Misurazione degli effetti dei composti farmacologici sulla morfologia mitocondriale nei modelli di invecchiamento del topo

Sommario

Questo protocollo descrive metodi per misurare gli effetti di farmaci somministrati tramite minipompe osmotiche impiantabili sulla morfologia mitocondriale in modelli murini invecchiati. Viene effettuata un'imaging confocale tridimensionale (3D) a super-risoluzione del fegato del topo e viene sviluppata una pipeline per la segmentazione, la classificazione e l'analisi quantitativa non distorta delle strutture mitocondriali.

Abstract

L'accumulo di danni molecolari legati all'invecchiamento può contribuire a cambiamenti nella morfologia mitocondriale e nella disfunzione metabolica, in particolare nei tessuti con elevati dispendi energetici. I composti farmacologici che migliorano la disfunzione metabolica e ripristinano morfologie mitocondriali sane e 'giovani' possono quindi rappresentare modalità efficaci per prolungare la durata della salute (cioè la parte della vita libera dal peso di malattie croniche legate all'invecchiamento) nei mammiferi. In questo caso vengono descritti metodi per eseguire impianti di pompa osmotica sottocutanea in topi anziani per la somministrazione stabile di composti farmacologici idrofobi. Successivamente, i tessuti vengono fissati, criosiati, colorati e fotografiati utilizzando una microscopia confocale a super-risoluzione. Infine, viene presentata una pipeline automatizzata per la segmentazione tridimensionale, la classificazione e la misurazione quantitativa delle strutture mitocondriali. Pertanto, questi metodi possono essere utili per valutare quantitativamente i cambiamenti nella struttura tridimensionale mitocondriale in diversi tessuti durante la vita del topo. Inoltre, queste tecniche possono aiutare nell'identificazione riproducibile di farmaci a piccole molecole che mitigano la disfunzione metabolica legata all'invecchiamento.

Introduzione

I mitocondri sono organelli doppi legati a membrana, organizzati spaziotemporalmente per adattarsi alle attuali esigenze metaboliche della cellula e del tessuto^{ospite 1}. Le invaginazioni nella membrana interna, chiamate criste, si formano e sono organizzate tramite una coordinazione dinamica tra fosfolipidi della membrana interna non bistrato come cardiolipina e fosfatidiletanolamina, file di dimeri ATP sintasi alle punte delle criste, oligomeri leganti la cardiolipina dell'atrofia ottica GTPasi simile a dinamina (OPA1) nella sommità delle criste, e complessi Mitocondrial Contact Site e Sistema di Organizzazione Cristae (MICOS) alle giunzioni delle^{cristi 1}. Queste strutture della membrana interna subcompartimentano i mitocondri in unità funzionali^{individuali 2} e forniscono un'area superficiale aumentata su cui i complessi respiratori produttori di potenziale transmembrana mitocondriale^{possono assemblarsi 1}. Come organelli dinamici con funzioni cellulari secondarie legate alla segnalazione^{apoptotica 3}, Ca²⁺ e specie reattive di ossigeno^{come omeostasi 3}, e biosintesi^{lipidica 4}, le strutture morfologiche mitocondriali sono altamente sensibili a cambiamenti ambientali come la diminuzione della disponibilità di ossigeno⁵ e l'aumento del rilascio di Ca²⁺ dal reticolo^{endoplasmatico 6,7}.

L'accumulo di danni molecolari contribuisce ai cambiamenti nella struttura e nella funzione mitocondriale durante l'invecchiamento⁸ anni. Studi pionieristici sulla crio-tomografia elettronica (crio-ET) condotti dal gruppo di Kühlbrandt su diversi organismi modello hanno dimostrato una chiara correlazione tra densità delle cristi e capacità respiratorie, oltre a una diminuzione dipendente dall'età della densità delle cristae e la perdita associata di dimeri ATP^{sintasi 9,10}. Inoltre, le variazioni del volume mitocondriale possono derivare da una fissione mitocondriale compromessa e da una dinamica^{di fusione 11}, un aumento dell'accumulo di^{lipidi 12} e un aumento del gonfiore¹³. Nel muscolo scheletrico, VO₂ max, che è un forte predittore dell'aspettativa di vita^14,15, può essere predetto con precisione in base al grado di frammentazione mitocondriale intermiofibrillare e alla densità delle^{cristi 16}.

Non sorprende che i cambiamenti strutturali e funzionali legati all'invecchiamento nei mitocondri possano contribuire alla patogenesi di diverse malattie^croniche 17,18,19,20. Un aumento della frammentazione mitocondriale e delle alterazioni nella biogenesi e morfologia mitocondriale sono associati sia al morbo di Alzheimer che al morbo di^{Parkinson 20}. Questi cambiamenti causano interruzioni dei complessi di fosforilazione ossidativa, compromettendo la generazione della forza motrice protonica e portando a una produzione eccessiva di specie reattive di ossigeno 20,21,22. Nelle disfunzioni cardiache correlate all'invecchiamento e nell'insufficienza cardiaca, l'aumento della frammentazione mitocondriale, del gonfiore, della vacuolizzazione e della perdita della densità delle cristi contribuisce alla diminuzione della produzione di^{ATP 23,24}. Queste alterazioni strutturali possono essere in parte legate alla manipolazione alterata del Ca²+ mitocondriale e all'aumento dell'attività del poro di transizione della permeabilità^{mitocondriale} 6,7,13,25. Come presunto regolatore della mitofagia, un'apertura eccessiva del poro di transizione della permeabilità durante l'invecchiamento può invece essere distruttiva e portare a una morte cellulare^{incontrollata 13}. Infine, è noto che i deficit legati all'invecchiamento nel metabolismo dei lipidi mitocondriali e nella mitofagia possono contribuire allo sviluppo della fegato adiposa^{non alcolica 26}. In particolare, la steatosi epatica è stata dimostrata come accompagnata da un aumento dello stress ossidativo e da una maggiore formazione di strutture mitocondriali simili a ciambelle^.

Di conseguenza, esiste un notevole interesse nello sviluppo di terapie che mirino ai declini della funzione mitocondriale legati all'invecchiamento per migliorare la qualità della vita delle persone che soffrono di alcune malattie croniche. Forzinity (elamipretide), un peptide interattivo con lipidi che attenua il potenziale superficiale della membrana^{interna 28} e aumenta la generazione di ATP mitocondriale^29,30, è recentemente diventato il primo farmaco mitocondriale approvato dalla FDA per il trattamento della sindrome di Barth. La sindrome di Barth è un disturbo legato al cromosoma X in cui difetti nel rimodellamento della cardiolipina contribuiscono a cardiomiopatia, debolezza muscolare scheletrica e mortalità^{prematura 31}. Sebbene il trattamento a breve termine non abbia prodotto cambiamenti rilevabili nell'età biologica muscolare nei topi^{anziani 32}, il trattamento con elamipretide ha mostrato miglioramenti ripetuti nei parametri funzionali dell'invecchiamento, come la frazione di eiezione cardiaca e la tensione longitudinale^{globale 32,33}, la fatica muscolare e la generazione^{di forza} 33,34,35 e la fragilità ³². L'urolitina A, un'ellagitannina derivata dall'intestino che induce la^{mitofagia 36}, ha inoltre mostrato miglioramenti clinici nella resistenza e forza muscolare^{aerobica 37,38}, oltre a effetti positivi sulla disfunzione cardiaca in topi anziani e nei modelli ratti di insufficienza cardiaca^{indotta 39}. La metformina, un farmaco antidiabetico che si è dimostrato interagire con il Complesso^{I 40}, è stata inoltre suggerita come un mimetico parziale della restrizione calorica^41,42. Tuttavia, sebbene il trattamento con metformina sia stato associato a una riduzione del rischio di cancro e a un ritardo declino cognitivo nei dati epidemiologici^{precedenti 43,44}, i suoi effetti sulla durata della salute e sulla durata della vita nei pazienti non diabetici restano una questione^{aperta 45}. Infine, il trattamento con riboside di nicotinamide, un precursore di NAD+, può aumentare la biogenesi mitocondriale e la risposta proteica non piegata mitocondriale per migliorare la generazione^{di energia} 46,47,48,49, ma il suo trattamento a lungo termine nei topi UM-HET3 non ha avuto effetti significativi sulla mediana del topo o sull'aspettativa di vita ^{del 90}° percentile 50.

