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La modifica da N6-metiladenosina di Rab27A favorisce l'osteoporosi influenzando la differenziazione osteoclastica nel modello murino ovariectomizzato

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DOI:

10.3791/71964

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11 agosto 2026

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1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

YTHDC1 promuove l'esportazione citoplasmatica di Rab27A modificato con m6A, mentre IGF2BP2 stabilizza Rab27A nel citoplasma, migliorando così la differenziazione degli osteoclasti e contribuendo all'osteoporosi.

Abstract

Lo sviluppo di nuove terapie per l'osteoporosi ha attirato sempre più attenzione. Rab27A viene regolato al rialzo durante la differenziazione degli osteoclasti, e la modifica con N6-metiladenosina (m6A) è emersa come un importante regolatore epigenetico nelle malattie ortopediche. Le analisi bioinformatiche hanno previsto che Rab27A contiene più siti di modifica di m6A e interagisce con diverse proteine associate a m6A. Sono stati condotti esperimenti di knockdown per valutare il ruolo di Rab27A nella differenziazione osteoclastica e nell'osteoporosi, utilizzando un modello murino ovariectomizzato (OVX). La deplezione di Rab27A ha attenuato l'osteoporosi e aumentato la percentuale di formazione ossea dal 14,73% al 28,13% (P < 0,05) nei topi OVX. Western blotting e PCR quantitativa hanno dimostrato che il knockdown di Rab27A riduceva l'espressione proteica e mRNA dei marcatori osteoclasti TRAP, NFATc1 e c-FOS, sopprimendo così la differenziazione osteoclastica dei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) indotti dal fattore stimolante della colonia macrofagica (M-CSF) e dall'attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare κB (RANKL). La colorazione TRAP ha inoltre mostrato che la deplezione di Rab27A ha ridotto significativamente l'attività TRAP dal 24,1% al 12,9% (P < 0,01) dopo l'induzione da M-CSF e RANKL. I saggi di immunoprecipitazione dell'RNA hanno confermato le interazioni tra Rab27A e le proteine lettrici m6A YTHDC1 e IGF2BP2. La frazionazione nucleare e citoplasmatica ha dimostrato che YTHDC1 facilita l'esportazione citoplasmatica di Rab27A modificato con m6A. Inoltre, analisi q-PCR e western blot hanno mostrato che il knockdown di YTHDC1 o IGF2BP2 riduceva l'espressione di Rab27A e diminuiva l'espressione di TRAP, NFATc1 e c-FOS, sopprimendo così la differenziazione osteoclastica indotta da M-CSF e RANKL. Collettivamente, questi risultati indicano che l'esportazione citoplasmatica mediata da YTHDC1 e la stabilizzazione mediata da IGF2BP2 di Rab27A modificato con m6A promuovono la differenziazione degli osteoclasti e contribuiscono alla perdita ossea nel modello murino OVX.

Introduzione

L'osteoporosi (OP) è un comune disturbo scheletrico caratterizzato dal deterioramento della microarchitettura ossea e dalla riduzione della densità minerale ossea, con conseguente aumento del rischio di fratture a livellomondiale 1,2,3. Le fratture osteoporotiche si verificano più frequentemente nell'avambraccio, nell'omero, nell'anca e nella colonna vertebrale e sono particolarmente diffuse tra gli anziani. Queste fratture compromettono sostanzialmente la qualità della vita e impongono notevoli oneri fisici, psicologici e socioeconomici ai pazienti, alle loro famiglie e ai sistemisanitari 3. Di conseguenza, la prevenzione, la gestione e il trattamento dell'osteoporosi rimangono priorità cliniche e di salute pubblica di primo piano.

Sono state sviluppate diverse strategie terapeutiche per l'osteoporosi e possono generalmente essere classificate in due categorie: agenti formatori ossei e terapie anti-riassorbtive 4,5. I farmaci anti-reassorbivi tradizionali includono bisfosfonati, raloxifene e ranelato di stronzio, mentre agenti più recenti includono denosumab, odanacatib e saracatinib. Le terapie formative ossee includono l'ormone paratiroideo (PTH 1–84), mentre diversi candidati aggiuntivi, come MK-5442, AMG 785 e BHQ 880, sono in fase di sviluppoclinico 5. Sebbene questi trattamenti possano essere efficaci, molti sono associati a effetti avversi significativi, efficacia limitata a lungo termine o restrizioni sull'usoprolungato 4,6,7,8,9. Ad esempio, la somministrazione a lungo termine di aminobisfosfonati e denosumab può compromettere il normale rimodellamentoosseo 5. Pertanto, identificare bersagli terapeutici più sicuri ed efficaci rimane un obiettivo importante nella ricerca sull'osteoporosi.

Le proteine Rab sono regolatori chiave del traffico delle vescicole intracellulari e della segnalazione cellulare e partecipano a diversi processi biologici, tra cui infezione virale, autofagia e organizzazione citoscheletro10. Negli ultimi anni, l'attenzione è stata sempre più rivolta ai ruoli delle proteine della famiglia Rab nel metabolismo osseo e nell'osteoporosi. È stato riportato che Rab44 regola la differenziazione degli osteoclasti modulando la segnalazione intracellulare Ca2⁺ e il fattore nucleare attivante delle cellule T attivate 1 (NFATc1) nel recettore attivatore dei macrofagi trattati con il fattore nucleare κB (RANKL) 11. Gli osteoclasti sono cellule multinucleate derivate da precursori della linea dei macrofagi e svolgono ruoli essenziali nel riassorbimento osseo e nell'omeostasischeletrica 12,13,14,15,16,17,18,19. Pertanto, comprendere i meccanismi molecolari che governano la differenziazione degli osteoclasti è fondamentale per sviluppare nuovi approcci terapeutici per l'osteoporosi.

