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Articolo metodologico

La metafase DNA-FISH si diffonde per distinguere il DNA extracromosomico dalle regioni di colorazione omogenea nelle linee cellulari tumorali umane

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⸱

DOI:

10.3791/71970

⸱

4 agosto 2026

 ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Riportiamo un protocollo di diffusione della metafase DNA-FISH che rileva visivamente il numero di copie e la posizione del locus all'interno del genoma. Questo approccio consente la risoluzione a singola cellula degli stati di amplificazione, in particolare nelle linee cellulari tumorali contenenti DNA extracromosomico e regioni di colorazione omogenea.

Abstract

Il sequenziamento dell'intero genoma identifica amplificazioni focali del DNA con risoluzione a coppie di basi, ma non può determinare se le sequenze amplificate risiedono sul DNA extracromosomico (ecDNA, noto anche come doppio minuto) o all'interno di regioni cromosomiche integrate e omogeneamente colorate (HSR). Le diffusioni metafase di ibridazione in situ di fluorescenza del DNA (DNA-FISH) rimangono lo standard d'oro per distinguere questi stati di amplificazione a risoluzione cellulare singola. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la diffusione della metafase DNA-FISH utilizzando linee cellulari tumorali umane, comprendendo coltura cellulare, arresto della metafase, trattamento ipotonico, fissazione, diffusione dei cromosomi, ibridazione con sonda fluorescente e imaging a fluorescenza. Il protocollo incorpora passaggi intermedi di controllo qualità per verificare la dispersione cromosomica riuscita e ottimizzare la qualità della diffusione della metafase, rendendo il flusso di lavoro accessibile a laboratori senza competenze specialistiche in citogenetica. I risultati dimostrano una chiara visualizzazione degli stati di amplificazione di ecDNA e HSR utilizzando sonde specifiche per il loco e illustrano artefatti tecnici comuni che possono influenzare l'interpretazione. Questo protocollo fornisce un approccio robusto e riproducibile per studiare l'organizzazione strutturale dell'amplificazione degli oncogeni nelle cellule tumorali.

Introduzione

Il genoma umano è organizzato non solo dalla sua sequenza, ma anche dalla sua struttura, e cambiamenti sia nella sequenza che nella struttura possono portare alcancro 1,2,3,4. L'amplificazione degli oncogeni è presente in circa il 40% di tutti i tumori, dove contribuisce all'iniziazione, crescita, metastasi e resistenza al farmaco5. In alcuni casi, gli oncogeni amplificati sono trasportati su DNA extracromosomici (ecDNA, detti anche doppi minuti), che sono elementi circolari, autoreplicanti e a doppio filamento che risiedono al di fuori dei cromosomilineari 6,7,8,9. Gli ecDNA sono centinaia di kilobase fino a megabasi di dimensioni10,11. A causa della loro assenza di centromeri, si segregano asimmetricamente durante la mitosi, portando a fino a 100+ copie in un singolonucleo 12,13,14,15,16,17,18. Questa segregazione diseguale genera variabilità del numero di copie tra le cellule figlie, che favorisce una rapida evoluzione tumorale e un esito scadente per i pazienti17,19.

Gli ecDNA esistono in una relazione dinamica con le regioni di colorazione omogenea (HSR) (Figura 1A)8,18. Gli HSR sono amplificazioni focali intracromosomiche che possono sorgere tramite la reintegrazione di ecDNA in un unico locus nelgenoma 8,10,18,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Questi due stati, ecDNA e HSR, possono interconvertirsi, rivelando che l'amplificazione oncogenica è strutturalmenteplastica 24,25,32,33. Questa interconversione ha rilevanza terapeutica perché gli ecDNA possono passare allo stato HSR in presenza di farmaci 32,33,34,35,36,37,38. Le cellule che subiscono questa transizione allo stato HSR diventano quindi resistenti al farmaco sotto pressioneterapeutica 33. Gli HSR sembrano inoltre essere più frequenti nei tumori maligni rispetto ai tumoribenigni 39. Nonostante la loro rilevanza clinica, nessuna strategia approvata dalla FDA mira allo stato HSR, in parte perché i metodi per distinguere queste strutture di amplificazione restano sottoutilizzati.