In questo caso vengono descritti metodi per preparare tessuti di topi anziani trattati con composti farmacologici per l'imaging confocale a super-risoluzione della morfologia mitocondriale. Viene dimostrata l'impiantamento efficace di minipompe osmotiche per una somministrazione prolungata di farmaci nei topi, e il fegato viene analizzato per gli effetti del trattamento sulla struttura della membrana esterna. Infine, viene presentata una pipeline di analisi per la misurazione quantitativa imparziale e riproducibile del volume mitocondriale, della superficie e della sfericità, nonché per la classificazione dei mitocondri in diverse strutture. Pertanto, questi metodi sono applicabili sia per studiare i cambiamenti nella morfologia mitocondriale durante la durata della vita dei mammiferi sia per identificare composti farmacologici che possano mitigare i declini della salute metabolica legati all'invecchiamento.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono animali da ricerca sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali per l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dai Comitati per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali del Brigham and Women's Hospital e della Harvard Medical School ai sensi del Protocollo n. 2016N000368. I ricercatori interessati ad applicare questo protocollo in altri paesi dovrebbero consultare gli enti istituzionali e regolatori locali per garantire il rispetto delle normative applicabili sul benessere animale.

1. Impianto della pompa osmotica sottocutanea

NOTA: Gli interventi chirurgici sugli animali dovrebbero essere eseguiti solo da personale esperto e formato, e bisogna prestare molta attenzione a minimizzare lo stress e/o la sofferenza animale. Eseguire procedure che coinvolgono animali da ricerca solo come descritto esattamente nei protocolli approvati sugli animali. Tutte le ricerche che coinvolgono l'uso degli animali devono rispettare rigorosamente le 3R – Sostituzione, Riduzione e Affinamento. Questo protocollo dettaglia l'impianto della pompa osmotica sottocutanea, classificato come una procedura chirurgica minore. Possono essere eseguite anche impianti di pompa osmotica intraperitoneale, ma si tratta di una procedura più complessa classificata come intervento chirurgico maggiore. Pertanto, si raccomanda che la procedura sottocutanea non venga eseguita a meno che non vi sia una forte giustificazione scientifica a favore dell'impianto intraperitoneale.

1. Riempimento delle pompe osmotiche
   NOTA: La preparazione delle soluzioni farmaceutiche e il riempimento delle pompe osmotiche devono essere eseguiti in un armadietto di biosicurezza utilizzando una tecnica sterile. I modelli di pompa devono essere scelti in base al volume desiderato del serbatoio e alla durata della consegna del trattamento. Per questo studio è stato utilizzato il modello 2004 (~200 μL volume del serbatoio, erogazione del trattamento per 4 settimane).
   1. Prepara la soluzione farmacologica in un solvente compatibile con le pompe osmotiche. Consulta https://alzet.com/formulating-the-solution/. Utilizzare la portata (μL/h) indicata sul lotto di pompe osmotiche ordinate per determinare la concentrazione necessaria al dosaggio giornaliero desiderato.
      NOTA: Una soluzione di 50% v/v DMSO e 50% v/v PEG₃₀₀ solubilizza stabilmente i composti idrofobici ed è compatibile con le pompe osmotiche. Tutti i composti e solventi dovrebbero essere di grado farmaceutico quando possibile.
   2. Filtra, sterilizza la soluzione farmacologica con un filtro a siringa da 0,22 μm e lascia a temperatura ambiente.
   3. Metti un moderatore di flusso in una pompa e spingila finché non entra in un tubo di microfuga. Non spingere il moderatore del flusso fino al minimo.
   4. Fai un bilancio analitico su un tubo vuoto di microfuge, e poi registra il peso della pompa osmotica.
   5. Collega il tubo di riempimento a una siringa da 1 mL e preleva almeno 1,5 volte il volume del serbatoio della pompa. Rimuovi le bolle d'aria tirando lo sturalavandini verso il basso, scossendo la siringa e spingendola verso l'alto finché non si forma liquido in cima al tubo di riempimento.
   6. Rimuovi il moderatore di flusso mantenendo la pompa in posizione verticale.
   7. Inserisci il tubo di riempimento attraverso l'apertura in cima alla pompa finché non può andare oltre.
   8. Spingi lentamente lo sturalavandini mentre tieni la pompa in posizione verticale. Continua a riempire finché la soluzione non appare alla presa. Poi, rimuovi il tubo di riempimento e pulisci l'eccesso con una salvietta delicata.
   9. Inserisci il moderatore di flusso finché il tappo non è a filo con la parte superiore della pompa.
   10. Rimetti la pompa piena in un tubo di microfuge e pesa. Determina il peso della soluzione e verifica che il volume di riempimento sia almeno il 90% del volume del serbatoio (differenza di peso in milligrammi ≈ volume in microlitri).
   11. Riempi un tubo conico da 15 mL con 5 mL di soluzione salina sterile 1× fosfato tamponata (PBS) e aggiungi la pompa già riempita. Sigillare con pellicola di paraffina e preparare la pompa incubando a 37 °C per il tempo richiesto dal modello delle pompe osmotiche. Per il modello 2004, si tratta di 40 ore.
2. Preparazione del meloxicam
   NOTA: Questo dovrebbe essere eseguito in un armadietto di biosicurezza utilizzando una tecnica sterile. Il meloxicam, un farmaco antinfiammatorio non steroideo (FANS), non è una sostanza controllata ma può richiedere una licenza per essere acquisito.
   1. Utilizzando un ago da 27 g e una siringa Luer-lok da 3 mL, diluire il calcio di meloxicam da 5 mg/mL a 1 mg/mL usando PBS sterile in una fiala di vetro sterile da 5 mL. Prepara il giorno stesso e conserva a temperatura ambiente.
3. Preparazione del sito chirurgico
   NOTA: Non è necessario eseguire l'impianto della pompa osmotica all'interno di un armadietto di biosicurezza, né è possibile mantenere la sterilità durante le procedure chirurgiche. Tuttavia, il sito dell'intervento dovrebbe comunque rispettare rigorosi standard di pulizia e pratiche aseptiche. Il sito dell'intervento dovrebbe essere pulito, privo di disordine e con poco traffico pedonale. Idealmente, c'è sia un sito di preparazione (cioè per la rasatura e la strofinazione) sia un sito chirurgico (cioè per l'impianto della pompa).
   1. Disinfetta completamente l'area chirurgica con etanolo al 70% e asciuga con carta assorbente.
   2. Accendi lo sterilizzatore a perline di vetro e impostalo a 250 °C. Lascia riscaldare per 15–30 minuti.
   3. Accendi il vaporizzatore e imposta la borsa riscaldante al 65%. Imposta il peso corporeo dell'animale e imposta la percentuale di isoflurano al 3,2%.
   4. Attacca una delle sonde di temperatura sulla superficie della base riscaldante. Lascia riscaldare la borsa riscaldante a 35–37 °C.
