Questo studio descrive un modello in vitro. per valutare gli effetti protettivi del Sanqi Baiji San contro il danno delle cellule epiteliali gastriche indotte dall'etanolo e il suo coinvolgimento nella segnalazione correlata a PI3K/AKT.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo di ricerca
Questo studio descrive un modello in vitro. per valutare gli effetti protettivi del Sanqi Baiji San contro il danno delle cellule epiteliali gastriche indotte dall'etanolo e il suo coinvolgimento nella segnalazione correlata a PI3K/AKT.
Questo lavoro mirava a chiarire il meccanismo protettivo del Sanqi Baiji San (SQBJ) contro il danno delle cellule epiteliali gastriche indotte dall'etanolo ed esplorare la sua potenziale rilevanza per l'ulcera gastrica (GU). La farmacologia di rete è stata utilizzata per selezionare i componenti attivi di SQBJ (Traditional Chinese Chinese Systems Pharmacology Database and Analysis Platform [TCMSP], Bioavailability Orale [OB] ≥ 20%, Drug-Likeness [DL] ≥ 0,1), mappare i loro target (Universal Protein Resource [UniProt]), raccogliere bersagli correlati alle GU (GeneCards/OMIM/DrugBank) e analizzare bersagli sovrapposti tramite arricchimento e docking molecolare tramite Gene Ontology (GO)/Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Le cellule della linea cellulare epiteliale gastrica (GES-1) danneggiate dall'etanolo sono state trattate con SQBJ o con l'inibitore PI3K LY294002. CCK-8 è stato utilizzato per determinare la concentrazione ottimale di SQBJ. Le analisi di farmacologia di rete hanno identificato 126 bersagli comuni arricchiti all'interno delle cascate correlate a PI3K/AKT/MAPK e hanno suggerito potenziali interazioni tra i principali costituenti di SQBJ e le proteine correlate a PI3K/AKT. Nelle cellule sfidate con etanolo, SQBJ alleviava il danno cellulare riducendo il rilascio infiammatorio dei mediatori e lo stress ossidativo, come dimostrato dalla diminuzione delle specie reattive intracellulari di ossigeno e dai livelli di malondialdeide. SQBJ ha ripristinato il potenziale della membrana mitocondriale e il contenuto di ATP e ha ridotto i cambiamenti associati all'apoptosi nei livelli di linfoma a cellule B-2, caspasi-3 tagliata e proteina X associata a Bcl-2. SQBJ modulava anche i marcatori di segnalazione associati a PI3K/AKT e MAPK. Questi effetti protettivi sono stati in gran parte indeboliti dalla LY294002, suggerendo che la segnalazione correlata a PI3K/AKT sia coinvolta nella citoprotezione mediata da SQBJ. Questi risultati forniscono una base meccanicistica in vitro per la potenziale applicazione della SQBJ nella GU, anche se è necessaria ulteriore validazione su modelli animali di ulcere gastriche indotte da etanolo.
L'ulcera gastrica (GU) è un disturbo gastrointestinale altamente diffuso a livello mondiale, caratterizzato da infiammazione localizzata, erosione e ulcerazione della mucosa gastrica. Secondo le stime fornite dall'analisi Global Burden of Disease (GBD 2021) del 2021, la malattia delle ulcere peptiche (PUD) continua a imporre un notevole onere clinico ed economico a milioni di pazienti in tutto il mondo. Sebbene la prevalenza complessiva del PUD sia diminuita con la diffusa ed estesa dipendenza clinica da regimi anti-infettivi e da inibitori della pompa protonica (PPI) soppressori di acido, questa tendenza al ribasso si è stabilizzata, con un rimbalzo osservato anche in alcuneregioni. In particolare, il consumo di alcol (etanolo) è un fattore patogeno critico indipendente dall'infezione da Helicobacter pylori (H. pylori) e dall'uso di farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS). L'assunzione eccessiva di alcol a lungo termine danneggia la barriera mucosa gastrica, accelera lo sviluppo delle ulcere e persino aumenta la suscettibilità alle neoplasie gastriche—rendendo così questa condizione una crisi sanitaria internazionalecritica 2. Nei paesi in via di sviluppo, l'incidenza delle lesioni della mucosa gastrica legata all'alcol è in aumento a causa di molteplici fattori, tra cui l'aumento del consumo di alcol e i cambiamenti nello stile di vita, creando un'urgente necessità di strategie di prevenzione e trattamento efficaci e sicure.
Il meccanismo patologico alla base della lesione della mucosa gastrica indotta dall'etanolo è multifattoriale e multistrato. Al contatto diretto con la mucosa gastrica, l'etanolo interrompe rapidamente la barriera muco-bicarbonato e provoca un'ondata incontrollata di specie reattive intracellulari dell'ossigeno (ROS). Questo scatto ossidativo instiga successivamente la perossidazione lipidica (caratterizzata da un aumento del malondialdeide, MDA), impolora gli antiossidanti endogeni all'interno del rivestimento dello stomaco, inclusa la dismutasia superossida (SOD), insieme al glutatione (GSH), e infine induce disfunzionemitocondriale 3. Le evidenze accumulate indicano che l'ROS intracellulare indotta dall'etanolo deriva principalmente dai mitocondri ed è strettamente collegata al collasso del potenziale della membrana mitocondriale interna (Δψm) e all'inibizione della sintesi dell'adenosina trifosfato(ATP) 4. Nel frattempo, lo stress ossidativo attiva ulteriormente le cascate pro-infiammatorie sotto il comando del fattore nucleare-kappa B (NF-κB). Questa attivazione promuove successivamente il rilascio massiccio di mediatori infiammatori, principalmente fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) e proteina C-reattiva (CRP), formando così un circolo vizioso di "risposta infiammatoria ossidativa-stress"5. Su questa base, la cascata apoptotica intrinseca guidata dai mitocondri viene innescata, come dimostrato da un rapporto interrotto di Bcl-2 rispetto a Bax insieme alla scissione proteolitica enzimatica sequenziale della proteinasi specifica di cysteinyl aspartate 3 (Caspasi-3), che porta infine a una morte massiccia delle cellule epiteliali mucosate gastrica e alla formazionedi ulcere 6. Di conseguenza, il targeting simultaneo dei tre legami patologici principali dello stress ossidativo, della risposta infiammatoria e dell'apoptosi rappresenta una strategia chiave per l'intervento efficace nella lesione della mucosa gastrica alcolica.