Rab27A è un membro importante della famiglia Rab GTPasi ed è ampiamente espresso nelle cellule secretorie e immunitarie. Svolge ruoli fondamentali nel trasporto delle vescicoline, nell'esocitosi e nella segnalazioneintracellulare 20,21,22,23,24,25,26,27. Studi precedenti hanno dimostrato che Rab27A regola la degranulazione degli eosinofili durante l'infiammazione delle vie aeree e controlla la mobilitazione vescicolare associata all'attività della NADPH ossidasi nei macrofagiattivati 20.23. In particolare, le evidenze accumulate indicano che l'espressione di Rab27A è significativamente aumentata durante la differenziazione degli osteoclasti. Shimada-Sugawara et al. hanno riferito che l'espressione di Rab27A aumenta durante la differenziazione dei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) in osteoclasti, suggerendo un possibile ruolo nell'osteoclastogenesi28. Collettivamente, questi risultati suggeriscono che Rab27A possa influenzare la formazione e la funzione degli osteoclasti regolando il traffico vescicolare e le vie di segnalazioneintracellulare 28,29.

La N6-metiladenosina (m6A) è la modifica interna dell'RNA più abbondante negli RNA messaggeri eucarioti e negli RNA non codificanti e funge da regolatore critico del metabolismo e dell'espressione genica dell'RNA. Essendo la prima modifica dell'mRNA identificata nei mammiferi, m6A è stata implicata in numerosi processi biologici, tra cui stabilità dell'RNA, splicing, trasporto e traduzione. Wang et al. hanno dimostrato che le modifiche m6A, comunemente presenti all'interno di motivi di sequenza conservato, sono riconosciute dalle proteine contenenti domini YTH e contribuiscono alla regolazione della stabilità e del metabolismodell'mRNA 30. Inoltre, la modifica m6A è stata implicata in diverse funzioni biologiche, tra cui la stabilità del genoma, la regolazione trascrizionale, l'organizzazione della cromatina, la progressione del cancro e le risposteimmunitarie 31. Studi recenti hanno inoltre evidenziato ruoli importanti per la segnalazione m6A nelle malattie ossee enell'osteoporosi 32.

Tra le proteine lettrici di m6A, YTHDC1 funziona come lettore nucleare che regola il processamento dell'RNA e l'esportazione nucleare, mentre la proteina di legaggio dell'mRNA 2 (IGF2BP2) del fattore di crescita simile all'insulina 2 stabilizza i trascrivertiti modificati con m6A nel citoplasma. Chen et al. hanno dimostrato che YTHDC1 promuove l'esportazione nucleare di circNSUN2 modificato con m6A, che successivamente interagisce con IGF2BP2 per stabilizzare l'mRNA di HMGA2 e promuovere la metastasi del cancrocolorettale 33. Questi risultati suggeriscono che la regolazione coordinata da parte di YTHDC1 e IGF2BP2 possa rappresentare un meccanismo generale che controlla il destino dei trascrizioni modificate con m6A.

Il presente studio ha indagato i siti previsti di modifica di m6A all'interno dell'mRNA Rab27A ed ha esaminato le sue interazioni con YTHDC1 e IGF2BP2. Si è riscontrato che YTHDC1 facilita l'esportazione nucleare di trascritti Rab27A modificati con m6A, mentre IGF2BP2 interagiva con Rab27A nel citoplasma migliorandone la stabilità. Attraverso questo meccanismo regolatorio, Rab27A ha promosso la differenziazione degli osteoclasti e contribuito alla progressione dell'osteoporosi. Collettivamente, i risultati identificano una via regolatoria dipendente da m6A precedentemente non riconosciuta che coinvolge YTHDC1, IGF2BP2 e Rab27A nella differenziazione degli osteoclasti. Questi risultati forniscono nuove intuizioni sulla patogenesi molecolare dell'osteoporosi e potrebbero facilitare lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche mirate alla regolazione di Rab27A mediata da m6A.

Protocollo

Tutte le procedure animali sono state approvate dal Comitato per la Protezione e l'Utilizzo degli Animali dell'Ospedale Affiliato della Southwest Medical University (Approvazione n. 2024-Ethics-042). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida ARRIVE, il U.K. Animals (Scientific Procedures) Act 1986 e le linee guida associate, la Direttiva UE 2010/63/UE e la Guida Nazionale degli Istituti di Salute per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio (Pubblicazione NIH n. 8023, revisionata nel 1978). I topi sono stati assegnati casualmente ai gruppi sperimentali e la sequenza di allocazione è stata nascosta al ricercatore. Tutte le acquisizioni e analisi dei dati, inclusa la valutazione istologica, l'analisi delle immagini micro-computerizzata (micro-TC) e le analisi statistiche, sono state effettuate da ricercatori ciechi all'allocazione dei grupi. Nessun animale o campione è stato escluso dalle analisi. Tutti i reagenti, le attrezzature, il software e le altre risorse utilizzate in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Costruzione del modello dell'ovaricotomia (OVX)

Ventiquattro femmine di topi selvatici C57BL/6 di 8 settimane sono state utilizzate per stabilire un modello di osteoporosi. Dopo un periodo di acclimatazione di una settimana, i topi sono stati assegnati casualmente al gruppo Sham o OVX. Il modello OVX è stato stabilito tramite ovaricotomia bilaterale come descrittoin precedenza 34,35. I topi operati da simulazione sono stati sottoposti a esposizione chirurgica delle ovaie senza rimozione.

Per la somministrazione del genio intra-femorale, i vettori lentivirali che esprimono sh-Rab27A o sh-NC sono stati iniettati 7 giorni dopo l'intervento OVX, come precedentementeriportato 36,37. Per un breve periodo, particelle lentivirali concentrate (1 × 106 unità trasducenti/mL) sono state iniettate nel femore attraverso la via rotula utilizzando un ago calibro 22 sotto anestesia. Ogni topo riceveva 20 μL di sospensione lentivirale. L'incisione è stata successivamente sutura e gli animali sono stati monitorati durante tutto il recupero.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in condizioni specifiche prive di patogeni. I campioni femorali sono stati prelevati 8 settimane dopo l'intervento. Almeno sei topi per gruppo sono stati utilizzati per analisi istologiche ed estrazione di RNA o proteine.

