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Articolo di ricerca
Questo studio retrospettivo caso-controllo ha valutato il miR-146a, il miR-642a, il miR-2861 sierico e i marcatori metabolici in donne con sindrome dell'ovaio policistico. Sono state osservate alterazioni coordinate nei miRNA, adipochine, resistenza all'insulina, infiammazione e testosterone, mentre un modello combinato di biomarcatori ha mostrato prestazioni discriminatorie superiori rispetto ai singoli marcatori.
La sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) è un disturbo endocrino e metabolico comune nelle donne in età riproduttiva, ma le relazioni tra microRNA circolanti (miRNA) e proteine correlate alla nutrizione non sono ancora completamente comprese. Questo studio ha indagato le associazioni tra miR-146a, miR-642a e miR-2861 sierici e i marcatori metabolici e infiammatori nella PCOS. Lo studio ha incluso 62 donne con PCOS e 71 controlli sani. I livelli sierici di miR-146a, miR-642a e miR-2861 sono stati misurati mediante PCR quantitativa in tempo reale, mentre sono stati valutati anche adiponectina (ADPN), leptina (LEP), proteina legante il retinolo 4 (RBP4), indice HOMA per la resistenza all'insulina (HOMA-IR), interleuchina-6 (IL-6) e testosterone (T). La validazione metodologica ha valutato le condizioni di lavorazione dei campioni, la precisione del saggio e l'accordo tra metodi analitici. Rispetto ai controlli, le donne con PCOS hanno mostrato un'espressione aumentata di miR-146a e una riduzione dell'espressione di miR-642a e miR-2861. I livelli di ADPN erano ridotti, mentre quelli di LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 e T erano elevati. MiR-146a era correlato negativamente con ADPN e positivamente con LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 e T. MiR-642a era correlato negativamente con RBP4, HOMA-IR e IL-6, mentre miR-2861 era correlato positivamente con ADPN. La validazione metodologica ha mostrato una stabilità accettabile del saggio, una buona precisione e accordo tra i metodi. Il modello che combina i tre miRNA con ADPN, LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 e T ha raggiunto un'area sotto la curva di 0,929, con una sensibilità del 82,26% e una specificità del 94,37%. Questi risultati dimostrano alterazioni coordinate nei miRNA circolanti e nei marcatori metabolici nella PCOS e supportano ulteriori valutazioni del loro potenziale diagnostico combinato.
La sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) è il disturbo endocrino e metabolico più comune nelle donne in età riproduttiva. Si stima che la sua prevalenza globale vari dal 6% al 20%. Circa il 70% delle donne affette presenta resistenza all'insulina e oltre la metà è in sovrappeso o obese1. La PCOS può portare a disfunzione ovulatoria, infertilità, diabete di tipo 2, malattie cardiovascolari e altre complicanze a lungo termine, compromettendo gravemente la salute riproduttiva e la qualità della vita2. Sebbene la sua patogenesi non sia stata completamente chiarita, generalmente si ritiene che la PCOS coinvolga fattori multipli, tra cui suscettibilità genetica, infiammazione cronica di basso grado, anomalie nelle vie di segnalazione dell'insulina e alterazioni del microambiente ovarico locale. In questo contesto, l'identificazione di marcatori molecolari specifici in grado di riflettere l'evoluzione della malattia riveste un chiaro valore per la diagnosi precoce e un intervento mirato nella PCOS3,4.
