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Articolo di ricerca

La modifica da N6-metiladenosina di Rab27A favorisce l'osteoporosi influenzando la differenziazione osteoclastica nel modello murino ovariectomizzato

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DOI:

10.3791/71964

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11 agosto 2026

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1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

YTHDC1 promuove l'esportazione citoplasmatica di Rab27A modificato con m6A, mentre IGF2BP2 stabilizza Rab27A nel citoplasma, migliorando così la differenziazione degli osteoclasti e contribuendo all'osteoporosi.

Abstract

Lo sviluppo di nuove terapie per l'osteoporosi ha attirato sempre più attenzione. Rab27A viene regolato al rialzo durante la differenziazione degli osteoclasti, e la modifica con N6-metiladenosina (m6A) è emersa come un importante regolatore epigenetico nelle malattie ortopediche. Le analisi bioinformatiche hanno previsto che Rab27A contiene più siti di modifica di m6A e interagisce con diverse proteine associate a m6A. Sono stati condotti esperimenti di knockdown per valutare il ruolo di Rab27A nella differenziazione osteoclastica e nell'osteoporosi, utilizzando un modello murino ovariectomizzato (OVX). La deplezione di Rab27A ha attenuato l'osteoporosi e aumentato la percentuale di formazione ossea dal 14,73% al 28,13% (P < 0,05) nei topi OVX. Western blotting e PCR quantitativa hanno dimostrato che il knockdown di Rab27A riduceva l'espressione proteica e mRNA dei marcatori osteoclasti TRAP, NFATc1 e c-FOS, sopprimendo così la differenziazione osteoclastica dei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) indotti dal fattore stimolante della colonia macrofagica (M-CSF) e dall'attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare κB (RANKL). La colorazione TRAP ha inoltre mostrato che la deplezione di Rab27A ha ridotto significativamente l'attività TRAP dal 24,1% al 12,9% (P < 0,01) dopo l'induzione da M-CSF e RANKL. I saggi di immunoprecipitazione dell'RNA hanno confermato le interazioni tra Rab27A e le proteine lettrici m6A YTHDC1 e IGF2BP2. La frazionazione nucleare e citoplasmatica ha dimostrato che YTHDC1 facilita l'esportazione citoplasmatica di Rab27A modificato con m6A. Inoltre, analisi q-PCR e western blot hanno mostrato che il knockdown di YTHDC1 o IGF2BP2 riduceva l'espressione di Rab27A e diminuiva l'espressione di TRAP, NFATc1 e c-FOS, sopprimendo così la differenziazione osteoclastica indotta da M-CSF e RANKL. Collettivamente, questi risultati indicano che l'esportazione citoplasmatica mediata da YTHDC1 e la stabilizzazione mediata da IGF2BP2 di Rab27A modificato con m6A promuovono la differenziazione degli osteoclasti e contribuiscono alla perdita ossea nel modello murino OVX.

Introduzione

L'osteoporosi (OP) è un comune disturbo scheletrico caratterizzato dal deterioramento della microarchitettura ossea e dalla riduzione della densità minerale ossea, con conseguente aumento del rischio di fratture a livellomondiale 1,2,3. Le fratture osteoporotiche si verificano più frequentemente nell'avambraccio, nell'omero, nell'anca e nella colonna vertebrale e sono particolarmente diffuse tra gli anziani. Queste fratture compromettono sostanzialmente la qualità della vita e impongono notevoli oneri fisici, psicologici e socioeconomici ai pazienti, alle loro famiglie e ai sistemisanitari 3. Di conseguenza, la prevenzione, la gestione e il trattamento dell'osteoporosi rimangono priorità cliniche e di salute pubblica di primo piano.

Sono state sviluppate diverse strategie terapeutiche per l'osteoporosi e possono generalmente essere classificate in due categorie: agenti formatori ossei e terapie anti-riassorbtive 4,5. I farmaci anti-reassorbivi tradizionali includono bisfosfonati, raloxifene e ranelato di stronzio, mentre agenti più recenti includono denosumab, odanacatib e saracatinib. Le terapie formative ossee includono l'ormone paratiroideo (PTH 1–84), mentre diversi candidati aggiuntivi, come MK-5442, AMG 785 e BHQ 880, sono in fase di sviluppoclinico 5. Sebbene questi trattamenti possano essere efficaci, molti sono associati a effetti avversi significativi, efficacia limitata a lungo termine o restrizioni sull'usoprolungato 4,6,7,8,9. Ad esempio, la somministrazione a lungo termine di aminobisfosfonati e denosumab può compromettere il normale rimodellamentoosseo 5. Pertanto, identificare bersagli terapeutici più sicuri ed efficaci rimane un obiettivo importante nella ricerca sull'osteoporosi.