2. Micro-TC in vivo

È stata eseguita una tomografia microcomputerizzata (micro-CT) per valutare la morfologia ossea trabecolare. La tibia destra di ciascun topo è stata scansionata in vivo prima dell'intervento OVX a 14 settimane di età. Le scansioni di follow-up venivano eseguite settimanalmente fino a 22 settimane di età. Almeno sei topi per gruppo sono stati inclusi nell'analisi micro-TC.

I topi sono stati anestetizzati con pentobarbital sodio intraperitoneale (50 mg/kg di peso corporeo). L'adeguata anestesia è stata confermata dall'assenza del riflesso del pizzicamento del dito del piede e dal monitoraggio continuo della frequenza respiratoria, mantenuta per tutta la procedura di imaging. Tutte le procedure di eutanasia sono state condotte in conformità con il protocollo approvato sugli animali, le linee guida istituzionali per il benessere animale e le normative nazionali per l'eutanasia degli animali da laboratorio.

A 24 settimane di età, i topi sono stati soppressi per lussazione cervicale dopo anestesia profonda, e entrambe le tibie sono state prelevate per la scansione ex vivo utilizzando lo stesso protocollo di imaging. I parametri di scansione includevano una dimensione voxel di 10,4 μm, una tensione di 55 kV, una corrente di 145 μA, un campo visivo di 32 mm, 1500/750 campioni per proiezione e un tempo di integrazione di 100 ms.

Le immagini sono state processate utilizzando un algoritmo di correzione per indurimento del fascio polinomiale di terzo ordine calibrato rispetto a un fantasma di 1200 mg HA/cm3 . La frazione volumetrica ossea (BV/TV), lo spessore trabecolare (Tb.Th) e il numero trabecolare (Tb.N) sono stati quantificati nella metafisi distale del femorale situata a 1,0 mm prossimale alla placca di crescita.

3. Trasfezione plasmidiale

Plasmidi sh-Rab27A e sh-NC sono stati generati e utilizzati per la produzione di lentivirus. Plasmidi e costrutti di shRNA che imballano lentivrali sono stati co-trasfettati nelle cellule HEK293T secondo le istruzioni del produttore. I titoli virali sono stati determinati prima della somministrazione intra-femorale come descrittoin precedenza: 36. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti.

4. Colorazione di ematossilina ed eosina (HE)

I campioni femorali sono stati fissati al 4% di paraformaldeide per 24 ore, decalcificati al 10% di EDTA per 4 settimane, crioprotetti al 30% di saccarosio/PBS, incorporati in paraffina e sezionati a uno spessore di 5 μm. Le sezioni tissutali sono state colorate con ematossilina ed eosina ed esaminate al microscopio ottico. Sono stati analizzati almeno sei topi per gruppo.

5. Colorazione con fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP)

La colorazione con trappola delle sezioni femorali è stata eseguita secondo le istruzioni delproduttore 38. L'attività TRAP nei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) è stata valutata utilizzando un saggio di colorazione TRAP. Gli osteoclasti maturi sono stati definiti come cellule multinucleate TRAP-positive contenenti almeno tre nuclei. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti, ciascuna con tre repliche tecniche.

6. q-PCR

L'RNA totale è stato isolato usando il reagente TRIzol secondo le istruzioni del produttore. Il DNA complementare è stato sintetizzato usando la trasscrittasi inversa e sottoposto a PCR quantitativa in tempo reale utilizzando la chimica SYBR Green. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti, ciascuna con tre repliche tecniche.

Le sequenze di primer erano le seguenti:

Rab27A: F, TTCCTGCTTCTCTTCGACCT; R, GGCAGCACTGGTTTCAAAT

TRAPPO: F, TGTTGACAGCGGTCCATCTA; R, CCTCCTTCTTAACCCGAAGC

NFATc1: F, GGTGCTGTCTGGCCATAACT; R, GCGGAAAGGTGGTATCTAA

C-FOS: F, TATTO ACCATTCCCCAGCCGA; R, GCTGTCACCGTGGGGATAAA

YTHDC1: F, GAAGTGGAAGCTCTGCATCAG; R, TTGATCTTTTCGGACAGCACG

IGF2BP2: F, GACTACCCCGACCAGAACTG; R, GAGGCGGGATGTTCCGAATC

β-actina: F, GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG; R, TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. Western blotting

Cellule o tessuti sono stati lisati utilizzando un tampone RIPA integrato con inibitori della proteasi. Le concentrazioni proteiche sono state determinate tramite un saggio di Bradford. Quantità uguali di proteine (20 μg) sono state separate tramite SDS-PAGE e trasferite in membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF) o nitrocellulosa. Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% per 1 ora a temperatura ambiente e incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro TRAP, NFATc1, c-FOS, Rab27A, YTHDC1, IGF2BP2 o β-actina. Dopo il lavaggio, le membrane sono state incubate con gli anticorpi secondari appropriati per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando procedure standard di rilevamento. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti.

8. Coltura cellulare

I macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) sono stati isolati come descrittoin precedenza: 39. Le cellule del midollo osseo prelevate dai femori del topo sono state coltivate durante la notte in un mezzo essenziale minimo α, integrato con siero bovino fetale al 10%, 30 ng/mL fattore stimolante della colonia macrofagica (M-CSF) e 1% di penicillina/streptomicina a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂. Cellule non aderenti sono state raccolte e coltivate in un sistema stromale privo di cellule contenente 30 ng/mL M-CSF. Dopo 3 giorni, le cellule aderenti sono state prelevate come BMM e ulteriormente coltivate in presenza di 30 ng/mL m-csf attivatore e 50 ng/mL del ligando del fattore nucleare κB (RANKL) per 72 ore, inducendo la differenziazione degli osteoclasti.

9. Interferenza RNA (RNAi)

Piccoli RNA interferenti (siRNA) venivano sintetizzati e trasfettati utilizzando un reagente di trasfezione a base di lipidi secondo le istruzioni del produttore. Le cellule sono state seminate a una densità di 2 × 104 cellule per pozzo in piastre da sei pozzi prima della trasfezione. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti.