La via di segnalazione della fosfoinositide 3-chinasi/protein chinasi B (PI3K/AKT) costituisce un asse regolatore centrale che governa la longevità cellulare, la proliferazione e la morte programmata, svolgendo una funzione vitale nella preservazione dell'omeostasi della mucosa gastrica. Dopo l'attivazione, la segnalazione PI3K/AKT fosforila molteplici substrati a valle, inibisce l'attività del fattore pro-apoptotico Bad, ostacolando così la fuga mitocondriale del citocromo c, distruttivo per cellule, mantenendo l'omeostasi di ΔΨm e promuovendo la sopravvivenzacellulare 7. Inoltre, esiste una complessa comunicazione antagonista tra la cascata PI3K/AKT e le reti di proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK): l'attivazione al rialzo di PI3K/AKT può attenuare la trasduzione del segnale infiammatorio e le reazioni a cascata apoptotiche inibendo l'attivazione delle chinasi dello stress, tra cui p38, la chinasi N-terminale c-Jun (JNK) e le chinasi proteiche regolate extracellulari (ERK)8. Numerosi studi hanno indicato che la riduzione dell'attività della via PI3K/AKT è strettamente associata a un'infiammazione aggravata e a un aumento dell'apoptosi nei modelli di lesioni della mucosa gastrica, mentre il ripristino dell'attività di questa via può migliorare significativamente la lesionemucosa. Tuttavia, attualmente manca una verifica sperimentale causale sistematica riguardo al meccanismo regolatore preciso di PI3K/AKT nella lesione mucosa gastrica indotta da etanolo, in particolare la sua relazione sinergica con la via MAPK.
In termini di farmacoterapia moderna, i PPI rappresentano l'opzione di prima linea per la gestione clinica della GU, ma la loro somministrazione a lungo termine ha sollevato crescenti preoccupazioni per la sicurezza. Studi accumulati hanno collegato l'uso cronico di PPI a una varietà di esiti avversi, tra cui malattie renali, eventi cardiovascolari, fratture osteoporotiche, carenze nutrizionali (ferro, magnesio e vitamina B12), infezione da Clostridioides difficile. e persino un rischio aumentato di cancrogastrico 10. Inoltre, il fenomeno dell'ipersecrezione di acido gastrico a rimbalzo dopo l'interruzione dei PPI è stato confermato dai dati di farmacovigilanza su largascala 11. Questi rischi per la sicurezza hanno spinto sia le comunità cliniche che quelle di ricerca di base a esplorare attivamente terapie alternative con meccanismi protettivi multi-bersaglio, effetti collaterali minimi e idoneità per un uso a lungo termine. In particolare, le preparazioni a base di composti naturali della medicina tradizionale cinese (MTC) hanno attirato ampia attenzione grazie al loro concetto terapeutico olistico di azione "multi-componente, multi-bersaglio e multi-percorso" 12.
La polvere Sanqi Baiji (SQBJ) è una formula classica composta della MTC composta da Panax notoginseng e Bletilla striata con un rapporto di massa di 1:1. Panax notoginseng è noto per i suoi effetti nel favorire la circolazione sanguigna e fermare il sanguinamento, oltre ad alleviare il gonfiore doloroso. I suoi principali costituenti bioattivi, tra cui il notoginsenoside R1 insieme ai ginsenosidi (Rg1, Rb1), esercitano significativi effetti antinfiammatori, antiossidanti e riparatori della mucosa. La bletilla striata si caratterizza per i suoi effetti astringenti che fermano il sanguinamento, riducono il gonfiore e favoriscono la rigenerazione dei tessuti danneggiati. Contemporaneamente, il polisaccaride di Bletilla striata (BSP), che funge da principale estratto attivo, ha documentato l'efficacia nella soppressione della cascata MAPK JNK/p38, riducendo così l'espressione di interleucina-1β (IL-1β), TNF-α e IL-6, e aumentando la capacità di difesa antiossidante della mucosagastrica 13. Le evidenze accumulate nella letteratura hanno verificato che la co-somministrazione di Panax notoginseng. saponine (PNS) e BSP esercita un effetto sinergico nei modelli14 di ulcere gastriche alcoliche, e i preparati correlati alla SQBJ hanno mostrato effetti protettivi mucosi significativi in studi preclinici su esofagite da reflusso e ulcerapeptica 15. Tuttavia, attualmente non esiste una verifica sperimentale in vitro sistematica del meccanismo della via di segnalazione alla base dell'effetto protettivo della mucosa gastrica della SQBJ, in particolare del ruolo centrale della via PI3K/AKT e della sua relazione regolatoria con la MAPK. Nel frattempo, l'associazione causale tra le sostanze chimiche costituenti fondamentali e i recettori funzionali della SQBJ deve ancora essere completamente chiara.
