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Questo studio computazionale basato su database non coinvolge partecipanti umani, esperimenti sugli animali o campioni clinici. Secondo l'Articolo 32 delle Misure Cinesi per la Revisione Etica delle Scienze della Vita e della Ricerca Medica che coinvolge Soggetti Umani, studi che utilizzano dati pubblicamente ottenuti legalmente, non causano danni ai soggetti umani, non coinvolgono informazioni personali sensibili e non hanno interessi commerciali sono idonei all'esenzione dalla revisione etica. Pertanto, non è richiesta un'approvazione etica per questo studio.
Il disegno sperimentale e la pipeline analitica di questo studio sono illustrati nel diagramma di flusso (Figura 1).
Figura 1: Flusso di lavoro complessivo dello studio. Il diagramma di flusso illustra il flusso di lavoro sequenziale della farmacologia della rete e delle analisi di docking molecolare, inclusa l'acquisizione di componenti attivi e target del Decoction di Sishen (SSD), la raccolta di bersagli correlati alla gotta, l'identificazione di bersagli sovrapposti, la costruzione della rete farmaco–componente–bersaglio–malattia e della rete di interazione proteina–proteina (PPI), le analisi di arricchimento della Gene Ontology (GO) e della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). e simulazioni di attracco molecolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Acquisizione di componenti attivi e proteine target dell'SSD
Il 2 gennaio 2026, i componenti chimici attivi delle cinque erbe che costituiscono SSD, ovvero Huangqi, Yuanzhi, Huainiuxi, Shihu e Jinyinhua, sono stati recuperati dal database21 della Medicina Tradizionale Cinese dei Sistemi di Farmacologia (TCMSP). Sono stati applicati criteri di screening basati sulle proprietà farmacocinetiche: biodisponibilità orale (OB) del ≥30% e somiglianza farmacologica (DL) di ≥0,1822. I componenti che soddisfano questi criteri sono stati considerati potenziali ingredienti attivi. Venivano quindi raccolti i bersagli corrispondenti per ogni componente. Poiché il TCMSP non disponeva di dati completi per Yuanzhi e Shihu, i componenti chimici di queste due erbe sono stati inoltre recuperati dal database Herb 2.0 lo stesso giorno. Dopo aver ottenuto i nomi dei componenti, veniva eseguita una ricerca inversa in TCMSP utilizzando i nomi dei componenti e i corrispondenti numeri CAS come parole chiave per recuperare le informazioni target. Per i composti ottenuti dal database Herb, sono stati mantenuti solo quelli che sono stati correttamente abbinati alle voci in TCMSP tramite nome di componente o numero CAS. I composti abbinati sono stati poi sottoposti agli stessi criteri di screening farmacocinetico (OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18) utilizzando dati TCMSP, e i composti privi di informazioni complete di OB o DL sono stati esclusi. Tutti i composti abbinati e filtrati sono stati verificati manualmente rispetto ai record originali di Herb 2.0 per evitare identificazioni errate. Successivamente, le informazioni sui target derivate dal database delle erbe sono state unite a quelle delle erbe rimanenti per generare l'insieme completo di bersagli di principio attivo per SSD.
Tutte le proteine bersaglio recuperate sono state standardizzate come simboli genici ufficiali utilizzando il database UniProt. È stata stabilita una corrispondenza uno a uno mantenendo solo le voci revisionate dall'uomo (Swiss-Prot) ed escludendo quelle non recensite (TrEMBL). Quando più isoforme corrispondevano allo stesso simbolo genico, veniva selezionata l'isoforma canonica. Il dataset standardizzato dei target è stato mantenuto per l'analisi successiva dei geni intersecanti.
Raccolta di bersagli correlati alla gotta
Il 2 gennaio 2026 sono state effettuate ricerche sistematiche nel database GeneCards e nel database OMIM utilizzando "gotta" come parola chiave per ottenere i target di malattie correlate alla gotta. I target ottenuti dai due database sono stati esportati in fogli di calcolo WPS (versione 12.1.0). La colonna Simboli Genici di OMIM era posizionata adiacente a quella di GeneCards, e i bersagli duplicati venivano rimossi usando la funzione "Rimuovi Duplicati" basata su corrispondenze esatte dei simboli genici ufficiali in modo insensibile alla maiuscolemica. I target dei due database sono stati poi uniti per costruire un insieme completo di target di malattie correlate alla gotta.
