Arricchimento dei tirotropi ipofisari topini da topi ipotiroidei tramite selezione cellulare attivata dalla fluorescenza basata CD90

Sommario

Questo protocollo descrive l'arricchimento dei tirotropi da ghiandole ipotiroide ipotiroide adulte dell'ipofisi di topo tramite dissociazione enzimatica e selezione cellulare attivata dalla fluorescenza basata su CD90, permettendo analisi molecolari a valle e colture primarie a breve termine di una popolazione cellulare arricchita con tirorope.

Abstract

I tirotropi sono cellule endocrine specializzate nella ghiandola pituitaria anteriore che secernono l'ormone stimolante della tiroide (TSH) e regolano l'attività tiroidea. La secrezione di TSH è regolata positivamente dall'ormone ipotalamico che rilascia la tirotropina e è regolata negativamente dagli ormoni tiroidei circolanti. I tirotropi costituiscono solo una piccola frazione delle cellule ipofisarie (~5%), complicando gli sforzi per isolare e studiare la loro fisiologia. Qui descriviamo un approccio migliorato per isolare i tirotropi dai topi adulti ipotiroidici. L'ipotiroidismo è stato indotto per espandere la popolazione di tirotropi prima della dissociazione enzimatica della ghiandola pituitaria anteriore e della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza utilizzando l'antigene superficiale CD90.2. L'elaborazione delle ghiandole pituitarie anteriori da dodici topi ha prodotto circa 1,5 × 10 cellule⁶ CD90,2 positive arricchite per l'espressione dell'RNA messaggero Tshb . Le cellule CD90,2-positive rappresentavano circa il 25% delle cellule ipofisarie anteriori e hanno mostrato un'espressione di Tshb circa cinque volte superiore rispetto alle cellule CD90,2-negative, indicando un arricchimento tirotropo sostanziale. Le cellule isolate sono rimaste vitali in colture a breve termine e hanno mantenuto la reattività al trattamento con triiodotironina. Questo protocollo consente l'arricchimento e la coltura dei tirotropi topini per analisi molecolari, trasscrittomiche, epigenomiche e fisiologiche a valle.

Introduzione

La ghiandola pituitaria è un organo endocrino situato alla base del cervello che esercita un controllo gerarchico sull'omeostasi ormonale. La sua attività è regolata da segnali ipotalamici che stimolano o inibiscono la produzione di ormoni ipofisari, che a loro volta governano la funzione degli organi endocrini periferici. La ghiandola contiene una popolazione eterogenea e dinamica di cellule, incluse cellule staminali/progenitrici e cellule differenziate produttrici^{di ormoni 1}. In risposta a stress fisiologico o lesioni, le cellule staminali/progenitrici ipofisarie possono attivare, auto-rinnovarsi e differenziarsi in molteplici linee che secreto^{ormoni 2,3}. Strutturalmente, l'ipofisi è organizzata in due lobi principali: il lobo posteriore (PL), composto da pituiciti e terminali neurosecretorie che rilasciano ossitocina e vasopressina, e il lobo anteriore (AL), che contiene tipi cellulari endocrini specializzati che secretono ormone della crescita, prolattina, ormone tiroideostimulante (TSH), ormone adrenocorticotropico e l'ormone gonadotropine follicolo-stimolante (FSH) e ormone luteinizzante (LH). L'ipofisi anteriore ospita anche tipi cellulari non ormonali, come le cellule follicolostellate S100B-positive, le cellule endoteliali e i periciti, che supportano la funzione^{endocrina 4,5,6}. I roditori contengono inoltre melanotrofi nel lobo intermedio della ghiandola^{pituitaria 7,8}.

L'interesse per la funzione, la differenziazione e lo sviluppo dell'ipofisi ha guidato lo sviluppo di molteplici protocolli volti a isolare cellule staminali e progenitrici ipofisarie adulte in modelli di roditori. I ratti sono frequentemente utilizzati nella ricerca sulla fisiologia ipofisaria perché le loro ghiandole pituitarie più grandi producono un numero cellulare maggiore e migliorano il recupero durante il processo dei^{tessuti 4,9}. Al contrario, isolare le cellule ipofisarie dai topi rimane tecnicamente una sfida e i protocolli standardizzati sono limitati. I protocolli recenti che utilizzano aggregati di cellule staminali/progenitrici ipofisarie adulte forniscono strumenti utili per modellare lo sviluppo e la funzione^{ipofisaria 10}; tuttavia, questi sistemi non consentono ancora l'isolamento diretto di specifiche popolazioni cellulari endocrine. Tra i tipi cellulari produttori di ormoni dell'ipofisi anteriore, i tirotropi sono i principali regolatori dell'asse ipotalamo–ipofisi–tiroidea (HPT), controllando la sintesi e la secrezione dell'ormone tiroideo (TH) nei mammiferi. La TSH prodotta dai tirotropi è una glicoproteina eterodimerica composta da una α-subunità comune (codificata da Cga e condivisa con FSH e LH) e da una β-subunità (codificata da Tshb), che conferisce specificità del recettore. Queste cellule sono altamente sensibili ai livelli circolanti di triiodotironia (T3) e tiroxina (T4). La popolazione di tirotropi si espande quando i livelli di T3 e T4 sono bassi durante l'ipotiroidismo e si contrae durante l'ipertiroidismo attraverso un classico meccanismo di retroazione negativa 11,12,13.

Nonostante il loro ruolo fisiologico essenziale, i tirotropi restano difficili da studiare perché costituiscono solo una piccola frazione delle cellule ipofisarie anteriori (circa il 5%) e condividono caratteristiche fenotipiche con altre popolazioni endocrine. Questa scarsità, insieme all'assenza di modelli in vitro robusti, ha limitato le indagini meccanicistiche sulla regolazione dei tirotropi e sul controllo dell'asse HPT. La linea cellulare tumorale TαT1 rappresenta un modello¹⁴ simile a un tirotropo comunemente usato, ma non riflette pienamente le risposte fisiologiche; in particolare, la repressione dipendente da T3 del Tshb è spesso difficile da valutare a causa del suo livello di trascrizione^{basale molto basso 15}. Di conseguenza, molti studi si sono basati su linee cellulari non tirotrope come HEK293, COS, CV1, GH3 o JEG3 che esprimono diverse costruzioni di Tshb ¹⁵. Tuttavia, si tratta di sistemi eterologi che possono introdurre artefatti regolatori non fisiologici, inclusi effetti guidati da spine dorsale plasmidiche piuttosto che da meccanismi trascrizionali endogeni.