Per colmare queste lacune, il presente studio ha adottato una strategia di ricerca integrata che combina farmacologia di rete e verifica sperimentale in vitro , impiegando la linea cellulare GES-1 con sfida con etanolo come piattaforma sperimentale per indagare il potenziale meccanismo molecolare alla base degli effetti protettivi epiteliali gastrici della SQBJ, con enfasi sullo stress ossidativo, risposte infiammatorie, processi apoptotici e segnalazione correlata a PI3K/AKT, e cambiamenti associati al MAPK. Per prima cosa, abbiamo utilizzato l'inibitore PI3K LY294002 per valutare preliminarmente il coinvolgimento della segnalazione PI3K/AKT e abbiamo riscontrato che inibire questa via attenuava l'effetto protettivo di SQBJ, suggerendo che la segnalazione correlata a PI3K/AKT contribuisca alla citoprotezione mediata da SQBJ. In secondo luogo, abbiamo esplorato l'associazione tra i cambiamenti correlati a PI3K/AKT e la regolazione delle vie MAPK, fornendo prove preliminari che i cambiamenti di segnalazione MAPK possano essere collegati alla modulazione SQBJ della risposta funzionale dell'asse PI3K/AKT. Collettivamente, questo lavoro stabilisce un quadro molecolare invitro per valutare come la SQBJ mitighi la lesione epiteliale gastrica indotta dall'etanolo e fornisce prove preliminari per ulteriori esplorazioni delle formule composte della MTC nella lesione mucosa gastrica alcolica. Tuttavia, sono ancora necessari esperimenti sugli animali per confermare se questi effetti protettivi cellulari possano essere tradotti in vivo. Efficacia terapeutica all'interno dei modelli sperimentali di ulcera gastrica causata da alcol (Figura Supplementare S1).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Questo studio non ha coinvolto partecipanti umani, campioni di tessuto umano, campioni clinici o esperimenti sugli animali. Risorse di database pubbliche e anonimizzate sono state utilizzate per l'analisi farmacologica di rete, mentre cellule GES-1 commercialmente disponibili sono state impiegate per esperimenti in vitro. Pertanto, non erano necessarie un'approvazione etica formale e un consenso informato. Informazioni dettagliate sui principali reagenti, anticorpi, kit di analisi, strumenti, produttori, numeri di catalogo e Identificatori delle Risorse di Ricerca (RRID), dove applicabile, sono riassunte nella Tabella dei Materiali.
Preparazione e controllo qualità dell'estratto acquoso di SQBJ
Materiali erboristici
Le materie prime di Panax notoginseng (Burk.), F. H. Chen (radice e rizoma) e Bletilla striata.(Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (tuber) sono stati ottenuti da un fornitore commerciale di medicina tradizionale cinese e successivamente autenticati da un farmacista senior della MTC a seguito della Farmacopea Cinese (edizione 2025). Esemplari voucher (n. SQBJ-20240301, n. PN-20240301, n. BS-20240301) sono stati depositati nell'erbario della nostra istituzione. Le due erbe venivano tritate e mescolate in un rapporto di massa di 1:1 per preparare la polvere di SQBJ.
Preparazione dell'estratto acquoso di SQBJ
La polvere di SQBJ ha subito due estrazioni successive per reflusso con acqua deionizzata a un rapporto solido-liquido di 1:10 (g/mL) per 1 ora per sessione. Successivamente, gli estratti raccolti venivano combinati e passati attraverso quattro strati di garza medica per rimuovere il materiale residuo. Il filtrato risultante veniva concentrato a pressione ridotta a 60 °C fino a raggiungere una densità relativa di 1,05–1,10, seguito da liofilizzazione in vuoto per ottenere polvere di estrazione acquosa SQBJ, con una resa finale di estrazione del 18,2% ± 0,6%. La polvere estratta veniva sigillata e conservata a −20 °C, sciolta in un mezzo DMEM senza siero e successivamente passata attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm per la sterilizzazione prima degli esperimenti cellulari.
Controllo qualità dell'estratto acquoso SQBJ
Per valutare la consistenza batch a batch e la standardizzazione dell'estratto acquoso SQBJ, abbiamo condotto una determinazione quantitativa insieme al profilaggio delle impronte digitali ad alta performance (HPLC). La Tabella dei Materiali elenca i parametri tecnici completi riguardanti il sistema HPLC. Basandoci sui profili chimici di entrambe le erbe costituenti, abbiamo preso di mira quattro marcatori rappresentativi: notoginsenoside R1, ginsenosido Rg1, ginsenoside Rb1 e militarine. Tuttavia, questa strategia di controllo qualità basata su HPLC rifletteva principalmente diversi componenti rappresentativi e non forniva un profilo chimico completo di tutti i composti attivi in SQBJ.
La separazione cromatografica è stata ottenuta tramite una colonna C18 a fase inversa (4,6 mm × 250 mm, 5 μm). Il funzionamento è stato mantenuto a una temperatura di colonna di 30 °C, con portata di 1,0 mL/min, un volume di iniezione di 10 μL e una lunghezza d'onda di rilevamento di 203 nm. La composizione della fase mobile era composta da acetonitrile (A) e soluzione acquosa fosforica (B) allo 0,1%, utilizzando la seguente eluzione a gradiente: 0–15 min, 19% A; 15–35 min, 19%–35% A; 35–55 min, 35%–55% A; e 55–60 min, 55%–19% A. Informazioni dettagliate su strumenti e colonne sono fornite nella Tabella dei Materiali.
Preparazione della sostanza di riferimento
Per effettuare un'analisi quantitativa, abbiamo acquisito standard commerciali per notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 e militarine, tutti con purezza ≥ 98%. I singoli prodotti di riferimento sono stati misurati con precisione e disciolti in un singolo stocco di metanolo per ottenere una soluzione di riferimento mista uniforme con una concentrazione finale di 50 μg/mL per ogni componente.
Preparazione di esempio:
La polvere secca estratto acquoso SQBJ (50 mg) è stata misurata con precisione, seguita da una dissoluzione utilizzando 25 mL di metanolo di grado analitico. Questa miscela è stata sottoposta a un trattamento a bagno ultrasonico per 30 minuti sotto parametri controllati di strumentazione (potenza: 250 W; frequenza: 40 kHz). Dopo l'equilibrio di nuovo alla temperatura ambiente della stanza, il liquido è passato attraverso una membrana filtrante organica di 0,22 μm per ottenere la soluzione analitica finale di prova.