Identificazione di bersagli sovrapposti farmaco–malattia
Il set di target del farmaco ottenuto dallo screening in componenti attivi e quello per la gotta e il set target per la gotta sono stati inseriti nella stessa cartella del progetto (D:\Venn). Fu lanciato il software R (versione 4.4.0) e il pacchetto readxl fu utilizzato per importare file Excel (.xlsx) contenenti le liste target. Il pacchetto dplyr veniva utilizzato per la manipolazione dei dati, inclusi il filtraggio e il rinominamento delle colonne prima dell'analisi delle intersezioni. I due set di target venivano poi convertiti in vettori caratteri e i target sovrapposti venivano identificati usando la funzione calculate.overlap() dal pacchetto VennDiagram. Il pacchetto VennDiagram veniva installato da CRAN usando il comando install.packages ("VennDiagram") e memorizzato nel percorso predefinito della libreria R. Se appariva un messaggio che indicava che il pacchetto era già stato installato, l'installazione era considerata un successo. La directory di lavoro veniva impostata usando il comando setwd("D:\\Venn"), che designava la cartella contenente i file di input e fungeva da directory di output. La prescrizione R veniva quindi eseguita per calcolare l'intersezione tra il set target del farmaco e quello per la malattia correlata alla gotta. I bersagli sovrapposti risultanti sono stati definiti come potenziali bersagli terapeutici della SSD per il trattamento della gotta.
Costruzione della rete "Drug-Component-Target-Disease"
I geni intersecanti identificati dalla sovrapposizione tra bersagli SSD e bersagli correlati alla gotta venivano salvati come file overlapping_targets.txt , mentre le informazioni sulla componente attiva dell'SSD venivano salvate come file drug_components.txt . Entrambi i file venivano inseriti nella cartella del progetto (D:\Network), che fungeva da directory operativa per l'analisi. Per garantire la riproducibilità, questa analisi veniva eseguita utilizzando R. Le operazioni di lettura, filtraggio e fusione dei dati venivano eseguite utilizzando una combinazione di funzioni base R, tra cui read.table(), write.table() e merge(), insieme al pacchetto dplyr per la manipolazione dei fotogrammi dati. Il comando setwd("D:\Network") veniva eseguito per definire esplicitamente la directory di lavoro.
La funzione graph_from_data_frame() veniva utilizzata come funzione di integrazione principale. Ogni riga di drug_components.txt collegava un componente attivo al gene bersaglio corrispondente utilizzando simboli genici ufficiali. Solo i target presenti in overlapping_targets.txt sono stati mantenuti e non è stato applicato alcun filtraggio aggiuntivo oltre il requisito dell'intersezione. Il dataset di rete risultante è stato esportato come network.txt in formato edge-list. Ogni riga conteneva due colonne (nodo1 e nodo2), dove il nodo1 rappresentava la formula SSD o una componente attiva, mentre il nodo2 rappresentava una componente attiva o un gene bersaglio. Il nodo malattico ("gotta") era collegato alla formula SSD come un bordo separato. I pesi dei bordi non erano assegnati e tutti i bordi erano trattati allo stesso modo (larghezza del bordo = 0,8).
Il file network.txt veniva importato nel software di visualizzazione di rete Cytoscape (versione 3.7.2). Lo strumento integrato NetworkAnalyzer è stato utilizzato tramite Tools → Network Analysis → Analyze Network per ottenere la struttura di base della rete, e è stato selezionato il "Degree Distribution" come quadro analitico. Le forme e i colori dei nodi sono stati assegnati in base ai tipi di nodi: i diamanti blu rappresentavano la formula SSD, i rettangoli blu i componenti attivi, le ellissi arancioni i geni target della malattia e gli ottagoni rossi rappresentavano l'entità della malattia della gotta. La dimensione del nodo era impostata come proporzionale al grado del nodo (dimensione del nodo = 30 + grado × 5, dimensione massima = 100).
Costruzione della rete di interazione proteina–proteina (PPI)
L'insieme filtrato di geni target intersecanti è stato importato nel database STRING (versione 12.0) il 2 gennaio 2026. La specie è stata limitata a Homo sapiens, la soglia minima di confidenza nell'interazione è stata impostata ad alta fiducia (0,700), le proteine disconnesse sono state nascoste, le fonti di interazione hanno incluso tutti i canali di evidenza disponibili e tutti gli altri parametri sono stati mantenuti alle impostazioni predefinite per ottenere interazioni proteina-proteina note e previste. I dati di rete risultanti venivano esportati in formato di valori separati da tabulazione (TSV) utilizzando le opzioni di esportazione predefinite.
La rete esportata veniva importata nel software di visualizzazione della rete per la visualizzazione e l'analisi topologica. Le proprietà di rete venivano calcolate utilizzando lo strumento integrato NetworkAnalyzer (Strumenti → Network Analysis → Analyze Network). Le metriche calcolate includevano grado, centralità tra le mezze e centralità della vicinanza. Le dimensioni dei nodi venivano mappate ai valori dei gradi usando una funzione di mappatura continua (dimensione del nodo = 20 + gradi × 3, dimensione massima = 80).