   5. Rimuovi la siringa del vaporizzatore. Spingi la linguetta verde fino in fondo e riempi con isoflurano collegandolo a una bottiglia di isoflurano e tirando indietro lo sturalavandini.
   6. Riattacca la siringa al vaporizzatore e prepara la siringa.
   7. Metti una seconda borsa riscaldante sotto una gabbia pulita per il recupero. Metti la gabbia a metà e a metà dal cuscinetto riscaldante.
4. Impianto della pompa
   NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere puliti e autoclavati in anticipo. Per sterilizzare strumenti chirurgici tra animali, può essere utilizzato uno sterilizzatore a perline di vetro. Questo può essere utilizzato solo per gruppi di fino a 5 animali. Assicurati di includere una striscia indicatrice autoclave per verificare che i parametri di sterilizzazione siano stati rispettati. L'adeguata attrezzatura di protezione individuale (DPI) include un camice pulito, una maschera chirurgica, guanti chirurgici sterili e copricapello. Gli animali che subiscono interventi chirurgici non dovrebbero essere visti da altri animali.
   1. Prendi il topo per la base della coda e mettilo nella camera di anestesia. Sganciare i tubi e avviare il flusso di isoflurano (3,2%) verso la camera. Posiziona due teli sterilizzati sopra il cuscinetto riscaldante.
   2. Aspetta che il topo si giri su un fianco e monitora la respirazione. Quando la respirazione si è rallentata e si rilassa, si interrompe il flusso di isoflurano verso la camera. Aggancia i tubi alla camera e sgancia i tubi dal naso da usare. Avvia il flusso di isoflurano (2%) verso il naso.
   3. Prendi il topo dalla camera e metti il naso nel naso del cuscinetto riscaldante. Aggiungi pomata oftalmica su entrambi gli occhi.
   4. Pesa il topo su una bilancia e poi torna al muso. Determina il volume di 1 mg/mL di meloxicam da somministrare. Per una dose di 5 mg/kg, moltiplica il peso del topo in grammi per 5 per ottenere i microlitri di meloxicam da somministrare.
   5. Spruzza il tappo della fiala con 1 mg/mL di meloxicam con etanolo al 70% e asciuga con una salvietta delicata. Poi, usando una siringa di insulina da 0,3 mL, preleva il volume corretto di meloxicam. Rimuovi tutte le bolle d'aria dalla siringa.
   6. Stringi il topo con una mano, con la testa inclinata verso il basso. Inserire l'ago a un angolo di 30°–45° nel quadrante inferiore destro dell'addome con la smussatura rivolta verso l'alto. Aspira per confermare la corretta posizione dell'ago.
   7. Se non si osserva aspirato, si preme dolcemente lo sturalavandini e iniettate meloxicam intraperitoneale.
   8. Riporta il mouse al naso e alla borsa riscaldante. Radere completamente il 150% dell'area circostante il sito di impiantamento (metà-parte superiore della schiena) con una tosa chirurgica. Una volta fatto, passa delicatamente l'aspirapolvere o spazzola il pelo dall'animale e butta via il primo foglio di drappeggiamento.
      NOTA: Una rasatura pulita è necessaria per eseguire un intervento asettico. Al minimo, qualsiasi incisione deve essere completamente priva di peli di animali.
   9. Posiziona il topo in modo che la sua testa sia rivolta verso il chirurgo. Eseguire una scorritura alternata con povidone-iodio e etanolo al 70%, utilizzando applicatori con punta di cotone, per un totale di 3 applicazioni. Assicurati di iniziare al centro dell'incisione prevista e di sparire a spirale verso l'esterno con gli applicatori con punta di cotone.
   10. Coprire l'animale con tende chirurgiche sterili e finestre e utilizzare la tecnica asettica adeguata per indossare i guanti chirurgici.
   11. Prima di effettuare qualsiasi incisione, assicurati di controllare accuratamente i riflessi dei pedali pizzicando con fermezza entrambi i piedi con una pinza di tessuto. Non procedere finché non hai più pressioni, non c'è movimento. Questo conferma un piano chirurgico di anestesia.
   12. Tendi la pelle media-scapolare con una pinza tissutale e realizza un'incisione di 1 cm perpendicolare alla colonna vertebrale con piccole forbici chirurgiche dell'iride. Per ottenere un taglio dritto, taglia con le forbici chirurgiche Iris a un angolo di 90° rispetto al topo.
   13. Usa piccole pinze emostatiche all'interno dell'incisione per distribuire il tessuto sottocutaneo e creare una tasca per la pompa. Assicurati che la tasca per la pompa sia lontana dalla parte anteriore dell'animale e posizionata leggermente di lato. Usa la pinza emostatica per allentare la pelle su tutti i lati dell'incisione.
   14. Apri l'incisione con le pinze tissutali e inserisci la pompa usando le pinze emostatiche. Inserisci prima la pompa con il moderatore di flusso.
       ATTENZIONE: La pompa deve essere inserita in modo da essere sufficientemente lontana dall'incisione, cioè in modo che la pelle circostante l'incisione non sia sotto tensione. Se non posizionata correttamente, può portare a deiscenza della ferita. La pompa può anche cambiare posizione durante il recupero dell'animale.
   15. Usando le pinze, tendere delicatamente la pelle e tirare entrambi i lati dell'incisione in modo che siano insieme. Partendo da un'estremità dell'incisione, si utilizza l'applaider a clip per posizionare clip da 7 mm lungo l'intera incisione (potrebbero essere necessarie 2–4 clip).
   16. Per eventuali spazi nell'incisione troppo piccoli per essere coperti da un'altra clip per ferite, applicare una piccola quantità di adesivo tissutale utilizzando l'applicatore sterile. Stringi con la pinza di tessuto.
   17. Tira e allunga delicatamente la pelle intorno all'incisione per confermare che la ferita sia chiusa. Poi, chiudi il flusso di isoflurano verso il muso e taglia i tubi rilevanti. Metti i topi nella gabbia di recupero sul cuscinetto riscaldante.
   18. Monitora completamente il topo finché non si risveglia e non diventa deambulante. Monitora frequentemente gli animali per eventuali segni di disagio o dolore e tienili isolati dagli altri topi finché non si sono ripresi.
   19. Dopo 24 ore, risomministrare 5 mg/kg di meloxicam tramite iniezione intraperitoneale. (Opzionale) Per facilitare il recupero degli animali, fornisci integratori Electro-Gel e/o posiziona il cibo sul pavimento della gabbia.
   20. Dopo 10–14 giorni, anestetizzare nuovamente gli animali con isoflurano, applicare pomata oftalmica e rimuovere le clip con il rimuovi-clip.
       NOTA: Le fermole devono essere rimosse entro questo periodo per evitare la ricrescita dei peli sopra le fermaglie della ferita. Inoltre, tutte le pompe osmotiche hanno un periodo di durata definito. Assicurati di espiantare le pompe o di sopportare gli animali entro la fine del loro periodo di durata. Per periodi di trattamento più lunghi, possono essere eseguite più impianti di pompa uno dopo l'altro sullo stesso animale.

