Questo studio integra set di dati pubblici, validazione su tessuti accoppiati, saggi di migrazione cellulare, previsione di reti bersaglio e analisi delle firme immunitarie per valutare il ruolo del miR-192-5p nel cancro del colon-retto. I risultati evidenziano una discordanza tra i dati di espressione del TCGA/GDC e i risultati locali ottenuti con qRT-PCR, mettendo in guardia contro un'interpretazione eccessiva del suo significato diagnostico, prognostico, funzionale e legato alla risposta immunitaria.
Articolo di ricerca
Significatività clinica, panorama dell'infiltrazione immunitaria e analisi della rete funzionale di miR-192-5p nel cancro colorettale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cancro del colon-retto (CCR) è una neoplasia eterogenea in cui i microRNA possono contribuire alla progressione tumorale e alla scoperta di biomarcatori. Questo studio ha valutato il significato clinico, le associazioni immunitarie e la rete funzionale di miR-192-5p nel CCR integrando analisi bioinformatiche di TCGA/GDC e GEO, una validazione mediante qRT-PCR su tessuti appaiati, la previsione di bersagli, l'analisi delle firme immunitarie e esperimenti di guarigione della ferita in cellule HT29. La rivalutazione dei dati di sequenziamento miRNA di TCGA/GDC ha incluso 616 campioni tumorali e 11 campioni normali di COADREAD, mostrando un segnale maggiore a livello del database per hsa-mir-192 nei campioni tumorali rispetto a quelli normali (Mann-Whitney p = 9,96 x 10-8). La stessa tendenza è stata osservata in 11 casi appaiati di TCGA (differenza mediana tumore-normale = 3,13 log2[RPM + 1], Wilcoxon p = 0,0029), mentre la qRT-PCR locale su tessuti clinici appaiati ha indicato un'espressione più bassa della forma matura di miR-192-5p nei tessuti di CCR. L'analisi ROC basata su TCGA ha mostrato una netta separazione tra tumore e tessuto normale, ma analisi di ricampionamento bilanciato e di tipo "leave-one-normal-out" hanno confermato che questo risultato deve essere interpretato con cautela a causa del numero limitato di campioni normali. L'analisi clinicopatologica ha suggerito associazioni con lo stadio N e l'età nel coorte di TCGA, mentre lo stadio T e lo stadio M non sono risultati significativi nella tabella riassuntiva, e l'analisi della sopravvivenza complessiva non ha evidenziato un'associazione prognostica significativa. L'analisi esplorativa dei geni hub candidati mediante RNA-seq di TCGA ha fornito prove di espressione, correlazione e sopravvivenza, ma non ha dimostrato un targeting diretto di miR-192-5p. L'analisi delle firme immunitarie ha mostrato correlazioni eterogenee, prevalentemente deboli. Funzionalmente, la trasfezione con un mimico di miR-192-5p ha ridotto la chiusura della ferita in cellule HT29. Questi risultati indicano che miR-192-5p è biologicamente rilevante nel CCR, ma la direzione della sua espressione e la sua interpretazione clinica dipendono dalla piattaforma utilizzata e richiedono ulteriore validazione sperimentale.
Introduzione
Il cancro del colon-retto (CCR) è una delle neoplasie più comuni a livello mondiale e continua a essere una delle principali cause di mortalità correlata al cancro1,2. Sebbene la colonscopia, il test immunoistochimico delle feci, il test di metilazione di SEPT9, i marcatori tumorali circolanti e il profilo molecolare abbiano migliorato la diagnosi e la gestione clinica del CCR3,4, permangono notevoli eterogeneità nella biologia tumorale, nella risposta al trattamento e nell'esito per il paziente5,6,7. Biomarcatori che contribuiscono a caratterizzare la biologia del CCR potrebbero quindi essere utili nella stratificazione del rischio e nello sviluppo di strategie terapeutiche più personalizzate8.
I microRNA (miRNA) sono piccoli RNA non codificanti, lunghi circa 19–24 nucleotidi, che regolano l'espressione genica principalmente attraverso meccanismi post-trascrizionali9. Un'espressione alterata dei miRNA può influenzare la proliferazione, la migrazione, l'invasione, l'apoptosi, le interazioni immunitarie e la risposta al trattamento delle cellule tumorali10. È stato riportato che miR-192-5p agisce in modo dipendente dal contesto in diverse malattie e tumori, mostrando associazioni sia oncogeniche sia soppressive del tumore a seconda del tipo di tessuto, dello sfondo molecolare e del sistema sperimentale11,12,13,14,15,16. Nel carcinoma del colon-retto (CRC), studi precedenti hanno riportato profili di miRNA alterati in campioni clinici e una regolazione funzionale di fenotipi maligni nelle cellule del cancro del colon12,14,15. Tuttavia, le analisi di database pubblici potrebbero non mostrare sempre la stessa direzione di espressione, e il significato clinico, la rete di bersagli e le associazioni immunitarie di miR-192-5p nel CRC richiedono una valutazione accurata.
Lo studio attuale ha valutato il ruolo del miR-192-5p nel carcinoma del colon-retto (CRC) integrando analisi bioinformatiche dei dati TCGA/GDC e GEO, validazione mediante qRT-PCR su tessuti clinici accoppiati, saggi di migrazione in vitro, previsione di geni bersaglio candidati, arricchimento di percorsi biologici e analisi di correlazione con firme immunitarie. Lo studio si basava sull'ipotesi che il miR-192-5p maturo potesse essere downregolato nei tessuti tumorali del CRC ed esercitare un effetto soppressore del tumore. Poiché l'analisi ri-effettuata del segnale di sequenziamento dell'RNA micro (miRNA-seq) proveniente da TCGA/GDC ha mostrato una direzione di espressione opposta, i risultati vengono interpretati come esplorativi e dipendenti dalla piattaforma utilizzata, piuttosto che rappresentare un unico modello definitivo di espressione.
Protocollo
Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. L'approvazione è stata rilasciata dal Comitato Etico dell'Università Medica della Mongolia Interna il 21 ottobre 2021. A tutti i partecipanti inclusi nello studio è stato ottenuto il consenso informato scritto.