Qui presentiamo un protocollo passo dopo passo per l'isolamento dei tirotropi dalla ghiandola pituitaria adulta del topo, adattato da un metodo precedentemente stabilito nei^{ratti 9}, ottimizzato per le dimensioni più piccole e il contenuto di tirotropi più basso nell'ipofisi del topo. Sono state introdotte diverse modifiche chiave per migliorare la resa delle cellule espressive di Tshb e garantire un'analisi affidabile a valle. Il protocollo sfrutta l'espressione dell'antigene superficiale CD90, un marcatore superficiale arricchito dai tirotropi. CD90 (noto anche come THY1) è una proteina di membrana^16,17 ancorata al glicosilfosfatidilinositolo che media la segnalazione giustacrina attraverso interazioni eterotipiche con il ligando integrina β2 (ITGB2). Sebbene CD90 sia comunemente associato a popolazioni di cellule immunitarie e neurali, studi trascritomici precedenti hanno identificato l'arricchimento Thy1 nei tirotropi. La segnalazione di contatto dipendente da THY1 si verifica in diversi tipi cellulari, inclusi cellule ematopoietiche, cellule T, fibroblasti, cellule endoteliali e neuroni, dove regola adesioni, migrazione, apoptosi, soppressione tumorale e^fibrosi 18,19,20.

È importante sottolineare che il profilo trascrivomico unicellulare dell'ipofisi anteriore del ratto ha identificato Thy1 come uno dei geni correlati all'adesione più espressi nei^{tirotropi 5}, suggerendo che THY1 sia un marcatore superficiale arricchito nei tirotropi. Inoltre, i dataset di sequenziamento degli acidi ribonucleici (RNA) monocellulari per ipofisi monocellulari di topo pubblicamente indicano che l'espressione di Thy1/CD90 è arricchita nei^{tirotropi 22,23}. Tuttavia, la sua espressione non è interamente limitata a questa linea, con espressione rilevabile in sottogruppi di cellule della linea PIT1, inclusi somatotropi e lattropi, così come popolazioni simili a progenitori. Studi trascrivomici a singola cellula hanno dimostrato una sostanziale sovrapposizione trascrizionale tra le cellule pituitarie della linea PIT1, inclusa l'identificazione di una popolazione progenitrice comune di PIT1 capace di generare somatotropi, lattropi e^{tirotropi 24}. Analogamente, Thy1/CD90 non identifica esclusivamente la popolazione di tirotropi ma può essere utilizzato per arricchire i tirotropi dei topi. Sulla base di questi risultati, l'uso di anticorpi mirati a THY1 nella nostra strategia di isolamento fornisce un metodo efficace per arricchire i tirotropi dopo l'espansione indotta dall'ipotiroidismo e consente studi funzionali, inclusa la valutazione delle risposte ormonali al T3.

Il protocollo inizia nutrendo topi selvatici di tipo C57BL/6 con una dieta povera di iodio e inibendo la funzione tiroidea con metimazolo (MMI) e perclorato di potassio (_{KClO 4}) nell'acqua^{potabile 25}. Questo trattamento induce un ipotiroidismo significativo entro una settimana ed espande la popolazione di tirotropi che esprimono Tshb nell'ipofisi anteriore. Le cellule produttrici di TSH in condizioni ipotiroidee subiscono sostanziali adattamenti fisiologici e morfologici, tra cui iperplasia, ipertrofia, abbondante citoplasma vacuolato, processi citoplasmatici prominenti e lisosomi ingranditi, riflettendo l'adattamento all'assenza di feedback TH 26,27,28. Pertanto, l'induzione dell'ipotiroidismo può essere utilizzata come strategia per espandere la popolazione di tirotropi.

Dopo l'induzione dell'ipotiroidismo, i topi vengono anestetizzati con isoflurano e sottoposti a perfusione cardiaca con soluzione salina Ca²⁺/^{Mg 2+}-free HEPES tamponata per massimizzare la vitalità cellulare durante la dissociazione tissutale. Dopo il prelievo, la ghiandola pituitaria anteriore subisce una delicata digestione enzimatica per generare una sospensione unicellulare che viene incubata con un anticorpo anti-CD90.2 coniugato con ficoeritrina-cianina 7 per arricchire i tirotropi tramite selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Le cellule marcate vengono successivamente raccolte o in mezzo di crescita per coltura a breve termine o in TRIzol per l'estrazione di RNA. Per convalidare la strategia di arricchimento, l'espressione dell'RNA messaggero Tshb è stata misurata in popolazioni ordinate e si è rivelata altamente arricchita nelle cellule CD90-positive. Questo metodo supporta un'ampia gamma di applicazioni a valle nei topi, tra cui il profiling dell'espressione genica, analisi trascrittomiche ed epigenomiche, saghi ad alta produttività e colture cellulari primarie, e fornisce una piattaforma preziosa per indagare i meccanismi cellulari e molecolari alla base della funzione del tirotropo e della regolazione dell'asse HPT.

Protocollo

Questo protocollo descrive l'isolamento dei tirotropi dalla AL di ghiandole pituitarie appena dissezionate ottenute da topi adulti dopo almeno 1 settimana di induzione dell'ipotiroidismo. Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali della University of Texas Medical Branch ha approvato tutte le procedure sugli animali.

Maschi e femmine di topi sono stati raggruppati durante gli esperimenti perché non sono state osservate differenze dipendenti dal sesso nella resa tirotopica o nelle analisi a valle. Sono stati utilizzati circa 12 topi per esperimento, anche se coorti più grandi fino a 20 animali possono essere processati scalando proporzionalmente tutti i volumi dei reagenti.

L'isolamento riuscito dipende da una perfusione rapida e costante, un tempo di dissezione minimo, la completa rimozione della PL e una placcatura ad alta densità delle cellule primarie. Il tempo massimo di elaborazione raccomandato tra l'eutanasia, la perfusione, la dissezione ipofisaria e l'inizio della digestione enzimatica era di 6 ore. Le celle sono state placcate a una densità di 2,0–2,5 × 10⁵ celle per 0,7 cm^{di pozzo 2} (la superficie di un pozzo di una vetrina a 8 pozzi). Era richiesta una vitalità minima del 95% per sostenere la coltura tirotropa a breve termine.

Tutti i reagenti utilizzati per la generazione di sospensioni a cella singola sono stati preparati in condizioni sterili. Le superfici di lavoro sono state sterilizzate con etanolo al 70%, gli strumenti di dissezione sono stati autoclavati prima dell'uso e tutti i passaggi di preparazione della coltura cellulare sono stati eseguiti in un armadietto di biosicurezza utilizzando la tecnica asettica. Questo protocollo è stato standardizzato per 12 animali. Scala proporzionalmente tutti i volumi dei reagenti usando un numero diverso di mouse. Consulta la Tabella dei Materiali per tutti i reagenti, consumabili e attrezzature.