2. Fissazione, incastonamento e sezionamento dei tessuti

1. Fissazione dei tessuti
   NOTA: Tutte le procedure animali devono essere eseguite da personale esperto per minimizzare lo stress e la sofferenza animale. La camera di eutanasia dovrebbe essere pulita e fisicamente svuotata tra ogni animale per rimuovere eventuali residui di anidride carbonica. Per ridurre lo stress, gli animali dovrebbero essere soppressi nelle loro gabbie domestiche quando possibile. Infine, gli animali non dovrebbero essere soppressi in prossimità spaziale o in vista di altri topi. Strumenti chirurgici puliti sono necessari per le procedure non di sopravvivenza, ma non devono necessariamente essere sterili (cioè autoclavate).
   1. Posizionare il mouse nella camera di induzione e aprire il regolatore finché il misuratore di portata non raggiunge la portata prevista (~40%–70% del volume della camera al minuto).
   2. Osserva il topo per tutta la procedura, assicurandoti che non ci siano segni di disagio come un salto. Monitorare la cessazione dell'attività respiratoria e mantenere il flusso di_CO2 per almeno 2 minuti dopo la cessazione dell'attività respiratoria. Assicurati che il tempo totale di esposizione al_CO2 sia di almeno 5 minuti.
   3. Recupera il topo ed esegui un metodo di eutanasia secondaria come la lussazione cervicale.
   4. Fissa gli arti dell'animale su un pezzo di schiuma di polistirene rivestito di carta alluminio usando aghi da 23-G. Bagna il pelo spruzzando con etanolo al 70%.
   5. Fai una piccola incisione vicino alla base dell'addome e taglia la pelle fino al collo. Segui la stessa incisione per aprire la cavità corporea e taglia con cura la gabbia toracica.
   6. Fai incisioni a forma di U a partire dalla base dell'addome e fissa la pelle con aghi 23-G.
   7. Dissezionare l'organo o organi rilevanti e inserirlo in un tubo conico da 15 mL pre-riempito con 5 mL di paraformaldeide (PFA) al 4%. Fissare per 24 ore a 4 °C su un girarrosto.
      ATTENZIONE: La soluzione PFA è pericolosa. Evita il contatto con la pelle. I DPI adeguati durante la maneggiatura includono camice da laboratorio, guanti in nitrilo e occhiali di sicurezza.
      NOTA: Se è necessario perfessere il sangue dai tessuti e/o se si desidera la fissazione per perfusione, eseguire la perfusione cardiaca come descritto^{in precedenza 51}. Nella fissazione a immersione, come eseguita qui, può volerci tempo perché il fissativo diffondi attraverso il tessuto, specialmente in pezzi di tessuto più grandi. Questo può alterare la morfologia mitocondriale; inoltre, la fissazione con il PFA può anche far sì che i tessuti si^{riducano a 52}.
   8. Dopo 24 ore, rimuovere la soluzione di paraformaldeide e risciacquare i fazzoletti con 10 mL di 1× PBS. Esegui un totale di 3 volte per 10 minuti ciascuna a temperatura ambiente su un girarrosto.
   9. Rimuovere il PBS e immergere i tessuti in 10 mL di saccarosio al 30% per 48 ore a 4 °C su un girarrosto. L'infiltrazione del saccarosio è completa quando il tessuto o i tessuti affondano.
      NOTA: Per verificare che il solvente sia stato somministrato all'animale, misura la quantità rimasta nella pompa.
2. Inserimento dei tessuti
   NOTA: Assicurati di tenere traccia della posizione e dell'orientamento del tessuto negli stampi.
   1. Riempi un contenitore di schiuma di polistirene con ghiaccio secco e posiziona sopra un foglio di metallo piatto.
   2. Posiziona gli stampi sopra la lamiera e riempi 2/3–3/4 fino in cima con un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) (mezzo di incassamento di tessuto). Porta eventuali bolle d'aria in superficie o agli angoli con una pinza fine. Per accelerare il tasso di congelamento, posiziona alcune pellet di ghiaccio secco direttamente contro gli stampi.
   3. Metti un po' di mezzo per l'incassamento di tessuto in una pesa e mescola i tessuti al suo interno. Cerca di evitare di portare via la soluzione di saccarosio.
   4. Una volta che il materiale per l'incassamento del tessuto si è completamente congelato sul fondo dello stampo (dovrebbe essere completamente opaco), immergi il tessuto all'interno dello stampo in modo che non tocchi nessun lato o la superficie. Posizionate nel luogo e orientamento desiderati.
   5. Aspetta che il mezzo di incorporazione del tessuto si congeli completamente prima di trasferire gli stampi in un congelatore a -80 °C.
      NOTA: (Punto di pausa) I tessuti incorporati possono essere conservati per almeno 3 mesi.
3. Sezionamento dei tessuti
   NOTA: Per ridurre la variazione da lotto a lotto nello spessore della sezione, tutti i tessuti da analizzare insieme devono essere sezionati in un'unica sessione.
   1. Recupera i tessuti incorporati dal congelatore a -80 °C e mettili in un contenitore in schiuma di polistirene riempito di ghiaccio secco.
   2. Preraffreddare la temperatura della camera del criostato e il portacampione a -24 °C e -25 °C, rispettivamente.
   3. Metti una lama microtome nuova nel portalama e inserisci la piastra antirollio. Per una pulizia più semplice, fodete la camera criostatica con carta assorbente.
   4. Rimuovi il mandrino del campione dalla camera criostatica e riscaldalo a temperatura ambiente.
   5. Usa una lametta per tagliare con cura ogni angolo dello stampo del tessuto tecnico. Sollevalo delicatamente per rimuovere il blocco di tessuto che incastra il mezzo di incastramento.
   6. Premi saldamente il blocco di tessuto nel mandrino del campione ruotando avanti e indietro. Una volta ben aderito, metti il pezzo di campione nella camera del criostato per alcuni minuti per congelarlo.
      NOTA: Assicurati di posizionare il blocco di tessuto sul mandrino nella giusta orientazione in modo che il tessuto sia sezionato nell'orientamento desiderato.
   7. Una volta che il blocco di tessuto è completamente congelato sul mandrino, posiziona il mandrino nel portamandrini e stringilo in posizione. Sposta la lama criostatica in modo che sia appena davanti al blocco di tessuto senza toccarlo.
   8. Imposta la regolazione del trim a 50 μm e inizia a rifilare il blocco finché non esposta una sezione trasversale completa del tessuto.
   9. Deseleziona la regolazione del trim e imposta lo spessore della sezione a 20 μm. Taglia alcune fette a questo spessore prima di abbassare la piastra anti-roll. Taglia lentamente e in modo fluido ~80%–90% della sezione prima di fermarti.
   10. Alza la piastra antirollio. Prendi un vetrino di vetro caricato e premi il lato carico sulla sezione del tessuto nella posizione desiderata.
       NOTA: Se la sezione del tessuto si arrotola dopo aver sollevato la piastra anti-roll, usa i pennelli fini per srotolarla.
   11. Rimuovi il mandrino dal portamandrin. Rimuovi il mandrino dal criostato e riscaldalo a temperatura ambiente. Estrai il blocco di tessuto dal mandrino e rimettilo nello stampo.
   12. Avvolgi in stagnola per evitare che il blocco di tessuto cada fuori dallo stampo e riportalo nel congelatore a -80 °C.
   13. Posizionare le sezioni di tessuto montate a -20 °C.
       NOTA: (Punto di pausa) Le sezioni di tessuto possono essere conservate in sicurezza a -20 °C indefinitamente.

3. Colorazione da immunofluorescenza

1. Recupera le criosezioni e lasciale asciugare per 10 minuti a 37 °C in un incubatore.
2. Lava le vetrine per rimuovere l'eccesso di tessuto che infonda il substrato.
   1. Prepara 1 L di 1× PBS contenente 0,1% v/v di Triton X-100 (PBS-T)
   2. Riempi 3 barattoli di tinta con PBS-T.
   3. Metti i slide nel portassolli. Immergi le slitte nel barattolo per 10 minuti. Ripeti per un totale di 3 volte.
3. Blocca il tessuto per le macchie.
   1. Tocca delicatamente ogni vetrino su una salvietta delicata per asciugare. Stendi i slide sospesi in una scatola con il tessuto rivolto verso l'alto.
   2. Prepara una soluzione bloccante da 20 mL di 1× PBS, 0,3% v/v Triton X-100 e 5% w/v albumina sirica bovina (BSA).
   3. Pipetta 1 mL di soluzione bloccante su ogni vetrina, assicurandoti che i tessuti siano completamente coperti.
   4. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
4. Incubare i tessuti con l'anticorpo primario.
   1. Tocca delicatamente ogni vetrino su una salvietta delicata per asciugare. Usa un'altra salvietta delicata per rimuovere delicatamente il liquido residuo tra le sezioni di fazzoletto.
   2. Prepara una diluizione 1:200 di anticorpo Tom20 rabbit α-mouse in soluzione bloccante (200 μL per vetrina)
   3. In fondo alla scatola per slide, posiziona dei tovaglioli di carta e inumidili completamente con acqua.
   4. Stendere i slide sospesi nella scatola con il tessuto rivolto verso l'alto. Pipettare 200 μL di anticorpo primario diluito su ogni vetrino, assicurando che i tessuti siano completamente coperti.
   5. Tagliare pezzi di pellicola di paraffina approssimativamente della dimensione delle coperture da utilizzare. Taglia 1 foglio di pellicola di paraffina per ogni diapositiva.
   6. Posizionare ogni pezzo di pellicola di paraffina su ciascun vetrino per distribuire la diluizione degli anticorpi sulle sezioni del tessuto. Chiudi la scatola del diavolo e incuba a 4 °C durante la notte.
5. Lava le vetrine dopo l'incubazione con l'anticorpo primario.
   1. Riempi 3 barattoli di tinta con PBS-T. Recupera le vetrine e rimuovi pezzi di pellicola di paraffina.
   2. Metti i slide nel portassolli. Immergi le slitte nel barattolo per 10 minuti. Ripeti per un totale di 3 volte.
6. Incubare i vetrini nell'anticorpo secondario.
   NOTA: Per confermare la marcatura specifica dei mitocondri, preparare almeno un vetrino di ciascun gruppo colorato solo con l'anticorpo secondario.
   1. Tocca delicatamente ogni vetrino su una salvietta delicata per asciugare. Usa un'altra salvietta delicata per rimuovere delicatamente il liquido residuo tra le sezioni di fazzoletto.
   2. Prepara una diluizione 1:200 dell'anticorpo Alexa Fluor 568 per α-coniglio di capra e 5 μg/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in soluzione bloccante (200 μL per vetrina).
   3. Stendere i slide sospesi nella scatola con il tessuto rivolto verso l'alto. Pipettare 200 μL di anticorpo secondario diluito su ogni vetrina, assicurando che i tessuti siano completamente coperti.
   4. Tagliare pezzi di pellicola di paraffina approssimativamente della dimensione delle coperture da utilizzare. Taglia 1 foglio di pellicola di paraffina per ogni diapositiva.
   5. Posizionare un pezzo di parafilm su ogni vetrino per diffondere la diluizione degli anticorpi nelle sezioni del tessuto. Chiudi la scatola del diavolo e incuba a temperatura ambiente per 4 ore, oppure a 4 °C durante la notte.
7. Lava le copertine.
   NOTA: Usa le pinze di plastica per raccogliere e maneggiare le coperture
   1. Posizionare le coperture una alla volta in un becher pieno con acqua calda del rubinetto e un detersivo per vetrerie, come Contrad 70. Copri con un pezzo di pellicola di paraffina.
   2. Sonica per 30 minuti in un sonicatore da bagno.
   3. Risciacqua più volte con acqua calda del rubinetto. Poi risciacqua ancora diverse volte in acqua doppiamente distillata. Sonicare per 15 minuti nel risciacquo finale con acqua doppia distillata.
   4. Metti le copertine in etanolo al 70% e conserva. Quando sei pronto per montare i copriversori, rimuovili dal 70% di etanolo e lasciali asciugare all'aria in una cappa a fumi.
8. Lava i vetri dopo l'incubazione con l'anticorpo secondario.
   1. Riempi 3 barattoli di tinta con PBS-T. Recupera le vetrine e rimuovi pezzi di pellicola di paraffina.
   2. Metti i slide nel portassolli. Immergi le slitte nel barattolo per 10 minuti. Ripeti per un totale di 3 volte.
   3. Tocca delicatamente ogni vetrino su una salvietta delicata per asciugare. Usa un'altra salvietta delicata per rimuovere delicatamente il liquido residuo tra le sezioni di fazzoletto.
9. Montate i copriversori.
   1. Aggiungi 2–3 gocce distribuite uniformemente di antifade su una slitta.
   2. Per evitare bolle d'aria, prendi un slip pulito #1.5 e tienilo a un angolo di 45° rispetto al carrello lungo l'asse lungo. Inclina delicatamente e lentamente la copertura sul carrello. Ripeti per tutte le diapositive.
   3. Lascia asciugare i vetrini per 18–60 ore a temperatura ambiente, protetti dalla luce.
   4. Conserva le slitte a 4 °C protette dalla luce.
      NOTA: (Punto di pausa) Le vetri possono essere fotografiate immediatamente dopo il periodo di polimerizzazione o fino a 1 mese se conservate a 4 °C. Non c'è bisogno di sigillare i bordi. Assicurati di usare le coperture #1.5 o #1.5H, poiché altri spessori introdurranno aberrazioni sferiche e possono ridurre la qualità dell'immagine. Non utilizzare supporti di montaggio con DAPI, poiché DAPI ha ampi spettri di eccitazione ed emissione. Il tempo di indurimento dipende dallo spessore del campione; qui, 48 h.