Prelievo di campioni clinici
Tessuti di CRC accoppiati e tessuti non tumorali adiacenti sono stati raccolti da 45 pazienti sottoposti a resezione radicale tra dicembre 2017 e febbraio 2020. Nessuno dei pazienti ha ricevuto radioterapia o chemioterapia preoperatoria, e sono stati esclusi i pazienti con altre neoplasie. Il tessuto non tumorale adiacente è stato prelevato a una distanza di almeno 5 cm dal margine tumorale. I campioni sono stati congelati immediatamente dopo l'asportazione chirurgica e conservati in azoto liquido fino all'estrazione dell'RNA. Il gruppo comprendeva 27 pazienti di sesso maschile e 18 di sesso femminile; 13 pazienti avevano meno di 60 anni, e 32 avevano 60 anni o più. Le variabili clinicopatologiche includevano diametro del tumore, stadio TNM, grado di differenziazione, trombo tumorale vascolare, metastasi linfonodali e livello preoperatorio di CEA.
Acquisizione e preelaborazione dei dati pubblici
I dati open-access di miRNA-seq, RNA-seq e dati clinici per TCGA-COAD e TCGA-READ sono stati ottenuti dal portale Genomic Data Commons. I campioni di tumori primari e di tessuto solido normale sono stati identificati in base al tipo di campione GDC. I campioni di tumori metastatici e ricorrenti sono stati esclusi dall'analisi dell'espressione differenziale tra tumore e tessuto normale. Per i file TCGA miRNA-seq, la voce a livello di database rilevata per questa analisi è stata hsa-mir-192; i valori di espressione sono stati analizzati come log2(RPM + 1), dove RPM indica i reads per milione di reads di miRNA mappati. Sono state eseguite sia analisi non appaiate che appaiate tra tumore e tessuto normale quando erano disponibili campioni abbinati. I set di dati GEO GSE89076 e GSE156355 sono stati utilizzati per lo screening dei geni bersaglio candidati. I geni differenzialmente espressi provenienti da GEO sono stati selezionati utilizzando un valore di p corretto < 0,05 e un fold-change log2 assoluto ≥ 2. I nomi dei set di dati sono stati verificati per garantire coerenza in tutto il manoscritto.
Analisi diagnostiche, clinicopatologiche e di sopravvivenza
È stata utilizzata l'analisi della caratteristica operativa del ricevitore (ROC) per valutare la separazione esplorativa tra tumore e tessuto normale nei cohort TCGA-COAD, TCGA-READ e nel cohort combinato COADREAD. Poiché il numero di campioni normali era ridotto, sono state eseguite ulteriori analisi di sensibilità, incluse il ricampionamento bilanciato tumore-normale con 5.000 iterazioni e l'analisi leave-one-normal-out. Per le analisi di associazione clinicopatologica, i campioni di tumore primario sono stati suddivisi in gruppi ad alta e bassa espressione in base al livello mediano di espressione di miR-192 nel TCGA. Le analisi sono state ripetute per il cohort combinato COADREAD e separatamente per COAD e READ quando le dimensioni del campione lo permettevano. La sopravvivenza complessiva è stata valutata mediante analisi di Kaplan-Meier con il test del log-rank e regressione di Cox univariata. Le analisi diagnostiche, clinicopatologiche e sulla sopravvivenza sono state riportate separatamente per evitare conclusioni prognostiche esagerate.
Analisi dei geni bersaglio candidati e dei geni hub
I geni bersaglio candidati sono stati identificati integrando le previsioni di miRWalk con i geni differenzialmente espressi provenienti da GSE89076 e GSE156355. L'intersezione tra queste tre fonti è stata conservata per l'analisi esplorativa successiva. È stata costruita una rete di interazione proteina-proteina utilizzando STRING, e i geni hub sono stati selezionati in base al grado del nodo e alla connettività del modulo mediante analisi cytoHubba e MCODE basate su Cytoscape. I geni hub conservati (KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 e KIF5C) sono stati ulteriormente valutati utilizzando dati RNA-seq del TCGA. Le differenze di espressione tra tumore e tessuto normale, le correlazioni di Spearman con l'espressione di miR-192 del TCGA e le associazioni con la sopravvivenza complessiva sono state riassunte come analisi esplorative supplementari. Questi geni sono stati considerati soltanto candidati bersaglio; dai dati bioinformatici non è stata dedotta alcuna interazione diretta, effetto di recupero o regolazione a livello proteico a valle.
Analisi di arricchimento GO e KEGG
Sono state eseguite analisi di arricchimento Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) per il set di geni candidati e i moduli di rete significativi. I termini GO sono stati raggruppati in categorie di processo biologico, componente cellulare e funzione molecolare. I risultati di arricchimento con p < 0,05 sono stati considerati statisticamente rilevanti e sono stati interpretati come segnali di percorso generati da ipotesi piuttosto che meccanismi validati sperimentalmente.
Estrazione dell'RNA e analisi di qRT-PCR
L'RNA totale è stato estratto da 45 campioni accoppiati di tessuto di CRC e tessuto non tumorale adiacente utilizzando il reagente TRIzol secondo il protocollo del produttore. La purezza e la concentrazione dell'RNA sono state valutate mediante spettrofotometria, e sono stati utilizzati per la trascrizione inversa solo i campioni con valori A260/A280 compresi tra 1,8 e 2,1. La qRT-PCR è stata eseguita utilizzando un sistema di trascrizione inversa per miRNA e reagenti per qPCR miRNA a base di SYBR Green di TransGen Biotech. La trascrizione inversa e l'amplificazione mediante qPCR sono state effettuate seguendo le istruzioni del produttore dei reagenti. Ogni reazione di qRT-PCR è stata eseguita in triplicato tecnico. RNU6B è stato utilizzato come riferimento interno. I primer per miR-192-5p erano 5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3' (forward) e 5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3' (reverse). I primer per RNU6B erano 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' (forward) e 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3' (reverse). L'analisi della curva di denaturazione è stata utilizzata per valutare la specificità dell'amplificazione, quando supportata dalla piattaforma di qPCR. L'espressione relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2-ΔΔCt. I risultati ottenuti dai tessuti tumorali e adiacenti accoppiati sono stati analizzati come misurazioni cliniche appaiate.
