Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. L'approvazione è stata rilasciata dal Comitato Etico dell'Università Medica della Mongolia Interna il 21 ottobre 2021. A tutti i partecipanti inclusi nello studio è stato ottenuto il consenso informato scritto.
Prelievo di campioni clinici
Tessuti di CRC accoppiati e tessuti non tumorali adiacenti sono stati raccolti da 45 pazienti sottoposti a resezione radicale tra dicembre 2017 e febbraio 2020. Nessuno dei pazienti ha ricevuto radioterapia o chemioterapia preoperatoria, e sono stati esclusi i pazienti con altre neoplasie. Il tessuto non tumorale adiacente è stato prelevato a una distanza di almeno 5 cm dal margine tumorale. I campioni sono stati congelati immediatamente dopo l'asportazione chirurgica e conservati in azoto liquido fino all'estrazione dell'RNA. Il gruppo comprendeva 27 pazienti di sesso maschile e 18 di sesso femminile; 13 pazienti avevano meno di 60 anni, e 32 avevano 60 anni o più. Le variabili clinicopatologiche includevano diametro del tumore, stadio TNM, grado di differenziazione, trombo tumorale vascolare, metastasi linfonodali e livello preoperatorio di CEA.
Acquisizione e preelaborazione dei dati pubblici
I dati open-access di miRNA-seq, RNA-seq e dati clinici per TCGA-COAD e TCGA-READ sono stati ottenuti dal portale Genomic Data Commons. I campioni di tumori primari e di tessuto solido normale sono stati identificati in base al tipo di campione GDC. I campioni di tumori metastatici e ricorrenti sono stati esclusi dall'analisi dell'espressione differenziale tra tumore e tessuto normale. Per i file TCGA miRNA-seq, la voce a livello di database rilevata per questa analisi è stata hsa-mir-192; i valori di espressione sono stati analizzati come log2(RPM + 1), dove RPM indica i reads per milione di reads di miRNA mappati. Sono state eseguite sia analisi non appaiate che appaiate tra tumore e tessuto normale quando erano disponibili campioni abbinati. I set di dati GEO GSE89076 e GSE156355 sono stati utilizzati per lo screening dei geni bersaglio candidati. I geni differenzialmente espressi provenienti da GEO sono stati selezionati utilizzando un valore di p corretto < 0,05 e un fold-change log2 assoluto ≥ 2. I nomi dei set di dati sono stati verificati per garantire coerenza in tutto il manoscritto.
Analisi diagnostiche, clinicopatologiche e di sopravvivenza
È stata utilizzata l'analisi della caratteristica operativa del ricevitore (ROC) per valutare la separazione esplorativa tra tumore e tessuto normale nei cohort TCGA-COAD, TCGA-READ e nel cohort combinato COADREAD. Poiché il numero di campioni normali era ridotto, sono state eseguite ulteriori analisi di sensibilità, incluse il ricampionamento bilanciato tumore-normale con 5.000 iterazioni e l'analisi leave-one-normal-out. Per le analisi di associazione clinicopatologica, i campioni di tumore primario sono stati suddivisi in gruppi ad alta e bassa espressione in base al livello mediano di espressione di miR-192 nel TCGA. Le analisi sono state ripetute per il cohort combinato COADREAD e separatamente per COAD e READ quando le dimensioni del campione lo permettevano. La sopravvivenza complessiva è stata valutata mediante analisi di Kaplan-Meier con il test del log-rank e regressione di Cox univariata. Le analisi diagnostiche, clinicopatologiche e sulla sopravvivenza sono state riportate separatamente per evitare conclusioni prognostiche esagerate.