Durante l'induzione dell'ipotiroidismo, i topi sono stati alloggiati in condizioni specifiche prive di patogeni a 20°C–24°C e umidità relativa del 40%–60%, con un ciclo di luce di 12 ore e 12 ore di buio e accesso ad libitum a cibo e acqua. Gli animali venivano alloggiati in gruppo (fino a tre topi per gabbia) in gabbie ventilate singolarmente contenenti biancheria standard e arricchimento ambientale, inclusi materiali per la nidificazione e rifugio. L'induzione di successo dell'ipotiroidismo è stata confermata misurando l'espressione epatica di iodotironina deiodinasi (Dio1). Una riduzione di almeno il 50% nell'espressione dell'RNA messaggero Dio1 (mRNA) rispetto ai topi di controllo eutiroidei è stata considerata indicativa di un'induzione di ipotiroidismo riuscita.

1. Induzione dell'ipotiroidismo nei topi C57BL/6

NOTA: Eseguire questa procedura per 7–10 giorni per indurre l'ipotiroidismo in vivo attraverso una dieta carente di iodio e l'inibizione chimica della funzione tiroidea. Vedi la Figura 1A per il disegno sperimentale e la Figura 1B per la validazione dell'induzione dell'ipotiroidismo.

Figura 1. Induzione dell'ipotiroidismo nei topi C57BL/6. (A) Rappresentazione schematica del flusso di lavoro sperimentale utilizzato per indurre l'ipotiroidismo nei topi adulti C57BL/6. I topi hanno ricevuto lo 0,05% di metimazolo (MMI) e lo 0,1% di perclorato di potassio (KClO₄) in acqua potabile insieme a una dieta carente di iodio per 7 giorni prima dell'isolamento dell'ipofisi anteriore. (B) Analisi della reazione a catena quantitativa della polimerasi a trascrizione inversa (RT-qPCR) sull'espressione epatica di acido ribonucleico (mRNA) messaggero Dio1 in topi eutiroidei e ipotiroidici. La ciclofilina A (CyA) è stata utilizzata come gene di riferimento. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD) (n = 6 per gruppo). La significatività statistica è stata determinata utilizzando il test t di Student. **P < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Prepara acqua potabile MMI/KClO₄
   1. Sciogliere 1 g di MMI e 2 g di KClO₄ in 2 L di acqua filtrata.
   2. Mescolare la soluzione a temperatura ambiente (20°C–25°C) per 1 ora fino alla completa dissoluzione.
      ATTENZIONE: MMI e KClO₄ sono sostanze chimiche pericolose. Indossa guanti, camice da laboratorio e protezione per gli occhi durante la preparazione e la maneggiazione.
      NOTA: La MMI inibisce l'organizzazione dello ioduro, mentre il KClO₄ blocca l'assorbimento dello ioduro attraverso il simporto²⁵ del sodio–ioduro. Sostituisci la soluzione per bere ogni 2 giorni per mantenere il dosaggio corretto e ridurre al minimo la contaminazione da biancheria da letto, detriti alimentari e crescita microbica. Se non viene usata immediatamente, conserva la soluzione in un contenitore impermeabile e chiuso a 4°C per un massimo di 14 giorni.
2. Induzione dell'ipotiroidismo
   1. Ospiti maschi o femmine di 8 settimane di topi C57BL/6 in gruppi di fino a tre animali per gabbia, in condizioni abitative prive di iodio.
      NOTA: Topolini domestici in condizioni specifiche prive di patogeni a 20°C–24°C e umidità relativa del 40%–60%, con un ciclo di luce di 12 ore e 12 ore di buio e accesso ad libitum a cibo e acqua. Mantenere gli animali in gabbie ventilate singolarmente contenenti biancheria standard e arricchimento ambientale, inclusi materiali per la nidificazione e rifugio. Acclimatare gli animali per 3 giorni prima di iniziare il trattamento. Maschi e femmine di casa separatamente. Per gli esperimenti descritti qui, il gruppo eutiroideo era composto da sei maschi e sei femmine ospitati in gabbie separate, mentre il gruppo ipotiroideo era composto da sei maschi e sei femmine alloggiati in gabbie separate. Pool AL da maschi e femmine di topi all'interno dello stesso gruppo di trattamento durante la preparazione cellulare perché non sono state osservate differenze dipendenti dal sesso nella resa tirotropa o nelle analisi a valle.
   2. Nutri i topi con una dieta carente di iodio ad libitum per 7–10 giorni.
      NOTA: Iniziare contemporaneamente la dieta carente di iodio e il trattamento MMI/KClO₄.
   3. Fornire acqua potabile contenente 0,05% di MMI e 0,1% di KClO₄ ad libitum durante tutto il periodo di trattamento.
      NOTA: Continuare il trattamento fino all'eutanasia. Monitora quotidianamente il peso corporeo, l'assunzione di cibo, l'assunzione di acqua e i sintomi clinici durante l'induzione dell'ipotiroidismo. L'induzione efficace dell'ipotiroidismo è tipicamente associata a una riduzione dell'aumento di peso corporeo e a segni clinici come diminuzione dell'attività o pelo opaco rispetto ai controlli eutiroidei. I periodi di induzione di sette e dieci giorni producono un'efficienza di arricchimento tirotropo comparabile.

2. Perfusione cardiaca e dissezione AL

NOTA: Esegui questa procedura in circa 15 minuti per topo per massimizzare la vitalità del tessuto e preservare l'integrità cellulare durante l'isolamento ipofisario.