Le sequenze di bersagli erano le seguenti:

si-Rab27A: GGACUUAAUCAUCTAAGAGAAUGGAA

si-YTHDC1: GCAAGGAGUGUUAUCUUAATT

si-IGF2BP2: CCGUUAACCAACAAGCCAATT

10. Immunofluorescenza

Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 20 minuti e permeabilizzate con 0,1% di Triton X-100 per 10 minuti. Dopo un blocco con albumina sirica bovina al 5% per 30 minuti, le cellule sono state incubate con anticorpi primari durante la notte a 4 °C.

Dopo il lavaggio, sono stati applicati anticorpi secondari coniugati con fluorofori per 30 minuti a temperatura ambiente. I nuclei sono stati controcolorati con DAPI e le immagini sono state acquisite tramite microscopia confocale. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti.

11. Separazione nucleare e citoplasmatica

Le frazioni nucleari e citoplasmatiche sono state isolate secondo le istruzioni del produttore. Le celle sono state lisate sul ghiaccio per 10 minuti e centrifugate a 500 × g per 3 minuti a 4 °C. Il sovrantantante contenente componenti citoplasmatici veniva raccolto, mentre il pellet contenente i nuclei veniva lavato e processato separatamente.

12. Immunoprecipitazione delle proteine legate all'RNA (RIP)

I saghi di immunoprecipitazione a RNA (RIP) sono stati eseguiti secondo le istruzioni del produttore. Per un breve periodo, le celle sono state lisate sul ghiaccio per 30 minuti. Dopo la centrifugazione, i soprannatanti sono stati incubati durante la notte con anticorpi e perle di agarosio proteico A/G. Dopo il lavaggio, le proteine immunoprecipitate sono state analizzate tramite western blotting e l'RNA co-immunoprecipitato è stato analizzato tramite PCR quantitativa in tempo reale. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti.

13. Saggio di stabilità mRNA Rab27A

L'RNA totale è stato estratto nei momenti indicati dopo IGF2BP2 knockdown. Successivamente sono state eseguite trascrizioni inverse e PCR quantitativa in tempo reale. I livelli di mRNA di Rab27A sono stati normalizzati al corrispondente gruppo si-NC a 0 ora. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti.

14. Analisi statistica

Tutti gli esperimenti sono stati condotti indipendentemente utilizzando almeno tre repliche biologiche. Per q-PCR, interferenza RNA, colorazione TRAP, western blotting e altri saghi cellulari, ogni replica biologica includeva tre repliche tecniche salvo diversa specificazione. I dati sono presentati come la deviazione media ± standard (SD).

Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando GraphPad Prism versione 9.0 e software SPSS. I confronti tra i due gruppi sono stati effettuati utilizzando un test t di Student a due code. I confronti tra più gruppi sono stati analizzati utilizzando l'analisi bidirezionale della varianza (ANOVA), seguiti dal test post hoc di Tukey per adeguare i confronti multipli. Un valore P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Il knockdown di Rab27A ha ridotto l'osteoporosi in vivo.

Per indagare il ruolo di Rab27A nell'osteoporosi, è stato eseguito il knockdown di Rab27A in un modello murino ovaricotectomizzato (OVX) stabilito utilizzando metodi precedentementeriportati 34,40. Il disegno complessivo dello studio è riassunto nella Figura 1. L'analisi micro-computerizzata ha dimostrato che la densità minerale ossea, la frazione volumetrica ossea (BV/TV), lo spessore trabecolare (Tb.Th) e il numero trabecolare (Tb.N) sono stati significativamente ridotti nei topi OVX rispetto ai controlli Sham (Figura 2A). Questi risultati hanno confermato il successo dell'istituzione del modello dell'osteoporosi. Il knockdown di Rab27A ha ripristinato significativamente tutti i parametri strutturali ossei misurati, indicando un'attenuazione della perdita ossea indotta da OVX e del deterioramento microarchitetturale (Figura 2A).

L'esame istologico ha ulteriormente confermato questi risultati. La colorazione di ematossilina ed eosina ha rivelato una marcata perdita ossea trabecolare e una rottura dell'architettura trabecolare nei topi OVX rispetto al gruppo Sham (Figura 2B). Al contrario, la deplezione di Rab27A ha alleviato il deterioramento trabecolare e parzialmente ripristinato la morfologia ossea (Figura 2B). Poiché Rab27A è stato implicato nella differenziazioneosteoclasta 28, l'attività osteoclasta è stata valutata tramite colorazione fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP). L'attività TRAP è stata nettamente elevata nei topi OVX rispetto ai controlli Sham ed è stata significativamente ridotta dopo il knockdown di Rab27A (Figura 2C).

Successivamente è stata esaminata l'espressione dei marcatori associati all'osteoclasta. L'analisi del Western blot ha dimostrato che i livelli di proteine Rab27A, TRAP, NFATc1 e c-FOS sono stati significativamente aumentati nei topi OVX e ridotti dopo la deplezione di Rab27A (Figura 2D). Risultati coerenti sono stati ottenuti a livello trascrizionale, con la PCR quantitativa in tempo reale (q-PCR) che ha dimostrato modelli di espressione simili per Rab27A, TRAP, NFATc1 e l'espressione dell'mRNA c-FOS (Figura 2E).