Cultura cellulare e trasfezione
La linea cellulare umana di CRC HT29 è stata ottenuta dalla banca cellulare del laboratorio degli autori ed era stata autenticata e confermata priva di contaminazione da micoplasma. Le cellule HT29 sono state coltivate in mezzo McCoy's 5A integrato con siero fetale bovino al 10%, penicillina 100 U/mL e streptomicina 100 µg/mL a 37 oC in un'atmosfera di CO2 al 5%. Le cellule sono state ripassate quando hanno raggiunto una confluenza di circa l'80%. I mimici di miR-192-5p e l'oligonucleotide di controllo negativo con238 sono stati acquistati da Sangon Biotech (Shanghai, Cina) e utilizzati per la trasfezione transitoria. Le cellule HT29 sono state seminate in piastre a 6 pozzetti e trasfettate quando la densità cellulare ha raggiunto circa il 20–30%, utilizzando una concentrazione finale di oligonucleotide di 50 nM e un protocollo di trasfezione basato su lipidi, eseguito secondo le istruzioni del produttore del reagente. Il rapporto esatto tra reagente e oligonucleotide e la quantità di reagente hanno seguito il protocollo raccomandato dal produttore, come registrato nei protocolli di laboratorio degli autori. Le cellule sono state incubate con i complessi di trasfezione in condizioni standard di coltura, e le analisi successive di imaging post-trasfezione e saggi di guarigione del "wound" sono state eseguite dopo la trasfezione, secondo il programma sperimentale. Solo i dati ottenuti con le cellule HT29 sono stati inclusi nel presente studio.
Saggio di guarigione delle ferite
Le cellule HT29 transfezionate sono state seminate in piastre da 6 pozzetti e coltivate fino alla formazione di un monostrato confluenziale. Un graffio lineare è stato realizzato utilizzando una punta sterile da 200 µL, e le cellule staccate sono state rimosse mediante lavaggio con PBS. Il mezzo è stato quindi sostituito con mezzo privo di siero per ridurre gli effetti legati alla proliferazione durante la valutazione della migrazione. Le immagini della ferita sono state acquisite a 0 h, 24 h e 48 h. Il saggio di guarigione della ferita è stato eseguito in tre replicati biologici indipendenti, e per ciascun gruppo e punto temporale sono stati analizzati diversi campi microscopici. L'ampiezza della ferita è stata quantificata a partire dalle immagini microscopiche mediante software di analisi dell'immagine; la versione esatta del software utilizzata per le misurazioni originali non era disponibile nei dati di origine. La velocità di guarigione della ferita è stata calcolata come [(ampiezza della ferita a 0 h - ampiezza della ferita al tempo indicato) / ampiezza della ferita a 0 h] x 100%. Poiché i dati del manoscritto disponibili non includono un esperimento di controllo specifico per la proliferazione, i risultati del saggio di guarigione della ferita sono stati interpretati come legati alla migrazione, ma non come esclusione completa degli effetti della proliferazione.
Analisi della correlazione del profilo immunitario
L'associazione tra l'espressione di miR-192 del TCGA e le firme immuno-correlate è stata rivalutata utilizzando dati di RNA-seq da tumori primari. Un totale di 425 campioni tumorali con dati abbinati di miRNA e RNA-seq è stato incluso nell'analisi di correlazione tra punteggio delle firme. L'espressione di miR-192 ha mostrato correlazioni negative statisticamente significative ma deboli con diverse firme immunitarie dopo la correzione per il tasso di falsa scoperta (FDR), inclusi le cellule Tfh (rho = -0,205, FDR = 0,00049), le cellule dendritiche attivate (rho = -0,186, FDR = 0,00098), le cellule Treg (rho = -0,185, FDR = 0,00098), le cellule dendritiche plasmacitoidi (rho = -0,169, FDR = 0,0027) e i macrofagi (rho = -0,149, FDR = 0,0092). Correlazioni positive sono state osservate principalmente per le firme degli eosinofili (rho = 0,139, FDR = 0,0155) e delle cellule Th17 (rho = 0,121, FDR = 0,0296). Questi risultati indicano associazioni immunitarie eterogenee e generalmente deboli, piuttosto che un modello uniforme di infiltrazione immunitaria positiva.
Analisi statistica
Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism 9.0, SPSS 25.0 e il software R 3.6.3. Le variabili continue sono state riassunte come media ± deviazione standard o mediana con intervallo interquartile, secondo opportunità. I confronti tra tessuti appaiati sono stati analizzati mediante test per campioni appaiati quando i campioni tumorali e quelli adiacenti erano abbinati. Sono stati utilizzati test non parametrici quando le assunzioni di normalità non erano soddisfatte. Curve ROC, ricampionamento bilanciato e analisi leave-one-normal-out sono stati impiegati per la discriminazione diagnostica esplorativa; test del chi-quadrato sono stati utilizzati per le associazioni clinicopatologiche categoriali; modelli log-rank e di Cox sono stati utilizzati per le analisi di sopravvivenza; e la correlazione di Spearman è stata utilizzata per le analisi immunitarie e dei geni hub. È stato considerato statisticamente significativo un valore di p bilaterale < 0,05, con correzione del tasso di falsa scoperta riportata per le correlazioni delle firme immunitarie.
Risultati
Analisi dell'espressione in dataset pubblici e tessuti clinici appaiati
Il profilo di espressione di miR-192 è stato rivalutato utilizzando i dati di sequenziamento dell'RNA microsomiale (miRNA-seq) derivati da GDC relativi a TCGA-COAD e TCGA-READ (Figura 1). In questi file, la voce a livello di database era annotata come hsa-mir-192 anziché direttamente come la specie matura hsa-miR-192-5p; pertanto, questo risultato proveniente da database pubblici è stato interpretato come un segnale TCGA di miR-192. Nel coorte COADREAD combinato, sono stati analizzati 616 tumori primari e 11 campioni normali di tessuto solido. I campioni tumorali mostravano un'espressione di miR-192 più elevata rispetto ai campioni normali (mediana 16,05 vs 13,46 log2[RPM + 1], Mann-Whitney p = 9,96 x 10-8). La stessa direzione di aumento nei tumori è stata osservata separatamente in COAD (455 tumori e 8 campioni normali, p = 9,89 x 10-8) e in READ (161 tumori e 3 campioni normali, p = 1,94 x 10-5). L'analisi appaiata di TCGA ha mostrato inoltre un'espressione tumorale più elevata in 11 casi accoppiati (differenza mediana tra tumore e normale = 3,13 log2[RPM + 1], Wilcoxon p = 0,0029). Questi risultati sono rimasti discordanti con il risultato locale ottenuto con qRT-PCR su campioni appaiati, che indicava una ridotta espressione della forma matura di miR-192-5p nei tessuti del carcinoma del colon-retto (CRC) (Figura 2).