4. Imaging a super-risoluzione

NOTA: Questo protocollo utilizza un confocale a scansione puntuale ZEISS Airyscan2 LSM 980 costruito attorno a un ZEISS Axio Observer Z1 e dotato di due tubi fotomoltiplicatori multi-alcalini (PMT) e un rivelatore spettrale GaASP a 32 canali, un involucro ambientale e un obiettivo Plan Apo 63×/1.4 oil differential interference contrast (DIC) III.

1. Organizza l'acquisizione.
   1. Aggiungi una singola traccia Airyscan SR e seleziona il fluoroforio appropriato.
   2. Seleziona la piastra da 10" e i filtri passa-banda a emissione appropriati.
      NOTA: La piastra da 10" è specifica per questo microscopio, poiché è equipaggiata anche con rivelatori a infrarossi (IR).
   3. Seleziona il/i laser appropriato/i. Imposta i criteri di campionamento di Nyquist a 2 cliccando su SR (la dimensione del pixel deve essere regolata a 0,05 μm).
   4. Clicca su live e allinea il rilevatore Airyscan (seleziona la funzione di allineamento live). Clicca su stop una volta che l'intensità è localizzata al centro dell'icona del rilevatore e quando il rilevatore è verde.
      NOTA: Se tutto è configurato correttamente, dovrebbe apparire un messaggio sul lato sinistro del software che dice "Le impostazioni Airyscan sono ottimizzate con successo".
   5. Rimetti in diretta e regola l'intensità del laser in modo che ci sia un segnale decente ma nessun pixel saturo (clicca sull'indicatore di distanza). Clicca stop una volta ottimizzato.
      1. (Opzionale) Per aumentare il segnale senza regolare la potenza del laser, aumenta il guadagno.
2. Effettuare l'acquisizione dei dati.
   1. Clicca su z-stack e verifica che la dimensione del passo sia impostata a 0,1 μm (aggiusta se non lo è).
   2. Clicca su live e imposta i limiti inferiore e superiore dello z-stack.
   3. Clicca inizia esperimento.
   4. Una volta raccolto lo z-stack, vai nella scheda Airyscan sotto l'immagine e clicca su processa 3D. Mantieni coerenti i parametri del filtro di Weiner per la denoising utilizzati qui tra repliche diverse e gruppi di trattamento.
   5. Salva lo stack z-stack Airyscan processato.
      NOTA: Se vengono utilizzate due tracce Airyscan SR, assicurati che il microscopio cambi traccia ad ogni fotogramma.

5. Creazione di una pipeline automatizzata per quantificare la morfologia mitocondriale

NOTA: Questo protocollo descrive lo sviluppo di una pipeline automatizzata di analisi delle immagini per la quantificazione 3D della morfologia mitocondriale utilizzando il software ZEISS arivis Pro 4.1.2.