Risultati della determinazione del contenuto:
I conti medi dei componenti caratteristici principali in tre lotti consecutivi di estratto acquoso SQBJ erano i seguenti: notoginsenoside R1 3,12 ± 0,11 mg/g, ginsenoside Rg1 8,45 ± 0,23 mg/g, ginsenoside Rb1 5,26 ± 0,18 mg/g, e militarine 2,78 ± 0,09 mg/g, con il contenuto RSD di ciascun componente < 5% tra un lotto e l'altro, confermando una buona consistenza l'estratto da lotto.
Dichiarazione etica e di conformità
Non sono stati coinvolti né test sugli animali né l'inclusione di campioni clinici umani, biopsie tissutali e soggetti vivi durante tutto lo studio. L'analisi farmacologica della rete è stata effettuata utilizzando database pubblici disponibili, tra cui TCMSP, UniProt, GeneCards, OMIM, DrugBank, STRING, Metascape, PubChem e RCSB PDB. Tutti i dati recuperati da questi database erano accessibili al pubblico e anonimizzati; Pertanto, il profiling bioinformatico era completamente esente dalla necessità di un consenso informato formale o di un ulteriore controllo etico.
Gli attuali esperimenti in vitro sono stati condotti utilizzando la linea cellulare epiteliale della mucosa gastrica umana GES-1, disponibile in commercio. Non sono state utilizzate cellule umane primarie né materiali biologici derivati dal paziente. La linea cellulare è stata ottenuta da un deposito cellulare autenticato e gestita in conformità con le linee guida istituzionali per la biosicurezza e le colture cellulari. Poiché questo studio coinvolgeva solo linee cellulari consolidate e database pubblici disponibili, fu esente dall'approvazione formale del comitato etico istituzionale. Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con i requisiti di sicurezza del laboratorio e di conformità alla ricerca istituzionali pertinenti.
Studi di farmacologia di rete
Identificazione e screening dei bersagli dei principi attivi
I componenti attivi di Panax notoginseng e Bletilla striata., le due erbe costitutive di SQBJ, sono stati recuperati da database pubblici disponibili. Tutte le informazioni derivate dal database utilizzate in questo studio erano accessibili al pubblico e non contenevano informazioni personali identificabili. Utilizzando nomi botanici come ricerche, abbiamo identificato fitochimici candidati dal Traditional Chinese Chinese Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP). Per identificare molecole bioattive idonee, il protocollo di screening ha applicato soglie di biodisponibilità orale (OB) ≥ 20% e somiglianza farmacologica (DL) ≥ 0,1. Successivamente, abbiamo identificato i potenziali bersagli genici a valle associati a questi componenti candidati, omettendo qualsiasi costituente senza bersagli genici validi corrispondenti. Tutti i geni target sono stati annotati e standardizzati tramite l'Universal Protein Resource (UniProt), limitando la ricerca nel database di riferimento esclusivamente a Homo sapiens, generando così la lista finale dei geni target per i componenti attivi funzionali di SQBJ.
Recupero di bersagli legati alla patologia
Per compilare i geni collegati alla condizione, abbiamo consultato tre database pubblici: GeneCards, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) e DrugBank, con "ulcera gastrica" come termine di ricerca. Il dataset multipiattaforma è stato successivamente unificato, seguito dall'eliminazione delle voci ridondanti per stabilire una lista standardizzata dei geni target associati alle ulcere gastriche.
Costruzione di rete per ingredienti, obiettivi e malattie
Abbiamo determinato i geni bersaglio sovrapposti tra i componenti attivi di SQBJ e l'ulcera gastrica. Successivamente, è stata costruita una rete di interazione multilivello utilizzando software di visualizzazione della rete. Per valutare l'importanza del nodo, l'algoritmo integrato di valutazione topologica calcolò i parametri topologici di ciascun nodo, inclusi i gradi e la centralità intermedia. Sulla base di questi valori calcolati, abbiamo identificato i componenti attivi e i principali obiettivi funzionali della SQBJ nel trattamento dell'ulcera gastrica.
Mappatura delle reti di interazione proteina-proteina (PPI)
I target di consenso identificati condivisi tra SQBJ e ulcera gastrica sono stati incrociati con il database STRING. La nostra query specificava il modello di analisi multi-proteinica, limitando però il background analitico a Homo sapiens. Gli IPP sono stati filtrati con una soglia minima di confidenza nell'interazione di media fiducia (> 0,4).
I record di connettività funzionale risultanti venivano esportati come file TSV, che successivamente venivano integrati in un software dedicato di visualizzazione di rete per l'analisi PPI. Basandoci sulla topografia di connessione calcolata, abbiamo valutato i nodi funzionali principali della rete classificando il valore specifico di grado di ciascun nodo.
Annotazione funzionale a valle e mappatura dei percorsi
Per chiarire i ruoli biologici dei nodi di intersezione condivisi, abbiamo condotto un'analisi di arricchimento funzionale con Gene Ontology (GO) e un'analisi di arricchimento delle vie della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) utilizzando uno strumento di annotazione bioinformatica accessibile via web. La classificazione funzionale classifica i geni in tre categorie classiche: processo biologico (BP), componente cellulare (CC) e funzione molecolare (MF). Sono stati generati diagrammi a bolle e diagrammi a barre per i risultati dell'arricchimento utilizzando una piattaforma online di tracciamento bioinformatica per mappare i processi biologici primari e le vie di segnalazione associati all'effetto terapeutico della SQBJ sull'ulcera gastrica.
Simulazione computazionale di aggancio molecolare
I file di geometria spaziale dei componenti attivi principali di SQBJ venivano scaricati da database composti pubblici e successivamente salvati come file MOL2 tramite software di elaborazione file. Abbiamo inoltre ottenuto le strutture cristalline tridimensionali delle proteine bersaglio centrali interrogando la Protein Data Bank. Queste strutture macromolecolari sono state preprocessate rimuovendo liganti originali e molecole d'acqua, e i modelli puliti risultanti sono stati salvati in formato PDB. Per simulare l'energetica del legame ricevitore-ligando, la verifica di aggancio tra componenti attivi centrali e proteine target è stata eseguita tramite software standard di aggancio molecolare computazionale. I risultati dell'attracco sono stati ottimizzati e renderizzati utilizzando software di visualizzazione molecolare.