Prestazioni diagnostiche e associazioni clinicopatologiche
L'analisi ROC basata su TCGA è stata ripetuta utilizzando la definizione di discriminazione tra campioni tumorali e normali descritta in precedenza (Figura 3). L'AUC è risultata pari a 0,968 per il coorte combinato COADREAD, 0,947 per COAD da solo e 0,994 per READ da solo. Un ulteriore campionamento bilanciato ha prodotto AUC medie di 0,983 per COADREAD, 0,984 per COAD e 1,000 per READ; tuttavia, gli intervalli di confidenza al 95% erano ampi per COADREAD (0,868–1,000) e COAD (0,781–1,000), e READ includeva soltanto tre campioni normali. L'analisi leave-one-out sui campioni normali ha inoltre mostrato che la stima ROC era sensibile alla ridotta dimensione del gruppo normale. Pertanto, il risultato ROC è stato mantenuto soltanto come evidenza esplorativa della separazione tra tumore e tessuto normale, non come prova sufficiente per un biomarcatore diagnostico clinico. L'analisi delle associazioni clinicopatologiche basata sull'espressione mediana di miR-192 in TCGA ha mostrato associazioni significative con lo stadio N (p = 0,019) e con l'età (p = 0,004), mentre lo stadio T (p = 0,110) e lo stadio M (p = 0,932) non sono risultati significativi (Tabella 1).
Analisi della sopravvivenza
L'analisi della sopravvivenza complessiva non ha evidenziato un'associazione prognostica significativa per l'espressione di miR-192 del TCGA nel carcinoma del colon-retto (CRC) (Figura 3). Nel coorte combinato COADREAD, il confronto di Kaplan-Meier con cutoff mediano non è risultato significativo (log-rank p = 0.857) e la regressione di Cox univariata non ha mostrato alcuna associazione significativa (HR = 0.934 per unità log2 di espressione, p = 0.374). La stessa conclusione è stata osservata nei sottogruppi COAD (log-rank p = 0.889; Cox p = 0.493) e READ (log-rank p = 0.807; Cox p = 0.716). Pertanto, i dati non supportano un'ipotesi solida riguardo al ruolo di miR-192 come biomarcatore prognostico nel CRC.
Geni bersaglio candidati e arricchimento funzionale
L'analisi dei geni candidati è stata eseguita integrando le previsioni di miRWalk con i geni differenzialmente espressi provenienti dai set di dati GEO GSE89076 e GSE156355. Questo screening ha identificato 93 geni candidati per le analisi successive di rete e di arricchimento (Figura 4). L'analisi delle interazioni proteiche ha mantenuto KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 e KIF5C come geni hub esplorativi (Figura 5). L'analisi di sensibilità basata su RNA-seq del TCGA ha mostrato che KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1 e CDK1 erano più elevati nel tessuto tumorale rispetto al tessuto normale, mentre PLP1, NRXN1, GRIK3 e KIF5C erano più bassi nel tessuto tumorale. L'analisi di correlazione con l'espressione di miR-192 del TCGA ha dato risultati misti: CDCA5, CCNB1 e CDK1 hanno mostrato correlazioni positive, mentre PLP1, NRXN1 e KIF5C hanno mostrato correlazioni negative. L'analisi di arricchimento ha evidenziato termini rappresentativi legati al metabolismo dei farmaci da parte del citocromo P450, al metabolismo di xenobiotici mediato dal citocromo P450, al metabolismo del retinolo, a termini correlati alla sinapsi glutammatergica e all'organizzazione della zona presinaptica (Figura 6). Questi risultati supportano la rilevanza biologica della rete di geni hub, ma non dimostrano un targeting diretto da parte di miR-192-5p.
Saggio di migrazione cellulare
Le cellule HT29 sono state trasfettate con mimici di miR-192 per valutare gli effetti funzionali dell'upregolazione di miR-192. La microscopia a fluorescenza ha confermato un trasfezione riuscita nei gruppi trasfettati con mimico di miR-192-5p e con controllo negativo (Figura 7). Nel saggio di guarigione della ferita, la velocità di migrazione delle cellule HT29 trasfettate con miR-192 è risultata inferiore rispetto a quella delle cellule HT29 non trasfettate e delle cellule trasfettate con controllo negativo sia a 24 h che a 48 h (Figura 8). A 24 h, la velocità di migrazione è stata del 9,75 +/- 2,43% nel gruppo trasfettato con miR-192 rispetto al 15,69 +/- 3,47% nel gruppo non trasfettato e al 15,45 +/- 3,92% nel gruppo con controllo negativo (P = 0,010). A 48 h, la velocità di migrazione è stata del 20,04 +/- 2,54% nel gruppo trasfettato con miR-192 rispetto al 26,84 +/- 7,65% e al 27,98 +/- 6,78% nei due gruppi di controllo, rispettivamente (P = 0,021). Questi risultati suggeriscono che l'upregolazione di miR-192 inibisce la migrazione delle cellule HT29 in vitro.