Sebbene gli stati ecDNA e HSR abbiano conseguenze cliniche distinte, gli attuali approcci di sequenziamento non possono distinguerli in modo affidabile. Il sequenziamento dell'intero genoma (WGS) ora identifica regioni amplificate con risoluzione a coppie dibasi 40. Il WGS è stato prezioso nel definire la composizione delle sequenze di ecDNA e HSR, ma a scapito della risoluzione spaziale. A differenza degli approcci citogenetici tradizionali, il WGS da solo non può determinare se una sequenza amplificata risieda sugli ecDNA o se sia integrata in un cromosoma come HSR 41,42,43. Di conseguenza, i metodi che preservano il contesto spaziale dell'amplificazione rimangono essenziali per comprendere la biologia di questi stati distinti.

Negli ultimi 40 anni, le propagazioni in situ della metafase di ibridazione in situ del DNA (DNA-FISH) sono state lo standard d'oro per identificare e distinguere gli stati di amplificazione ecDNA eHSR 42,44,45,46. Infatti, ecDNA e HSR sono stati identificati e caratterizzati per la prima volta tramite analisi citogenetiche basate sullametafase 7,47. Prima dell'uso diffuso delle sonde fluorescenti, l'ibridazione in situ veniva eseguita utilizzando sonde di DNA radiomarcate, che sono state anche utilizzate per visualizzare ecDNA e HSR48,49. Con la crescente popolarità del WGS, le diffusioni della metafase DNA-FISH sono diventate meno comuni. Molti aspetti del flusso di lavoro sono sparsi nella letteratura citogenetica, e i protocolli ottimizzati sono tipicamente mantenuti all'interno di singoli gruppi di ricerca o laboratori di citogenetica che trattano il metodo comeproprietario 50,51. Qui descriviamo un protocollo di diffusione metafase DNA-FISH per risolvere visivamente lo stato di amplificazione a livello di singola cellula.

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Protocollo

Tutte le procedure di coltura cellulare umane sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali.

1. Arrestare le cellule in metafase usando Colcemide (N-metil-N-deacetil-colchicina)

  1. Si inizia con circa 2,0 × 106–2,0 × 107 cellule tumorali o altre cellule coltivate. Troppo poche cellule produrranno meno diffusioni della metafase, mentre troppe cellule possono portare a una fissazione insufficiente.
  2. Determinare il tempo di incubazione appropriato del Colcemid per il sistema sperimentale. Il tempo di incubazione influisce sul numero di propagazioni metafasiche ottenute e sulla lunghezza dei cromosomi, e le condizioni ottimali variano tra i tipi cellulari.
    NOTA: tempi di incubazione più brevi comportano un minor arresto delle cellule in metafase al momento della raccolta. I tempi di incubazione più lunghi producono più cromosomi condensati con braccia più corte, rendendo l'analisi più difficile. Per le linee cellulari tumorali con un tempo di raddoppio approssimativo di 24 ore, i periodi di incubazione che vanno da 45 minuti fino a una notte producono propagazioni metafase adeguate. Ottimizza il tempo di incubazione per le cellule con tempi di raddoppio più lenti. Un'incubazione di 2 ore è generalmente sufficiente per produrre un numero adeguato di propagazioni metafasiche con lunghezze cromosomiche adeguate all'analisi.
  3. Calcola la quantità di Colcemide necessaria per raggiungere una concentrazione finale di 10 μL/mL nel terreno di coltura cellulare appropriato.
    NOTA: Mantieni le cellule in crescita logaritmica passandole o seminandole almeno 24 ore prima dell'arresto della metafase. Trattare le cellule con Colcemide quando le colture raggiungono una confluenza del 70%–90%.
  4. Diluire la soluzione di Colcemid 1:1 con acqua ultrapura sterile. Aggiungi il volume appropriato alla coltura e incuba per 45 minuti fino a tutta la notte in un incubatore di colture cellulari.