Coltura cellulare
Le cellule epiteliali gastriche di origine umana GES-1 sono state coltivate utilizzando un mezzo RPMI-1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina–streptomicina a 37 °C sotto un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂. Abbiamo identificato la coltura di origine come una linea cellulare consolidata, ottenendo lo stock iniziale da un archivio di celle autenticato. A una confluenza osservata dell'80–90%, i monostrati sono stati risciacquati 2 volte con PBS seguiti da distacco usando tripsina-EDTA allo 0,25% per 2 minuti a 37 °C. Per terminare la reazione di scindimento enzimatico, abbiamo introdotto un volume uguale di mezzo completo. La sospensione cellulare risultante veniva centrifugata a 1.000 × g per 5 minuti, dopo di che il pellet veniva risospeso in un mezzo fresco e completo e riseminato alla densità appropriata. Le colture sono state riportate a condizioni di incubazione identiche. Durante tutto il periodo di propagazione, è stato utilizzato un microscopio a contrasto di fase invertito per valutare la vitalità, la morfologia e lo stato di crescita cellulare, e le cellule nella loro fase logaritmica di crescita venivano raccolte di routine per analisi a valle.
Stabilimento e trattamento del modello di lesione cellulare GES-1 indotto dall'etanolo
Le cellule GES-1 in fase logaritmica sono state seminate a 5 × 105 cellule per pozzo in piastre a 6 pozzi o 1 × 104 cellule per pozzo in piastre a 96 pozzi e incubate durante la notte per aderire. La lesione indotta dall'etanolo è stata stabilita esponendo le cellule a 500 mmol/L etanolo in RPMI-1640 non integrato per 4 ore. Questa condizione è stata selezionata sulla base di esperimenti preliminari di concentrazione e risposta nel tempo. Nel test preliminare, 250 mmol/L di etanolo per 4 ore ha causato solo lievi lesioni, con la vitalità cellulare rimasta intorno al 78,6 ± 5,4%, mentre 750 mmol/L etanolo ha ridotto la vitalità al 32,8 ± 4,7%, indicando citotossicità eccessiva. L'esposizione a 500 mmol/L di etanolo per 4 ore ha ridotto la vitalità cellulare al 54,7 ± 4,9%, che ha prodotto lesioni riproducibili da moderate a gravi mantenendo al contempo cellule sufficienti per interventi successivi e test meccanicistici. Pertanto, fu selezionato etanolo di 500 mmol/L per 4 ore per la realizzazione del modello. Questa condizione è stata utilizzata per simulare in vitro una lesione epiteliale acuta indotta dall'etanolo e non riproduce completamente il modello fisiologico di esposizione della mucosa gastrica in vivo.
Per l'intervento farmacologico, sono state selezionate tre concentrazioni di estratto acquoso di SQBJ (5, 10 e 50 μg/mL) e somministrate immediatamente dopo la sfida con etanolo. Nel braccio inibitore PI3K, le cellule sono state preincubate con 20 μmol/L LY294002 per 30 minuti prima del co-trattamento con etanolo e della concentrazione ottimale di SQBJ. Una coorte di controllo positiva ha ricevuto 20 μmol/L omeprazolo immediatamente dopo l'esposizione all'etanolo. L'omeprazolo è stato utilizzato come agente gastroprotettivo di riferimento piuttosto che come comparatore di dose equivalente. La concentrazione è stata selezionata sulla base di una valutazione preliminare della citotossicità e su intervalli di intervento in vitro comunemente utilizzati, ed era intesa a fornire un riferimento farmacologico per la protezione cellulare. Le celle di controllo sono state mantenute in un mezzo completo senza etanolo o agenti aggiuntivi. Tutte le incubazioni sono state condotte in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂ a 37 °C. Ogni gruppo sperimentale comprendeva almeno tre pozzi replicati, e l'intero protocollo veniva eseguito indipendentemente 3 volte.
Determinazione della concentrazione ottimale di SQBJ tramite il metodo CCK-8
Gli elementi log-phase HGE/GES-1 sono stati placcati in vettori a 96 pozzi con una densità di 1 × 104 cellule/pozzo e incubati durante la notte in un mezzo RPMI-1640 completo in condizioni standard (37 °C, 5% CO₂) per garantire l'aderenza. Le colture sono state randomizzate in quattro gruppi: controllo con veicolo (solo mezzo completo), intervento SQBJ a basso dosaggio (5 μg/mL), intervento SQBJ a dosaggio medio (10 μg/mL) e intervento SQBJ ad alta dose (50 μg/mL); queste tre concentrazioni sono state utilizzate per lo screening terapeutico e preparate dissolvendo l'SQBJ in PBS. Tutte le condizioni sono state analizzate in almeno tre pozzi paralleli e il protocollo totale è stato ripetuto in tre distinti lotti sperimentali. Dopo il periodo di trattamento designato, ogni pozzo riceveva 10 μL di reagente CCK-8, seguiti da un periodo di incubazione di 2 ore a 37 °C. La densità ottica (OD) a 450 nm veniva misurata utilizzando un lettore di microplacche. La percentuale di vitalità cellulare è stata calcolata come (absorbance_treatment / absorbance_control) × 100%, permettendo di identificare la concentrazione più efficace di SQBJ per gli esperimenti successivi.
qPCR
Gli elementi GES-1 in fase logaritmica sono stati coltivati in piastre a 6 pozzi (5 × 105 cellule/pozzo) e mantenuti durante la notte a 37 °C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO₂ per consentire l'adesione. Successivamente, le cellule sono state esposte alla concentrazione predefinita ottimale di SQBJ e prelevate alla base (0 ora) e a 6, 12, 24 e 48 ore dopo il trattamento per determinare la risposta dinamica delle molecole di segnalazione. Sulla base dei risultati del corso temporale, l'intervallo di 24 ore è stato scelto per i successivi saghi meccanicistici perché mostrava la risposta di segnalazione più forte mantenendo la vitalità cellulare stabile. Ogni punto temporale era rappresentato da tre pozzi triplicati e l'intero esperimento veniva ripetuto indipendentemente 3 volte.