Analisi della correlazione del profilo immunitario
L'associazione tra l'espressione di miR-192 del TCGA e le firme immuno-correlate è stata rivalutata utilizzando dati di RNA-seq da tumori primari (Figura 9). Un totale di 425 campioni tumorali con dati abbinati di miRNA e RNA-seq è stato incluso nell'analisi di correlazione dei punteggi delle firme. L'espressione di miR-192 ha mostrato deboli correlazioni negative con molteplici firme di cellule immunitarie, inclusi linfociti Tfh (rho = -0.205, p = 2.15e-05), cellule dendritiche attivate (rho = -0.186, p = 0,00011), cellule Treg (rho = -0.185, p = 0,00013), cellule dendritiche plasmacitoidi (rho = -0.169, p = 0,00046), macrofagi (rho = -0.149, p = 0,0020), cellule Tcm (rho = -0.136, p = 0,0050), cellule NK CD56bright (rho = -0.132, p = 0,0065) e cellule Tem (rho = -0.129, p = 0,0078). Sono state osservate deboli correlazioni positive per le firme di eosinofili (rho = 0,139, p = 0,0040) e di cellule Th17 (rho = 0,121, p = 0,0129). Pertanto, l'associazione immunitaria di miR-192 nel carcinoma colorettale appare eterogenea e non dovrebbe essere descritta come uniformemente positiva in tutti gli infiltrati immunitari.
Disponibilità dei dati
I set di dati pubblici analizzati in questo studio sono disponibili tramite il portale GDC/TCGA e il database Gene Expression Omnibus (GEO) con i numeri di accessione GSE89076 e GSE156355. Le analisi e rianalisi in silico generate durante questo studio sono fornite nella Tabella Supplementare 1. I dati sperimentali di base a supporto delle analisi di qRT-PCR e guarigione delle ferite, inclusi i valori Ct grezzi della qRT-PCR, le misurazioni della larghezza della ferita, le immagini originali di microscopia e i dati sperimentali correlati, sono forniti nella Cartella Supplementare 1.
Figura 1: Panoramica dell'espressione di miR-192 in diversi tipi di cancro nel TCGA. L'asse x mostra le abbreviazioni dei tumori, e l'asse y mostra l'espressione relativa di miR-192. Il blu indica tessuto normale, e il rosso indica tessuto tumorale. La significatività statistica è indicata come segue: * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001; NS = non significativo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Espressione di miR-192/miR-192-5p nei dataset di CRC e nei tessuti accoppiati. (A) Analisi miRNA-seq di TCGA/GDC che mostra un segnale hsa-mir-192 a livello del database più elevato nei campioni tumorali di CRC rispetto ai campioni normali. (B) Analisi qRT-PCR di campioni di tessuto locale accoppiati che mostra un'espressione più bassa del miR-192-5p maturo nei tessuti di CRC rispetto ai tessuti adiacenti non cancerosi. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Analisi diagnostiche esplorative e analisi di sopravvivenza basate sull'espressione di hsa-mir-192 nel TCGA. (A–C) Curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier. L'analisi della sopravvivenza non ha evidenziato un'associazione prognostica significativa. (D) Curva ROC per la discriminazione tra tumore e tessuto normale nel coorte TCGA. L'AUC va interpretata con cautela a causa del ridotto numero di campioni normali. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi del set di geni bersaglio candidati e analisi delle interazioni proteiche. (A) Diagramma di Venn che mostra l'intersezione tra le previsioni di geni bersaglio per miRNA e i geni differenzialmente espressi provenienti da GSE89076 e GSE156355. (B) Rete di interazione proteina-proteina dei 93 geni candidati. I nodi rappresentano geni, mentre i collegamenti rappresentano associazioni geniche previste o curate. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Selezione dei geni hub dalla rete di bersagli candidati. (A,B) Moduli della rete identificati mediante l'analisi dei moduli. (C) Classificazione dei geni hub in base alla connettività della rete. (D) I bersagli hub candidati vengono mantenuti dopo l'integrazione dell'analisi basata sui moduli e sul grado di connettività. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Termini di arricchimento GO e KEGG selezionati per i geni candidati e i moduli della rete significativi. Il grafico a bolle riassume le funzioni biologiche e i percorsi rappresentativi arricchiti. I risultati dell'arricchimento sono esplorativi e richiedono una validazione sperimentale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Immagini di trasfezione delle cellule HT29. (A) Cellule HT29 rappresentative. (B) Immagine a fluorescenza di cellule HT29 trasfettate con il mimico di miR-192-5p. (C) Immagine a fluorescenza di cellule HT29 trasfettate con il controllo negativo con238. Barra della scala = 100 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Saggio di guarigione della ferita in cellule HT29. (A) Immagini rappresentative delle incisioni a 0 h, 24 h e 48 h in cellule HT29 non trasfettate, cellule HT29 trasfettate con mimico di miR-192-5p e cellule HT29 trasfettate con con238. (B) Quantificazione dei tassi di guarigione della ferita a 24 h e 48 h, espressi come percentuali. Barra della scala = 100 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: Correlazione tra l'espressione di miR-192 nel TCGA e i punteggi delle firme immuno-correlate nei campioni tumorali di CRC. L'analisi ha mostrato associazioni immunitarie eterogenee, con diverse deboli correlazioni negative e, principalmente per le firme di eosinofili e cellule Th17, correlazioni positive. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Caratteristiche | Bassa espressione di TCGA miR-192 | Alta espressione di TCGA miR-192 | Valore p | Metodo |
| n | 308 | 308 | ||
| Stadio T, n (%) | 0,11 | Chisq.test | ||
| T1 | 9 (1,5%) | 11 (1,8%) | ||
| T2 | 44 (7,2%) | 59 (9,6%) | ||
| T3 | 209 (34,1%) | 211 (34,4%) | ||
| T4 | 43 (7%) | 27 (4,4%) | ||
| Stadio N, n (%) | 0,019 | Chisq.test | ||
| N0 | 156 (25,5%) | 190 (31%) | ||
| N1 | 88 (14,4%) | 63 (10,3%) | ||
| N2 | 61 (10%) | 54 (8,8%) | ||
| Stadio M, n (%) | 0,932 | Chisq.test | ||
| M0 | 214 (39,9%) | 234 (43,7%) | ||
| M1 | 41 (7,6%) | 47 (8,8%) | ||
| Età, mediana (IQR) | 66 (56, 75) | 69 (60, 77) | 0,004 | Wilcoxon |
Tabella 1: Associazione tra i gruppi di espressione di miR-192 del TCGA e le caratteristiche clinicopatologiche nel CRC. I gruppi ad alta e bassa espressione sono stati definiti in base al livello mediano di espressione di miR-192 del TCGA. Nella tabella riassuntiva, lo stadio N e l'età erano significativi, mentre lo stadio T e lo stadio M non erano significativi.