1. Prepara soluzioni per perfusione e raccolta
   1. Prepara soluzione salina tamponata con HEPES (HBSS) senza Ca²⁺ e Mg²⁺
      1. Combinare 667 mL di 0,9% di NaCl, 20 mL di 1 M HEPES e 313 mL di acqua doppiamente distillata (ddH₂O) per preparare 1 L di HBSS preparato su misura senza Ca²⁺ e Mg²⁺.
      2. Autoclave la soluzione e conservarla a 4°C fino all'uso.
   2. Prepara HBSS eparinizzato senza Ca²⁺ e Mg²⁺
      1. Aggiungi 27 μL di enoxaparina sodica (soluzione di 100 mg/mL di stock) a 50 mL di HBSS preparato su misura senza Ca²⁺ e Mg²⁺.
   3. Preparare il mezzo di raccolta (CM)
      1. Combinare 440 mL di medium Eagle modificato di Dulbecco, 50 mL di siero fetale inattivato al calore (FBS), 4 mM di L-glutammina e 10 mL di 1 M HEPES per un volume finale di 500 mL.
      2. Sterilizza la soluzione con un filtro da 0,22 μm e conservala a 4°C per un massimo di 1 mese.
         NOTA: Preparare 50 mL di aliquote sotto un armadietto di biosicurezza prima di essere conservato per minimizzare la contaminazione.
      3. Riscalda il CM a 20°C–25°C prima dell'uso.
   4. Sterilizzare strumenti di dissezione
      1. Sterilizza forbici, pinze, pinzette, portaaghi, pinze per l'iride, cucchiai chirurgici e sonde smussate con etanolo al 75% prima dell'uso.
         NOTA: Lasciare asciugare completamente gli strumenti all'aria dopo la sterilizzazione con etanolo prima del contatto con i tessuti.
2. Eseguire perfusione cardiaca
   1. Anestetizzare profondamente il topo usando isoflurano somministrato al 100% di ossigeno. Indurre anestesia in una camera al 5% di isoflurano e mantenere l'anestesia tramite un cono nasale al 3% di isoflurano con monitoraggio continuo e raccolta dei gas di scarto.
      ATTENZIONE: Eseguire procedure di anestesia con isoflurano in conformità con le linee guida di sicurezza istituzionali e utilizzare sistemi di recupero appropriati per minimizzare l'esposizione all'inalazione.
   2. Conferma l'anestesia completa verificando l'assenza del riflesso di ritiro del pedale usando una pizzicatura all'allucco.
   3. Spruzza l'animale con etanolo al 75% e posizionalo sulla fase di perfusione all'interno della teglia di raccolta.
   4. Fissa gli arti per esporre la regione peritoneale.
   5. Apri con attenzione la cavità toracica evitando danni agli organi principali e ai vasi sanguigni.
   6. Taglia lungo le costole per creare un lembo toracico, piega il lembo sopra la testa e fissalo con un emostato.
   7. Stabilizza il cuore con una pinza e inserisci un ago calibro 23 nell'apice del ventricolo sinistro.
   8. Collega l'ago a una pompa peristaltica usando tubi in silicone.
   9. Iniziare la perfusione con HBSS eparinizzata senza Ca²⁺ e Mg²⁺ mantenuti a temperatura ambiente.
   10. Incidere l'atrio destro immediatamente dopo l'inizio della perfusione per permettere il drenaggio.
   11. Perfondere l'animale per 5 minuti a una porta di 3 mL/min.
       NOTA: Confermare la perfusione riuscita osservando un evidente paliduto del fegato.
3. Isolare l'AL
   1. Decapita il topo immediatamente dopo la perfusione.
   2. Rimuovere il cuoio capelluto e le ossa craniche usando forbici svelanti fini e pinze per esporre il cervello.
   3. Inserisci un cucchiaio chirurgico tra cervello e cranio.
   4. Solleva delicatamente il cervello e taglia il chiasma ottico.
   5. Rimuovere la sottile membrana meningea (dura mater) che ricopre la ghiandola pituitaria sotto uno stereomicroscopio utilizzando pinzette fine.
   6. Dissezionare e scartare con attenzione la PL come mostrato nella Figura 2A.
      NOTA: Identifica l'AL come il tessuto rosa più grande situato rostralmente. Identificare il PL come il tessuto bianco-traslucido più piccolo situato dorsalmente.
   7. Tagliare il tessuto connettivo circostante e le membrane meningee residue con una sonda smussata per migliorare l'accesso alla AL.
   8. Afferra l'AL con una pinzetta smussata e trasferiscila in un tubo di polipropilene da 15 mL contenente 1,8 mL CM.
      NOTA: Raccogliere le AL di 12 animali nello stesso tubo di raccolta.
   9. Tieni il campione a temperatura ambiente fino al completamento di tutte le dissezioni.
      NOTA: Non superare le 3 ore tra la raccolta del tessuto e l'inizio della digestione enzimatica per minimizzare la perdita di vitalità cellulare.
4. Confermare l'induzione dell'ipotiroidismo
   1. Raccogli un piccolo campione di fegato (circa 50 mg) da ciascun topo.
   2. Quantificare l'espressione epatica di Dio1 mRNA tramite la reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa in tempo reale e confrontarla con i controlli eutiroidei non trattati (Figura 1B).
      NOTA: Definire l'induzione riuscita dell'ipotiroidismo come una riduzione di almeno il 50% dell'espressione epatica di Dio1 rispetto ai controlli eutiroidei. L'espressione di Dio1 è positivamente correlata con i livelli di TH^{circolante 29}; pertanto, la riduzione dell'espressione di Dio1 conferma l'induzione riuscita dell'ipotiroidismo.
5. Raccolta ripetuta dei tessuti
   1. Ripeti i passaggi 2.2–2.4. fino a quando non sono state raccolte le AL da 12 topi.
   2. Procedere immediatamente al Passo 3.

Figura 2. Preparazione di una sospensione a singola cellula dall'ipofisi anteriore del topo. (A) Workflow che illustra la dissezione del lobo anteriore (AL), la dissociazione enzimatica e la preparazione di una sospensione monocellulare per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Il flusso di lavoro include la rimozione del lobo posteriore, la digestione della collagenasi, la digestione dell'acido tripsina-etilendidiamina-tetraacetico (EDTA) e la filtrazione prima dell'analisi FACS. (B) Immagini rappresentative della colorazione con colorante di vitalità e del conteggio automatico delle cellule disociate dell'ipofisi anteriore da topi eutiroidei e ipotiroidei. Sono indicati il rendimento totale delle cellule e la concentrazione nelle cellule vitali. Barra di scala = 200 μm. (C) Distribuzione dei diametri delle cellule dell'ipofisi anteriore dopo la dissociazione tissutale e la preparazione per l'analisi FACS a valle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

3. Preparazione di una sospensione a singola a base di AL del topo

NOTA: Esegui questa procedura in circa 60 minuti per generare una sospensione monocellulare dal tessuto ipofisario anteriore.