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Figura 1: Panoramica schematica del disegno sperimentale e del meccanismo regolatorio proposto alla base della regolazione mediata da YTHDC1 e IGF2BP2 di Rab27A modificato da m6A durante la differenziazione degli osteoclasti e la progressione dell'osteoporosi. Un modello murino ovariectomizzato (OVX) e un attivatore dei recettori del ligando nucleare κB (RANKL)/fattore stimolante della colonia macrofagica (M-CSF) sono stati utilizzati per indagare il ruolo di Rab27A nell'osteoclastogenesi. Sono stati eseguiti saggi di knockdown di Rab27A, frazionamento nucleare e citoplasmico e immunoprecipitazione RNA per valutare i marcatori di differenziazione degli osteoclasti (TRAP, NFATc1 e c-FOS), l'espressione di Rab27A e la localizzazione subcellulare. YTHDC1 facilitava l'esportazione citoplasmatica di Rab27A modificato con m6A, mentre IGF2BP2 stabilizzato Rab27A nel citoplasma. Insieme, questi meccanismi regolatori coordinati hanno promosso la differenziazione degli osteoclasti e contribuito alla perdita ossea nel modello OVX. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Riduzione di Rab27A ridotto l'osteoporosi in vivo. (A) Analisi morfometrica dell'osso trabecolare. Sono stati quantificati la densità minerale ossea, la frazione volumetrica ossea (BV/TV), lo spessore trabecolare (Tb.Th) e il numero trabecolare (Tb.N). **P < 0,01, ***P < 0,001. (B) Valutazione istologica dell'osso trabecolare femorale dopo la deplezione di Rab27A. È stata eseguita una colorazione di ematossilina ed eosina (HE) per valutare i cambiamenti strutturali nel femore distale. I gruppi OVX e OVX + sh-NC fungevano da controlli. Barra della scala = 50 μm. ***P < 0,001. (C) Colorazione con trappola delle sezioni femori. L'attività TRAP è stata valutata per valutare l'attività osteoclastica. I gruppi OVX e OVX + sh-NC fungevano da controlli. Barra della scala = 50 μm. ***P < 0,001. (D–E) Espressione di Rab27A, TRAP, NFATc1 e c-FOS dopo l'esaurimento di Rab27A. L'espressione proteica è stata determinata tramite western blotting (D), mentre l'espressione dell'mRNA è stata determinata tramite q-PCR (E). β-actin fungeva da controllo del carico. **P < 0,01, ***P < 0,001. Il gruppo Sham ha subito l'esposizione chirurgica delle ovaie senza ovariectomia, mentre il gruppo OVX ha subito un'ovaiectomia bilaterale. sh-NC, controllo negativo a corto tornante a pennello. Sei topi sono stati inclusi in ciascun gruppo sperimentale. I dati sono presentati come media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il knockdown di Rab27A ha soppresso la differenziazione osteoclastica dei BMM indotta da M-CSF e RANKL

Per valutare ulteriormente il ruolo di Rab27A durante l'osteoclastogenesi, i macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) sono stati stimolati con fattore stimolante della colonia di macrofagi (M-CSF) e con attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare κB (RANKL) per indurre la differenziazioneosteoclasta 28.

Analisi quantitative in tempo reale per PCR e western blot hanno dimostrato che la stimolazione di M-CSF e RANKL ha aumentato significativamente l'espressione di mRNA e proteine di Rab27A, mentre la trasfezione con si-Rab27A ha effettivamente ridotto l'espressione di Rab27A (Figura 3A, B). La colorazione con TRAP ha mostrato un marcato aumento dell'attività osteoclastica dopo il trattamento con M-CSF e RANKL. Il knockdown di Rab27A ridusse significativamente l'attività TRAP rispetto al gruppo indotto (Figura 3C).

Successivamente è stata esaminata l'espressione dei marcatori di differenziazione degli osteoclasti. L'analisi quantitativa in tempo reale per PCR ha dimostrato che i livelli di mRNA di TRAP, NFATc1 e c-FOS sono stati significativamente aumentati dopo l'induzione dell'osteoclasto e ridotti da Rab27A (Figura 3D). Risultati simili sono stati osservati a livello proteico tramite western blotting (Figura 3E).

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Figura 3: Knockdown della differenziazione osteoclasta soppressa da Rab27A dei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) indotta da M-CSF e RANKL. (A–B) Espressione di Rab27A dopo l'induzione dell'osteoclasto. I livelli di mRNA (A) e proteina (B) di Rab27A sono stati determinati rispettivamente da q-PCR e western blotting. β-actin fungeva da controllo del carico. P < 0,001. (C) Colorazione TRAP degli osteoclasti derivati dalla BMM. L'aumento dell'attività TRAP indotta da M-CSF e RANKL è stata soppressa dopo il knockdown di Rab27A. Barra della scala = 50 μm. ***P < 0,001. (D–E) Espressione dei marcatori di differenziazione osteoclasta dopo la deplezione di Rab27A. I livelli di mRNA di TRAP, NFATc1 e c-FOS sono stati determinati tramite q-PCR (D), mentre i livelli proteici sono stati determinati tramite western blotting (E). β-actin fungeva da controllo del carico. **P < 0,01, ***P < 0,001. Cellule di controllo, non trattate; si-NC, siRNA di controllo negativo. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti. I dati sono presentati come media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L'esportazione citoplasmatica di Rab27A modificato con m6A è stata facilitata da YTHDC1

Per indagare il potenziale coinvolgimento della modifica di m6A nella regolamentazione di Rab27A, sono state effettuate analisi bioinformatiche. Sono stati identificati più siti previsti di modifica m6A all'interno della trascrizione Rab27A (Figura 4A). Inoltre, l'analisi di previsione delle interazioni ha suggerito potenziali associazioni tra Rab27A e le proteine lettrici m6A YTHDC1 e IGF2BP2 (Figura 4B).

Per convalidare l'interazione tra YTHDC1 e Rab27A mRNA, sono stati eseguiti saghi di immunoprecipitazione a RNA (RIP). L'mRNA di Rab27A è stato significativamente arricchito nei complessi immunoprecipitati con anticorpi anti-YTHDC1 rispetto al controllo dell'immunoglobulina G (IgG) (Figura 4C).

Poiché YTHDC1 funziona come lettore nucleare m6A coinvolto nell'esportazione diRNA 41, sono stati eseguiti saggi di frazionamento nucleare e citoplasmatico. Il knockdown di YTHDC1 ha aumentato significativamente la ritenzione nucleare dell'mRNA Rab27A riducendone l'abbondanza citoplasmatica (Figura 4D).