Le proteine Rab sono regolatori chiave del traffico delle vescicole intracellulari e della segnalazione cellulare e partecipano a diversi processi biologici, tra cui infezione virale, autofagia e organizzazione citoscheletro10. Negli ultimi anni, l'attenzione è stata sempre più rivolta ai ruoli delle proteine della famiglia Rab nel metabolismo osseo e nell'osteoporosi. È stato riportato che Rab44 regola la differenziazione degli osteoclasti modulando la segnalazione intracellulare Ca2⁺ e il fattore nucleare attivante delle cellule T attivate 1 (NFATc1) nel recettore attivatore dei macrofagi trattati con il fattore nucleare κB (RANKL) 11. Gli osteoclasti sono cellule multinucleate derivate da precursori della linea dei macrofagi e svolgono ruoli essenziali nel riassorbimento osseo e nell'omeostasischeletrica 12,13,14,15,16,17,18,19. Pertanto, comprendere i meccanismi molecolari che governano la differenziazione degli osteoclasti è fondamentale per sviluppare nuovi approcci terapeutici per l'osteoporosi.

Rab27A è un membro importante della famiglia Rab GTPasi ed è ampiamente espresso nelle cellule secretorie e immunitarie. Svolge ruoli fondamentali nel trasporto delle vescicoline, nell'esocitosi e nella segnalazioneintracellulare 20,21,22,23,24,25,26,27. Studi precedenti hanno dimostrato che Rab27A regola la degranulazione degli eosinofili durante l'infiammazione delle vie aeree e controlla la mobilitazione vescicolare associata all'attività della NADPH ossidasi nei macrofagiattivati 20.23. In particolare, le evidenze accumulate indicano che l'espressione di Rab27A è significativamente aumentata durante la differenziazione degli osteoclasti. Shimada-Sugawara et al. hanno riferito che l'espressione di Rab27A aumenta durante la differenziazione dei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) in osteoclasti, suggerendo un possibile ruolo nell'osteoclastogenesi28. Collettivamente, questi risultati suggeriscono che Rab27A possa influenzare la formazione e la funzione degli osteoclasti regolando il traffico vescicolare e le vie di segnalazioneintracellulare 28,29.

La N6-metiladenosina (m6A) è la modifica interna dell'RNA più abbondante negli RNA messaggeri eucarioti e negli RNA non codificanti e funge da regolatore critico del metabolismo e dell'espressione genica dell'RNA. Essendo la prima modifica dell'mRNA identificata nei mammiferi, m6A è stata implicata in numerosi processi biologici, tra cui stabilità dell'RNA, splicing, trasporto e traduzione. Wang et al. hanno dimostrato che le modifiche m6A, comunemente presenti all'interno di motivi di sequenza conservato, sono riconosciute dalle proteine contenenti domini YTH e contribuiscono alla regolazione della stabilità e del metabolismodell'mRNA 30. Inoltre, la modifica m6A è stata implicata in diverse funzioni biologiche, tra cui la stabilità del genoma, la regolazione trascrizionale, l'organizzazione della cromatina, la progressione del cancro e le risposteimmunitarie 31. Studi recenti hanno inoltre evidenziato ruoli importanti per la segnalazione m6A nelle malattie ossee enell'osteoporosi 32.

Tra le proteine lettrici di m6A, YTHDC1 funziona come lettore nucleare che regola il processamento dell'RNA e l'esportazione nucleare, mentre la proteina di legaggio dell'mRNA 2 (IGF2BP2) del fattore di crescita simile all'insulina 2 stabilizza i trascrivertiti modificati con m6A nel citoplasma. Chen et al. hanno dimostrato che YTHDC1 promuove l'esportazione nucleare di circNSUN2 modificato con m6A, che successivamente interagisce con IGF2BP2 per stabilizzare l'mRNA di HMGA2 e promuovere la metastasi del cancrocolorettale 33. Questi risultati suggeriscono che la regolazione coordinata da parte di YTHDC1 e IGF2BP2 possa rappresentare un meccanismo generale che controlla il destino dei trascrizioni modificate con m6A.

