Dispositivo portatile per il pretrattamento della saliva al fine di migliorare la rilevazione del cortisolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo rapido di pretrattamento per la saliva per migliorare la rilevazione del cortisolo. Un dispositivo di filtrazione portatile viene utilizzato per rimuovere mucine e altre sostanze interferenti preservando l'analita bersaglio. La saliva pretrattata mostra un flusso capillare migliorato, consentendo così prestazioni di analisi più costanti e riproducibili.

Abstract

La rilevazione del cortisolo salivare offre un'alternativa non invasiva all'analisi basata sul sangue. Tuttavia, la sua implementazione pratica rimane limitata dalla viscosità intrinseca della saliva e dalla presenza di componenti interferenti. In particolare, mucine e proteine salvari ostacolano il flusso guidato dai capillari e compromettono l'affidabilità dei successivi saggi a flusso laterale (LFA), rendendo così necessarie strategie di pretrattamento efficaci e accessibili. Qui presentiamo un dispositivo portatile di pretrattamento della saliva, chiamato SaliFilter, per la rilevazione del cortisolo nel punto di cura. Il dispositivo impiega un meccanismo di filtrazione che rimuove selettivamente componenti interferenti ad alto peso molecolare, consentendo al contempo il passaggio di piccole molecole, incluso il cortisolo. Azionata con una semplice pressione manuale, consente una rapida elaborazione dei campioni (~2 min) senza la necessità di apparecchiature esterne, rendendola adatta a contesti decentralizzati. Le prestazioni del dispositivo sono state valutate utilizzando misurazioni di torbidità, quantificazione proteica e SDS-PAGE, che hanno confermato l'efficace rimozione di mucina e proteine salivari. I campioni trattati hanno mostrato un flusso capillare migliorato, con conseguente funzionamento stabile e affidabile del LFA. L'analisi quantitativa ha dimostrato un miglioramento della riproducibilità del segnale, e la rilevazione del cortisolo ha raggiunto un limite di rilevamento di 1,47 ng mL⁻¹ rispetto a intervalli di concentrazione clinicamente rilevanti. Questo protocollo stabilisce una strategia efficace di pretrattamento della saliva che migliora la sensibilità analitica e l'affidabilità senza compromettere l'integrità dell'analita. L'approccio proposto offre una soluzione pratica e portatile per la diagnostica a base di saliva, con potenziale applicabilità per test al punto di cura e automonitoraggio.

Introduzione

Il cortisolo, un ormone glucocorticoide secreto dalla corteccia surrenale, è un biomarcatore chiave per valutare lo stress^{fisiologico 1,2}. Può essere misurata in molteplici fluidi biologici, inclusi siero, plasma, urina, liquido interstiziale e saliva, con sangue e saliva i più comunemente utilizzati nella pratica^{clinica 3}. Sebbene le misurazioni basate sul sangue forniscano informazioni quantitative affidabili, richiedono una venpuntura invasiva e personale addestrato, il che ne limita l'idoneità per un monitoraggio frequente o ^{longitudinale 4,5,6}. Al contrario, la misurazione del cortisolo salivare offre un'alternativa non invasiva e comoda, che consente applicazioni di assistenza e automonitoraggio ^7,8. In particolare, i livelli di cortisolo salivare sono fortemente correlati con le concentrazioni ematiche, supportando la saliva come campione surrogato^{affidabile 9}. Tuttavia, la viscosità intrinseca della saliva e la presenza di componenti interferenti ostacolano significativamente le prestazioni analitiche, rendendo necessario un pretrattamento efficace prima dell'analisi 10,11,12.

Sono state esplorate varie strategie di pretrattamento per affrontare queste sfide. La centrifugazione è ampiamente utilizzata per rimuovere componenti di grandi dimensioni come mucine, proteine e detriti cellulari. Tuttavia, richiede attrezzature di laboratorio ingombranti e molteplici fasi di lavorazione, il che ne limita l'applicabilità in contesti^{decentralizzati 13,14}. La diluizione con soluzioni tampone può ridurre la viscosità e migliorare il flusso del^{campione 15}. Tuttavia, riduce contemporaneamente la concentrazione degli analitis, compromettendo così la sensibilità analitica. Di conseguenza, gli approcci esistenti rimangono insufficienti per le applicazioni point-of-care, dove un elaboramento rapido e senza attrezzature e la conservazione degli analiti target sono essenziali.

Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato SaliFilter, un dispositivo portatile per il pretrattamento della saliva pensato per il rilevamento del cortisolo nel punto di cura. Il dispositivo impiega un meccanismo di filtrazione che rimuove selettivamente sostanze interferenti ad alto peso molecolare, permettendo al contempo il passaggio di piccole molecole, incluso il^{cortisolo 16}. Azionato manualmente, il dispositivo consente un'elaborazione rapida e intuitiva senza la necessità di strumenti esterni. Eliminando i componenti interferenti, questo approccio migliora il flusso capillare nei saghi a flusso laterale, aumentando così l'affidabilità analitica. Questo protocollo descrive la fabbricazione del dispositivo e la sua applicazione per il pretrattamento rapido della saliva prima della rilevazione del cortisolo tramite saggi a flusso laterale.

Protocollo

In questo studio è stata utilizzata saliva umana raccolta e deidentificata e sbloccata. Non sono stati reclutati partecipanti umani e non era richiesta l'approvazione etica istituzionale.

1. Preparazione del campione di saliva

1. Istruisci i partecipanti a astenersi dal mangiare o bere per almeno 30 minuti prima della raccolta del campione.
2. Prepara il campione di saliva secondo le istruzioni del fornitore.
   NOTA: Questo studio ha utilizzato saliva umana aggregata commercialmente disponibile per la validazione a livello di protocollo.
3. Mescola delicatamente il campione di saliva prima dell'uso per assicurarne l'omogeneità.
4. Conserva i campioni di saliva a 4 °C e utilizzali entro il periodo di conservazione raccomandato dal fornitore.

2. Preparazione della membrana rivestita di RBCM (Figura 1A)

1. Isolare il globulo rosso dal sangue totale secondo un protocollo^{precedentemente riportato 16}.
   1. Utilizzare il sangue umano totale ottenuto commercialmente con anticoagulante K2EDTA come fonte di RBCM.
   2. Centrifuga il sangue intero a 800 × g per 5 minuti e raccogli la frazione dei globuli rossi dopo aver rimosso il plasma e il buffy coat.
   3. Lava il pellet isolato di globuli rossi tre volte con soluzione salina 1× fosfato tamponata (PBS) fredda usando una miscelazione manuale delicata.
   4. Risospendere la pellet di globuli rossi lavati in PBS di 0,25× gelato per 30 minuti per indurre l'emolisi.
   5. Separare l'emoglobina libera centrifugando la sospensione lisata a 20.000 × g per 30 minuti e raccogliendo il pellet RBCM.
   6. Lavare il pellet RBCM raccolto altre tre volte con 0,25× PBS e conservare il pellet RBCM rosa pallido a −80 °C fino a un ulteriore utilizzo.
2. Prepara una membrana di polieterosolfone (PES) con poro di 30 nm e diametro di 13 mm.
3. Depositare 100 μL di soluzione RBCM al 2% (p/v) su un lato della membrana PES. Distribuire delicatamente o distribuire la soluzione a goccia finché l'intera superficie della membrana non è completamente bagnata.
4. Incubare la membrana a 50 °C per 30 minuti per garantire un rivestimento e un'asciugatura uniforme.
5. Conserva la membrana rivestita a temperatura ambiente e utilizzala entro 15 giorni dalla^{preparazione 17}.
   NOTA: La caratterizzazione dettagliata della membrana PES rivestita di RBCM è stata descritta nel nostro studio^{precedente 16}.

3. Fabbricazione del dispositivo SaliFilter (Figura 1B)

1. Inserire la membrana rivestita di RBCM nel portafiltro designato.
2. Assembla il dispositivo collegando saldamente i componenti di ingresso e uscita.
3. Attacca una siringa da 1 mL all'ingresso del dispositivo.
   ATTENZIONE: Assicurati che tutti i componenti siano ben sigillati per evitare perdite durante il funzionamento.

4. Pretrattamento della saliva

1. Carica 500 μL di saliva nella siringa collegata al dispositivo SaliFilter.
2. Applica una pressione manuale delicata per far passare il campione di saliva attraverso la membrana (~ 2 min).
3. Raccogli la saliva pretrattata dalla presa.
4. Utilizzare immediatamente il campione pretrattato oppure conservarlo a 4 °C fino a ulteriori analisi.

5. Analisi SDS-PAGE delle proteine salivari

1. Mescola 15 μL del campione con 5 μL di tampone di Laemmli.
2. Carica la miscela in pozzi separati di un gel SDS-PAGE all'8%.
3. Esegui l'elettroforesi a 150 V per 40 minuti.
4. Tingi il gel con il blu Coomassie per 2 ore.
5. Smettere il gel in acqua distillata durante tutta la notte.
6. Scatta immagini del gel usando uno smartphone o un sistema di imaging.

