temperatura cutanea locale, questa metodica fornisce un indicatore indiretto della risoluzione dell'infiammazione. La disponibilità di queste metodiche di imaging rende possibile effettuare misurazioni ripetute durante tutto il corso del trattamento. Oltre a rispettare i principi delle 3R, questo disegno sperimentale longitudinale consente osservazioni ripetute all'interno di ciascun animale, riducendo al minimo l'influenza della variabilità interindividuale. Per quanto a nostra conoscenza, nessuno studio preclinico precedente che abbia valutato l'agopuntura per l'osteoartrosi ha integrato ecografia, risonanza magnetica, termografia, test comportamentali e istopatologia all'interno di un unico schema sperimentale. Questo approccio multilivello fornisce dati complementari nei domini funzionale, morfologico e istologico, offrendo una valutazione più completa di quanto possa garantire un singolo punto finale.

Diversi limiti devono essere riconosciuti. In primo luogo, questo studio si basa su dati osservazionali provenienti da esperimenti sugli animali e manca di evidenze meccanicistiche derivanti da studi in vitro. Non è ancora noto se l'elettroagopuntura (EA) attivi il percorso del recettore simile a NOD, dominio pirina 3 (NLRP3)/caspasi-1/IL-1β. L'IL-1β e l'IL-18 sono mediatori chiave dell'infiammazione sinoviale e muscolare, e la loro maturazione richiede l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3²². Inoltre, non possiamo determinare se i miglioramenti circolatori osservati siano correlati a variazioni nell'espressione del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) o della sintasi dell'ossido nitrico endoteliale (eNOS)²³. In secondo luogo, abbiamo applicato un singolo parametro di EA (2/100 Hz) su due punti di agopuntura (ST36 e SP10). Se impostazioni diverse o combinazioni alternative di punti di agopuntura possano produrre risultati superiori richiede ulteriori indagini²⁴. In terzo luogo, un singolo operatore ha acquisito tutti i dati di imaging. Sebbene questo approccio abbia garantito coerenza tecnica, l'affidabilità inter-osservatore non è stata valutata, limitando potenzialmente la generalizzabilità dei risultati ottenuti dall'imaging. In quarto luogo, abbiamo omesso un gruppo di controllo sottoposto esclusivamente al contenimento, rendendo difficile separare completamente gli effetti dell'anestesia, dell'immobilizzazione e della manipolazione dagli effetti terapeutici dell'EA. In quinto luogo, la procedura di finto trattamento (SA) è stata progettata come controllo minimo per ridurre gli effetti specifici legati ai punti di agopuntura, ai tessuti profondi e alla stimolazione elettrica. Tuttavia, la differenza nella profondità di inserimento dell'ago tra l'intervento reale e quello fittizio ci impedisce di isolare il contributo esclusivo della profondità. Di conseguenza, i nostri risultati devono essere interpretati come un confronto tra il protocollo completo di EA e una procedura fittizia minima, piuttosto che come una valutazione rigorosa della sola stimolazione elettrica. In sesto luogo, la distanza della telecamera, l'angolo di imaging e l'area assoluta della regione di interesse (ROI) non sono stati documentati formalmente, costituendo una limitazione tecnica. Un'ultima limitazione è l'uso di ANOVA separate per ciascun punto temporale, che trascura le correlazioni ripetute nel tempo e l'interazione tempo per gruppo, riducendo così la sensibilità ai cambiamenti dinamici.