Il presente studio ha indagato i siti previsti di modifica di m6A all'interno dell'mRNA Rab27A ed ha esaminato le sue interazioni con YTHDC1 e IGF2BP2. Si è riscontrato che YTHDC1 facilita l'esportazione nucleare di trascritti Rab27A modificati con m6A, mentre IGF2BP2 interagiva con Rab27A nel citoplasma migliorandone la stabilità. Attraverso questo meccanismo regolatorio, Rab27A ha promosso la differenziazione degli osteoclasti e contribuito alla progressione dell'osteoporosi. Collettivamente, i risultati identificano una via regolatoria dipendente da m6A precedentemente non riconosciuta che coinvolge YTHDC1, IGF2BP2 e Rab27A nella differenziazione degli osteoclasti. Questi risultati forniscono nuove intuizioni sulla patogenesi molecolare dell'osteoporosi e potrebbero facilitare lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche mirate alla regolazione di Rab27A mediata da m6A.

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Protocollo

Tutte le procedure animali sono state approvate dal Comitato per la Protezione e l'Utilizzo degli Animali dell'Ospedale Affiliato della Southwest Medical University (Approvazione n. 2024-Ethics-042). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida ARRIVE, il U.K. Animals (Scientific Procedures) Act 1986 e le linee guida associate, la Direttiva UE 2010/63/UE e la Guida Nazionale degli Istituti di Salute per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio (Pubblicazione NIH n. 8023, revisionata nel 1978). I topi sono stati assegnati casualmente ai gruppi sperimentali e la sequenza di allocazione è stata nascosta al ricercatore. Tutte le acquisizioni e analisi dei dati, inclusa la valutazione istologica, l'analisi delle immagini micro-computerizzata (micro-TC) e le analisi statistiche, sono state effettuate da ricercatori ciechi all'allocazione dei grupi. Nessun animale o campione è stato escluso dalle analisi. Tutti i reagenti, le attrezzature, il software e le altre risorse utilizzate in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Costruzione del modello dell'ovaricotomia (OVX)

Ventiquattro femmine di topi selvatici C57BL/6 di 8 settimane sono state utilizzate per stabilire un modello di osteoporosi. Dopo un periodo di acclimatazione di una settimana, i topi sono stati assegnati casualmente al gruppo Sham o OVX. Il modello OVX è stato stabilito tramite ovaricotomia bilaterale come descrittoin precedenza 34,35. I topi operati da simulazione sono stati sottoposti a esposizione chirurgica delle ovaie senza rimozione.

Per la somministrazione del genio intra-femorale, i vettori lentivirali che esprimono sh-Rab27A o sh-NC sono stati iniettati 7 giorni dopo l'intervento OVX, come precedentementeriportato 36,37. Per un breve periodo, particelle lentivirali concentrate (1 × 106 unità trasducenti/mL) sono state iniettate nel femore attraverso la via rotula utilizzando un ago calibro 22 sotto anestesia. Ogni topo riceveva 20 μL di sospensione lentivirale. L'incisione è stata successivamente sutura e gli animali sono stati monitorati durante tutto il recupero.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in condizioni specifiche prive di patogeni. I campioni femorali sono stati prelevati 8 settimane dopo l'intervento. Almeno sei topi per gruppo sono stati utilizzati per analisi istologiche ed estrazione di RNA o proteine.

2. Micro-TC in vivo

È stata eseguita una tomografia microcomputerizzata (micro-CT) per valutare la morfologia ossea trabecolare. La tibia destra di ciascun topo è stata scansionata in vivo prima dell'intervento OVX a 14 settimane di età. Le scansioni di follow-up venivano eseguite settimanalmente fino a 22 settimane di età. Almeno sei topi per gruppo sono stati inclusi nell'analisi micro-TC.

