Presentiamo qui un protocollo di dissezione che preserva la ghiandola pineale, spesso persa durante il prelievo del cervello dalla volta cranica. Questo protocollo garantisce il mantenimento della ghiandola pineale in preparati cerebrali di topo embrionali e postnatale precoci per applicazioni successive, inclusi immunohistochimica, ibridazione in situ e trascrittomica spaziale.
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Articolo metodologico
Preservazione della ghiandola pineale nelle preparazioni di cervello di topo perinatale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La ghiandola pineale, una struttura neuroendocrina che secerne melatonina, si forma a partire da un abbozzo situato alla linea mediana dorsale del proencefalo embrionale. Al giorno embrionale (E) 14,5 nel topo, si osserva un diverticolo pineale che si estroflette dal tetto del diencefalo tra le vescicole telencefaliche appaiate. Questo diverticolo è in stretto contatto con il tessuto cartilagineo sovrastante, nonché con i tessuti meningeo e vascolare. È facilmente perdibile quando si apre la volta cranica per estrarre il cervello in fasi embrionali avanzate o postnatali precoci. Nonostante il suo importante ruolo neuroendocrino, lo sviluppo iniziale della ghiandola pineale e i meccanismi di segnalazione che regolano questo processo rimangono poco compresi, anche a causa della difficoltà di preservare intatta questa struttura durante le fasi embrionali dello sviluppo cerebrale del topo.
Questo articolo presenta una procedura innovativa di dissezione che preserva la ghiandola pineale mantenendone l'integrità strutturale e il collegamento con la parete dorsale del diencefalo durante l'isolamento del cervello, dalle fasi embrionali fino al settimo giorno postnatale (P7). La procedura viene dimostrata utilizzando un cervello di topo a 18,5 giorni embrionali ed è quindi adatta ad applicazioni successive che richiedono il mantenimento dell'architettura tissutale, inclusa l'ibridazione in situ, l'immunohistochimica e la trascrittomica spaziale. Il protocollo può essere impiegato anche per isolare la ghiandola pineale in via di sviluppo, migliorando così la rappresentatività specifica della pineale nelle analisi trascrittomiche e proteomiche, che risulta altrimenti difficoltosa a causa delle ridotte dimensioni dell'organo.
Introduzione
La ghiandola pineale è una piccola struttura neuroendocrina situata alla linea mediana dorsale del cervello dei vertebrati e svolge un ruolo centrale nella regolazione della fisiologia circadiana attraverso la secrezione ritmica di melatonina1,2. Durante l'embriogenesi dei mammiferi, la ghiandola pineale si origina dalla linea mediana dorsale del prosencefalo in via di sviluppo. Nei topi, lo sviluppo della ghiandola pineale inizia quando una regione specializzata del neuroepitelio diencefalico dorsale forma l'abbozzo pineale/recesso pineale, che successivamente evagina per formare il diverticolo pineale al giorno embrionale (E) 14,53,4,5. Questo diverticolo è attaccato al tetto del diencefalo ed è visibile tra le vescicole telencefaliche appaiate. Procedendo lo sviluppo, questo diverticolo si associa strettamente con le strutture sovrastanti localizzate alla linea mediana dorsale del cervello, in particolare con il seno sagittale superiore (SSS) e il seno trasverso (TS), canali venosi che decorrono lungo la superficie dorsale del prosencefalo6. La ghiandola pineale in via di sviluppo si trova immediatamente al di sotto dell'intersezione tra SSS e TS, e il suo fragile attaccamento al diencefalo dorsale risulta particolarmente vulnerabile quando le strutture vascolo-meningee sovrastanti vengono rimosse per estrarre il cervello dalla volta cranica7. Ciò rende la ghiandola pineale particolarmente suscettibile a lesioni, poiché può essere strappata durante l'apertura della volta cranica per l'estrazione del cervello. Di conseguenza, la ghiandola pineale viene spesso persa durante dissezioni di routine, il che limita l'analisi della sua struttura e composizione molecolare in preparati integri.
In questo studio, descriviamo un protocollo passo dopo passo per dissezionare il cervello del topo preservando la ghiandola pineale e il suo attacco al tetto del diencefalo. Il metodo è applicabile a stadi embrionali da E16.5 fino ai primi stadi postnatali (P7) ed è adatto per studi sullo sviluppo della ghiandola pineale mediante ibridazione in situ, immunohistochemia e trascrittomica spaziale. A dimostrazione delle applicazioni successive, vengono presentate l'ibridazione in situ e l'immunohistochemia per il marcatore arricchito nella pineale CRX.