1. Prepara soluzioni digestive enzimatiche
   1. Prepara una soluzione di collagenasi al 2%
      1. Sciogliere 100 mg di collagenasi da Clostridium histolyticum (>125 unità di digestione collagenasi/mg solido) in 4,9 mL ddH₂O.
      2. Aggiungere 100 μL di 1 M HEPES per ottenere un volume finale di 5 mL.
      3. Sterilizza la soluzione usando un filtro da 0,22 μm.
      4. Alota la soluzione in volumi di 200 μL e conserva a −30°C per un massimo di 2 mesi.
         NOTA: Evitare cicli ripetuti di congelamento-disgelo. Non riutilizzare le aliquote di collagenasi scongelate.
   2. Prepara acido tripsina–etilendediamina-tetraacetico (EDTA) allo 0,25%
      1. Mescolare 1 mL di tripsina–EDTA allo 0,5% con 1 mL di HBSS senza Ca²⁺ e Mg²⁺.
      2. Conserva la soluzione a 4°C fino all'uso.
         NOTA: Utilizzare la soluzione diluita di tripsina–EDTA il giorno della preparazione. Non conservare né riutilizzare tripsina–EDTA diluita.
2. Eseguire la digestione della collagenasi
   1. Aggiungere 200 μL di soluzione di collagenasi al 2% ai tessuti AL raccolti.
   2. Mescola delicatamente il tessuto pipettando con una micropipetta P1000 dotata di punte a bassa ritenuzione.
   3. Incubare la sospensione in un bagno d'acqua a 37°C per 15 minuti.
      NOTA: Tieni chiuso il tappo del tubo durante l'incubazione per minimizzare la contaminazione.
   4. Batti delicatamente il tubo ogni 5 minuti durante l'incubazione.
3. Eseguire la digestione della desossiribonucleasi I (DNasi I)
   1. Aggiungere 5 μL di DNasi I (1 U/μL) direttamente alla sospensione senza rimuovere il sovrandante.
   2. Batti delicatamente il tubo 10 volte per mescolare la soluzione.
   3. Incubare la sospensione a 37°C per 5 minuti.
4. Applica il tessuto a pellet
   1. Centrifuga la sospensione a 100 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   2. Rimuovi con attenzione il sovrantantante usando una pipetta da 1 mL.
      NOTA: Lasciare circa 50 μL di liquido residuo sopra il pellet durante la rimozione del sovrantantante per minimizzare la perdita cellulare.
5. Eseguire la digestione della tripsina
   1. Aggiungi 2 mL di tripsina–EDTA allo 0,25% al pellet.
   2. Incubare la sospensione a 37°C per 10–15 minuti finché non rimangono frammenti di tessuto intatti visibili.
      NOTA: Non superare i 15 minuti per evitare una digestione eccessiva dei tessuti e una riduzione della vitalità cellulare.
6. Fermare la digestione enzimatica e dissociare il tessuto
   1. Aggiungi 2 mL di CM per fermare la tripsinizzazione.
   2. Pipetta delicatamente la sospensione su e giù 10–20 volte usando una micropipetta impostata su 1 mL finché non restano frammenti di tessuto visibili.
      NOTA: Utilizzare punte di pipetta a bassa ritenzione durante la dissociazione meccanica. Una sospensione a cella singola accettabile è una sospensione uniforme a bassa viscosità che contiene prevalentemente celle singole con aggregati visibili o detriti minimi (≤5%–10% di grumi tramite ispezione microscopica usando esclusione Trippan Blue).
7. Ritiro la sospensione a singola
   1. Centrifuga la sospensione a 100 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   2. Rimuovi con attenzione il soprantantante.
   3. Procedi immediatamente al Passo 4.
      NOTA: Iniziare la colorazione entro 15 minuti dalla preparazione della sospensione a singola e completare la selezione delle celle entro 1 ora ogni volta che è possibile. Mantenere le cellule sul ghiaccio durante questo intervallo per minimizzare la perdita di vitalità.

4. Colorazione per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza

NOTA: Eseguire questa procedura in circa 60 minuti per colorare le cellule disociate dell'ipofisi anteriore alla ricerca di FACS delle cellule CD90-positive.

1. Prepara la sospensione della cella
   1. Aggiungere un tampone di colorazione di 350 μL costituito da soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, 1×) contenente il 2% di FBS e 0,09% di azide di sodio al pellet cellulare.
   2. Sospendere delicatamente il pellet pipettando su e giù 10 volte usando una micropipetta P1000 dotata di punte a bassa ritenzione per ottenere una sospensione a singola cella.
   3. Trasferire la sospensione in un tubo microcentrifuga a basso legame da 1,5 mL.
2. Determinare la concentrazione e la vitalità cellulare
   1. Rimuovere un'aliquota da 5 μL dalla sospensione per il conteggio delle cellule.
   2. Mescola l'aliquota con un colorante di vitalità da 5 μL.
   3. Carica 10 μL della miscela in un contatore automatico delle celle.
      NOTA: Procedere al FACS quando la vitalità cellulare è dell'≥85%, come determinato dall'esclusione dei coloranti di vitalità e quando si osservano detriti e aggregati cellulari minimi.
   4. Confermare che la concentrazione totale delle cellule sia di circa 1 × 10⁷ cellule/mL per i campioni eutiroidei e 2 × 10⁷ cellule/mL per i campioni di ipotiroidei (Figura 2B). La distribuzione delle dimensioni cellulari dopo la dissociazione è mostrata nella Figura 2C.
3. Preparare i controlli di compensazione
   1. Trasferire 50 μL della sospensione della cella in un tampone di colorazione da 300 μL.
   2. Dividere la sospensione in tre aliquote da 100 μL in tubi microcentrifughe separati da 1,5 mL.
   3. Prepara i seguenti controlli: (i) controllo non colorato, (ii) controllo solo con iodio di propidio (PI) e (iii) controllo solo per ficoeritrina-ciana 7 (PE-Cy7) CD90.2.
4. Tingi le celle
   1. Aggiungere 3 μL di anticorpo anti-CD90.2 coniugato con PE-Cy7 alla sospensione cellulare da 300 μL.
      NOTA: La concentrazione di anticorpi è stata determinata da precedenti esperimenti di titolazione. Una diluizione finale di 1:100 ha fornito una separazione ottimale tra popolazioni positive e negative minimizzando la colorazione di fondo.
   2. Aggiungere 1 μL di anticorpo al controllo di compensazione CD90.2 per ottenere una diluizione finale di 1:100.
   3. Incubare tutti i campioni sul ghiaccio al buio per 30 minuti.
      NOTA: Mescola delicatamente i campioni ogni 10 minuti durante l'incubazione per mantenere una colorazione omogenea.
5. Lava le cellule macchiate
   1. Aggiungi 1 mL di tampone per la colorazione a freddo a ogni tubo.
   2. Centrifuga i campioni a 210 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Se disponibile, disattivare il freno centrifugo per minimizzare la rottura del pellet della cella durante la decelerazione.
   3. Rimuovi e scarta con attenzione il soprantantante.
6. Risospendi le cellule colorate
   1. Risospendere la sospensione della cella principale in un tampone di colorazione da 300 μL.
      NOTA: Aggiungi il PI immediatamente prima di selezionare a una concentrazione finale di 1 μg/mL.
   2. Risospendere ogni controllo di compensazione in un buffer di colorazione da 100 μL.
7. Filtra la sospensione della cella
   1. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un tubo di citometria a flusso dotato di un filtro cellulare da 35 μm immediatamente prima della selezione della selezione.
8. Procedere con la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza
   1. Procedere immediatamente al Passo 5 e selezionare le cellule colorate utilizzando un classificatore di cellule attivato a fluorescenza.