I topi sono stati anestetizzati con pentobarbital sodio intraperitoneale (50 mg/kg di peso corporeo). L'adeguata anestesia è stata confermata dall'assenza del riflesso del pizzicamento del dito del piede e dal monitoraggio continuo della frequenza respiratoria, mantenuta per tutta la procedura di imaging. Tutte le procedure di eutanasia sono state condotte in conformità con il protocollo approvato sugli animali, le linee guida istituzionali per il benessere animale e le normative nazionali per l'eutanasia degli animali da laboratorio.

A 24 settimane di età, i topi sono stati soppressi per lussazione cervicale dopo anestesia profonda, e entrambe le tibie sono state prelevate per la scansione ex vivo utilizzando lo stesso protocollo di imaging. I parametri di scansione includevano una dimensione voxel di 10,4 μm, una tensione di 55 kV, una corrente di 145 μA, un campo visivo di 32 mm, 1500/750 campioni per proiezione e un tempo di integrazione di 100 ms.

Le immagini sono state processate utilizzando un algoritmo di correzione per indurimento del fascio polinomiale di terzo ordine calibrato rispetto a un fantasma di 1200 mg HA/cm3 . La frazione volumetrica ossea (BV/TV), lo spessore trabecolare (Tb.Th) e il numero trabecolare (Tb.N) sono stati quantificati nella metafisi distale del femorale situata a 1,0 mm prossimale alla placca di crescita.

3. Trasfezione plasmidiale

Plasmidi sh-Rab27A e sh-NC sono stati generati e utilizzati per la produzione di lentivirus. Plasmidi e costrutti di shRNA che imballano lentivrali sono stati co-trasfettati nelle cellule HEK293T secondo le istruzioni del produttore. I titoli virali sono stati determinati prima della somministrazione intra-femorale come descrittoin precedenza: 36. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti.

4. Colorazione di ematossilina ed eosina (HE)

I campioni femorali sono stati fissati al 4% di paraformaldeide per 24 ore, decalcificati al 10% di EDTA per 4 settimane, crioprotetti al 30% di saccarosio/PBS, incorporati in paraffina e sezionati a uno spessore di 5 μm. Le sezioni tissutali sono state colorate con ematossilina ed eosina ed esaminate al microscopio ottico. Sono stati analizzati almeno sei topi per gruppo.

5. Colorazione con fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP)

La colorazione con trappola delle sezioni femorali è stata eseguita secondo le istruzioni delproduttore 38. L'attività TRAP nei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) è stata valutata utilizzando un saggio di colorazione TRAP. Gli osteoclasti maturi sono stati definiti come cellule multinucleate TRAP-positive contenenti almeno tre nuclei. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti, ciascuna con tre repliche tecniche.

6. q-PCR

L'RNA totale è stato isolato usando il reagente TRIzol secondo le istruzioni del produttore. Il DNA complementare è stato sintetizzato usando la trasscrittasi inversa e sottoposto a PCR quantitativa in tempo reale utilizzando la chimica SYBR Green. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti, ciascuna con tre repliche tecniche.

Le sequenze di primer erano le seguenti:

Rab27A: F, TTCCTGCTTCTCTTCGACCT; R, GGCAGCACTGGTTTCAAAT

TRAPPO: F, TGTTGACAGCGGTCCATCTA; R, CCTCCTTCTTAACCCGAAGC

NFATc1: F, GGTGCTGTCTGGCCATAACT; R, GCGGAAAGGTGGTATCTAA

C-FOS: F, TATTO ACCATTCCCCAGCCGA; R, GCTGTCACCGTGGGGATAAA

YTHDC1: F, GAAGTGGAAGCTCTGCATCAG; R, TTGATCTTTTCGGACAGCACG

IGF2BP2: F, GACTACCCCGACCAGAACTG; R, GAGGCGGGATGTTCCGAATC

β-actina: F, GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG; R, TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. Western blotting

Cellule o tessuti sono stati lisati utilizzando un tampone RIPA integrato con inibitori della proteasi. Le concentrazioni proteiche sono state determinate tramite un saggio di Bradford. Quantità uguali di proteine (20 μg) sono state separate tramite SDS-PAGE e trasferite in membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF) o nitrocellulosa. Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% per 1 ora a temperatura ambiente e incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro TRAP, NFATc1, c-FOS, Rab27A, YTHDC1, IGF2BP2 o β-actina. Dopo il lavaggio, le membrane sono state incubate con gli anticorpi secondari appropriati per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando procedure standard di rilevamento. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti.