Abbiamo isolato l'RNA totale utilizzando un reagente specializzato per l'estrazione, valutando la concentrazione e la qualità della resa con uno spettrofotometro. Tutti i campioni hanno mostrato un rapporto di assorbanza A₂₆₀/A₂₈₀ nell'intervallo di 1,8 e 2,0. Un kit di trascrizione inversa con tergicristallo gDNA è stato utilizzato per trascrivere inversamente cDNA da 1 μg di RNA totale. L'analisi PCR in tempo reale è stata eseguita tramite un sistema quantitativo di PCR con primer per PI3K, AKT, p38, JNK, ERK e il gene di riferimento GAPDH. I dettagli del sistema PCR, dei reagenti e del servizio di sintesi degli innesco sono dettagliati nella Tabella dei Materiali. I primer sono stati progettati per specifiche regioni dei corrispondenti geni umani. Protocollo qPCR: attivazione a caldo a 95 °C per 30 secondi, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 5 secondi e ricottezza/estensione a 60 °C per 30 secondi. Il calcolo dell'espressione dell'mRNA del gene target si basava sul metodo relativo quantitativo della PCR con il metodo 2-ΔΔCt .
ELISA
I soprannatanti sono stati raccolti e eliminati tramite centrifugazione a 1.200 × g per 10 minuti a 4 °C per la rimozione dei detriti cellulari. I livelli di mediatori infiammatori (CRP, IL-6, TNF-α) e gli indici di stress ossidativo (SOD, MDA, GSH) sono stati valutati utilizzando kit ELISA commerciali seguendo le indicazioni specifiche dei produttori. I profili di concentrazione di questi target sono stati verificati con formulazioni di saghi commerciali secondo le istruzioni dei fornitori. Ogni gruppo sperimentale comprendeva tre pozzi replicati, e la procedura fu eseguita in tre diversi lotti di colture cellulari per confermare la riproducibilità dei dati sperimentali. Per breve, 100 μL di standard o supernatanti chiarificati venivano erogati in piastre di reazione pre-rivestite e incubati a 37 °C per 90 minuti. Dopo tre cicli di lavaggio consecutivi, ogni cavità riceveva 100 μL dell'anticorpo specifico di rilevamento per un'incubazione di 60 minuti a 37 °C, seguita da altri tre cicli di lavaggio. Successivamente, è stata introdotta una soluzione di substrato (100 μL), e i campioni sono stati protetti dalla luce per 15 minuti prima di bloccare la reazione enzimatica con 50 μL di soluzione di stop. La densità ottica a 450 nm veniva rilevata tramite un lettore di microplacche. Le concentrazioni sono state interpolate dalle corrispondenti curve standard. Per minimizzare il bias causato da differenze nel numero cellulare o da cambiamenti indotti dal trattamento nella vitalità cellulare, i profili MDA, SOD, GSH, CRP, TNF-α e IL-6 sono stati calibrati rispetto ai contenuti proteici di ciascun campione analitico, come determinato dal test BCA, ed espressi come valori relativi rispetto al gruppo di controllo.
Rilevamento di ROS intracellulari nelle cellule GES-1 tramite sonda fluorescente DCFH-DA
Per quantificare i livelli di specie reattive intracellulari di ossigeno (ROS), abbiamo utilizzato l'indicatore fluorogeno permeabile alla membrana DCFH-DA. Le cellule prelevate sono state risospese in RPMI-1640 non integrato contenente 10 μmol/L DCFH-DA e mantenute per 20 minuti in condizioni standard di coltura (37 °C, 5% CO₂) al buio. Dopo tre lavaggi successivi con mezzo senza siero fino a sonda libera non legata, l'intensità della fluorescenza è stata monitorata tramite citometria di flusso con eccitazione di 488 nm e emissione di 525 nm. I livelli relativi di ROS sono stati riportati come intensità media di fluorescenza per ciascun gruppo di trattamento, normalizzati al numero di cellule vitali determinato in pozzi paralleli tramite il saggio CCK-8, ed espressi rispetto al gruppo di controllo corrispondente.
Determinazione del potenziale della membrana mitocondriale (ΔΨm)
Abbiamo valutato le variazioni del potenziale della membrana mitocondriale (ΔΨm) utilizzando un kit commerciale di saggio JC-1. In breve, le cellule raccolte venivano risospese in una soluzione lavorativa JC-1 appena preparata—una miscela a pari volume di colorante JC-1 e tampone di colorazione fornita dal kit—fino a una concentrazione finale di 1 × 106 cellule/mL. Dopo un'incubazione di 20 minuti a 37 °C in un ambiente umidificato contenente il 5% di CO₂, protetto dalla luce per evitare lo sbiancamento, il campione è stato prelevato tramite centrifugazione (800 × g., 5 minuti) e risciacquato una volta con 1 mL di tampone di colorazione JC-1 raffreddato in ghiaccio. La fluorescenza è stata successivamente acquisita tramite citometria a flusso.
Gli aggregati di JC-1 (indicativo di ΔΨm intatta) sono stati monitorati tramite il canale FL2 utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione da 488 nm e emissione di 590 nm, mentre i monomeri di JC-1 (indicativo della dissipazione di ΔΨm) sono stati tracciati tramite il canale FL1 utilizzando impostazioni di eccitazione a 488 nm e emissione di 525 nm. Il ΔΨm era espresso come la proporzione del segnale di fluorescenza rosso-verde; i valori di calo indicano la depolarizzazione mitocondriale.