Tabella supplementare 1: Risultati del reanalisi bioinformatica generati per questo studio. La cartella di lavoro include confronti dell'espressione da TCGA/GDC, analisi di sensibilità ROC bilanciate, analisi leave-one-normal-out, analisi di associazione clinicopatologica, analisi di sopravvivenza, riepiloghi dell'espressione e correlazione dei geni hub e risultati di correlazione delle firme immunitarie.Cliccare qui per scaricare il file.
Cartella supplementare 1: Dati sperimentali grezzi a supporto degli esperimenti di qRT-PCR, trasfezione cellulare e guarigione della ferita. Questi file includono i valori originali di Ct della qRT-PCR, dati di citometria a flusso/trasfezione, misurazioni della larghezza della ferita e immagini rappresentative al microscopio utilizzate per le analisi presentate nel manoscritto.Cliccare qui per scaricare questo file.
Discussione
Questo studio ha valutato la rilevanza clinica e biologica di miR-192-5p nel CRC combinando l'analisi di dataset pubblici, la validazione su tessuti locali, la previsione di reti bersaglio, l'analisi delle firme immunitarie e esperimenti in vitro di migrazione. Le analisi hanno utilizzato definizioni di campioni TCGA verificate, separando COAD e READ quando possibile, impiegando valori di miRNA in log2(RPM + 1), distinguendo confronti appaiati da quelli non appaiati, verificando la robustezza della curva ROC e aggiungendo analisi di sensibilità dell'RNA-seq per i geni centrali. Il risultato principale è che il segnale di miR-192 pubblico proveniente da TCGA/GDC e il risultato locale di qRT-PCR per la forma matura di miR-192-5p indicano direzioni opposte di espressione, sottolineando la necessità di distinguere annotazioni di precursori a livello di database dalle misurazioni delle miRNA mature9,11.
Questa discordanza non dovrebbe essere spiegata esclusivamente da dimensioni campionarie non equivalenti. Il gruppo normale di TCGA era di piccole dimensioni, ma analisi indipendenti, appaiate, solo COAD e solo READ hanno tutte mostrato la stessa direzione di aumento nel tumore in TCGA/GDC. Diversi fattori potrebbero contribuire, tra cui differenze nella fonte del campione, piattaforme di sequenziamento rispetto a qRT-PCR, annotazione a livello del database di hsa-mir-192 rispetto alla misurazione della forma matura hsa-miR-192-5p, processamento dell'RNA, purezza del tumore, definizione del tessuto adiacente e caratteristiche della popolazione. Preoccupazioni simili riguardo all'interpretazione dei biomarcatori e all'eterogeneità tumorale sono state sottolineate in studi sul carcinoma del colon-retto (CRC)5,6,7,8. Pertanto, i risultati supportano un'interpretazione del miR-192-5p nel CRC dipendente dal contesto e dalla piattaforma, piuttosto che una singola direzione universale di espressione.
Anche l'analisi diagnostica dovrebbe essere interpretata con cautela. Sebbene l'analisi ROC basata su TCGA abbia prodotto un valore AUC elevato, il confronto includeva molte più campioni tumorali che campioni normali, con soli 11 campioni normali nel coorte combinato COADREAD. Il ricampionamento bilanciato ha comunque mostrato valori mediani di AUC elevati, ma gli intervalli erano ampi perché ogni confronto bilanciato era limitato dal piccolo gruppo di campioni normali. Pertanto, il risultato dell'ROC supporta una separazione esplorativa tra tumore e tessuto normale all'interno di TCGA/GDC, ma non è sufficiente per stabilire miR-192-5p come biomarcatore diagnostico clinico. Questa interpretazione è coerente con la distinzione generale tra segnali di biomarcatori esplorativi e biomarcatori diagnostici o prognostici clinicamente validati4,8.
L'analisi della sopravvivenza non ha mostrato un'associazione significativa tra l'espressione di miR-192 e la sopravvivenza complessiva in COADREAD, COAD o READ. Nell'analisi attuale, miR-192 potrebbe essere associato a determinate variabili clinicopatologiche, ma i dati disponibili non supportano una conclusione solida riguardo al suo ruolo come biomarcatore prognostico. Tale distinzione è importante perché i biomarcatori prognostici richiedono prove che lo stato del marcatore sia associato all'esito in modo indipendente e riproducibile in contesti clinicamente rilevanti8.
Il saggio in vitro di guarigione della ferita fornisce evidenze funzionali che l'upregolazione di miR-192 può ridurre la migrazione delle cellule HT29. Questo risultato è coerente con una potenziale funzione soppressiva del tumore nelle cellule CRC e con la direzione locale del qRT-PCR. Studi precedenti hanno inoltre supportato ruoli per le miRNA, inclusi i percorsi correlati a miR-192, nella regolazione della transizione epitelio-mesenchimale, del destino cellulare e dei fenotipi legati alla migrazione15,16,17. Tuttavia, i dati funzionali rimangono incompleti. Sarebbe necessaria un'ulteriore validazione in laboratorio per sostenere un modello meccanicistico di soppressore tumorale, inclusa la ripetizione delle trasfezioni in almeno una ulteriore linea cellulare CRC, controlli della proliferazione per i saggi di guarigione della ferita, saggi di migrazione/invasione in Transwell, validazione con dual-luciferase dei bersagli selezionati, misurazioni dell'mRNA e delle proteine bersaglio e esperimenti di recupero.
L'analisi dei geni hub deve essere considerata generatrice di ipotesi. Il completamento con dati RNA-seq del TCGA ha mostrato forti differenze di espressione tra tumore e tessuto normale per i geni hub conservati, ma le loro correlazioni con miR-192 erano discordanti. Diversi geni coinvolti nel ciclo cellulare, tra cui CDCA5, CCNB1 e CDK1, presentavano una correlazione positiva piuttosto che negativa con miR-192, risultato non compatibile con un semplice modello di repressione diretta miRNA-target. Al contrario, PLP1, NRXN1 e KIF5C mostravano correlazioni negative. Questi risultati sostengono la rilevanza biologica della rete, ma indicano che non è possibile affermare un targeting diretto senza validazione mediante saggi di luciferasi, analisi a livello proteico e esperimenti di recupero fenotipico. Questa interpretazione cauta è coerente con la natura esplorativa delle analisi in silico delle reti di target10,11.