5. Strategia di cancellazione e ordinamento FACS

NOTA: Eseguire questa procedura in circa 60 minuti per isolare i tirotropi vitali CD90.2 positivi tramite FACS.

1. Configura il sistema di ordinamento delle celle
   1. Installa un ugello da 100 μm sul classificatore delle celle.
   2. Imposta la pressione della guaina a 20 psi.
      NOTA: Utilizzare un fluido sterile a base di PBS mantenuto a temperatura ambiente.
2. Eseguire il controllo qualità degli strumenti
   1. Esegui le procedure di controllo qualità degli strumenti secondo le istruzioni del produttore prima dell'acquisizione del campione.
      NOTA: Flussi di lavoro equivalenti raccomandati dal produttore possono essere utilizzati su selezionatori di celle alternativi.
   2. Verifica il ritardo di caduta e la stabilità del flusso usando le sfere di calibrazione.
3. Eseguire la compensazione della fluorescenza
   1. Acquisire controlli di compensazione a colore singolo.
   2. Esegui la compensazione della fluorescenza prima di fare il gate e lo smistamento.
      NOTA: Calcola la compensazione usando controlli non colorati e a colorazione singola. Verifica e regola manualmente le matrici di compensazione prima di ordinarle, quando necessario.
4. Definisci la strategia di gating
   1. Escludere i detriti utilizzando parametri di diffusione diretta e laterale (Figura 3A,B).
   2. Gate delle singole celle usando l'altezza di scattering diretto rispetto all'area di scattering diretto e l'altezza di scattering laterale rispetto all'area di scattering laterale (Figura 3A,B).
   3. Escludere le cellule morte tramite la gratificazione delle cellule PI-negative.
   4. Cellule a gate CD90.2 positive per l'arricchimento tirotropo.
      NOTA: Definire le cellule CD90.2-positive come eventi che mostrano un'intensità di fluorescenza superiore a^10-3 nel canale di rilevamento CD90 (Figura 3C–F).
5. Prepara i tubi di raccolta
   1. Preparare i tubi di raccolta in base all'applicazione prevista a valle.
      NOTA: Preriempire i tubetti di raccolta a bassa ritenzione con un reagente di lisi QIAzol da 1 mL per l'isolamento di RNA o con Medium 199 integrato con siero fetale al 10% spogliato di carbone per applicazioni in coltura cellulare.
6. Ordina i tirotropi CD90.2-positivi
   1. Ordina le cellule singole CD90.2 positive in tubi di raccolta.
   2. Raccogliere cellule per l'analisi dell'RNA
      1. Raccogli le cellule direttamente in un reagente per lisi da 1 mL.
      2. Vortice i tubi per 1 minuto per lisare le cellule.
      3. Congela immediatamente i campioni su ghiaccio secco.
      4. Conservare i campioni a −80°C fino all'estrazione dell'RNA.
   3. Raccogliere cellule per la coltura primaria
      1. Raccogliere cellule in un mezzo di coltura integrato con siero fetale al 10% spogliato di carbone e 1% di penicillina-streptomicina.
      2. Inseminare le cellule in vetrine a 8 pozzi a una densità di almeno 2 × 10⁵ celle per pozzo in un volume finale di 200 μL.
      3. Coltivare le cellule per un massimo di 72 ore a 37°C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO₂.
         NOTA: La performance accettabile della coltura è indicata dall'attacco cellulare visibile entro 24 ore, da circa il 60%–80% di efficienza di attacco e dalla vitalità ≥70%–80% dopo 72 ore.
      4. Aggiungi 100 nM T3 al mezzo di coltura quando necessario.
         NOTA: Iniziare il trattamento T3 dopo l'inserimento della cellula, tipicamente 24 ore dopo la placcatura e mantenere il trattamento fino alla raccolta del campione a 72 ore. Preparare la soluzione di T3 in NaOH da 40 mM e includere controlli trattati con veicolo alla stessa concentrazione finale di solvente.
         NOTA: Il siero spostato con carbone mantiene un ambiente di coltura impoverito di TH e migliora la rilevazione della soppressione sperimentalmente dipendente da T3 dell'espressione di Tshb .

Figura 3. Strategia di gate FACS e validazione dell'arricchimento tirotropo. (A,B) Strategia di gating sequenziale utilizzata per isolare singole cellule ipofisarie anteriori vitali. Le porte includono l'esclusione dei detriti usando area di scattering frontale (FSC-A) e area di scattering laterale (SSC-A), discriminazione dei singoli tramite altezza di scattering frontale (FSC-H) rispetto a FSC-A e altezza di scattering laterale (SSC-H) contro SSC-A, e esclusione di cellule morte positive a iodio propidio (PI). (C–F) Grafici rappresentativi FACS che mostrano l'identificazione e l'arricchimento delle popolazioni cellulari CD90.2-positive e CD90.2-negative utilizzando un anticorpo anti-CD90.2 coniugato con ficoeritrina-cianina 7 (PE-Cy7). (G–I) Validazione della reazione a catena quantitativa della polimerasi con trascrizione inversa (RT-qPCR) dell'arricchimento tirotropo in popolazioni cellulari ordinate. Abbreviazioni: FSC-A, area a scattering in avanti; SSC-A, area di dispersione laterale; FSC-H, altezza di diffusione in avanti; SSC-H, altezza a scattering laterale; PI, propidio ioduro; PE-Cy7, ficoeritrina–cianina 7; NT, non trattato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Analisi dell'espressione genica dell'mRNA di Tshb in cellule CD90-positive rispetto a CD90-negative tramite reazione a catena della polimerasi in tempo reale

NOTA: Esegui questa procedura in circa 5 ore per quantificare l'espressione di mRNA di Tshb nelle popolazioni cellulari ordinate.