1. Converti file .czi elaborati da Airyscan in formato .sis utilizzando lo strumento di conversione arivis.
   NOTA: Se l'immagine completa è grande e il tempo di elaborazione è troppo lungo durante l'ottimizzazione dei parametri, ritaglia una piccola sotto-regione rappresentativa dell'immagine da usare come riferimento di lavoro per ottimizzare le impostazioni. Questa immagine ritagliata dovrebbe includere sia mitocondri ben isolati sia regioni di densità maggiore, in modo da rappresentare accuratamente l'intero campo dell'immagine. Una volta raggiunta una segmentazione soddisfacente sull'immagine ritagliata, la pipeline ottimizzata può essere applicata all'intero set di immagini. Questo approccio farà risparmiare tempo in modo significativo e renderà più facile modificare tutti i parametri senza compromettere la qualità della pipeline.
2. Configura e ottimizza la pipeline.
   1. Apri un'immagine rappresentativa (ad esempio, dal gruppo di controllo) nel software.
   2. Seleziona il canale di immunofluorescenza Tom20 come input per l'analisi.
   3. Applica un passaggio di denoising prima della segmentazione. Qui è stato utilizzato l'algoritmo di potenziamento delle particelle, con un diametro di 5,42 e una forza di 0,5.
      NOTA: Il filtro di potenziamento particellare è un algoritmo di denoising che preserva la struttura, progettato per amplificare oggetti compatti, grossomodo sferici o allungati sopprimendo al contempo il rumore di fondo. Funziona aumentando l'intensità locale a una specificata scala spaziale (diametro), rendendola particolarmente adatta ai mitocondri, che appaiono come particelle o tubuli luminosi e isolati su uno sfondo scuro. Se il valore del parametro del diametro è impostato troppo basso, aumenterà il rumore, mentre un valore troppo grande sfumerà gli oggetti adiacenti tra loro. Il parametro di forza controlla il grado di miglioramento, in cui valori elevati aumentano l'amplificazione del segnale ma possono introdurre artefatti se impostati troppo alti. Inizia con i valori predefiniti e aggiusta mentre ispezioni visivamente l'output in una regione rappresentativa di interesse. Sono disponibili diversi metodi di denoising nell'arivis Pro. Il levigamento gaussiano è un'opzione semplice e veloce che riduce uniformemente il rumore ad alta frequenza ma può sfumare dettagli strutturali fini. Il filtraggio mediano è migliore nel preservare i bordi affilati eliminando il suono di sale e pepe. Il potenziamento delle particelle (usato qui) è preferito quando l'obiettivo è rilevare oggetti fluorescenti discreti, poiché amplifica selettivamente il segnale di strutture che corrispondono all'intervallo di dimensioni specificato. Per immagini con basso rapporto segnale-rumore o eterogeneità di fondo significativa, può essere necessario un passaggio di derumore più intenso. Si raccomanda di testare due o tre metodi sulla stessa immagine rappresentativa e confrontare la qualità della segmentazione a valle.
   4. Segmenta i singoli mitocondri usando l'algoritmo Blob Finder, che rileva oggetti nello spazio 3D.
   5. Regolare i parametri di segmentazione, inclusa la dimensione dell'oggetto e la soglia di sensibilità, e ispezionare visivamente la sovrapposizione tra gli oggetti rilevati e l'immagine denoisetato per garantire una segmentazione accurata. Qui sono stati utilizzati i seguenti parametri: un diametro di 0,244 μm, una soglia di probabilità del 25% e una sensibilità di divisione del 22,22%, con la normalizzazione impostata al primo punto di partenza.
      NOTA: I parametri di segmentazione dipendono dalla risoluzione dell'immagine e dalla dimensione del voxel. In questo studio, le dimensioni dell'immagine erano 1354 × 1354 pixel, con una dimensione XY di 0,049 μm e una dimensione voxel di 0,049 × 0,049 × 0,100^{μm 3}.
3. Effettuare l'estrazione delle caratteristiche e il controllo qualità.
   1. Estrarre parametri morfologici per ciascun oggetto rilevato, inclusi volume (μm³), area superficiale (μm²) e sfericità (area superficiale di una sfera con lo stesso volume/area superficiale dei mitocondri).
   2. Esporta oggetti segmentati come file TIFF per la validazione visiva.
   3. Apri i file esportati in FIJI o arivis e sovrappongi l'immagine originale per un'ispezione visiva della precisione della segmentazione.
   4. Esporta le misurazioni quantitative come singoli file di foglio di calcolo per ogni campione.
4. Applica la pipeline.
   1. Salva la pipeline ottimizzata. Un esempio di pipeline si trova nel Supplementary File 1.
   2. Applicare la pipeline a immagini aggiuntive di tutti i gruppi sperimentali dello studio.
   3. Affinare iterativamente i parametri di segmentazione se necessario per garantire prestazioni coerenti su tutti i gruppi sperimentali.
   4. Una volta finalizzata, applica la pipeline in modalità batch a tutte le immagini dello studio.
5. Eseguire l'analisi dei dati
   1. Importare i dati esportati in RStudio (versione 4.3.2) per l'analisi statistica.
   2. Se non installati, installa i pacchetti: readxl, dplyr, tidyr, purrr, ggplot2, ggpubr, patchwork, scales, randomForest, caret, umap, factoextra, RColorBrewer, mclust, outliers e tidyverse.
   3. Carica lo script (Supplementary File 2) per unire tutti i dataset, filtra i dati (vedi sotto), traccia i valori di volume, superficie e sfericità, e analizza i mitocondri segmentati per proporzioni per sottotipo di campione.
   4. (Opzionale) Filtrare i mitocondri segmentati in base al volume per escludere artefatti di segmentazione e rumore.
      1. Per determinare i filtri appropriati, si ispeziona visivamente le distribuzioni dei volumi.
         NOTA: Tutti i campioni hanno mostrato un picco pronunciato a volumi molto piccoli (sotto 0,0003^{μm 3}), coerente con rumore di segmentazione piuttosto che con i mitocondri reali.
      2. Per identificare il limite inferiore, si valuta la ritenzione delle particelle tra le soglie candidate (0,0009, 0,003, 0,005, 0,007 e 0,01^{μm 3}). Il calo più ripicante nel conteggio delle particelle si è verificato sotto 0,003^{μm 3}, indicando che la maggior parte delle particelle di rumore rientra in quell'intervallo. L'ispezione visiva ha confermato che 0,003^{μm 3} corrispondeva al bordo destro del picco di rumore.
      3. Per il limite superiore, le distribuzioni si assottavano naturalmente ben sotto i 10^{μm 3}; imposta questo limite per escludere grandi oggetti artefattuali come reti mitocondriali sovra-segmentate. Il filtraggio finale ha mantenuto particelle con volumi compresi tra 0,003 e 10^{μm 3}.
         NOTA: Questo script calcola i valori mediani per campione su tutti i mitocondri rilevati e li utilizza come unità di analisi. Questo approccio spiega la non indipendenza dei singoli mitocondri all'interno dello stesso campione biologico.

Risultati

Il protocollo descritto sopra è stato eseguito (Figura 1) su maschi di topi UM-HET3 di 20 mesi. Ai topi è stato somministrato tramite veicolo (Control) o un cocktail di riprogrammazione chimica (Treated) utilizzando minipompe osmotiche^{modello 2004 53}. I fegati sono stati poi sezionati e fotografiati su un microscopio confocale Airyscan2 prima di elaborare gli z-stack utilizzando la pipeline di analisi.

Le immagini 3D di fluorescenza venivano elaborate e analizzate utilizzando il software ZEISS arivis Pro 4.1.2. Prima della segmentazione dei mitocondri, l'algoritmo di potenziamento delle particelle veniva applicato per ridurre il rumore delle immagini e rimuovere la luce di fondo, fuori fuoco, autofluorescenza e/o fluorescenza proveniente da legami non specifici. L'aumento delle particelle amplifica selettivamente il segnale da un dato diametro. Dopo la riduzione del rumore, i singoli mitocondri sono stati segmentati in 3D utilizzando l'algoritmo Blob Finder, che rileva oggetti in base ai massimi locali di intensità all'interno di un intervallo di dimensioni definito. Infine, la segmentazione degli oggetti riduce ogni taglio 2D a un'immagine binaria.

Per illustrare il flusso di lavoro di segmentazione, la Figura 2 presenta slice ottiche rappresentative in ogni fase della pipeline di elaborazione per campioni di controllo e trattati. L'immagine a fluorescenza grezzo mostra il segnale Tom20 non elaborato, che contiene una miscela di fluorescenza mitocondriale specifica e fondo indesiderato, luce fuori fuoco e autofluorescenza. Dopo l'applicazione del denomore per potenziamento particellare, il segnale di fondo è stato sostanzialmente ridotto e la fluorescenza residua è confinata a strutture discrete e ben definite (Figura 2). Questo si traduce in una rappresentazione più pulita dei confini mitocondriali, facilitando una segmentazione accurata.

L'output della segmentazione del Blob Finder è mostrato in verde. Per confermare che gli z-stack siano segmentati con precisione, le sezioni 2D denodatate con le associate immagini binarie segmentate sono state sovrapposte (Figura 2). Se il processo di segmentazione è sufficientemente ottimizzato, si dovrebbe osservare una forte e costante co-localizzazione della fluorescenza mitocondriale con gli oggetti binari. Se il processo di segmentazione è sovra-segmentazione (cioè, la suddivisione dei singoli mitocondri in più oggetti) o la sotto-segmentazione (cioè la combinazione di più mitocondri in uno), si adattano i parametri di segmentazione. L'ispezione visiva degli inserti conferma una segmentazione di alta qualità: gli oggetti rilevati co-localizzano con precisione il segnale di fluorescenza Tom20 denodata, senza alcuna evidenza di sovrasegmentazione, sovradimensionamento degli oggetti, fusione inappropriata di mitocondri spazialmente adiacenti in singoli oggetti, o generazione di oggetti spuri in regioni prive di alcun segnale Tom20. Questo livello di fedeltà di segmentazione è stato costantemente raggiunto sia su campioni di controllo che trattati, dimostrando che i parametri della pipeline ottimizzati nel software arivis di ZEISS sono robusti e generalizzabili tra i gruppi sperimentali. Insieme, questi risultati convalidano l'approccio di segmentazione e supportano l'affidabilità delle misurazioni morfologiche da esso derivate.

Gli oggetti segmentati possono essere misurati per parametri mitocondriali come volume, sfericità e superficie (Figura 3). Per tenere conto del gran numero di mitocondri rilevati per campione biologico e della non indipendenza dei singoli organelli all'interno di una cellula, sono stati calcolati valori mediani per campione e utilizzati come unità di confronto statistico. Le differenze tra gruppi sono state valutate utilizzando il test di Wilcoxon. I campioni trattati hanno mostrato un volume e una superficie mitocondriali significativamente maggiori rispetto ai controlli, indicando che la riprogrammazione chimica induce un rimodellamento sostanziale della morfologia mitocondriale.

Infine, i mitocondri segmentati possono essere classificati in diversi sottotipi^54,55 (Figura 4). Il metodo del^{gomito 56} è stato utilizzato per determinare il numero ottimale di cluster per il clustering k-media ^57,58 (Figura 4A). Successivamente, utilizzando k = 4 cluster, sottocampioni casuali di mitocondri per i gruppi di controllo e trattati sono stati tracciati tramite una riduzione della dimensionalità per approssimazione e proiezione uniforme della varietà (UMAP) (Figura 4B), colorati sia per sottotipo mitocondriale (a sinistra) sia per gruppo di trattamento (a destra). Infine, sono state tracciate le proporzioni di ciascun sottotipo mitocondriale (Figura 4C) per i gruppi Control e Treated. Nel gruppo trattato, vi sono stati meno mitocondri frammentati ma nessuna variazione significativa nella proporzione di mitocondri in rete o allungati.