L'innovazione fondamentale di questo metodo consiste nel ridurre al minimo lo stress sulle strutture mediane rimuovendo con attenzione le connessioni fisiche che altrimenti strapperebbero la ghiandola pineale quando il cervello viene estratto dalla volta cranica. Questo rappresenta un miglioramento rispetto alla procedura standard.
Questo metodo di dissezione è limitato alle fasi fino a P7 poiché l'ossificazione progressiva della volta cranica durante lo sviluppo postnatale precoce aumenta la rigidità del cranio e rafforza la sua associazione con le strutture meningee e vascolari. Sebbene diversi studi abbiano descritto procedure di dissezione della ghiandola pineale in roditori adulti8, pochissimi si sono concentrati sul mantenimento della ghiandola pineale durante le fasi embrionali e postnatali precoci, quando la ghiandola è particolarmente fragile e suscettibile a danni durante l'isolamento del cervello.
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Protocollo
Tutte le procedure sono approvate e condotte in conformità con il Comitato Etico per gli Animali dell'Istituto Tata di Ricerca Fondamentale.
1. Preparazione dei materiali
- Assicurarsi che tutti gli strumenti necessari per la microdissezione (vedere la Tabella dei Materiali) siano pronti prima della procedura. Sterilizzare tutti gli strumenti utilizzando etanolo al 70%. Per raccogliere preparati destinati a applicazioni successive come la trascrittomica spaziale o ibridazione in situ, pulire gli strumenti con soluzione decontaminante per RNasi.
- Pulire il piano del microscopio per dissezione con soluzione decontaminante per RNasi e tenere a portata di mano una bottiglia di PBS 1× freddo su ghiaccio vicino al banco di dissezione.
- Preparare in anticipo i seguenti strumenti e materiali in plastica prima di questa procedura:
- Per la preparazione dell'animale, tenere pronti: 2 paia di pinzette ottuse, 1 paio di forbici chirurgiche, 2 piastre di Petri (10 cm), diverse piastre di Petri (6 cm; secondo necessità, una per ogni testa).
- Per l'isolamento del cervello, tenere pronti: 1 paio di pinzette #5, 1 paio di pinzette #55, 1 paio di forbici per microdissezione e provette/piastre di raccolta adatte all'applicazione successiva.
- NOTA: Se l'applicazione successiva prevede ibridazione in situ o trascrittomica spaziale, pulire gli strumenti di dissezione con soluzione decontaminante per RNasi prima dell'uso.
2. Preparazione dell'animale
- Seguire i passaggi (2.1.1–2.1.6) per animali E14,5–P0
- Eutanasia la femmina gravida in conformità con le linee guida del Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell'Istituto. Nell'esempio mostrato, l'animale è stato eutanasato mediante dislocazione cervicale.
- Praticare un'incisione mediana nella cavità addominale della femmina incinta per esporre l'utero. Utilizzando pinze a punta smussata, estrarre delicatamente le corna uterine e posizionarle in una piastra sterile da 10 cm contenente 1× PBS.
- Isolare con attenzione i singoli feti separandoli dalla sacca amniotica circostante e dalla placenta.
- Trasferire i feti in una nuova piastra di Petri da 10 cm contenente 1× PBS e mantenere sul ghiaccio fino al momento dell'isolamento del cervello. Trasferire un singolo feto in una piastra di Petri da 6 cm contenente PBS freddo.
- Per le fasi postnatali fino a P7, eutanasia il cucciolo in conformità con le linee guida del Comitato Etico per gli Animali Istituzionale. Proseguire quindi dal passaggio 2.1.6 in avanti.
- Utilizzando un paio di forbici chirurgiche, separare la testa dal corpo in modo che il romboencefalo rimanga incluso nella testa, al fine di proteggere il proencefalo da danni accidentali.
- Lavare la testa con PBS freddo per rimuovere il sangue. Trasferirla in una nuova piastra Petri da 6 cm contenente 1× PBS. Mantenere la testa immersa nel PBS per consentire la rimozione del sangue e dei detriti durante i successivi passaggi di dissezione.