I target hub sono stati identificati classificando tutti i nodi in base ai valori dei gradi in ordine decrescente. I nodi con valori di grado più elevati erano considerati più centrali all'interno della rete. I nodi isolati (grado = 0) sono stati esclusi dalla visualizzazione. La disposizione della rete era disposta in cerchi concentrici dal centro verso l'esterno secondo la connettività dei nodi, e i colori dei nodi venivano mappati usando un gradiente blu-ciano corrispondente a valori di grado crescenti. La rete risultante è stata utilizzata per identificare i principali obiettivi dell'hub coinvolti nei potenziali effetti terapeutici della SSD contro la gotta.
Analisi di Arricchimento dell'Ontologia Genica (GO)
Sulla base dei geni target sovrapposti identificati, l'analisi di arricchimento funzionale GO è stata eseguita utilizzando R. I pacchetti Bioconductor necessari sono stati installati nel percorso della libreria R predefinito e caricati nell'ambiente di analisi. Il file genico intersecante veniva memorizzato nella directory del progetto (D:\GO), e la directory di lavoro veniva definita usando la funzione setwd().
La conversione e l'annotazione dell'identificatore genico venivano effettuate utilizzando l'org del pacchetto Bioconductor. Hs.eg.db (versione 3.20.0). I simboli geni ufficiali sono stati convertiti in ID geni Entrez utilizzando la funzione bitr() nel pacchetto di analisi di arricchimento clusterProfiler (versione 4.21.0). Solo i geni che mostravano mappaggi uniche uno a uno sono stati mantenuti per le analisi a valle, mentre le voci ambigue o non mappate sono state escluse.
L'analisi di arricchimento GO è stata condotta utilizzando il pacchetto di analisi dell'arricchimento. La funzione enrichGO() è stata utilizzata con le categorie ontologiche Processo Biologico (BP), Componente Cellulare (CC) e Funzione Molecolare (MF). La significatività statistica è stata determinata utilizzando il metodo di correzione a test multiplo Benjamini–Hochberg, con un valore P corretto < 0,05 considerato significativo.
Per ogni categoria ontologica, i termini significativamente arricchiti sono stati classificati secondo il fattore di arricchimento:
EF = (conteggio genico / geni di fondo totale) ÷ (dimensione del termine / geni genomica totali)
I primi 10 termini sono stati selezionati per un'analisi dettagliata. Quando si verificavano fattori di arricchimento identici, i termini con valori P aggiustati più bassi venivano classificati più in alto.
I risultati dell'arricchimento sono stati visualizzati utilizzando ggplot2 (versione 3.5.1) ed enrichplot (versione 1.24.0). I grafici a bolle e i diagrammi a barre venivano generati usando le funzioni dotplot() e barplot(). La dimensione della bolla rappresentava il numero di geni arricchiti, mentre il colore corrispondeva al significato di arricchimento espresso come −log10 (valore P aggiustato). I parametri di traccia predefiniti sono stati utilizzati per tutto il processo.
Analisi dell'arricchimento delle vie KEGG
L'analisi di arricchimento delle vie KEGG dei bersagli intersecanti di SSD e gota è stata eseguita utilizzando R e il pacchetto di analisi dell'arricchimento precedentemente descritto. I simboli genici venivano convertiti in identificatori compatibili con KEGG utilizzando la funzione bitr() fornita dal pacchetto di analisi di arricchimento, con KEGG che fungeva da risorsa di annotazione. L'analisi di arricchimento delle vie è stata condotta utilizzando la funzione enrichKEGG() basata sul test ipergeometrico. La significatività statistica è stata determinata utilizzando il metodo di correzione a test multipli di Benjamini–Hochberg (BH), e i percorsi con un valore P aggiustato < 0,05 sono stati considerati significativamente arricchiti.
I risultati dell'arricchimento venivano esportati in file workbook compatibili con Microsoft Excel utilizzando il pacchetto openxlsx (versione 4.2.8.1) e la funzione write.xlsx() per la successiva revisione e preparazione delle figure.
Successivamente è stata costruita una rete multilivello di interazione bersaglio-percorso utilizzando il software di visualizzazione della rete. I dati di rete venivano importati utilizzando File → Import → Network from File. I nodi erano costituiti da nodi genici target e nodi della via KEGG significativamente arricchiti (valore P corretto BH < 0,05), mentre gli edge rappresentavano associazioni documentate tra geni target e vie arricchite identificate durante l'analisi di arricchimento. La visualizzazione della rete veniva eseguita utilizzando il pannello Stile del software di visualizzazione della rete, con i geni target mostrati come ellissi grigie e i percorsi mostrati come rettangoli ciano. Non sono stati utilizzati plugin aggiuntivi. La rete veniva generata manualmente dalla tabella di output dell'arricchimento per visualizzare le relazioni tra i core target e i percorsi significativamente arricchiti.