Figura 1: Panoramica del protocollo. I topi vengono trattati con farmaci o un veicolo per un massimo di 6 settimane utilizzando l'impianto di minipompa osmotica sottocutanea (1). Dopo il trattamento, i tessuti del topo vengono sistemati, infiltrati con il saccarosio, incorporati nel composto OCT e criosezionati (2). Le sezioni tissutali vengono quindi colorate con anticorpi contro Tom20 e anticorpi secondari marcati con Alexa Fluor 568 (3). Gli z-stack a super-risoluzione vengono raccolti su un microscopio confocale a scansione puntuale Airyscan2 (4), e gli z-stack processati denosed sono segmentati in arivis per quantificare la morfologia mitocondriale (5). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Pipeline automatizzato per l'analisi della segmentazione mitocondriale e morfologia.
Singole fette ottiche rappresentative da campioni Control (pannelli superiori) e Treated (pannelli inferiori). Il segnale di immunofluorescenza Tom20 è mostrato in grigio (a sinistra). La stessa immagine dopo la riduzione del rumore viene visualizzata in grigio, seguita dall'output della segmentazione che evidenzia in verde gli oggetti mitocondriali rilevati. L'immagine unita mostra la sovrapposizione tra il segnale denosed e gli oggetti segmentati. Gli inserti mostrano viste a ingrandimento più elevato delle regioni indicate, illustrando gli effetti della riduzione del rumore e la precisione della segmentazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Morfologia mitocondriale nei gruppi di controllo e trattato. I box plot mostrano l'intervallo mediano ± interquartile dei valori mediani per campione (n = 10 per gruppo). Ogni punto rappresenta un campione biologico, riassunto come la mediana di tutti i mitocondri rilevati all'interno di quel campione. Volume e superficie sono visualizzati su una scala log₁₀ . I gruppi sono stati confrontati utilizzando i test di somma dei rangi di Wilcoxon. Livelli di significatività: ns p ≥ 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Classificazione morfometrica non supervisionata dei sottotipi mitocondriali. (A) Grafico del gomito che mostra la somma totale dei quadrati all'interno del cluster (WSS) in funzione del numero di cluster (k), calcolato su un sottocampione casuale di 10.000 mitocondri. Il punto di flessione a k = 4 è stato selezionato come numero ottimale di cluster per l'analisi a valle. (B) (Sinistra) Riduzione della dimensionalità UMAP delle caratteristiche morfometriche mitocondriali (n = 20.000 mitocondri campionati casualmente), colorata in base al sottotipo assegnato. Sono stati identificati quattro sottotipi morfologicamente distinti: frammentati (piccoli, alta sfericità), allungati (lunghi e bassi sferici), reticolati (grandi, irregolari) e intermedi. (Destra) Proiezione UMAP colorata per gruppo sperimentale (Controllo vs. Trattato) che mostra la distribuzione di ciascun gruppo nello spazio morfologico. (C) Proporzioni per campione di ciascun sottotipo mitocondriale in ogni gruppo sperimentale. Ogni punto dati rappresenta un campione biologico (n = 10 per gruppo). I diagrammi a scatole mostrano l'intervallo interquartile e la mediana, con baffi che si estendono fino a 1,5 volte l'intervallo interquartile. Le proporzioni dei sottotipi sono state confrontate tra i gruppi utilizzando il test della somma dei rangi di Wilcoxon, e i valori p sono stati corretti per confronti multipli utilizzando il metodo Benjamini-Hochberg. ns p ≥ 0,05, ****p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Esempio di pipeline arivis. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Script R per quantificare la morfologia mitocondriale e le popolazioni di sottotipi.Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

I due passaggi più critici per eseguire con successo questo protocollo sono (i) la chiusura dell'incisione durante l'impianto della pompa osmotica e (ii) una segmentazione accurata. Per il primo caso, fai particolare attenzione a creare una tasca sottocutanea abbastanza grande per la pompa, ma non troppo grande da far scivolare la pompa lungo il fianco dell'animale. Quando l'incisione è chiusa, la pompa deve essere posizionata sufficientemente lontano da non indurre alcuna tensione sulla pelle circostante, che potrebbe portare a deiscenza. Assicurati di tirare la pelle intorno all'incisione chiusa in tutte le direzioni per verificare che la ferita sia sufficientemente chiusa prima di iniziare il recupero dell'animale. Le clip per ferite sono vantaggiose perché sono rapide da applicare e rimuovere. Tuttavia, se sorgono problemi dovuti a non riuscire a chiudere correttamente le incisioni, possono essere utilizzate suture interrotte. Per quest'ultimo, una segmentazione accurata richiede di confrontare costantemente i risultati della segmentazione con le immagini denoasate fino a raggiungere una sufficiente somiglianza d'immagine. Le Z-stack di animali di controllo e trattati devono essere raccolte utilizzando gli stessi parametri di raccolta e preferibilmente durante la stessa sessione di imaging. Allo stesso modo, tutti i passaggi di elaborazione devono essere applicati a tutte le immagini usando esattamente gli stessi parametri. Il parametro di segmentazione del diametro definisce la dimensione attesa degli oggetti da rilevare. Un buon punto di partenza è la larghezza mitocondriale media misurata da pochi oggetti ispezionati manualmente usando una sola fetta ottica. La soglia di probabilità controlla la fiducia minima di rilevamento richiesta affinché un oggetto venga accettato. Valori più bassi aumentano la sensibilità e rilevano più oggetti, ma alcuni di questi oggetti possono essere falsi. Al contrario, valori più alti migliorano la specificità ma possono causare la perdita di oggetti con segnale più basso. Un intervallo iniziale raccomandato è dal 25%-30%. Infine, la sensibilità alla divisione determina quanto in modo aggressivo gli oggetti che toccano o si sovrappongono vengono separati in singoli oggetti. Una bassa sensibilità alla divisione lascerà i mitocondri raggruppati come singoli oggetti fusi. D'altra parte, un'elevata sensibilità alla divisione può causare una sovra-scissione dei mitocondri allungati o ramificati in frammenti. Valori compresi tra il 15% e il 30% sono ragionevoli per studi morfologici mitocondriali tipici. Se la segmentazione accurata risulta ancora difficile, la segmentazione può essere eseguita utilizzando il Mitochondry^{Analyzer 59} in FIJI⁶⁰. È stata recentemente descritta anche una pipeline semi-automatizzata per la quantificazione delle morfologie mitocondriali sia nelle celle che nei tessuti utilizzando il software Huygens Professional e uno script Python^{personalizzato 61}.

Una limitazione è il limite di risoluzione del microscopio confocale Airyscan2, che è di ~150 nm in XY e ~350 nm nel piano Z. Questo previene immagini ad alta risoluzione delle criste mitocondriali, poiché le distanze tra le singole criste sono di ~40–120^nm 62,63,64. Al contrario, la depletion di emissione stimolata (STED) può raggiungere limiti di risoluzione di ~20–50 nm lateralmente e può distinguere chiaramente le singole criste mitocondriali 62,63,64. Sono stati recentemente sviluppati diversi coloranti STED che permettono una colorazione e un'imaging efficaci della membrana interna mitocondriale sia in cellule vive che^fisse 63,64,65. Dato che l'analisi delle morfologie delle cristi può fornire informazioni sulla salute bioenergetica^{mitocondriale,} tali dati sono quindi desiderati. Tuttavia, la morfologia mitocondriale differisce fortemente tra i tessuti mammiferi e la coltura cellulare (discussa approfonditamente di seguito), e attualmente non esiste alcuna metodologia per colorare la membrana interna dei tessuti per l'imaging STED e l'analisi delle strutture delle cristi.