Gli miRNA sono una classe di RNA non codificanti di circa 22 nucleotidi di lunghezza. Queste molecole regolano l'espressione genica a livello post-trascrizionale promuovendo la degradazione dell'mRNA o inibendo la traduzione. Pertanto, queste molecole sono cruciali per numerosi processi cellulari, tra cui la crescita cellulare, la differenziazione, le risposte all'infiammazione e la regolazione del metabolismo5,6. Studi precedenti hanno evidenziato una disregolazione caratteristica di miR-146a, miR-642a e miR-2861 nel siero di pazienti con PCOS. L'upregolazione di miR-146a potrebbe mediare risposte infiammatorie croniche attraverso la regolazione mirata della via TLR4/NF-κB7, mentre la ridotta espressione di miR-642a e miR-2861 è stata strettamente associata all'insulino-resistenza e al deterioramento della funzione delle cellule della granulosa ovarica8,9. ADPN, LEP e RBP4, proteine legate alla nutrizione, svolgono un ruolo fondamentale nel regolare l'equilibrio metabolico. Le variazioni nei loro livelli possono influenzare direttamente il metabolismo dei lipidi, la sensibilità all'insulina e lo stato infiammatorio. Questo aspetto è considerato una componente chiave della base molecolare dei disturbi metabolici osservati nel PCOS10,11. Tuttavia, la maggior parte degli studi pubblicati ha analizzato separatamente gli miRNA o le proteine legate alla nutrizione in relazione al PCOS12,13, e la relazione molecolare tra questi due fattori non è ancora stata chiarita in modo sistematico.
In questo studio, abbiamo misurato i livelli di espressione di tre miRNA e sei biomarcatori principali in pazienti con PCOS, analizzato le correlazioni tra questi marcatori e le loro associazioni con indici biochimici clinici, ed esplorato ulteriormente se gli miRNA possano partecipare al processo patologico del PCOS attraverso associazioni con proteine legate alla nutrizione. I risultati di questo studio potrebbero arricchire la comprensione attuale delle basi molecolari del PCOS, fornire potenziali bersagli per terapie mirate alla regolazione nutrizionale e metabolica, e offrire evidenze di laboratorio per lo screening precoce, il monitoraggio dell'efficacia e la gestione personalizzata del PCOS.
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Dichiarazione di etica
Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal Comitato di Etica Medica dell'Ospedale di Medicina Tradizionale Cinese di Ganzhou (numero di approvazione: GZSZYYKYLL20240092, Data: 2024-12-20).
Tutti i materiali, reagenti, kit per saggi e l'equipaggiamento utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.
Disegno dello studio
Questo studio caso-controllo retrospettivo ha incluso 62 pazienti con PCOS diagnosticate presso l'ambulatorio di ginecologia dell'Ospedale di Medicina Tradizionale Cinese di Ganzhou tra giugno 2024 e agosto 2025 e 71 donne sane in età riproduttiva esaminate presso il centro di gestione della salute dell'ospedale nello stesso periodo. I controlli sono stati selezionati per ottenere una comparabilità tra i gruppi a livello di età; il BMI non è stato utilizzato come variabile di abbinamento ed è stato valutato come caratteristica basale.
Soggetti dello studio
Criteri di inclusione: I criteri di inclusione per il gruppo con PCOS erano i seguenti: (1) età >18 anni; (2) diagnosi di PCOS secondo i criteri di Rotterdam modificati raccomandati dalla linea guida internazionale basata su evidenze del 2023, che richiedono almeno due delle seguenti tre caratteristiche dopo l'esclusione di disturbi correlati: oligo-ovulazione o anovulazione, definite come cicli mestruali più lunghi di 35 giorni o meno di otto cicli all'anno; iperandrogenismo clinico e/o iperandrogenismo biochimico, con iperandrogenismo biochimico definito come concentrazione sierica di testosterone totale superiore al limite superiore di riferimento specifico per il saggio; e morfologia ovarica policistica, definita come almeno 20 follicoli in un'ovaia o un volume ovarico di almeno 10 mL quando non era possibile effettuare un conteggio completo dei follicoli14; (3) cartelle cliniche elettroniche complete; (4) assenza di terapia sostitutiva ormonale, agenti ipoglicemizzanti o immunosoppressori nei precedenti 3 mesi; e (5) disponibilità di un campione sierico a digiuno raccolto al momento dell'arruolamento e conservato nella biobanca istituzionale.
I criteri di inclusione per il gruppo di controllo erano i seguenti: (1) aver partecipato a un esame sanitario nello stesso periodo; (2) cicli mestruali regolari; (3) morfologia ovarica normale all'ecografia transvaginale; (4) assenza di anamnesi di disturbi endocrini, malattie ginecologiche, infertilità o disfunzioni epatiche o renali clinicamente significative; e (5) disponibilità di un campione di siero a digiuno raccolto il giorno dell'esame e conservato nella biobanca istituzionale.