Determinazione del livello intracellulare di ATP
La funzionalità mitocondriale è stata valutata tramite quantificazione intracellulare dell'ATP utilizzando un kit di analisi ATP. Una reazione bioluminescente luciferina–luciferasi è stata impiegata per determinare il contenuto di ATP, che è direttamente proporzionale all'attività mitocondriale. Per un breve periodo, le cellule prelevate venivano risospese in un buffer di lisi ATP gelato e conservate per una finestra di lisi di 5 minuti sul ghiaccio. La centrifugazione è stata poi eseguita a 12.000 × g per 5 minuti a 4 °C, dopo di che 20 μL del soprantantante liberato sono stati trasferiti su micropiastre opache bianche a 96 pozzi. Successivamente, in ciascuna cavità sono stati introdotti 100 μL di soluzione di lavoro per la rilevazione di ATP appena preparata—un mix di reagente luciferasi e substrato di luciferina preparati seguendo il protocollo fornito. Il segnale di luminescenza risultante veniva subito catturato con un lettore di microplacche di luminescenza. Per ottenere livelli relativi di ATP, i valori di luminescenza grezza sono stati normalizzati alle singole concentrazioni proteiche supernatanti totali quantificate con un kit commerciale di analisi delle proteine BCA, correggendo così le variazioni nel numero cellulare.
Rilevamento dell'apoptosi cellulare tramite doppia colorazione Annexin V/PI
La rilevazione delle cellule apoptotiche è stata effettuata con una configurazione commerciale di test di morte cellulare Annexin V-FITC/PI come descritto dal produttore. Dopo il lavaggio, i pellet sono stati risospesi nel tampone di legame Annexin V-FITC a una densità cellulare di 1 × 106 cellule/mL (195 μL per campione). Successivamente, ogni tubo indipendente riceveva 5 μL di Annexin V-FITC seguiti da 10 μL di soluzione di colorazione PI. Il campione è stato vortizato delicatamente e incubato al buio a temperatura ambiente per 15 minuti. A seguito di questo processo, le cellule apoptotiche venivano monitorate tramite un citometro a flusso. I rispettivi canali fluorescenti facilitavano la differenziazione tra cellule vitali (Annexin V⁻/PI⁻), celle apoptotiche precoci (Annexin V⁺/PI⁻) e celle tardo apoptotiche/necrotiche (Annexin V⁺/PI⁺). La percentuale di cellule apoptotiche in ciascun gruppo è stata quantificata seguendo questi parametri di gating.
Tachia occidentale
Le membrane sono state incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro Bcl-2, Bax, Caspasi-3 scindata, AKT, p38 MAPK, JNK, ERK1/2 e GAPDH. Gli anticorpi sono stati selezionati in base alle informazioni di validazione per campioni umani e applicazioni western blot. Gli RRID sono stati aggiunti per tutti gli anticorpi con registrazioni disponibili nel Registro degli Anticorpi o nel Portale RRID. I livelli di proteine target sono stati normalizzati in GAPDH. Dopo i protocolli di lavaggio standard, i tagli sono stati esposti ad anticorpi secondari coniugati con HRP per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande sono state rilevate utilizzando una soluzione di substrato ECL. I valori di grigio delle bande western blot sono stati valutati utilizzando software di analisi digitale delle immagini.
Colorazione immunofluorescenza
I monostrati GES-1 sono stati installati su vetri di copertura all'interno di piastre a 24 pozzi prima dei trattamenti indicati. Dopo il trattamento, la fissazione è stata eseguita utilizzando paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente, seguita dalla permeabilizzazione della membrana usando Triton X-100 allo 0,3% in PBS per 10 minuti, e bloccamento con albumina sierica al 5% per 30 minuti a 37 °C. I coverslip sono stati poi trasferiti per incubazione notturna a 4 °C con anticorpi primari mirati su AKT, p38, JNK ed ERK. Dopo tre successivi lavaggi PBS, i campioni sono stati incubati per 1 ora a temperatura ambiente con un anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con fluorescenza protetto dalla luce. La controcolorazione DAPI è stata applicata per 5 minuti per visualizzare i nuclei. Successivamente furono montati i coperti con reagente anti-sbiadimento e la raccolta dati utilizzava un microscopio laser confocale per determinare la distribuzione subcellulare delle proteine bersaglio. Tutte le immagini di immunofluorescenza sono state catturate con gli stessi parametri di imaging utilizzando una lente obiettivo del 20×. Barre di scala corrispondenti a 50 μm sono state aggiunte a tutte le immagini rappresentative di immunofluorescenza.