La quantificazione della morfologia mitocondriale in tessuto intatto presenta sfide uniche rispetto ai sistemi di coltura cellulare. Nelle cellule coltivate, i mitocondri sono tipicamente distribuiti in tutto il citoplasma in reti ben separate con una minima sovrapposizione tra le cellule. Nelle sezioni tissutali o nei preparati a montaggio completo, tuttavia, le cellule sono densamente impacchettate e i loro confini non sono ben definiti. Se è richiesta un'analisi a livello cellulare, dovrebbe essere incorporato un ulteriore marcatore fluorescente che miri alla membrana plasmatica o un marcatore specifico per il tipo cellulare, insieme a un corrispondente passaggio di segmentazione nella pipeline di analisi delle immagini per definire i confini cellulari individuali prima della quantificazione della morfologia mitocondriale. Una seconda differenza importante è che nelle cellule coltivate, i mitocondri spesso formano reti reticulari continue e interconnesse, facili da visualizzare e interpretare. Nei tessuti, questo schema è raramente osservato. Ad esempio, i mitocondri provenienti da sezioni epatiche mostrano un pattern puntito, bastoncino e fascio che occupa l'intero^{citosol 66}. Tuttavia, gli epatociti in coltura mostrano morfologie tubolari con formazioni di rete^{chiare 66}. Analogamente, confrontando i mitocondri provenienti da tessuto liscio con quelli delle cellule muscolari lisce in coltura, si osservano differenze distinte nelle loro morfologie e nei pattern di^{rete 67}. L'architettura tridimensionale, combinata con differenze specifiche per tipo cellulare nella distribuzione mitocondriale, fa sì che i mitocondri in questi tessuti appaiono come punti discreti e densamente impacchettati o frammenti brevi piuttosto che come reti allungate. Pertanto, è giustificata un'interpretazione cauta dei dati quando si confrontano le caratteristiche morfologiche tra tessuti e colture cellulari, poiché le differenze tra le due possono essere in parte attribuibili al contesto di imaging piuttosto che a una vera variazione biologica.

Un punto forte di questo protocollo è la capacità di misurare quantitativamente le strutture mitocondriali nei tessuti tramite microscopia luminosa. Sebbene esistano altri metodi per quantificare la morfologia mitocondriale da immagini microscopiche a super-risoluzione, molti di essi sono adatti solo per cellule in coltura. Inoltre, a differenza di altri metodi di analisi, la pipeline qui presentata è completamente automatizzata, quantifica sia le dimensioni mitocondriali sia le proporzioni dei sottotipi e richiede poca esperienza di codifica per essere eseguita con successo. La microscopia elettronica a scansione/trasmissione (SEM/TEM) e la crio-ET sono state precedentemente utilizzate per riprendere immagini delle strutture mitocondriali nei tessuti in 2D e 3D 10,68,69. Tuttavia, per il primo caso, ci sono preoccupazioni riguardo alla conservazione delle strutture native dopo la fissazione del campione, la disidratazione e l'incorporamento^70,71. Inoltre, la misurazione manuale dei parametri mitocondriali in FIJI⁶⁰ è talvolta il metodo di analisi preferito per le immagini^{TEM 72}, che richiede un lavoro significativo e può portare a bias del campione. Tuttavia, metodi di deep learning per la quantificazione automatica delle morfologie mitocondriali da immagini TEM sono stati recentemente^{descritti 73,74}. Un vantaggio dell'approccio presentato è che, una volta stabilita la pipeline di analisi, può elaborare immagini in batch con poco o nessun input da parte dell'utente. Per quest'ultimo, il congelamento ad alta pressione può preservare le strutture tissutali in condizioni quasi native⁷⁵. Tuttavia, il congelamento dei campioni crio-ET, la sezionamento, la fresatura, la raccolta e l'elaborazione dei dati richiedono tutti una formazione approfondita e attrezzature altamente avanzate. Al contrario, la microscopia confocale a super-risoluzione è relativamente più accessibile e richiede meno formazione e risorse per essere eseguita con successo.

Le impiantazioni della pompa osmotica possono essere eseguite in sicurezza su topi anziani per valutare gli effetti di diversi composti farmacologici sui declini fisiologici legati all'invecchiamento. Inoltre, i metodi descritti qui sono generalizzabili a molti organi diversi. È ben caratterizzato che i declini della funzione metabolica legati all'invecchiamento contribuiscono alle malattie e derivano da disfunzioni mitocondriali, uno dei tratti colloquiali dell'età^{a 76} anni. Inoltre, si comprende che le strutture mitocondriali informano la capacità bioenergetica mitocondriale e lo stato metabolico^77,78. Pertanto, valutare quantitativamente i composti per i loro effetti sulla struttura mitocondriale durante l'invecchiamento del topo, utilizzando i metodi qui descritti, può aiutare nell'identificazione di terapie che possano prolungare la durata della salute umana.

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Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Airyscan2 point scanning confocal microscope	ZEISS	LSM 980 with Airyscan2	ZEISS point scanning LSM 980 confocal built around a ZEISS Axio Observer Z1 and equipped with two multi-alkali PMTs and a GaASP 32 channel spectral detector, an environmental enclosure, and a Plan Apo 63×/1.4 Oil DIC III objective. The microscope used in this study is also equipped with two external NIR detectors, as well as the following laser lines: 405, 458, 488, 514, 561, 594, 639, and 730 nm.
Foglio di alluminio	Essendant	BWK7112
Bilancia analitica	Mettler Toledo	MR204
Piastra di vetro antiriflesso	Gel Company	LGI70
Software Arivis Pro	ZEISS	Versione 4.1.2
Ultrasuonificatore da bagno	Branson Ultrasonics	71020-MT
Albumina sierica bovina	Research Products International	A30075
Centrifuga, tubi da 15 mL	CELLTREAT	229411
Vetrini da microscopio caricati	Globe Scientific	1358W
Rimozione clip	Alzet	0009976
CO2	Airgas	CD 50
Contrad 70	Decon Labs	1003
Applicatori cotonati	Puritan Medical	25-8061WC
Criostato	Leica Biosystems	CM3050 S
Lamelle per criostato	Sakura Finetek USA Inc	4689
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Preparare a 5 mg/mL in ddH2O, porzionare e conservare a -20 °C al riparo dalla luce
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Sistema di colorazione vetrini EasyDip	Electron Microscopy Services	71388-01
Electro-Gel	Bio-Serv	EGS-1
Stampi per incorporazione, 22 mm ´ 22 mm ´ 20 mm	Polysciences	18646A-1
Etanolo, 200 proof	Decon Labs	V1001
Fondi sterili fenestrati	Dukal	20001
Pinzette fini	Fine Science Tools	11445-12
Sterilizzatore per perline di vetro	VWR	75999-324
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11036
Tappetino riscaldante	CVS	215313
Forcipi emostatici	World Precision Instruments	501705
Olio da immersione Immersol 518 F	ZEISS	433802-9010-000
Camera di induzione	World Precision Instruments	EZ178
Siringhe per insulina, 0,3 mL	BD	328431
Forbici chirurgiche Iris	Sklar Surgical Instruments	47-1135
Isoflurano	Patterson Veterinary	07-890-8115
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
Siringhe Luer-Lok da 1 mL	BD	309628
Siringhe Luer-Lok da 3 mL	BD	309657
Siringhe Luer-Lok da 50 mL	BD	309653
Meloxivet (meloxicam)	Patterson Veterinary	07-894-8524
Tubetti per microcentrifuga, 1,5 mL	CELLTREAT	229443
Scatola vetrini da microscopio	Heathrow Scientific	15994E
Vetrino di copertura per microscopio, #1.5, 22 mm ´ 50 mm	Electron Microscopy Services	72204-04
Incubatore non CO2	Benchmark Scientific	H2200-H
Fondi sterili non fenestrati	Dukal	20-002
OCT Compound	Sakura Finetek USA Inc	4583
Unguento oftalmico	Patterson Veterinary	07-888-2572
Minipompe osmotiche	Alzet	2004
Parafilm	Bemis	PM999
Paraformaldeide, 4% p/v	Santa-Cruz Biotechnology	sc-281692
PBS, 1×	Thermo Scientific	10010023
PEG300	Sigma-Aldrich	90878
Filtri per siringhe PES, 0,22 µm	CELLTREAT	229747
Bacilletti di iodio povidone al 10% USP	Medline	MDS093901ZZ
ProLong Glass Antifade	Invitrogen	P36980
Anticorpo anti-Tom20 di coniglio	Novus Biologicals	NBP2-67501
Lamelle per rasoio, 0,22 mm	VWR	55411-050
Rotatore/giraarrosti	Labnet	H5500
RStudio	The R Project for Statistical Computing	versione 4.3.2
Bilancia	Fisher Scientific	S72422
Sistema di anestesia a basso flusso SomnoSuite	Kent Scientific	SS-01
Strisce indicatori per sterilizzazione a vapore	Crosstex	SIS-250
Flaconi di vetro sterili, 5 mL	Thermo Scientific	ST5
Aghi sterili, 0,5", 23 G	BD	305145
Aghi sterili, 0,5", 27 G	BD	305109
Borse per sterilizzazione	Cardinal Health	92510
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S9378	Preparare una soluzione del 30% p/v in PBS 1×
Forbici chirurgiche	3M	9680
Gu