Analisi dei geni bersaglio candidati e dei geni hub
I geni bersaglio candidati sono stati identificati integrando le previsioni di miRWalk con i geni differenzialmente espressi provenienti da GSE89076 e GSE156355. L'intersezione tra queste tre fonti è stata conservata per l'analisi esplorativa successiva. È stata costruita una rete di interazione proteina-proteina utilizzando STRING, e i geni hub sono stati selezionati in base al grado del nodo e alla connettività del modulo mediante analisi cytoHubba e MCODE basate su Cytoscape. I geni hub conservati (KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 e KIF5C) sono stati ulteriormente valutati utilizzando dati RNA-seq del TCGA. Le differenze di espressione tra tumore e tessuto normale, le correlazioni di Spearman con l'espressione di miR-192 del TCGA e le associazioni con la sopravvivenza complessiva sono state riassunte come analisi esplorative supplementari. Questi geni sono stati considerati soltanto candidati bersaglio; dai dati bioinformatici non è stata dedotta alcuna interazione diretta, effetto di recupero o regolazione a livello proteico a valle.
Analisi di arricchimento GO e KEGG
Sono state eseguite analisi di arricchimento Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) per il set di geni candidati e i moduli di rete significativi. I termini GO sono stati raggruppati in categorie di processo biologico, componente cellulare e funzione molecolare. I risultati di arricchimento con p < 0,05 sono stati considerati statisticamente rilevanti e sono stati interpretati come segnali di percorso generati da ipotesi piuttosto che meccanismi validati sperimentalmente.
Estrazione dell'RNA e analisi di qRT-PCR
L'RNA totale è stato estratto da 45 campioni accoppiati di tessuto di CRC e tessuto non tumorale adiacente utilizzando il reagente TRIzol secondo il protocollo del produttore. La purezza e la concentrazione dell'RNA sono state valutate mediante spettrofotometria, e sono stati utilizzati per la trascrizione inversa solo i campioni con valori A260/A280 compresi tra 1,8 e 2,1. La qRT-PCR è stata eseguita utilizzando un sistema di trascrizione inversa per miRNA e reagenti per qPCR miRNA a base di SYBR Green di TransGen Biotech. La trascrizione inversa e l'amplificazione mediante qPCR sono state effettuate seguendo le istruzioni del produttore dei reagenti. Ogni reazione di qRT-PCR è stata eseguita in triplicato tecnico. RNU6B è stato utilizzato come riferimento interno. I primer per miR-192-5p erano 5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3' (forward) e 5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3' (reverse). I primer per RNU6B erano 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' (forward) e 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3' (reverse). L'analisi della curva di denaturazione è stata utilizzata per valutare la specificità dell'amplificazione, quando supportata dalla piattaforma di qPCR. L'espressione relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2-ΔΔCt. I risultati ottenuti dai tessuti tumorali e adiacenti accoppiati sono stati analizzati come misurazioni cliniche appaiate.
Cultura cellulare e trasfezione
La linea cellulare umana di CRC HT29 è stata ottenuta dalla banca cellulare del laboratorio degli autori ed era stata autenticata e confermata priva di contaminazione da micoplasma. Le cellule HT29 sono state coltivate in mezzo McCoy's 5A integrato con siero fetale bovino al 10%, penicillina 100 U/mL e streptomicina 100 µg/mL a 37 oC in un'atmosfera di CO2 al 5%. Le cellule sono state ripassate quando hanno raggiunto una confluenza di circa l'80%. I mimici di miR-192-5p e l'oligonucleotide di controllo negativo con238 sono stati acquistati da Sangon Biotech (Shanghai, Cina) e utilizzati per la trasfezione transitoria. Le cellule HT29 sono state seminate in piastre a 6 pozzetti e trasfettate quando la densità cellulare ha raggiunto circa il 20–30%, utilizzando una concentrazione finale di oligonucleotide di 50 nM e un protocollo di trasfezione basato su lipidi, eseguito secondo le istruzioni del produttore del reagente. Il rapporto esatto tra reagente e oligonucleotide e la quantità di reagente hanno seguito il protocollo raccomandato dal produttore, come registrato nei protocolli di laboratorio degli autori. Le cellule sono state incubate con i complessi di trasfezione in condizioni standard di coltura, e le analisi successive di imaging post-trasfezione e saggi di guarigione del "wound" sono state eseguite dopo la trasfezione, secondo il programma sperimentale. Solo i dati ottenuti con le cellule HT29 sono stati inclusi nel presente studio.