In sintesi, la EA è risultata associata a effetti anti-infiammatori e a miglioramenti funzionali in un modello murino di OA indotta da DMM. Nonostante limitazioni come la risoluzione variabile tra le diverse modalità, la dipendenza dall'operatore per l'ecografia e la termografia a infrarossi, i costi elevati della risonanza magnetica e lo stress potenziale derivante da misurazioni ripetute, il protocollo rimane una piattaforma fattibile per la valutazione longitudinale multimodale. Il sistema integrato fornisce un quadro per la valutazione preclinica. Studi futuri dovranno ottimizzare i parametri elettrici e sfruttare piattaforme basate su organoidi, organi-su-chip e intelligenza artificiale per chiarire i meccanismi d'azione e guidare terapie personalizzate^25,26. Sono inoltre necessari controlli placebo migliorati, protocolli standardizzati e periodi di follow-up più lunghi per potenziare la traslazione clinica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione al 1% di acido acetico	Solarbio	Cat# G1371	Soluzione di differenziazione/lavaggio per la colorazione
Acido cloridrico al 1% in etanolo	Solarbio	Cat# G1371	Soluzione di differenziazione acido-alcolica
7T Small Animal MRI	Shanghai Chenguang	7T MRI NOVAL	Sistema di risonanza magnetica per piccoli animali
Aghi per agopuntura (0,16 mm × 25 mm)	Wuxi Jiajian Medical Instrument, Wuxi, Cina	lotto n. 491226	Aghi per agopuntura sterili
Vetrini adesivi	Jiangsu Shitai	MH0662	Vetrini per sezioni di tessuto
Etanolo anidro	Shanghai Titan Technology Co., Ltd.	64-17-5	Etanolo per disidratazione
Topi C57BL/6	Shanghai Silaike Laboratory Animal Co., Ltd.	https://www.slaccas.com/	Animali sperimentali
Coprioggetti	Jiangsu Shitai	Non fornito	Raccolta e montaggio di sezioni di tessuto
Soluzione decalcificante	Serivebio	G1105-500ml	Reagente per decalcificazione di ossa e articolazioni, pH 7,2-7,4
Dispositivo per terapia elettrica	Suzhou Medical Supplies Factory Co., Ltd.	SD-Z	Stimolatore per elettroagopuntura
Acido etilendiamminotetraacetico	Shanghai Titan Technology Co., Ltd.	60-00-4	Reagente chelante
Fiji (ImageJ)	National Institutes of Health (NIH)	ImageJ fornito con Java 8 a 64 bit.	Software per l'analisi delle immagini
Garza	Weizhe Medical	Tipo A1: Pad in garza standard (sterili)	Materiale per rimozione dei peli e pulizia
Crema depilatoria	VEET	Non fornito	Crema depilatoria
Software per analisi di immagini infrarosse	FLIR	Versione non fornita	Software fornito con l'imager termico a infrarossi
Imager termico a infrarossi	FLIR	435-0007-03 (primo lotto)	Sistema di termografia a infrarossi
Sistema di anestesia per inalazione per piccoli animali	Matrx	07149	Sistema di anestesia gassosa per piccoli animali
Isoflurano (anestetico per inalazione)	RWD	217140901	Anestetico per inalazione
Nastro elastico impermeabile medicale Naisikang (3,81 cm × 4,57 m)	Naisikang™	732	Materiale per posizionamento degli arti in risonanza magnetica
Kit di colorazione modificato Safranina O e Verde Rapido (per osso)	Solarbio	Cat# G1371	Kit per colorazione di cartilagine e osso
Pinza per aghi	RWD	F21001-12	Pinzatura e sutura intraoperatoria
Mezzo di montaggio in resina neutra	biosharp	23338664	Mezzo di montaggio istologico
Ossigeno	Non fornito	Non fornito	Gas di trasporto per anestesia per inalazione
Macchina per inclusione in paraffina	LEICA	EG1150C	Sistema per inclusione in paraffina
Microtomo a paraffina	LEICA	RM2235	Microtomo rotativo
Paraffina	epredia	151534	Mezzo di inclusione
Paraformaldeide	Sinopharm Reagents Co., Ltd.	80096618	Fissativo per tessuti
PBS	Servicebio	G0002	Soluzione salina tamponata al fosfato
Apparato rotarod	Panlab	LE8205	Sistema per test di affaticamento rotarod
Piattaforma per imaging ecografico per piccoli animali	Fuji	Vevo 3100	Sistema ecografico per piccoli animali
Idrossido di sodio	Shanghai Titan Technology Co., Ltd.	G19852H	Reagente di laboratorio
Stereomicroscopio	Olympus	SZ61	Microscopio per dissezione
Aghi per sutura con filo (sutura riassorbibile 6-0 e sutura in seta 6-0)	Ningbo Medical Suture Co., Ltd.	Aghi estetici 1/2 4X12 40	Sutura postoperatoria
Lame chirurgiche (10#)	Hangzhou Nuoyang Biotechnology Co., Ltd.	20090120	Incisione del legamento del menisco mediale
Disidratatore per tessuti	LEICA	TP1020	Processore automatico per tessuti
Asciugatore per tessuti	LEICA	HI1220	Asciugatore per vetrini
Blocchi per inclusione di tessuti	Jiangsu Shitai	REF31050102W	Consumabili per inclusione
Spargitore di tessuti	LEICA	HI1210	Sistema di spargimento di sezioni
Software per analisi ecografica (Vevo Lab 3.1.0)	Optic	Versione 3.1.0	Software per analisi ecografica tridimensionale
Agente di accoppiamento ecografico	Hu Qingyu Tang	YY0299-2008	Gel di accoppiamento ecografico
Scanner per vetrini interi	Olympus	VS200	Sistema digitale per scansione di vetrini
Xilene	Sinopharm Reagents Co., Ltd.	10023418	Reagente per chiarificazione