6. Rilevamento del cortisolo tramite Saggio a Flusso Laterale (LFA)

1. Applicare 150 μL di saliva pretrattata sul tampone campione della striscia LFA.
2. Lascia che il campione migri lungo la striscia per 10 minuti.
3. Acquisisci immagini dei risultati dei test utilizzando uno smartphone o un sistema di imaging.
4. Apri l'immagine LFA in ImageJ e usa Image > Color > Split Channels per separare i canali RGB.
5. Usa l'immagine del canale verde per l'analisi dell'intensità della linea di prova.
6. Seleziona una Regione di Interesse (ROI) rettangolare di 100 × 10 pixel che copre la linea di test e applica la mesma dimensione del ROI a tutte le immagini della striscia.
7. Misura il valore medio di intensità del ROI della linea di test. Seleziona una regione di membrana vuota adiacente con la dimensione del ROI e misura l'intensità di fondo.
8. Calcola l'intensità normalizzata della linea di prova come segue: intensità normalizzata = intensità della linea di prova − intensità di fondo.

7. Analisi statistica

1. Presentare i dati quantitativi come media ± deviazione standard (SD), salvo diversa indicazione. Definisci le barre di errore come SD.
   NOTA: In questo studio, tutti i valori di N riportati rappresentano repliche tecniche eseguite utilizzando aliquote di saliva umana aggregata ottenuta commercialmente.
2. Eseguire un'analisi di regressione lineare utilizzando i valori di intensità della linea di prova normalizzati ottenuti da concentrazioni di cortisolo da 0–8 ng ^mL−1 e calcolare il coefficiente di determinazione (R²) dalla curva adattata.
3. Calcola il limite di rilevamento (LOD) usando la seguente equazione: LOD = 3,3 × SE / |pendenza|, dove SE è l'errore standard dell'intercetta y e |pendenza| è il valore assoluto della pendenza ottenuta dall'equazione di regressione lineare. Usa il valore assoluto della pendenza perché la LFA competitiva produce una pendenza negativa.
   NOTA: In questo studio non sono stati eseguiti test statistici inferenziali né sono stati applicati criteri di significatività.

Risultati

Un efficace pretrattamento della saliva richiede la rimozione di componenti interferenti, inclusi mucine e proteine, che compromettono le prestazioni analitiche a valle. La capacità di filtrazione di SaliFilter è stata inizialmente valutata confrontando i cambiamenti di torbidità con quelli ottenuti con kit commerciali di raccolta della saliva (Figura 2A). La saliva non trattata mostrava un'elevata torbidità, mentre i campioni trattati con SaliFilter appariv...

Discussione

Le diagnostiche basate sulla saliva offrono un'alternativa non invasiva all'analisi del sangue. Tuttavia, la loro adozione più ampia è stata limitata dalla viscosità intrinseca della saliva e dalla presenza di componenti interferenti come mucine e proteine. Questi fattori interrompono il flusso guidato dai capillari e compromettono le prestazioni di semplici piattaforme analitiche, inclusi i LFA, rendendo così necessario un efficace pretrattamento del campione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Saliva artificiale	Solarbio, Cina	A7990
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent	Bio-Rad, USA	5000006	Per il saggio di Bradford
Blu di Coomassie	Abcam, Regno Unito	ab119211	Per la visualizzazione delle bande proteiche
Kit ELISA per cortisolo	Abcam, Regno Unito	ab154996
Cortisolo LFA	In-house
Piastrina calda	Daihan Scientific, Repubblica di Corea)
Idrocortisone (cortisolo)	Sigma-Aldrich, USA	PHR1014
Buffer campione Laemmli	GenDEPOT, USA	L1200-001	Per la denaturazione delle proteine prima della SDS-PAGE
Supporto per membrana	GVS Filter Technology	1220950	Supporto con diametro di 13 mm
Mini-PROTEAN® Tetra Cell per gel da 0,75 mm	Bio-Rad, USA	1658000	Per elettroforesi su gel
Mucina	Sigma-Aldrich, USA	M2378
Spettrofotometro NanoDrop 2000	Thermo Fisher Scientific, USA		Per il saggio delle proteine
Membrane PES	STERLITECH, USA	PES00313100	Membrana PES da 0,03 micron, 13 mm
Soluzione salina fosfatata (PBS)	DUKSAN, Repubblica di Corea	LB004
Saliva umana in pool	Innovative Research Inc., USA	IRHUSL5ML
RBCM	In-house
Buffer di risoluzione per PAGE	Bio-Rad, USA	1610798	Per la preparazione del gel di risoluzione
Salivette Cortisolo	SARSTEDT, Germania	51.1534.500	Kit per la raccolta della saliva
Buffer del gel di stacking per PAGE	Bio-Rad, USA	1610799	Per la preparazione del gel di stacking
Super•SAL™	Oasis Diagnostics, USA	SSAL-601	Kit per la raccolta della saliva
Siringa	koreavaccine, Repubblica di Corea)		Volume da 1 mL
TEMED	Bio-Rad, USA	1610800	Per la polimerizzazione dell'acrilammide