I criteri di esclusione erano i seguenti: (1) endometriosi, fibromi uterini, tumori ovarici, malattia infiammatoria pelvica o altri disturbi ginecologici; (2) disfunzione tiroidea, sindrome di Cushing, iperprolattinemia, iperplasia surrenale congenita, o altri disturbi endocrini che potessero spiegare una disfunzione ovulatoria o iperandrogenismo; (3) disfunzione grave cardiaca, epatica, renale o polmonare, tumori maligni, malattie autoimmuni o disturbi ematologici; (4) gravidanza, parto o aborto nei precedenti 6 mesi; (5) uso di glucocorticoidi, contraccettivi orali o altri farmaci che influenzano il metabolismo di glucidi o lipidi nei precedenti 3 mesi; (6) disturbi psichiatrici o alterazioni cognitive; (7) mancanza di informazioni cliniche fondamentali; e (8) emolisi grave del siero, definita come una concentrazione di emoglobina >2,0 g/L, lipemia, ittero, più di un ciclo di congelamento-scongelamento o interruzione dello stoccaggio del campione. La disfunzione tiroidea, l'iperprolattinemia e l'iperplasia surrenale congenita non classica sono state escluse mediante la misurazione dell'ormone stimolante la tiroide, della prolattina sierica e della 17-idrossiprogesterone, rispettivamente; l'ormone follicolo-stimolante è stato valutato quando appropriato, mentre la sindrome di Cushing o un tumore surrenale sono stati indagati in base alle indicazioni cliniche. A tutti i campioni clinici è stata applicata la stessa procedura pre-analitica e nessun campione incluso nell'analisi primaria ha subito più di un ciclo di congelamento-scongelamento.
Prelievo e conservazione dei campioni di siero
Sangue venoso a digiuno (10 mL) è stato prelevato al mattino in provette senza anticoagulante, lasciato coagulare a temperatura ambiente per 30 minuti e centrifugato a 1.505 x g per 15 minuti a 4 °C. Il siero è stato suddiviso in aliquote da 200 µL e conservato a −80 °C fino all'analisi. La stessa procedura preanalitica è stata applicata a tutti i campioni clinici e nessun campione incluso nell'analisi primaria ha subito più di un ciclo di congelamento-scongelamento.
Preparazione dei campioni per la validazione del metodo
Dieci campioni di siero poolati provenienti da volontari sani sono stati utilizzati per valutare gli effetti della velocità di centrifugazione (1.505, 3.000 e 4.000 x g per 15 min), della frequenza di congelamento-scongelamento (0, 1, 3 e 5 cicli), della temperatura di conservazione (4 °C, −20 °C e −80 °C per 7 giorni), della durata della conservazione (1, 3, 6 e 12 mesi a −80 °C) e dell'emolisi (<0,1, 0,1–0,5 e 0,5–2,0 g/L di emoglobina).
Analisi di laboratorio
Tutti i saggi di laboratorio sono stati eseguiti dallo stesso tecnico esperto in condizioni ambientali standardizzate e secondo procedure operative predefinite. Gli miRNA sierici sono stati quantificati mediante qRT-PCR; ADPN, LEP e RBP4 sono stati misurati mediante saggio immunoenzimatico a sandwich (ELISA); T e IL-6 sono stati misurati mediante saggi immunochemiluminescenti; le variabili del metabolismo del glucosio sono state ottenute utilizzando metodi di laboratorio automatizzati di routine.