2. Prelievo delle cellule

  1. Prepara il fissatore fresco di Carnoy (metanolo 3:1: acido acetico). Tieni il fissatore sul ghiaccio durante tutto il processo di fissazione.
  2. Prepara una soluzione fresca di 0,075 M KCl e riscaldala in un bagno d'acqua a 37 °C.
  3. Raccogli le cellule come una pellet e registra il conteggio delle cellule. Usa questo valore per calcolare il volume finale di sospensione.
    NOTA: Distacca le cellule aderenti tramite tripsinizzazione. Trasferire le celle di sospensione direttamente in tubi centrifughe da 15 mL. Smaltire Colcemid e i materiali contenenti Colcemid secondo le linee guida istituzionali sui rifiuti pericolosi.
  4. Lava le cellule con PBS.
  5. Sospezione delicata delle celle in 10 mL di 0,075 M KCl caldo e mescolate con inversione delicata. Questo trattamento ipotonico gonfia le cellule, permettendo loro di rompersi e disperdere i cromosomi durante la preparazione delle vetrine.
  6. Incubare le cellule in un bagno d'acqua a 37 °C per 30 minuti.
  7. Aggiungi lentamente 2 mL di fissativo Carnoy's gelato mentre mescoli delicatamente la sospensione per inversione.
  8. Lascia riposare le cellule per 5 minuti.
  9. Centrifuga a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
  10. Aspira con cura il surnatant o rimuovilo con una pipetta.
  11. Aggiungi lentamente 10 mL di fissativo Carnoy's ghiacciato in incrementi di 0,5 mL, mescolando delicatamente dopo ogni aggiunta.
  12. Lascia che le celle restino ferme per 10 minuti a RT.
  13. Centrifuga a 650 × g per 5 minuti in tempo di ritiro.
  14. Ripeti due volte i passaggi 2.10–2.13
  15. Durante il lavaggio finale, lasciare le cellule sospese nel fissativo di Carnoy.
    PAUSA: Conservare la sospensione a celle fisse a −20 °C o procedere immediatamente alla Sezione 3.
    NOTA: Per campioni contenenti meno di circa 3 × 106 celle, effettuare la fissazione in tubi microcentrifuga da 1,5 mL invece che in tubi conici più grandi. Ridurre i volumi di 0,075 M KCl e il fissativo di Carnoy di 10 volte mantenendo tutti i tempi di incubazione, le temperature e le condizioni di centrifugazione.

3. Scendere sul tavolo

  1. Recuperare il campione da −20 °C e scongelarlo in RT.
  2. Centrifuga a 800 × g per 7 minuti a RT.
  3. Etichetta i vetrini e mettili sul ghiaccio.
  4. Utilizzando il conteggio cellulare ottenuto prima della fissazione, calcola il volume del fissativo di Carnoy necessario per risospendere il pellet a una concentrazione finale di circa 5 × 106 cellule/mL. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta, lasciando il volume calcolato del fissativo sopra la pellet.
  5. Risospendere le cellule fisse nel fissativo di Carnoy usando una pipetta P1000.
  6. Trasferire circa 300 μL della sospensione a cella fissa in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
  7. Sospezioni accuratamente il campione usando una pipetta P200 pipettando su e giù più volte.
  8. Aspirare 60 μL delle celle risospese utilizzando una pipetta P200.
  9. Tieni la punta della pipetta circa 1 m sopra il vetrino di vetro sul ghiaccio e mira al centro del carrello.
  10. Sforna lentamente una goccia della sospensione a celle sulla carrella.
    NOTA: Segnare la posizione della caduta sul bordo della vetrina con un marcatore resistente all'etanolo per facilitare l'identificazione durante i passaggi successivi.
  11. Lascia asciugare le celle sul ghiaccio per 10 minuti.
  12. Posiziona i vetri su un incubatore a 80 °C per 10 minuti.
  13. Rimuovi i vetri con delle pinze e lasciali raffreddare al tatto.
  14. Esaminare le vetrine con un microscopio a contrasto di fase con obiettivo del 10× o 20×. Confermare la presenza di più propagazioni metafasi ben disperse senza sovrapposizione eccessiva.

4. Pretrattare il vetrino

  1. Prepara i barattoli di Coplin per i passaggi di lavaggio
    1. Prepara ogni reagente fresco: 70% acido acetico (40 mL), PBS (40 mL), PBS (45 mL), etanolo al 70% (40 mL), 85% etanolo (40 mL) e 100% etanolo (40 mL).
  2. Metti le vetrate in acido acetico al 70% per 2 minuti.
  3. Metti i vetri in 40 mL di PBS per 30 secondi.
  4. Metti le vetrine in 45 mL di PBS per 5 minuti.
  5. Disidrata il vetro in sequenza con il 70%, 85% e 100% etanolo per 1 minuto ciascuno.
  6. Asciuga le slide all'aria a RT per 10 minuti.

5. Prepara la sonda

NOTA: Questo protocollo utilizza sonde DNA-FISH specifiche per loco disponibili commercialmente che si ibridano in una regione genomica di interesse.