1. Raccogliere cellule ordinate per l'estrazione dell'RNA
   1. Raccogliere un numero uguale di celle CD90-positive e CD90-negative (2,5 × 10⁵ cellule) in tubi separati da 1,5 mL contenenti un reagente di lisi da 1 mL.
2. Lisa le celle
   1. Vortice vigorosamente i campioni per 1 minuto per lisare completamente le cellule e posizionare i campioni sul ghiaccio.
      NOTA: Conservare i campioni lisati a −80°C prima dell'estrazione dell'RNA, se necessario.
3. Estrazione dell'RNA totale
   1. Estrai l'RNA totale secondo le istruzioni del produttore fornite con il kit di estrazione dell'RNA.
      NOTA: Eseguire la digestione della DNasi durante la purificazione utilizzando DNase I senza RNasi secondo le istruzioni del produttore per rimuovere residui di acido desossiribonucleico genomico (DNA) prima dell'eluzione.
   2. Misura la concentrazione di RNA usando uno spettrofotometro.
      NOTA: Utilizzare campioni con un rapporto A260/A280 di circa 1,8–2,1 e un rapporto A260/A230 superiore a 1,8 per la sintesi del DNA complementare (cDNA).
4. Sintesi cDNA
   1. Sintetizza cDNA da 100 ng di RNA totale secondo le istruzioni del produttore fornite con il kit di sintesi del cDNA a primo filamento.
      NOTA: Utilizzare primer oligo(dT) durante la sintesi del cDNA.
   2. Preparare la miscela modella-primer secondo la Tabella 1.
   3. Mescola delicatamente i reagenti e centrifuga brevemente per raccogliere il campione sul fondo del tubo.
   4. Denatura la miscela di modello-primer a 65°C per 10 minuti.
   5. Raffredda subito i campioni su un posto di raffreddamento.
   6. Preparare la miscela di reazione di trascrittione inversa secondo la Tabella 2 per ottenere un volume finale di 20 μL.
      NOTA: Prepara un master mix moltiplicando i volumi dei reagenti elencati nella Tabella 2 per il numero totale di campioni e aggiungendo un ulteriore 10% di volume in eccesso per tenere conto della variabilità della pipetta.
   7. Mescola delicatamente la reazione senza vortex e centrifuga brevemente.
   8. Incubare la reazione a 50°C per 60 minuti.
   9. Inattiva la reazione a 85°C per 5 minuti.
   10. Raffredda i campioni sul ghiaccio.
   11. Procedere direttamente alla reazione a catena quantitativa della polimerasi con trascrizione inversa (RT-qPCR) o conservare il cDNA a −30°C fino all'utilizzo.
       NOTA: il cDNA può essere conservato a −30°C per un massimo di 6 mesi in condizioni prive di nucleasi. Evita cicli ripetuti di congelamento-disgelo.
       NOTA: Eseguire i passaggi di sintesi del cDNA in un termociclatore dotato di coperchio riscaldato per minimizzare l'evaporazione.
5. Preparare la miscela di reazione RT-qPCR
   1. Prepara la miscela di reazione RT-qPCR secondo la Tabella 3.
6. Carica la piastra RT-qPCR
   1. Aggiungere 9 μL di miscela di reazione RT-qPCR in ciascun pozzo di una piastra da 96 pozzi.
   2. Aggiungere 1 μL di cDNA corrispondente al prodotto trascritto inverso generato da 5 ng di RNA totale in ingresso.
   3. Mescola delicatamente i campioni e centrifuga brevemente.
7. Eseguire RT-qPCR
   1. Esegui RT-qPCR secondo le istruzioni del produttore fornite con il SYBR Green master mix.
      NOTA: Utilizzare un passo iniziale di denaturazione di 95°C per 2 minuti seguito da 40 cicli a 95°C per 5 secondi e 60°C per 30 secondi. Acquisire fluorescenza alla fine di ogni fase di estensione. Eseguire l'analisi della curva di fusione da 65°C a 95°C in incrementi di 0,5°C per verificare l'amplificazione a prodotto singolo.
8. Normalizzare l'espressione di Tshb
   1. Normalizzare l'espressione di Tshb in espressione di Ciclofilina A (CyA) utilizzando il metodo ΔCt.
      NOTA: Validare la stabilità di CyA prima dell'analisi confermando la minima variazione del Ct tra i gruppi sperimentali.
9. Calcolare l'espressione genica relativa
   1. Calcola l'espressione relativa di Tshb nelle celle CD90-positive rispetto a quelle CD90-negative utilizzando il metodo 2^−ΔΔCt .
      NOTA: Eseguire l'analisi RT-qPCR utilizzando otto campioni biologici, ciascuno analizzato in reazioni tecniche duplicate (Figura 3G–I).

Reagente	Volume	Quantità/concentrazione finale
RNA totale	Variabile	100 ng
Primer oligo(dT)18 ancorato (50 pmol/μL)	1 μL	2,5 μM
Acqua di grado PCR	Variabile	Regolare a 13 μL di volume totale
Totale	13 μL	—

Tabella 1: Preparazione della miscela template–primer per la sintesi complementare degli acidi desossiribonucleici. Reagenti, volumi e quantità finali utilizzati per preparare la miscela modella-primer per la sintesi complementare di acidi desossiribonucleici (cDNA). Ogni reazione conteneva 100 ng di acido ribonucleico totale (RNA), un primer oligo(dT)18 ancorato e acqua di grado PCR (reazione a catena della polimerasi) regolata a un volume finale di 13 μL. La concentrazione riportata di 2,5 μM si riferisce alla concentrazione di primer nella miscela template–primer di 13 μL prima dell'aggiunta dei componenti della reazione di trascrizione inversa.

Reagente	Volume	Quantità/concentrazione finale
Buffer di reazione a transcriptor reverse transcriptasi (5×)	4 μL	1×
Inibitore della RNasi Protettore (40 U/μL)	0,5 μL	20 U
Miscela di desossinucleotidi (10 mM ciascuno)	2 μL	1 mM ciascuno
Trascriptore Transcriptasi Inversa (20 U/μL)	0,5 μL	10 U
Miscela template–primer (Tabella 1)	13 μL	—
Totale	20 μL	—

Tabella 2: Miscela di reazione di trascrittione inversa per la sintesi complementare degli acidi desossiribonucleici. Reagenti, volumi e concentrazioni finali utilizzati per la sintesi dell'acido desossiribonucleico complementare (cDNA) a primo filamento. Il volume finale di reazione era di 20 μL. Le concentrazioni di trifosfato di desossinucleotide riportate (1 mM ciascuna) si riferiscono alle concentrazioni finali nella miscela di reazione completa.