3. Procedura di dissezione per isolare il cervello con la ghiandola pineale integra
NOTA: Tutti i passaggi seguenti devono essere eseguiti utilizzando un microscopio stereoscopico. Regolare l'ingrandimento a un minimo di 2× (o secondo necessità) per visualizzare chiaramente il cervello e le strutture circostanti durante tutta la dissezione. L'intero processo di dissezione deve essere eseguito in PBS ghiacciato per minimizzare la degradazione di RNA e proteine. Per i passaggi 3.1–3.10, utilizzare la mano non dominante per tenere saldamente la testa e stabilizzarla durante tutta la procedura, come indicato nel passaggio 3.1. I passaggi 3.2–3.9 devono essere eseguiti mantenendo la testa stabilizzata con la mano non dominante, mentre la mano dominante esegue le operazioni che richiedono abilità motorie fini, iniziando con una pinzetta #5, passando poi alla pinzetta #55 o al bisturi per microdissezione, come specificato per ciascun passaggio.
- Utilizzare una pinzetta #5 nella mano non dominante. Inserire i due rebbi nelle orbite oculari con un movimento deciso verso il basso. Mantenere una pressione costante verso il basso per fissare il cervello al fondo della piastra di Petri fino al completamento del passaggio 3.9.
NOTA: Il cervello si trova al di sopra delle orbite oculari e non viene influenzato dall'inserimento della pinzetta nelle orbite. Mantenere una pressione costante verso il basso stabilizza il cervello durante tutta la dissezione. - Con la mano dominante, afferrare e rimuovere la pelle che ricopre la testa utilizzando una pinzetta #5.
NOTA: A questo stadio, si osserva il cranio cartilagineo liscio che ricopre il cervello. - Rimuovere la porzione del cranio cartilagineo che sovrasta il mesencefalo e il romboencefalo come segue:
- Utilizzare la pinzetta #5 per praticare due incisioni penetranti nel cranio cartilagineo su entrambi i lati del mesencefalo, proprio nel punto in cui si congiunge con il telencefalo.
- Fare scivolare un rebbio della pinzetta #5 tangenzialmente sotto il cranio cartilagineo lungo la linea tangenziale immaginaria che separa il telencefalo dal mesencefalo. Afferrare saldamente e strappare il cranio cartilagineo.
- Continuare a rimuovere il cranio cartilagineo in modo da esporre il mesencefalo e il romboencefalo.
- Passare alla pinzetta #55. Inserire un rebbio appena sotto il margine caudale del cranio cartilagineo che sovrasta il telencefalo. Separare delicatamente il cranio cartilagineo staccando eventuali connessioni con i tessuti vascolari e meningei.
- Utilizzando un paio di forbici per microdissezione, tagliare lungo la linea mediana dorsale del telencefalo in direzione del bulbo olfattivo. Utilizzando una pinzetta #55 chiusa, rimuovere delicatamente eventuali aderenze del cranio cartilagineo al cervello. Separare le due metà del cranio cartilagineo che ricoprono gli emisferi telencefalici utilizzando la pinzetta #5.
NOTA: A questo stadio, la vena SSS appare come un vaso di colore rosso scuro lungo il margine superiore del cranio cartilagineo nel cervello, mentre la TS appare ortogonale rispetto alla SSS. - La ghiandola pineale si trova immediatamente al di sotto della SSS. Praticare un'incisione all'estremità rostrale della SSS utilizzando un paio di forbici per microdissezione.
- Utilizzando una pinzetta #55, rimuovere completamente la porzione dorsale del cranio cartilagineo da ciascun lato per esporre meglio la pineale, la SSS e la TS.
- Praticare due incisioni nella TS su entrambi i lati della ghiandola pineale, utilizzando un paio di forbici per microdissezione. Utilizzando una pinzetta #55, staccare le aderenze laterali della TS.
- Utilizzando una pinzetta #5 chiusa, staccare delicatamente la porzione rostrale del cervello dalla volta cranica ventrale. Far scivolare la pinzetta chiusa sotto la faccia ventrale del cervello, staccandolo completamente.
- Conservare il cervello con la ghiandola pineale integra, come appropriato per ulteriori applicazioni successive.
4. Passaggi critici nel protocollo
NOTA: Il successo di questo protocollo di dissezione dipende dalla manipolazione accurata degli attacchi vascolari che circondano la ghiandola pineale. I seguenti punti sono fondamentali per mantenere la ghiandola pineale integra durante tutta la procedura di dissezione:
- Stabilizzare la testa inserendo i rebbi di una pinza n. 5 in entrambe le orbite oculari e mantenere una pressione ferma verso il basso durante tutti i passaggi da 3.1 a 3.9. Questo fornisce un supporto stabile evitando al contempo pressioni dirette sul cervello.