Analisi statistica
I valori quantitativi sono illustrati come la media ± deviazione standard (SD), provenienti da almeno tre esecuzioni sperimentali indipendenti con ciascun campione verificato in triplice. Le analisi statistiche sono state condotte tramite strumenti specializzati di analisi numerica. Per determinare variazioni distinte tra più coorti, abbiamo utilizzato l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) insieme al test post hoc di Tukey per i confronti intergruppi. Una soglia a due code di P < 0,05 di significatività statistica designata.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dissezione bioinformatica dei meccanismi mediati da SQBJ nell'ulcera gastrica
Per esplorare come la SQBJ possa esercitare le sue azioni farmacologiche su GU, abbiamo inizialmente previsto i bersagli corrispondenti ai suoi principali costituenti bioattivi. Utilizzando la programmazione R, abbiamo estratto e eliminato voci ridondanti tra questi componenti bioattivi, ottenendo infine 411 candidati bersagli. Successivamente, bersagli patologici collegati a GU sono stati r...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
L'obiettivo principale di questa indagine era valutare se SQBJ, una formula classica composta dalla MTC composta da Panax notoginseng e Bletilla striata, possieda attività citoprotettiva contro danni epiteliali della mucosa gastrica scatenati dall'etanolo all'interno di un modello cellulare GES-1, con coinvolgimento della segnalazione correlata a PI3K/AKT e riduzioni associate nei mediatori infiammatori, negli indicatori di stress ossidativo, nella disfunzione mitocondr...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Questo studio è stato finanziato dal Progetto Generale del Piano di Sviluppo della Scienza e della Tecnologia della Medicina Tradizionale Cinese della Provincia del Jiangsu (2023), Numero di Progetto: MS2023118.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Assay di apoptosi | Kit di rilevamento dell'apoptosi Annexin V-FITC/PI | Beyotime | C1062L |
| Assay di ATP | Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 |
| Buffer | PBS | Solarbio | — |
| Reagent di digestione cellulare | 0,25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 |
| Linea cellulare | Cellule epiteliali della mucosa gastrica umana GES-1 | Banca cellulare, Accademia Cinese delle Scienze | SCSP-533 |
| Assay di vitalità cellulare | Reagent CCK-8 | — | — |
| Microscopio confocale | Microscopio confocale LSM 880 | Zeiss | LSM 880 |
| Mezzo di coltura | RPMI-1640 | Gibco | — |
| Kit ELISA | Kit ELISA per CRP umana | R&D Systems | DCPR00 |
| Kit ELISA | Kit ELISA per IL-6 umana | R&D Systems | DTAM00D |
| Kit ELISA | Kit ELISA per TNF-α umano | R&D Systems | — |
| Citometria a flusso | FACSCalibur / FACSCanto II | BD Biosciences | — |
| Materiale erboristico | Bletilla striata (Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (tuber) | Mercato di medicina tradizionale cinese di Anguo | Voucher No. BS-20240301 |
| Materiale erboristico | Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (radice e rizoma) | Mercato di medicina tradizionale cinese di Anguo | Voucher No. PN-20240301 |
| Materiale erboristico | Polvere di Sanqi Baiji San | Preparazione interna | Voucher No. SQBJ-20240301 |
| Colonna HPLC | Colonna ZORBAX SB-C18 | Agilent Technologies | 4,6 mm × 250 mm, 5 μm |
| Sistema HPLC | Sistema HPLC 1260 Infinity II | Agilent Technologies | 1260 Infinity II |
| Anticorpo secondario IF | Anti-IgG di coniglio coniugato con Alexa Fluor 594– | Invitrogen | A11012 |
| Microscopio invertito | Microscopio a contrasto di fase invertito CKX41 | Olympus | CKX41 |
| Lettore di luminescenza | Lettore di micropiastre Infinite 200 PRO | Tecan | Infinite 200 PRO |
| Membrana | Membrana PVDF | Millipore | IPVH00010 |
| Lettore di micropiastre | Lettore di micropiastre iMark | Bio-Rad | iMark |
| Kit per potenziale di membrana mitocondriale | Kit di assay JC-1 | Beyotime | C2006 |
| Colorante nucleare | DAPI | Beyotime | C1002 |
| Piattaforma online | Piattaforma di tracciamento bioinformatico online | Piattaforma di analisi online bioinformatica | Piattaforma online |
| Piattaforma online | Piattaforma di analisi di arricchimento basata sul web | Metascape | Piattaforma online |
| Assay di stress ossidativo | Kit di assay GSH | Beyotime | S0052 |
| Assay di stress ossidativo | Kit di assay MDA | Beyotime | S0131 |
| Assay di stress ossidativo | Kit di assay SOD | Beyotime | S0109 |
| Inibitore PI3K | LY294002 | MCE | S1105 |
| Farmaco di controllo positivo | Omeprazol | MCE | HY-B0053 |
| Anticorpo primario | AKT | Cell Signaling Technology | 4691 |
| Anticorpo primario | Bax | Cell Signaling Technology | 5023 |
| Anticorpo primario | Bcl-2 | Cell Signaling Technology | 15071 |
| Anticorpo primario | Cleaved Caspase-3 Asp175 | Cell Signaling Technology | 9664 |
| Anticorpo primario | ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 4695 |
| Anticorpo primario | GAPDH | Abcam | ab8245 |
| Anticorpo primario | JNK / SAPK-JNK | Cell Signaling Technology | 9252 |
| Anticorpo primario | p-AKT Ser473 | Cell Signaling Technology | 4060 |
| Anticorpo primario | p-ERK1/2 Thr202/Tyr204 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| Anticorpo primario | p-JNK Thr183/Tyr185 | Cell Signaling Technology | 4668 |
| Anticorpo primario | p-p38 MAPK Thr180/Tyr182 | Cell Signaling Technology | 4511 |
| Anticorpo primario | p-PI3K p85 Tyr458 / p55 Tyr199 | Cell Signaling Technology | 4228 |
| Anticorpo primario | p38 MAPK | Cell Signaling Technology | 8690 |
| Anticorpo primario | PI3K p85 | Cell Signaling Technology | 4257 |
| Primo | Primo AKT | — | — |
| Primo | Primo AKT inverso | — | — |
| Primo | Primo ERK | — | — |
| Primo | Primo ERK inverso | — | — |
| Primo | Primo GAPDH | — | — |
| Primo | Primo GAPDH inverso | — | — |
| Primo | Primo JNK | — | — |
| Primo | Primo JNK inverso | — | — |
| Primo | Primo p38 | — | — |
| Primo | Primo p38 inverso | — | — |
| Primo | Primo PI3K: | — | — |
| Primo | Primo PI3K inverso | — | — |
| Inibitore proteasico | PMSF | Beyotime | ST506 |
| Assay di proteine | Kit di assay di proteine BCA | Beyotime | P0010 |
| Buffer di lisi delle proteine | Buffer RIPA | Beyotime | P0013B |
| Database pubblico | DrugBank | DrugBank Online | Database online |
| Database pubblico | GeneCards | Istituto Weizmann delle Scienze | Database online |
| Database pubblico | Online Mendelian Inheritance in Man | Università Johns Hopkins | Database online |
| Database pubblico | Database di composti PubChem | Centro Nazionale per le Informazioni sulle Biotecnologie | Database online |
| Database pubblico | RCSB Protein Data Bank | RCSB PDB | Database online |