L'effetto di YTHDC1 sull'espressione di Rab27A è stato ulteriormente valutato. L'analisi quantitativa in tempo reale per PCR ha dimostrato che la deplezione di YTHDC1 riduceva l'espressione dell'mRNA di Rab27A (Figura 4E). Costantemente, l'analisi western blot ha mostrato una diminuzione dell'espressione della proteina Rab27A dopo il knockdown di YTHDC1 (Figura 4F).

figure-results-4
Figura 4: L'esportazione citoplasmatica di Rab27A modificato con m6A è stata facilitata da YTHDC1. (A) Siti previsti di modifica m6A all'interno di Rab27A identificati utilizzando lo strumento di previsione SRAMP. (B) Interazioni previste tra Rab27A e le proteine lettrici m6A YTHDC1 e IGF2BP2 identificate utilizzando StarBase. (C) Saggio di immunoprecipitazione dell'RNA (RIP) che dimostra l'interazione tra YTHDC1 e Rab27A mRNA. **P < 0,01. IgG fungeva da controllo negativo. L'arricchimento Rab27A è stato normalizzato alla percentuale di input. La banda immunoblot YTHDC1 riflette l'efficienza dell'immunoprecipitazione. (D) Analisi della frazionazione nucleare e citoplasmatica che ha dimostrato un aumento della ritenzione nucleare di Rab27A dopo il knockdown di YTHDC1. **P < 0,01, ***P < 0,001. (E–F) Espressione di YTHDC1 e Rab27A dopo il knockdown di YTHDC1. L'espressione dell'mRNA è stata determinata tramite q-PCR (E), mentre l'espressione proteica è stata determinata dal western blotting (F). β-actin fungeva da controllo del carico. **P < 0,01. si-NC, siRNA di controllo negativo. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti. I dati sono presentati come media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Stabilizzazione di Rab27A attraverso l'interazione con IGF2BP2

L'interazione tra IGF2BP2 e Rab27A è stata studiata utilizzando saghi RIP. L'mRNA di Rab27A è stato significativamente arricchito nei complessi immunoprecipitati con anticorpi anti-IGF2BP2 rispetto al controllo IgG, indicando un'associazione tra IGF2BP2 e mRNA Rab27A (Figura 5A).

L'analisi di immunofluorescenza ha dimostrato la co-localizzazione di IGF2BP2 e Rab27A prevalentemente all'interno del citoplasma (Figura 5B). Per determinare l'effetto funzionale della IGF2BP2 sull'espressione di Rab27A, IGF2BP2 è stato silenziato utilizzando siRNA. L'analisi quantitativa in tempo reale per PCR ha rivelato una significativa riduzione dei livelli di mRNA di Rab27A dopo IGF2BP2 esaurimento (Figura 5C). In linea con questi risultati, l'analisi del western blot ha mostrato una diminuzione dell'espressione proteica Rab27A dopo IGF2BP2 knockdown (Figura 5D).

L'effetto della IGF2BP2 sulla stabilità dell'mRNA Rab27A è stato successivamente valutato. IGF2BP2 deplezione ha significativamente accorciato l'emivita dell'mRNA Rab27A e ridotto la stabilità del trascritto (Figura 5E).

figure-results-5
Figura 5: Stabilizzazione di Rab27A tramite interazione con IGF2BP2. (A) Saggio di immunoprecipitazione dell'RNA che dimostra l'associazione tra IGF2BP2 e Rab27A mRNA. IgG fungeva da controllo negativo. L'arricchimento Rab27A è stato normalizzato alla percentuale di input. P < 0,001. (B) Analisi di immunofluorescenza che dimostra la co-localizzazione di Rab27A e IGF2BP2 nel citoplasma. I nuclei sono stati contrastati con DAPI. Barra di scala = 20 μm (C–D) Regolazione al ribasso di Rab27A dopo IGF2BP2 esaurimento. I livelli di mRNA di Rab27A sono stati determinati tramite q-PCR (C), mentre i livelli proteici sono stati determinati tramite western blotting (D). β-actin fungeva da controllo del carico. **P < 0,01, ***P < 0,001. (E) Stabilità dell'mRNA Rab27A dopo IGF2BP2 knockdown. I livelli di mRNA di Rab27A sono stati normalizzati al corrispondente gruppo si-NC a 0 ora. **P < 0,01. si-NC, siRNA di controllo negativo. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti. I dati sono presentati come media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il silenziamento di YTHDC1 o IGF2BP2 soppresso della differenziazione osteoclastica dei BMM indotta da M-CSF e RANKL

Per approfondire la relazione funzionale tra YTHDC1, IGF2BP2 e Rab27A durante la differenziazione degli osteoclasti, sono stati condotti esperimenti di knockdown nei BMM.

La stimolazione di M-CSF e RANKL ha aumentato significativamente l'espressione dell'mRNA di Rab27A, YTHDC1 e IGF2BP2 (Figura 6A). Di conseguenza, l'espressione proteica di queste molecole è stata elevata anche dopo l'induzione dell'osteoclasto (Figura 6B). Silenziare YTHDC1 o IGF2BP2 riduceva significativamente l'espressione di Rab27A, mentre il knockdown di un regolatore non influiva sostanzialmente sull'espressione dell'altro.

La colorazione TRAP ha dimostrato che la deplezione di YTHDC1 o IGF2BP2 ha significativamente soppresso l'attività osteoclastica indotta da M-CSF e RANKL (Figura 6C). Inoltre, l'analisi quantitativa in tempo reale per PCR ha rivelato una riduzione dell'espressione di TRAP, NFATc1 e c-FOS dopo YTHDC1 o IGF2BP2 knockdown (Figura 6D). L'analisi del Western blot ha confermato riduzioni corrispondenti a livello proteico (Figura 6E).