Quantificazione di miRNA sierici mediante qRT-PCR
L'RNA totale è stato estratto da 200 µL di siero utilizzando il reagente TRIzol. I dati sulla concentrazione di RNA e sulla purezza A260/A280 ottenuti mediante spettrofotometria non erano disponibili per i preparati di RNA sierico archiviati. L'accettabilità del saggio di qRT-PCR è stata quindi valutata in base alla presenza di un unico picco specifico nella curva di denaturazione e alla concordanza tra tre replicati tecnici. Dopo la separazione delle fasi con cloroformio, la precipitazione con isopropanolo e due lavaggi con etanolo al 75%, il pellet di RNA è stato disciolto in acqua priva di enzimi. Il sistema di reazione da 20 µL conteneva 4 µL di buffer 5x, 1 µL di trascrittasi inversa, 1 µL di primer a stem-loop (10 µM) e 5 µL di stampo di RNA. Le condizioni di reazione erano: 16 °C per 30 minuti, 42 °C per 30 minuti e 85 °C per 5 secondi. I prodotti della trascrizione inversa sono stati conservati a −20 °C. La PCR quantitativa è stata eseguita utilizzando il kit TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II. Ogni reazione da 20 µL conteneva 10 µL di miscela SYBR 2×, 0,8 µL ciascuno di primer diretto e inverso (10 µM) e 2 µL di stampo di cDNA. L'amplificazione è stata effettuata su un sistema PCR in tempo reale Applied Biosystems 7500 alle seguenti condizioni: pre-denaturazione a 95 °C per 30 secondi; 40 cicli a 95 °C per 5 secondi e 60 °C per 30 secondi; successivamente è stata eseguita l'analisi della curva di denaturazione per confermare la specificità dell'amplificazione. L'RNA snU6 è stato utilizzato come gene di riferimento interno e i livelli di espressione relativi di miR-146a, miR-642a e miR-2861 sono stati calcolati con il metodo 2-ΔΔCt. Ogni campione è stato analizzato in triplice replicato. Le sequenze di tutti i primer utilizzati in questo studio sono elencate in Tabella 1.
Rilevamento dei marcatori proteici nel siero
Le concentrazioni di ADPN, LEP e RBP4 nel siero sono state misurate mediante saggio ELISA a sandwich con doppio anticorpo utilizzando rispettivamente il Human Total ADPN/Acrp30 Quantikine ELISA Kit (sensibilità analitica, 0,891 ng/mL; intervallo del saggio, 3,9–250 ng/mL), il Human Leptin Quantikine ELISA Kit (sensibilità analitica, 7,8 pg/mL; intervallo del saggio, 15,6–1.000 pg/mL) e il Human RBP4 Quantikine ELISA Kit (sensibilità analitica, 0,628 ng/mL; intervallo del saggio, 1,56–100 ng/mL). Ogni saggio era specifico per l'analita umano corrispondente e i campioni di siero sono stati diluiti secondo le istruzioni del produttore. L'assorbanza è stata misurata a 450 nm e le concentrazioni sono state calcolate utilizzando curve standard logistiche a quattro parametri. I coefficienti di variazione intra-saggio o inter-saggio erano del 2,5% o del 3,2% per ADPN, del 2,7% o del 3,4% per LEP e del 2,6% o del 3,3% per RBP4.
Misurazione della T
La T sierica è stata misurata mediante saggio immunoenzimatico con chemiluminescenza elettrochimica utilizzando un analizzatore immunoenzimatico automatizzato Roche Cobas e601.
Misure del metabolismo glucidico e infiammatorie
I valori di glucosio plasmatico a digiuno, insulina a digiuno e HbA1c sono stati ottenuti da referti di laboratorio clinico di routine dello stesso giorno, piuttosto che dagli aliquote di siero conservate utilizzate per i saggi di miRNA e proteine metaboliche. Il glucosio plasmatico a digiuno è stato misurato mediante il metodo dell'ossidasi del glucosio, l'insulina a digiuno mediante immunoturbidimetria e l'HbA1c mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni. L'HOMA-IR è stato calcolato come [glucosio plasmatico a digiuno (mmol/L) × insulina a digiuno (mIU/L)]/22,5. L'IL-6 sierica è stata misurata mediante saggio immunochemiluminescente.