Reagente	Volume	Quantità/concentrazione finale
PowerTrack SYBR Green Master Mix (2×)	5 μL	1×
Primer oligonucleotidi TSHB diretti e invertiti (vedi Tabella dei Materiali)	0,5 μL	400 nM
Acqua di grado PCR	3,5 μL	Regolare a 9 μL di volume di reazione
Volume di reazione subtotale	9 μL	—
Modello cDNA	1 μL	5 ng
Volume finale di reazione	10 μL	—

Tabella 3: Preparazione della miscela di reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa. Reagenti, volumi e concentrazioni finali utilizzati per l'amplificazione della reazione a catena della polimerasi quantitativa (RT-qPCR) con trascrizione inversa dell'acido ribonucleico messaggero Tshb (mRNA). Il volume della miscela di reazione prima dell'aggiunta del template era di 9 μL. Aggiungere 1 μL di modello complementare di acido desossiribonucleico (cDNA) immediatamente prima dell'amplificazione per ottenere un volume finale di reazione di 10 μL.

Risultati

Dodici topi C57BL/6 di 8 settimane (6 maschi e 6 femmine) sono stati trattati con MMI e KClO₄ in acqua potabile insieme a una dieta carente di iodio per 1 settimana per indurre l'ipotiroidismo (Figura 1A). L'espressione epatica di Dio1 di tipo 1 è stata quantificata in topi eutiroidei e ipotiroidei per confermare un'induzione di ipotiroidismo²⁹ di successo. I topi ipotiroidei hanno mostrato una riduzione di circa il 60% dell'...

Discussione

Il protocollo FACS basato su CD90 descritto qui fornisce un metodo riproducibile per arricchire i tirotropi primari dal tessuto ipofisario adulto del topo preservando la risposta ormonale. Questo metodo affronta una limitazione tecnica di lunga data nello studio della biologia dei tirotropi e della regolazione degli assi HPT. Storicamente, le indagini sulla regolazione dei tirotropi si sono fortemente basate sulla linea cellulare TαT1; tuttavia, le cellule TαT1 mostrano un'espressione ba...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.22 µm filter	Corning	430769	Per la sterilizzazione del mezzo di raccolta
Filtro siringa 0.22 µm	Pall Life Sciences	PN4602	Per la sterilizzazione della collagenasi
Trypsina 0,5% ed EDTA	Gibco	15400-054	Per la dissociazione cellulare
Microcentrifughette da 1,5 mL a basso assorbimento	Invitrogen	AM12450	Per la colorazione FACS
Tubi polipropilenici da 15 mL	Falcon	352097	Per la raccolta del lobo anteriore e la dissociazione cellulare
Aghi calibro 23	BD Vacutainer Safety-Lok	367283	Per la perfusione cardiaca
Camera di vetro a 8 pozzetti	Millipore	PEZGS0816	Per la coltura post-FACS
Perle Accudrop	BD Biosciences	345249	Per la calibrazione del ritardo delle gocce durante la FACS
Anticorpo anti-topo PE-Cy7 anti-CD90.2	Invitrogen	25-0902-82	Per la colorazione FACS
Contatore cellulare automatico	DeNovix	s-10700	Per il conteggio delle cellule
Siero fetale bovino privato di carbone	Gibco	12676029	Per la coltura del tirotropo post-FACS
Collagenasa da Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9263	Per la dissociazione cellulare
Piatto di dissezione standard da laboratorio	N/A	N/A	Per la perfusione cardiaca
Soluzione di cloruro di sodio tamponata con HEPES (HBSS) preparata su misura senza Ca2+ e Mg2+	N/A	N/A	Per la perfusione e la dissociazione cellulare
Primo di oligonucleotidi di ciclofillina A (CyA) forward	Integrated DNA Technologies	5’-GCC GAT GAC GAG CCC TTG-3’	Per RT-qPCR
Primo di oligonucleotidi di ciclofillina A (CyA) reverse	Integrated DNA Technologies	5’-TGC CGC CAG TCG CAT TAT-3’	Per RT-qPCR
DMEM, 1x	Gibco	11965-092	Per il mezzo di raccolta
Soluzione di DNase I	Promega	M6101	Per la dissociazione cellulare
Iniezione di enoxaparina sodica	Sandoz	0781-3119-64	Per la perfusione
Siero fetale bovino (FBS)	Cytiva HyClone	SH30088.02HI	Per il mezzo di raccolta
Buffer di colorazione per citometria a flusso	Invitrogen	00-4222-26	Per la colorazione FACS
Emostato	Fine Science Tools	13008-12	Per la stabilizzazione della cavità toracica
HEPES, 1 M	Gibco	15630-080	Per il mezzo di raccolta
HEPES, 1 M	Teknova	H1035	Per la preparazione di HBSS
Dieta carente di iodio	Envigo	TD.95007	Per l'induzione dell'ipotiroidismo in vivo
Pinze per iris	Fine Science Tools	11065-07	Per la dissezione dell'ipofisi
Isoflurano	Piramal Critical Care	66794-017-25	Per l'anestesia
L-glutammina	Gibco	35050-061	Per il mezzo di raccolta
Medium 199	Gibco	11150-059	Per la coltura post-FACS
Metimazolo (MMI)	Sigma-Aldrich	M8506-100G	Per l'induzione dell'ipotiroidismo in vivo
Piastra di reazione Fast 96 pozzetti MicroAmp	Applied Biosystems	4346907	Per RT-qPCR
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122	Per la coltura post-FACS
Pompa peristaltica	Fisher Scientific	GP1000	Per la perfusione cardiaca
Perclorato di potassio (KClO4)	Sigma-Aldrich	241830-500G	Per l'induzione dell'ipotiroidismo in vivo
PowerTrack SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A46109	Per RT-qPCR
Ioduro di propidio	eBioscience	00-6990-50	Per la colorazione della vitalità durante la FACS
Reagente di lisi QIAzol	Qiagen	79306	Per l'estrazione dell'RNA
Tubi in silicone	Cole-Parmer	EW-96410-13	Per la perfusione cardiaca
Stereomicroscopio	Nikon	SMZ-745T	Per la dissezione del lobo anteriore
Sistema di Real-Time PCR StepOnePlus	Applied Biosystems	4376600	Per RT-qPCR
Cucchiaio chirurgico	Fine Science Tools	10090-13	Per il sollevamento del cervello durante l'esposizione dell'ipofisi
Kit per la sintesi del primo filamento di cDNA Transcriptor	Roche	4379012001	Per la preparazione del cDNA
Blu di Tripano	Thermo Fisher Scientific	T10282	Per il conteggio delle cellule
Primo di oligonucleotidi di Tshb forward	Integrated DNA Technologies	5’-TCT GTG CTG GGT ATT GTA TGA C-3’	Per RT-qPCR
Primo di oligonucleotidi di Tshb reverse	Integrated DNA Technologies	5’-GCG GCT TGG TCG AGT AGT TG-3’	Per RT-qPCR
Bagno d'acqua	Fisher Scientific Isotemp Water Bath	15-462-5Q	Per la digestione enzimatica