Saggio di guarigione delle ferite
Le cellule HT29 transfezionate sono state seminate in piastre da 6 pozzetti e coltivate fino alla formazione di un monostrato confluenziale. Un graffio lineare è stato realizzato utilizzando una punta sterile da 200 µL, e le cellule staccate sono state rimosse mediante lavaggio con PBS. Il mezzo è stato quindi sostituito con mezzo privo di siero per ridurre gli effetti legati alla proliferazione durante la valutazione della migrazione. Le immagini della ferita sono state acquisite a 0 h, 24 h e 48 h. Il saggio di guarigione della ferita è stato eseguito in tre replicati biologici indipendenti, e per ciascun gruppo e punto temporale sono stati analizzati diversi campi microscopici. L'ampiezza della ferita è stata quantificata a partire dalle immagini microscopiche mediante software di analisi dell'immagine; la versione esatta del software utilizzata per le misurazioni originali non era disponibile nei dati di origine. La velocità di guarigione della ferita è stata calcolata come [(ampiezza della ferita a 0 h - ampiezza della ferita al tempo indicato) / ampiezza della ferita a 0 h] x 100%. Poiché i dati del manoscritto disponibili non includono un esperimento di controllo specifico per la proliferazione, i risultati del saggio di guarigione della ferita sono stati interpretati come legati alla migrazione, ma non come esclusione completa degli effetti della proliferazione.
Analisi della correlazione del profilo immunitario
L'associazione tra l'espressione di miR-192 del TCGA e le firme immuno-correlate è stata rivalutata utilizzando dati di RNA-seq da tumori primari. Un totale di 425 campioni tumorali con dati abbinati di miRNA e RNA-seq è stato incluso nell'analisi di correlazione tra punteggio delle firme. L'espressione di miR-192 ha mostrato correlazioni negative statisticamente significative ma deboli con diverse firme immunitarie dopo la correzione per il tasso di falsa scoperta (FDR), inclusi le cellule Tfh (rho = -0,205, FDR = 0,00049), le cellule dendritiche attivate (rho = -0,186, FDR = 0,00098), le cellule Treg (rho = -0,185, FDR = 0,00098), le cellule dendritiche plasmacitoidi (rho = -0,169, FDR = 0,0027) e i macrofagi (rho = -0,149, FDR = 0,0092). Correlazioni positive sono state osservate principalmente per le firme degli eosinofili (rho = 0,139, FDR = 0,0155) e delle cellule Th17 (rho = 0,121, FDR = 0,0296). Questi risultati indicano associazioni immunitarie eterogenee e generalmente deboli, piuttosto che un modello uniforme di infiltrazione immunitaria positiva.
Analisi statistica
Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism 9.0, SPSS 25.0 e il software R 3.6.3. Le variabili continue sono state riassunte come media ± deviazione standard o mediana con intervallo interquartile, secondo opportunità. I confronti tra tessuti appaiati sono stati analizzati mediante test per campioni appaiati quando i campioni tumorali e quelli adiacenti erano abbinati. Sono stati utilizzati test non parametrici quando le assunzioni di normalità non erano soddisfatte. Curve ROC, ricampionamento bilanciato e analisi leave-one-normal-out sono stati impiegati per la discriminazione diagnostica esplorativa; test del chi-quadrato sono stati utilizzati per le associazioni clinicopatologiche categoriali; modelli log-rank e di Cox sono stati utilizzati per le analisi di sopravvivenza; e la correlazione di Spearman è stata utilizzata per le analisi immunitarie e dei geni hub. È stato considerato statisticamente significativo un valore di p bilaterale < 0,05, con correzione del tasso di falsa scoperta riportata per le correlazioni delle firme immunitarie.