Validazione dell'Aggancio Molecolare
I file strutturali 3D (formato MOL2) dei 10 componenti attivi principali classificati per connettività target nella rete "farmaco–componente–bersaglio–malattia" sono stati scaricati dal database TCMSP. La connettività target era definita come il grado del nodo (cioè, il numero di connessioni dirette tra un componente attivo e un geni target nella rete). I componenti attivi sono stati classificati in ordine decrescente secondo i valori di grado, e i primi 10 componenti sono stati selezionati per l'analisi dell'aggancio molecolare.
Le strutture cristalline delle prime 10 proteine target hub identificate dalla rete PPI sono state ottenute dalla RCSB Protein Data Bank (PDB) il 23 gennaio 2026. La specie era limitata all'Homo sapiens. Per ogni proteina bersaglio, è stata selezionata preferenzialmente la struttura con la massima risoluzione cristallografica (valore Å più basso), senza mutazioni e co-cristallizzata con un ligando o inibitore nativo. Se più strutture soddisfacevano questi criteri, veniva selezionata la struttura con la risoluzione più alta e la copertura proteica più completa. Sono state utilizzate le seguenti strutture PDB: 1GKC (MMP9), 5WHH (BCL2), 2P33 (JUN), 1RHJ (CASP3), 1WT5 (EGFR), 7APJ (AKT1), 1DU3 (TNF), 1T4Q (IL1B), 4NI9 (IL6) e 9CKJ (TP53).
Le simulazioni di docking molecolare sono state eseguite utilizzando il server online CB-Dock 2 (versione web, accessibile il 23 gennaio 2026), che impiega AutoDock Vina come motore di docking. Le strutture proteiche venivano automaticamente pre-elaborate dal server, inclusa la rimozione degli eteroatomi e la preparazione delle strutture dei recettori. I ligandi venivano caricati in formato MOL2. È stata utilizzata la rilevazione delle cavità indipendente dal modello, con cinque potenziali cavità di legame identificate automaticamente per ciascuna struttura proteica. I calcoli di attracco venivano eseguiti utilizzando i parametri predefiniti del motore di attracco: esaustività = 8, intervallo energetico = 4 e numero massimo di modalità di legaggio = 9.
Per ogni coppia bersaglio–composto, l'attracco è stato effettuato indipendentemente all'interno di ciascuna delle cinque cavità rilevate. Le pose di attracco venivano valutate usando la funzione di punteggio del motore di attracco, e la posa con la minore energia di legame all'interno di ogni cavità veniva mantenuta come conformazione rappresentativa di quella cavità. Tra le cinque conformazioni rappresentative, la posa di attracco con l'energia di legame globalmente più bassa è stata selezionata come risultato finale per quella coppia bersaglio–composto e utilizzata per le analisi successive.
Il valore di energia di legame più basso ottenuto per ogni risultato di attracco è stato registrato in un foglio di calcolo e importato sulla piattaforma di tracciamento online Weishengxin (consultato il 23 gennaio 2026) per generare una heatmap usando parametri predefiniti. La heatmap utilizzava un gradiente di colore dal giallo al rosso, un clustering gerarchico a collegamento completo e la distanza euclidea come metrica di clustering.
Le interazioni idrogeno-legame sono state identificate automaticamente dal modulo di analisi del server di attracco basandosi su criteri geometrici. Un legame a idrogeno è stato definito come un'interazione tra una distanza donatore–accettore ≤ 3,5 Å e un angolo donatore–idrogeno–accettore ≥ 120°. I legami a idrogeno erano mostrati come linee tratteggiate sia nei diagrammi di interazione bidimensionali che tridimensionali. La coppia proteina-componente attivo bersaglio che mostra l'energia di legame globalmente più bassa tra tutte le combinazioni di docking è stata selezionata per un'analisi dettagliata dell'interazione. Questa selezione si basava su una singola coppia bersaglio–composto piuttosto che su una singola posa di attracco ed era pensata per identificare l'interazione prevista più forte all'interno della rete. La posa di attracco rappresentativa finale corrispondente a questa coppia bersaglio–composto è stata utilizzata per la visualizzazione e l'analisi dell'interazione.
Diagrammi di interazione tridimensionali e bidimensionali sono stati generati utilizzando rispettivamente ChimeraX versione 1.5 e LigPlot+ versione 2.2. In ChimeraX, le proteine venivano visualizzate usando la rappresentazione caricaturale predefinita, i liganti in modalità stick, i legami all'idrogeno erano mostrati come linee tratteggiate e veniva applicato lo schema di colori predefinito. In LigPlot+, l'identificazione dei legami idrogeno è stata effettuata utilizzando l'algoritmo HBPLUS con una soglia di distanza donatore–accettore di 3,9 Å e una soglia angolare di 90°. Tutti gli altri parametri di visualizzazione sono stati mantenuti nelle impostazioni predefinite.