Collettivamente, questi risultati indicano che YTHDC1 e IGF2BP2 favoriscono la differenziazione degli osteoclasti attraverso la regolazione dell'espressione di Rab27A.

figure-results-6
Figura 6: Silenziamento di YTHDC1 o IGF2BP2 differenziazione osteoclasta soppressa delle BMM indotta da M-CSF e RANKL. (A–B) Espressione di Rab27A dopo YTHDC1 o IGF2BP2 knockdown. I livelli di mRNA (A) e proteina (B) di Rab27A sono stati determinati rispettivamente da q-PCR e western blotting. β-actin fungeva da controllo del carico. P < 0,001. (C) Colorazione TRAP che dimostra la soppressione dell'attività osteoclasta dopo YTHDC1 o IGF2BP2 esaurimento di YTHDC1. Barra della scala = 50 μm. **P < 0,01, ***P < 0,001. (D–E) Espressione dei marcatori di differenziazione osteoclasta dopo YTHDC1 o IGF2BP2 esaurimento della situazione. I livelli di mRNA di TRAP, NFATc1 e c-FOS sono stati determinati tramite q-PCR (D), mentre i livelli proteici sono stati determinati tramite western blotting (E). β-actin fungeva da controllo del carico. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Cellule di controllo, non trattate; si-NC, siRNA di controllo negativo. Furono eseguite tre repliche biologiche indipendenti. I dati sono presentati come media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

I dataset utilizzati e/o analizzati durante lo studio attuale (inclusi dati western blot, dataset di immagini, analisi quantitative e file sorgente) durante questo studio sono stati forniti nel File Supplementare 1.

File supplementare 1: I dataset e i dati grezzi di questo studio. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

La differenziazione degli osteoclasti svolge ruoli essenziali nel rimodellamento osseo, nel riassorbimento osseo, nella riparazione delle fratture e nell'omeostasischeletrica 12˒15˒17˒18˒42˒43. L'eccessiva attività osteoclastica è un fattore importante che contribuisce all'osteoporosi, rendendo l'identificazione delle vie regolatorie che controllano la differenziazione degli osteoclasti un obiettivo di ricerca importante. Diverse terapie anti-reassorbtive mirate alla funzione osteoclasta hanno dimostrato efficaciaclinica 6,44,45. Ad esempio, il denosumab è stato associato a una riduzione dell'incidenza delle fratture e a un profilo di sicurezzafavorevole 6, mentre l'inibitore della catepsina K ONO-5334 ha mostrato effetti benefici sulla densità minerale ossea e sulla resistenza ossea in primati non umani ovaricomizzati44. Il presente studio ha identificato un meccanismo regolatorio dipendente da m6A precedentemente non riconosciuto che coinvolge YTHDC1, Rab27A e IGF2BP2 che promuove la differenziazione degli osteoclasti e la progressione dell'osteoporosi. Questi risultati forniscono nuove intuizioni sulla regolazione molecolare dell'osteoclastogenesi e suggeriscono potenziali bersagli terapeutici per l'osteoporosi.

Rab27A è stato precedentemente implicato nella differenziazione osteoclastica e nel riassorbimento osseo tramite la regolazione del traffico vescicolare e della segnalazione intracellulare, e può anche influenzare le cascate di segnalazione indotte da RANKL tramite il riciclo endosomico dei recettorichiave 28,29. In linea con questi rapporti, l'espressione di Rab27A è stata notevolmente aumentata durante la differenziazione degli osteoclasti, mentre la deplezione di Rab27A ha soppresso la differenziazione degli osteoclasti in vitro e alleviato la perdita ossea associata all'osteoporosi in vivo. Questi risultati supportano un ruolo fondamentale per Rab27A nella biologia degli osteoclasti e estendono ulteriormente le osservazioni precedenti dimostrando che l'attività di Rab27A è regolata tramite meccanismi dipendenti da m6A. Collettivamente, i risultati suggeriscono che Rab27A modificato con m6A possa regolare questi processi a livello post-trascrizionale e quindi influenzare l'attività di riassorbimento osseo.

Le evidenze accumulate indicano che la modifica m6A contribuisce allo sviluppo e alla progressione di malattie ossee32. Analisi bioinformatiche hanno identificato molteplici siti di modifica presunti di m6A all'interno dell'mRNA di Rab27A (Figura 4A), e studi funzionali hanno dimostrato che YTHDC1 e IGF2BP2 regolano l'espressione di Rab27A e la differenziazione degli osteoclasti (Figure 4–6). Questi risultati suggeriscono che la modifica di m6A sia un importante meccanismo regolatorio a monte che controlla la funzione di Rab27A durante l'osteoclastogenesi. Poiché sono stati identificati più siti m6A previsti all'interno di Rab27A, studi futuri dovrebbero determinare se siano necessari siti individuali o combinazioni di siti per la regolamentazione di Rab27A. La costruzione di mutanti Rab27A carenti di m6A e i successivi esperimenti di salvataggio fornirebbero prove dirette dell'importanza funzionale della modifica di m6A in questo percorso.

Dal punto di vista meccanistico, il presente studio ha dimostrato che YTHDC1 interagisce con l'mRNA di Rab27A e ne facilita l'esportazione nucleare. Dopo la traslocazione citoplasmatica, IGF2BP2 si associa direttamente all'mRNA Rab27A e migliora la stabilità del trascritto. Di conseguenza, la deplezione di YTHDC1 o IGF2BP2 riduceva l'espressione di Rab27A e soppresso la differenziazione degli osteoclasti. Questi risultati supportano un modello in cui YTHDC1 e IGF2BP2 cooperano per mantenere l'espressione di Rab27A coordinando il trasporto e la stabilità dell'mRNA. Questo meccanismo regolatorio amplia la comprensione attuale della regolazione mediata da m6A della differenziazione osteoclasta e identifica molteplici componenti di questa via come potenziali bersagli terapeutici.