Validazione metodologica
I confronti con metodi alternativi sono stati effettuati per determinare se le misurazioni principali fossero robuste rispetto alla piattaforma del saggio e non sono stati utilizzati per generare i principali risultati tra i gruppi. I livelli di espressione dei tre miRNA e dei cinque marcatori biochimici sono stati misurati nelle diverse condizioni di lavorazione descritte in precedenza, e il coefficiente di variazione per ciascun indicatore è stato calcolato come CV = (deviazione standard/valore medio) × 100%. Un CV <Il valore del 15% è stato considerato accettabile per la valutazione della stabilità dei risultati del saggio in diverse condizioni di lavorazione e conservazione dei campioni. La precisione all'interno dello stesso giorno è stata valutata mediante 10 ripetizioni della misurazione dello stesso campione di siero pool in un singolo giorno, mentre la precisione tra giorni è stata determinata mediante misurazioni effettuate una volta al giorno per cinque giorni consecutivi. Per ciascun indicatore, sono stati calcolati la media, la deviazione standard e il relativo coefficiente di variazione (CV). Per il test di concordanza analitica, cinque analiti biochimici—ADPN, LEP, RBP4, IL-6 e T—sono stati misurati nei campioni di validazione utilizzando il saggio principale e una piattaforma immunoanalitica basata sulla chemiluminescenza Roche. L’analisi di Bland-Altman è stata utilizzata per calcolare i limiti di concordanza al 95%. Il saggio principale di qRT-PCR è stato utilizzato per tutte le misurazioni cliniche di miRNA, mentre il miScript SYBR Green PCR Kit è stato impiegato esclusivamente come metodo ortogonale nell’esperimento di concordanza analitica; sono stati calcolati i coefficienti di correlazione di Pearson tra i due sistemi di qRT-PCR.
Analisi statistica
L'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando software statistici. Tutte le variabili continue sono state inizialmente sottoposte a test di normalità mediante il test di Shapiro-Wilk. I dati con distribuzione normale sono espressi come media ± deviazione standard. Il confronto tra due gruppi è stato effettuato con il test t per campioni indipendenti, mentre i confronti tra più gruppi sono stati eseguiti mediante analisi della varianza a un fattore (ANOVA), seguita dal test LSD-t per confronti a coppie. I dati che non seguivano una distribuzione normale sono riportati come mediana (intervallo interquartile) [M (P25, P75)]. I confronti tra due gruppi sono stati quindi effettuati con il test U di Mann-Whitney e i confronti tra più gruppi con il test H di Kruskal-Wallis. I dati categorici sono stati presentati come frequenze e percentuali. Per il confronto tra gruppi è stato utilizzato il test χ2 o il test esatto di Fisher. Le correlazioni tra le variabili sono state valutate mediante analisi di correlazione di Pearson o analisi di correlazione dei ranghi di Spearman, a seconda della distribuzione dei dati. Come analisi esplorativa, le correlazioni di Pearson tra ciascun miRNA e i sei marcatori metabolici sono state ripetute nei sottogruppi di PCOS non obese (BMI <28 kg/m2) e obese (BMI ≥28 kg/m2). I coefficienti di correlazione sono stati confrontati utilizzando la trasformazione r-to-z di Fisher, e i valori p risultanti tra sottogruppi sono stati corretti mediante la procedura di Benjamini–Hochberg per il tasso di falsa scoperta. Le prestazioni diagnostiche sono state valutate mediante curve ROC (caratteristica operativa del ricevitore) e area sotto la curva (AUC). Inoltre, è stata analizzata la rilevazione combinata utilizzando un modello di regressione logistica. Tutti i test erano a due code e un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Caratteristiche basali della popolazione in studio
Lo studio ha incluso un totale di 62 pazienti con PCOS e 71 controlli sani. I due gruppi erano comparabili per età, composizione etnica e altre caratteristiche basali (p > 0,05). Al contrario, i cicli mestruali erano significativamente più lunghi nel gruppo PCOS rispetto al gruppo di controllo (p < 0,001), il che è coerente con la presentazione clinica tipica della PCOS (Tabella 2).
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Utilizzando saggi biochimici standardizzati su siero e qRT-PCR, questo studio ha analizzato campioni di siero di 62 pazienti con PCOS e di 71 controlli sani. È stato osservato un profilo caratteristico di espressione alterata di miRNA e di proteine correlate alla nutrizione nel PCOS, insieme a significative associazioni post-trascrizionali tra i due. Tutti gli esperimenti sono stati sottoposti a rigorosa validazione metodologica. La precisione, la stabilità e la concordanza tra i metodi del sistema di rilevamento hanno s...