L'analisi immunologica supporta ulteriormente un'interpretazione cauta. I punteggi delle firme immunitarie ottenuti da RNA-seq del tumore hanno mostrato che l'espressione di miR-192 era negativamente correlata con diverse firme immunitarie e positivamente correlata principalmente con le firme degli eosinofili e delle cellule Th17. La maggior parte delle correlazioni era debole, anche dopo la correzione per il tasso di falsa scoperta. Poiché i metodi basati sulle firme immunitarie inferiscono l'arricchimento di percorsi o stati cellulari a partire da dati di espressione bulk, questi risultati devono essere considerati esplorativi e richiedono una validazione mediante approcci ortogonali di caratterizzazione immunitaria13.
Questo studio presenta diversi limiti. In primo luogo, il gruppo di validazione locale era relativamente piccolo e proveniva da un singolo centro. In secondo luogo, l'analisi del dataset pubblico e la validazione locale mediante qRT-PCR hanno utilizzato piattaforme e livelli di misurazione diversi. In terzo luogo, i campioni normali di sequenziamento dell'RNA interferente (miRNA-seq) del TCGA erano pochi, il che ha limitato l'inferenza diagnostica. In quarto luogo, le analisi sui geni centrali (hub-gene) e sul sistema immunitario sono state di tipo computazionale e richiedono una validazione sperimentale. In quinto luogo, gli esperimenti funzionali disponibili si sono limitati ai dati sulla guarigione della ferita nella linea cellulare HT29. Questi limiti giustificano la presentazione dello studio come un'analisi esplorativa integrata piuttosto che come prova definitiva che miR-192-5p sia un biomarcatore diagnostico, prognostico o meccanicistico validato nel carcinoma del colon-retto (CRC)6,8.
In sintesi, miR-192-5p sembra essere biologicamente rilevante per il CRC, ma il suo profilo di espressione e l'interpretazione clinica sono complessi. L'analisi TCGA/GDC ha mostrato un segnale più elevato di miR-192 nei campioni tumorali del CRC, mentre la qRT-PCR effettuata su una coorte locale di tessuti accoppiati ha evidenziato una minore espressione della forma matura di miR-192-5p. L'analisi ROC ha indicato una separazione esplorativa tra tumore e tessuto normale, ma è stata limitata dalla ridotta dimensione del gruppo di campioni normali di TCGA. Non è stata osservata alcuna associazione significativa con la sopravvivenza globale. Le analisi sui geni hub e sul sistema immunitario forniscono dati utili a formulare ipotesi, mentre i risultati del test di guarigione della ferita condotto su cellule HT29 suggeriscono che un aumento dell'espressione di miR-192-5p potrebbe ridurre la migrazione cellulare. Sono necessarie ulteriori coorti indipendenti ed esperimenti mirati in laboratorio prima che miR-192-5p possa essere considerato un biomarcatore diagnostico, prognostico o meccanicistico validato nel CRC.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Laboratorio di Diagnostica Molecolare del Tumore dell'Università Medica della Mongolia Interna per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto di Ricerca Scientifica della Commissione Sanitaria Municipale di Yancheng (Grant No. YK2023101), che ha inoltre finanziato il costo di elaborazione dell'articolo.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| tripsina-EDTA 0,25%+2:60 | Biological Industries | 03-054-1 | Digestione/pasaggio cellulare |
| Persolfato di ammonio al 10% | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | A8090 | Reagente per SDS-PAGE |
| Lauryl solfato di sodio al 10% | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | SIS1070 | Reagente per SDS-PAGE |
| Buffer di caricamento proteico 4x | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | P1016 | Preparazione del campione proteico |
| Congelatore ultrafreddo a -80 °C | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | Conservazione dei campioni |
| Reagente per l'eliminazione di Mycoplasma Anti-Myc | Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | P-CMR-001 | Decontaminazione da micoplasmi |
| Set di primer per ARL2, BATF2, MEN1 e beta-actina | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Cina | Sintetizzati su misura | Primer per qPCR dell'mRNA |
| Lettore automatico per micropiastre | PerkinElmer, USA | VICTOR Nivo | Misurazione dell'assorbanza |
| Kit per saggio proteico BCA | Thermo Fisher Scientific | 23225 | Quantificazione proteica |
| Cappa di sicurezza biologica / bancone sterile | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | Coltura cellulare asettica |
| Camera per il conteggio cellulare / emocitometro | Shanghai Qiujing Biochemical Reagent Instrument Co., Ltd. | http://www.shqiujing.net/ | Conteggio cellulare |
| Kit per il conteggio cellulare-8 (CCK-8) | Biosharp | BS350B | Saggio di proliferazione cellulare/tossicità |
| Flaconi per coltura cellulare, piastre, provette da centrifuga e punte per pipetta | Corning | https://www.corning.com/in/en.html | Consumabili generici per coltura cellulare |
| Kit per rilevamento del ciclo cellulare e dell'apoptosi | Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, Cina | https://www.chemicalbook.com/ShowSupplierProductsList13366/0_EN.htm | Analisi citofluorimetrica del ciclo cellulare/apoptosi |
| Incubatore cellulare a CO2 | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | Coltura cellulare |
| Oligonucleotide controllo negativo con238 | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Cina | Sintetizzato su misura | Controllo di trasfezione |
| Software Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | Visualizzazione di moduli di rete e geni hub |
| Agitatore magnetico termostatico digitale | Changzhou Saipu Experimental Instrument Factory | https://czxtyq.en.alibaba.com/ | Preparazione delle soluzioni |
| Forno elettrico termostatico a circolazione d'aria | Nanjing Wohuan Technology Industry Co., Ltd. | https://www.wtsensor.com/about-wt/aboutwt/ | Supporto per essiccazione/sterilizzazione |
| Sistema di elettroforesi | Bio-Rad Laboratories | Mini-PROTEAN 3 Cell | Elettroforesi su gel |