Devono essere riconosciute diverse limitazioni. Innanzitutto, sebbene Rab27A sia stato dimostrato efficace per regolare la differenziazione degli osteoclasti, i suoi potenziali effetti sulla funzione degli osteoblasti non sono stati ancora studiati. Poiché l'omeostasi ossea dipende dall'equilibrio tra la riassorbimento ossea mediata dagli osteoclasti e la formazione ossea mediata dagli osteoblasti, studi futuri dovrebbero valutare se anche Rab27A influenzi la differenziazione o l'attività degli osteoblasti. In secondo luogo, il presente studio si è basato principalmente su approcci basati sulla perdita di funzione. La sovraespressione complementare di Rab27A, YTHDC1 e IGF2BP2, insieme a esperimenti di salvataggio con mutanti Rab27A carenti di m6A, rafforzerebbe ulteriormente il modello regolatorio proposto. In terzo luogo, sebbene diversi siti m6A presunti all'interno dell'mRNA Rab27A siano stati previsti utilizzando approcci bioinformatici, i siti specifici responsabili della regolazione della funzione di Rab27A rimangono non identificati e richiedono una validazione sperimentale. Infine, sono necessari ulteriori studi per determinare se altre proteine lettrici m6A, proteine leganti l'RNA o vie di segnalazione partecipino alla regolazione di Rab27A durante la differenziazione degli osteoclasti.

La regolazione immunitaria è emersa come un componente importante della patogenesidell'osteoporosi 46,47. Rab27A ha stabilito funzioni nella secrezione delle cellule immunità, nel rilascio di granuli citotossici, nella degranulazione dei neutrofili e nella regolazione del microambientetissutale 48,49,50,51,52,53,54,55. Ulteriori indagini sulla relazione tra Rab27A, regolazione immunitaria e omeostasi ossea potrebbero fornire ulteriori informazioni sulla patogenesi dell'osteoporosi.

Le indagini future dovrebbero dare priorità a diverse aree chiave. Innanzitutto, è necessaria una mutagenesi sistematica dei siti m6A previsti all'interno di Rab27A per identificare i siti di legame funzionali coinvolti nella regolazione mediata da YTHDC1 e IGF2BP2. In secondo luogo, la sovraespressione di Rab27A, YTHDC1 e IGF2BP2, insieme a esperimenti di salvataggio con mutanti Rab27A carenti di m6A, sarà essenziale per stabilire il contributo diretto dell'asse regolatorio YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2. In terzo luogo, la validazione di questa via in ulteriori modelli di osteoporosi e la valutazione della funzione Rab27A negli osteoblasti saranno importanti per rafforzare ulteriormente i risultati attuali.

In conclusione, il presente studio ha identificato un nuovo asse regolatorio YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2 che promuove la differenziazione degli osteoclasti e la progressione dell'osteoporosi. YTHDC1 facilitava l'esportazione nucleare di mRNA Rab27A modificato con m6A, mentre IGF2BP2 migliorato la stabilità dell'mRNA Rab27A nel citoplasma. Questi eventi regolatori coordinati aumentarono l'espressione di Rab27A e promossero l'osteoclastogenesi. Collettivamente, i risultati ampliano la comprensione attuale della regolazione mediata da m6A nell'osteoporosi e forniscono una base per sviluppare strategie terapeutiche mirate al percorso YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non esserci interessi finanziari o conflitti di interesse in conflitto.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal Progetto di Cooperazione Strategica Scientifica e Tecnologica tra il Pengzhou People's Hospital e la Southwest Medical University (Grant n. 2023PZXNYD01) a Lian Tang.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4% ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificA5818101Tissue and cell fixation
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11001Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11035Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534093
Bovine serum albumin (BSA)MerckA2153Blocking reagent
Bradford Protein AssayMerckB6916Protein quantification
C57BL/6JSlac miceShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.—Female, 8 weeks old; RRID: MGI:2159769
c-FOS antibodyAbcamab222699Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2891049
Confocal laser scanning microscope (SP8)Leica MicrosystemsSP8Immunofluorescence image acquisition; RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571Nuclear counterstain for immunofluorescence; RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500GTissue decalcification reagent
EosinSolarbioG1100Histological cytoplasmic stain
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701Cell culture supplement
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0Statistical analysis software; RRID: SCR_002798
HematoxylinCell Signaling Technology#14166Histological nuclear stain
IBM SPSS StatisticsIBMWindows versionStatistical analysis software; RRID: SCR_016479
IGF2BP2 antibodyProteintech11601-1-APPrimary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_2122672
Inverted light microscope (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8Histological image acquisition; RRID: SCR_026672
Lentiviral titer quantification kitTakara Bio631235Lentiviral titer determination
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Plasmid transfection reagent
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA transfection reagent
M-CSFMedChemExpressHY-P7085Osteoclast differentiation factor
Micro-computed tomography systemScanco MedicalVivaCT80Bone morphometric analysis
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1701cDNA synthesis
NFATc1 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7294Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2152503
PARIS KitThermo Fisher ScientificAM1556Nuclear and cytoplasmic fractionation
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotic supplement for cell culture
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659Quantitative real-time PCR
Protease inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific78429Prevention of protein degradation
Protein A/G agarose beadsMerckIP05Immunoprecipitation
PVDF membraneThermo Fisher Scientific88520Protein transfer membrane for western blotting
Rab27A antibodyAbcamab55667Primary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425Osteoclast differentiation factor
Real-time PCR systemApplied BiosystemsABI7900HTQuantitative real-time PCR instrument
RIPA bufferThermo Fisher Scientific78501Protein extraction buffer
RNA Immunoprecipitation (RIP) KitMilliporeRIP-12RXNRNA immunoprecipitation assay
SDS-PAGE reagentsThermo Fisher ScientificBT041210BOXProtein electrophoresis
shRNA plasmidsRiboBio—Gene silencing by RNA interference
Small interfering RNAs (siRNAs)GenePharma—Gene silencing by RNA interference
SRAMPOnline resource—Prediction of m6A modification sites; RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)Online resource—RNA interaction prediction database; RRID: SCR_016303
TRAP antibodyAbcamab2391Primary antibody for western blotting; RRID: AB_303034
TRAP staining kitMerck387ADetection of osteoclast activity
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111Cell permeabilization reagent
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNTotal RNA isolation
YTHDC1 antibodyAbcamab122340Primary antibody for western blotting; RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651Cell culture medium
β-Actin antibodyMerckA5441Loading control for western blotting; RRID: AB_476744

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