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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Freezer a temperatura ultra-bassa a -80 °C | Thermo Fisher (USA) | Forma 900 | Conservazione a lungo termine a bassa temperatura di campioni sierici |
| Kit ELISA per adiponectina (ADPN) | R&D Systems (USA) | DY1065 | Rilevamento quantitativo della concentrazione sierica di ADPN |
| Analizzatore biochimico automatico | Beckman Coulter (USA) | AU5800 | Rilevamento di glucosio ematico a digiuno, insulina ed emoglobina glicata |
| Lettore automatico per micropiastre | Tecan (Svizzera) | Infinite M200 Pro | Misurazione dell'assorbanza a 450 nm per esperimenti ELISA |
| Kit per il rilevamento del glucosio ematico | Beckman Coulter (USA) | A11A01 | Rilevamento del glucosio sierico a digiuno mediante metodo della glucosio ossidasi |
| Analizzatore per immunodosaggio chemiluminescente Cobas e601 | Roche (Germania) | Cobas e601 | Rilevamento elettrochemiluminescente di testosterone e IL-6 sierici |
| Provetta criogenica senza enzimi | Axygen (USA) | MCT-150-C | Aliquotatura di campioni sierici, conservazione a temperatura ultra-bassa a -80 °C |
| Pipetta Eppendorf Research plus | Eppendorf (Germania) | Research plus 0,5-1.000 μL | Aspirazione del siero, pipettaggio di RNA/reagenti, aliquotatura di campioni |
| Kit per emoglobina glicata (HbA1c) | Beckman Coulter (USA) | A11A03 | Rilevamento dell'HbA1c sierica mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni |
| Kit per il rilevamento dell'IL-6 | Roche (Germania) | 5200057190 | Quantificazione dell'interleuchina-6 sierica |
| Kit per il rilevamento dell'insulina | Beckman Coulter (USA) | A11A02 | Rilevamento dell'insulina sierica a digiuno mediante immunoturbidimetria |
| Kit ELISA per leptina (LEP) | R&D Systems (USA) | DY398 | Rilevamento quantitativo della concentrazione sierica di LEP |
| Centrifuga ad alta velocità a bassa temperatura | Xiangyi Instrument (Cina) | TDZ5-WS | Centrifugazione dei campioni alle forze centrifughe specificate |
| Kit miScript SYBR Green PCR | Qiagen (Germania) | 218073 | Verifica della coerenza metodologica per il rilevamento di miRNA |
| Kit di trascrizione inversa PrimeScript RT | TaKaRa (Giappone) | RR036A | Trascrizione inversa dell'RNA micro per la sintesi di cDNA |
| Strumento per PCR quantitativa in tempo reale con fluorescenza | Applied Biosystems (USA) | 7500 | Amplificazione qRT-PCR e rilevamento della fluorescenza di miRNA |
| Kit ELISA per proteina legante il retinolo 4 (RBP4) | R&D Systems (USA) | DY6005 | Rilevamento quantitativo della concentrazione sierica di RBP4 |
| Software statistico SPSS | IBM (USA) | 25 | Test di normalità dei dati, confronto tra gruppi, analisi di correlazione e analisi ROC |
| Kit SYBR Premix Ex Taq II | TaKaRa (Giappone) | RR420A | Amplificazione PCR quantitativa con fluorescenza per miRNA |
| Kit per il rilevamento del testosterone (T) | Roche (Germania) | 5200067190 | Quantificazione dei livelli sierici di testosterone |
| Reagente per l'estrazione totale di RNA TRIzol | Invitrogen (USA) | 15596026 | Estrazione di RNA totale da campioni sierici |
| Provetta per prelievo di sangue sotto vuoto senza anticoagulante | BD Biosciences (USA) | 367812 | Prelievo di sangue venoso cubitale a digiuno per la separazione del siero |
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