| Sistema di elettrotrasferimento | Hoefer | TE77XP | Trasferimento proteico |
| Siero fetale bovino | Biological Industries | 04-001-1ACS | Supplemento per coltura cellulare |
| Citometro a flusso | ACEA Biosciences | NovoCyte | Citometria a flusso |
| Microscopio invertito a fluorescenza | Ningbo Sunny Instruments Co., Ltd. | https://www.sunny-instrument.com/en | Immagini cellulari e di ferite |
| Portale GDC/TCGA | National Cancer Institute | Database ad accesso aperto | Dati pubblici di sequenziamento di miRNA, RNA e dati clinici |
| Database GEO | National Center for Biotechnology Information | GSE89076 e GSE156355 | Dataset pubblici di espressione genica |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Versione 9 | Analisi statistica e creazione di grafici |
| Centrifuga refrigerata ad alta velocità | Shanghai Huxiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | https://www.bioridgecentrifuge.com/ | Preparazione del campione |
| Cellule HT29 | Banca cellulare del laboratorio degli autori | Non applicabile | Linea cellulare di cancro colorettale umano |
| Software di analisi delle immagini | ImageJ | Non applicabile | Quantificazione della larghezza della ferita |
| Sistema di imaging | Tanon Science & Technology Co., Ltd. | Tanon-5200 | Imaging di gel/blot |
| Sistema di osservazione cellulare dinamica e analisi funzionale IncuCyte S3 | Beijing Sensi Wantong Technology Co., Ltd. | IncuCyte S3 | Imaging e analisi funzionale di cellule vive |
| Bagno termostatico intelligente | Leica | HI1210 | Incubazione controllata in temperatura |
| Lentivirus e reagente per infezione | Shanghai GeneChem Co., Ltd. | https://synapse.patsnap.com/organization/04ffbf33ff2a6311226a8fa05498cec4 | Trasduzione cellulare stabile |
| Pipette manuali | Gilson | PIPETMAN P | Manipolazione di liquidi |
| Mezzo basale McCoy's 5A | Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | PM150710 | Mezzo di coltura per cellule HT29 |
| Centrifuga medica | Produttore di Zhuhai non specificato | 3200 | Preparazione del campione |
| Frigorifero-congelatore medico | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | Conservazione di reagenti/campioni |
| Substrato chemiluminescente ECL supersensibile Meilunbio Fixer | Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, Cina | MA0186 | Rilevamento immunoblot |
| Mini centrifuga | Beijing DLAB Scientific Co., Ltd. | https://www.dlabsci.com/ | Preparazione del campione |
| Set di primer per miR-192-5p e U6 | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Pechino, Cina | Sintetizzati su misura | Primer per qPCR di miRNA |
| mimico di miR-192-5p | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Cina | Sintetizzato su misura | Oligonucleotide per trasfezione transitoria |
| Kit per la sintesi del primo filamento di cDNA per miRNA amplificato miRcute | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Pechino, Cina | KR211 | Trascrizione inversa di miRNA |
| Kit di quantificazione fluorimetrica per miRNA miRcute Enhanced (SYBR Green FP) | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Pechino, Cina | FP411 | qPCR per miRNA |
| miRWalk | Database pubblico | Database web | Database di previsione di target per miRNA |
| Membrana di nitrocellulosa | Millipore | HATF00010 | Membrana per trasferimento proteico |
| Latte in polvere scremato | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | D8340 | Reagente bloccante per immunoblot |
| Tessuti accoppiati di cancro colorettale e tessuti non tumorali adiacenti | Istituzione degli autori | Non applicabile | Campioni clinici |
| Provette per PCR | Corning | PCR-02-C | Impostazione PCR/qRT-PCR |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | Biological Industries | 03-031-1B | Antibiotico per coltura cellulare |
| Kit PerfectStart Uni RT&qPCR | TransGen Biotech Co., Ltd., Pechino, Cina | AUQ-01 | Trascrizione inversa dell'mRNA e qPCR |
| Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | Tampone per lavaggio cellulare |
| Marcatore proteico precolorato | Fermentas | 26619 | Marcatore del peso molecolare proteico |
| Sistema di preparazione di acqua pura | China Moer | Non disponibile | Preparazione di acqua pura |
| Puromicina | Phygene | PH1143 | Selezione di cellule trasdotte |
| Software R | R Foundation for Statistical Computing | Versione 3.6.3 | Analisi statistica e bioinformatica |
| Buffer di trasferimento rapido | Crisbio | Non applicabile | Elettrotrasferimento proteico |
| Sistema di PCR quantitativa in tempo reale con fluorescenza | Applied Biosystems (ABI), USA | Non disponibile | Rilevamento qRT-PCR |
| Buffer di lisi RIPA | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | R0020 | Estrazione proteica |
| Microprovette da centrifuga senza RNasi | Corning | 3208 | Manipolazione dell'RNA |
| Mezzo di criopreservazione cellulare senza siero | New Cell & Molecular Biotech Co., Ltd. | C40100 | Criopreservazione cellulare |
| SPSS Statistics | IBM | Versione 25 | Analisi statistica |
| Diluente stabilizzato per anticorpi | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | Non applicabile | Diluizione di anticorpi primari/secondari |
| Punte per pipetta sterili | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | TP-10-C | Strumento per graffi di guarigione delle ferite |
| Database STRING | STRING Consortium | Database web | Analisi di reti di interazione proteica |
| TEMED | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T8090 | Reagente per SDS-PAGE |
| TransZol Up | TransGen Biotech Co., Ltd., Pechino, Cina | ET111-01 | Estrazione dell'RNA |
| Tampone Tris-HCl, pH 6,8 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1020 | Tampone per gel di raccordo SDS-PAGE |
| Tampone Tris-HCl, pH 8,8 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1010 | Tampone per gel di risoluzione SDS-PAGE |
| Tween-20 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T8220 | Reagente per lavaggio immunoblot |
| Sterilizzatore verticale a vapore sotto pressione | Shanghai Boxun Medical Biological Instrument Corp. | BXM-30R | Sterilizzazione |
Riferimenti
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