8. Coltura cellulare

I macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) sono stati isolati come descrittoin precedenza: 39. Le cellule del midollo osseo prelevate dai femori del topo sono state coltivate durante la notte in un mezzo essenziale minimo α, integrato con siero bovino fetale al 10%, 30 ng/mL fattore stimolante della colonia macrofagica (M-CSF) e 1% di penicillina/streptomicina a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂. Cellule non aderenti sono state raccolte e coltivate in un sistema stromale privo di cellule contenente 30 ng/mL M-CSF. Dopo 3 giorni, le cellule aderenti sono state prelevate come BMM e ulteriormente coltivate in presenza di 30 ng/mL m-csf attivatore e 50 ng/mL del ligando del fattore nucleare κB (RANKL) per 72 ore, inducendo la differenziazione degli osteoclasti.

9. Interferenza RNA (RNAi)

Piccoli RNA interferenti (siRNA) venivano sintetizzati e trasfettati utilizzando un reagente di trasfezione a base di lipidi secondo le istruzioni del produttore. Le cellule sono state seminate a una densità di 2 × 104 cellule per pozzo in piastre da sei pozzi prima della trasfezione. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti.

Le sequenze di bersagli erano le seguenti:

si-Rab27A: GGACUUAAUCAUCTAAGAGAAUGGAA

si-YTHDC1: GCAAGGAGUGUUAUCUUAATT

si-IGF2BP2: CCGUUAACCAACAAGCCAATT

10. Immunofluorescenza

Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 20 minuti e permeabilizzate con 0,1% di Triton X-100 per 10 minuti. Dopo un blocco con albumina sirica bovina al 5% per 30 minuti, le cellule sono state incubate con anticorpi primari durante la notte a 4 °C.

Dopo il lavaggio, sono stati applicati anticorpi secondari coniugati con fluorofori per 30 minuti a temperatura ambiente. I nuclei sono stati controcolorati con DAPI e le immagini sono state acquisite tramite microscopia confocale. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti.

11. Separazione nucleare e citoplasmatica

Le frazioni nucleari e citoplasmatiche sono state isolate secondo le istruzioni del produttore. Le celle sono state lisate sul ghiaccio per 10 minuti e centrifugate a 500 × g per 3 minuti a 4 °C. Il sovrantantante contenente componenti citoplasmatici veniva raccolto, mentre il pellet contenente i nuclei veniva lavato e processato separatamente.

12. Immunoprecipitazione delle proteine legate all'RNA (RIP)

I saghi di immunoprecipitazione a RNA (RIP) sono stati eseguiti secondo le istruzioni del produttore. Per un breve periodo, le celle sono state lisate sul ghiaccio per 30 minuti. Dopo la centrifugazione, i soprannatanti sono stati incubati durante la notte con anticorpi e perle di agarosio proteico A/G. Dopo il lavaggio, le proteine immunoprecipitate sono state analizzate tramite western blotting e l'RNA co-immunoprecipitato è stato analizzato tramite PCR quantitativa in tempo reale. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti.

13. Saggio di stabilità mRNA Rab27A

L'RNA totale è stato estratto nei momenti indicati dopo IGF2BP2 knockdown. Successivamente sono state eseguite trascrizioni inverse e PCR quantitativa in tempo reale. I livelli di mRNA di Rab27A sono stati normalizzati al corrispondente gruppo si-NC a 0 ora. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti.

14. Analisi statistica

Tutti gli esperimenti sono stati condotti indipendentemente utilizzando almeno tre repliche biologiche. Per q-PCR, interferenza RNA, colorazione TRAP, western blotting e altri saghi cellulari, ogni replica biologica includeva tre repliche tecniche salvo diversa specificazione. I dati sono presentati come la deviazione media ± standard (SD).

Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando GraphPad Prism versione 9.0 e software SPSS. I confronti tra i due gruppi sono stati effettuati utilizzando un test t di Student a due code. I confronti tra più gruppi sono stati analizzati utilizzando l'analisi bidirezionale della varianza (ANOVA), seguiti dal test post hoc di Tukey per adeguare i confronti multipli. Un valore P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

Il knockdown di Rab27A ha ridotto l'osteoporosi in vivo.

Per indagare il ruolo di Rab27A nell'osteoporosi, è stato eseguito il knockdown di Rab27A in un modello murino ovaricotectomizzato (OVX) stabilito utilizzando metodi precedentementeriportati 34,40. Il disegno complessivo dello studio è riassunto nella Figura 1. L'analisi micro-computerizzata...

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Discussione

La differenziazione degli osteoclasti svolge ruoli essenziali nel rimodellamento osseo, nel riassorbimento osseo, nella riparazione delle fratture e nell'omeostasischeletrica 12˒15˒17˒18˒42˒43. L'eccessiva attività osteoclastica è un fattore importante che contribuisce all'osteoporosi, rendendo l'identificazione delle vie regolatorie che controll...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non esserci interessi finanziari o conflitti di interesse in conflitto.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal Progetto di Cooperazione Strategica Scientifica e Tecnologica tra il Pengzhou People's Hospital e la Southwest Medical University (Grant n. 2023PZXNYD01) a Lian Tang.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4% ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificA5818101Tissue and cell fixation
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11001Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11035Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534093
Bovine serum albumin (BSA)MerckA2153Blocking reagent
Bradford Protein AssayMerckB6916Protein quantification
C57BL/6JSlac miceShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.—Female, 8 weeks old; RRID: MGI:2159769
c-FOS antibodyAbcamab222699Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2891049
Confocal laser scanning microscope (SP8)Leica MicrosystemsSP8Immunofluorescence image acquisition; RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571Nuclear counterstain for immunofluorescence; RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500GTissue decalcification reagent
EosinSolarbioG1100Histological cytoplasmic stain
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701Cell culture supplement
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0Statistical analysis software; RRID: SCR_002798
HematoxylinCell Signaling Technology#14166Histological nuclear stain
IBM SPSS StatisticsIBMWindows versionStatistical analysis software; RRID: SCR_016479
IGF2BP2 antibodyProteintech11601-1-APPrimary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_2122672
Inverted light microscope (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8Histological image acquisition; RRID: SCR_026672
Lentiviral titer quantification kitTakara Bio631235Lentiviral titer determination
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Plasmid transfection reagent
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA transfection reagent
M-CSFMedChemExpressHY-P7085Osteoclast differentiation factor
Micro-computed tomography systemScanco MedicalVivaCT80Bone morphometric analysis
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1701cDNA synthesis
NFATc1 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7294Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2152503
PARIS KitThermo Fisher ScientificAM1556Nuclear and cytoplasmic fractionation
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotic supplement for cell culture
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659Quantitative real-time PCR
Protease inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific78429Prevention of protein degradation
Protein A/G agarose beadsMerckIP05Immunoprecipitation
PVDF membraneThermo Fisher Scientific88520Protein transfer membrane for western blotting
Rab27A antibodyAbcamab55667Primary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425Osteoclast differentiation factor
Real-time PCR systemApplied BiosystemsABI7900HTQuantitative real-time PCR instrument
RIPA bufferThermo Fisher Scientific78501Protein extraction buffer
RNA Immunoprecipitation (RIP) KitMilliporeRIP-12RXNRNA immunoprecipitation assay
SDS-PAGE reagentsThermo Fisher ScientificBT041210BOXProtein electrophoresis
shRNA plasmidsRiboBio—Gene silencing by RNA interference
Small interfering RNAs (siRNAs)GenePharma—Gene silencing by RNA interference
SRAMPOnline resource—Prediction of m6A modification sites; RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)Online resource—RNA interaction prediction database; RRID: SCR_016303
TRAP antibodyAbcamab2391Primary antibody for western blotting; RRID: AB_303034
TRAP staining kitMerck387ADetection of osteoclast activity
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111Cell permeabilization reagent
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNTotal RNA isolation
YTHDC1 antibodyAbcamab122340Primary antibody for western blotting; RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651Cell culture medium
β-Actin antibodyMerckA5441Loading control for western blotting; RRID: AB_476744

Riferimenti

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