- Durante la rimozione del condrocranio (passaggio 3.3), evitare trazioni eccessive o movimenti di distacco, poiché potrebbero causare il distacco della ghiandola pineale dal diencefalo dorsale.
- Durante l'eliminazione degli attacchi meningei e vascolari (passaggio 3.4) e l'apertura del condrocranio telencefalico dorsale (passaggio 3.5), utilizzare esclusivamente le punte della pinza n. 55. Una penetrazione profonda della pinza potrebbe danneggiare la ghiandola pineale, situata immediatamente al di sotto della porzione caudale del tetto telencefalico.
- Completare la sezione del seno sagittale superiore (passaggio 3.6) e la sezione bilaterale del seno trasverso (passaggio 3.8) prima di estrarre il cervello. Questi tagli alleviano la tensione all'interno della rete venosa dorsale e prevengono lo strappo della ghiandola pineale durante la rimozione del cervello.
- Al passaggio 3.9, staccare delicatamente il cervello utilizzando la pinza chiusa, senza disturbare la linea mediana dorsale. Il cervello dovrebbe staccarsi liberamente dalla volta cranica una volta che tutti gli attacchi meningei e vascolari sono stati recisi.
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Risultati
Questo protocollo di dissezione consente l'isolamento riproducibile di cervelli di topo embrionali e nei primi stadi postnatale da E16,5 a P7, mantenendo la ghiandola pineale nella sua posizione anatomica originale (Figura 1).
La rimozione progressiva del cranio cartilagineo, unita a un'accurata eliminazione degli attacchi meningei e vascolari, previene stress di taglio involontari sulla ghiandola pineale. Inoltre, il taglio controllato del seno sagittale superior...
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Discussione
Sono stati sviluppati metodi standardizzati per la dissezione della ghiandola pineale nel cervello fetale/infantile umano, utili ai patologi forensi per comprendere la causa della sindrome della morte improvvisa del lattante11. Protocolli precedenti hanno dimostrato l'asportazione della ghiandola pineale insieme alla vascolarizzazione superficiale, alle meningi e al plesso coroideo12; tuttavia, metodi in grado di conservare in modo affidabile una ghiandola pineale integra, ...
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Dichiarazioni
Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il dottor Shital Suryavanshi e il personale dell'animal house del Tata Institute of Fundamental Research per il loro eccellente supporto. Ringraziamo il dottor Sundar Naganathan per aver generosamente concesso l'utilizzo del microscopio stereo macro zoom Olympus MVX10 nel suo laboratorio per la registrazione del video della procedura. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Dipartimento per l'Energia Atomica (DAE), Governo dell'India, numero di identificazione del progetto RTI4003 e RTI4015 (ST); sovvenzione ICMR-DHR SUG, GAP00303, sovvenzione ANRF PMECRG GAP00313 (AP).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio a campo chiaro | Olympus | IX73 | Qualsiasi microscopio a campo chiaro dotato di una telecamera a colori è adatto. |
| Microscopio confocale | Olympus | FV3000 | Qualsiasi microscopio confocale o microscopio ad epifluorescenza è adatto, a seconda della risoluzione richiesta |
| Anticorpo anti-CRX | Invitrogen | PA5-32182 | Protocollo di immunostaining descritto in Parichha et al.9. |
| Sonda CRX | Prodotto su misura | Prodotto su misura | Protocollo di ibridazione in situ di Parichha et al.10. |
| Pinzette fini # 5 | F.S.T | 11251-23 | Può essere sostituita con strumenti simili di qualsiasi azienda. |
| Pinzette fini # 55 | F.S.T | 11255-20 | Può essere sostituita con strumenti simili di qualsiasi azienda. |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | Può essere sostituito con prodotti simili di qualsiasi azienda. |
| Piastra di Petri | Corning | CLS351029 | Può essere sostituita con prodotti simili di qualsiasi azienda. |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9782 | La soluzione di decontaminazione RNaseZap è una soluzione per la decontaminazione delle superfici che distrugge le RNasi al contatto |
| Forbici a molla (forbici per microdissezione) | F.S.T | 15020-15 | Può essere sostituita con strumenti simili di qualsiasi azienda. |
| Microscopio stereozoom | Nikon | SMZ745 | Qualsiasi microscopio per dissezione è adatto |
Riferimenti
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- Rath MF, Rohde K, Klein DC, Møller M. Homeobox genes in the rodent pineal gland: roles in development and phenotype maintenance. Neurochem Res. 2013;38(6):1100-12.
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Ristampe e permessi