  1. Seleziona una sonda che mira al locus amplificato da esaminare. Scongelare la sonda e il buffer di ibridazione secondo le istruzioni del produttore. Lascia che la sonda raggiunga il livello RT prima dell'uso.
  2. Prepara una miscela per sonda contenente 1 μL di sonda e 4 μL di tampone di ibridazione per ogni vetrata di vetro.
    NOTA: La concentrazione ottimale della sonda può dipendere dal produttore e dalla sonda. La concentrazione specificata qui è stata ottimizzata in base alle sonde utilizzate in questo studio. Tuttavia, ottimizzare la concentrazione della sonda per ogni nuovo locus.
  3. Applicare 5 μL della miscela tampone sonda/ibridazione al centro di ogni punto di goccia sul vetrino del vetro.
    NOTA: Le sonde sono fotosensibili. Minimizza l'esposizione alla luce durante tutto il resto della procedura conservando le vetri in un cassetto buio tra un passaggio e l'altro e l'altro durante l'elaborazione delle altre vetrine.
  4. Posiziona con cura un copertino sul campione.
  5. Sigilla i bordi della copertura con cemento di gomma.
  6. Metti i vetri in una camera umida.
  7. Ibridare la sonda secondo il protocollo del produttore. Permettere che l'ibridazione proceda durante la notte (12–18 ore).

6. Lavaggi post-ibridazione, controcolorazione, montaggio e imaging

  1. Prepara i barattoli di Coplin per i passaggi di lavaggio
    1. Preparare ogni reagente fresco: 2× SSC (40 mL), 0,4× SSC (40 mL), 70% etanolo (40 mL), 85% etanolo (40 mL), 100% etanolo (40 mL) e PBS (45 mL).
    2. Preparare e conservare l'SSC come soluzione di stocco al 20× (3 M NaCl, 0,3 M citrato di sodio, pH 7,0). Per preparare 1 L, sciogliere 175,3 g di NaCl e 88,2 g di citrato di sodio in 1 L di acqua ultrapura. Diluire il materiale per preparare soluzioni operative da 2× SSC e 0,4× SSC secondo necessità.
  2. Riscalda la soluzione SSC 0,4× a 72 °C in un bagno d'acqua.
  3. Rimuovi le vetrine di vetro dalla camera umida e rimuovi con cura il cemento di gomma.
  4. Metti i vetri in 2× SSC per 2 minuti a RT. Rimuovi con attenzione i copriversori.
  5. Metti i vetri in SSC preriscaldati a 0,4× °C per 2 minuti.
  6. Metti i vetri in 2× SSC per 1 minuto a RT.
  7. Disidrata il vetro in sequenza con il 70%, 85% e 100% etanolo per 1 minuto ciascuno.
  8. Asciuga le slide all'aria a RT per 10 minuti al buio.
  9. Diluire 1 mg/mL di DAPI 1:1000 in PBS fino a un volume finale di 1 mL.
    NOTA: Questa aliquota può essere conservata a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
  10. Pipetta 10 μL del DAPI diluito su ogni vetrata di vetro nella posizione indicata per la caduta.
  11. Posiziona con cura un copertore sul campione per garantire che la soluzione DAPI si distribua uniformemente.
  12. Incubare i vetrimenti al buio per 5–10 minuti.
  13. Metti i vetri in PBS per 30 secondi.
  14. Rimuovi le coperture.
  15. Metti i vetrimenti in PBS per 2 minuti.
  16. La disidratazione del vetro si immerge brevemente nel 70%, 85% e 100% etanolo per circa 10 secondi ciascuno.
  17. Asciuga le slide all'aria a RT per 10 minuti al buio.
  18. Aggiungi 15 μL di mezzo di montaggio a ogni vetrata di vetro, poi posiziona un copricapo sopra.
  19. Lascia che il mezzo di montaggio si distribuisca uniformemente, poi tampona delicatamente l'eccesso.
  20. Sigilla i bordi della copertura con lo smalto.
  21. Lascia asciugare lo smalto per 15 minuti a RT al buio.
    PAUSA: Conserva i vetrini a 4 °C per conservazione a lungo termine.
  22. Immagina le diapositive.
    NOTA: Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita con un obiettivo di immersione in olio del 60×.
  23. Raccogli più z-stack per ogni canale di fluorescenza per catturare il segnale per tutta la profondità della diffusione della metafase.
  24. Deconvolvolgi gli stack di immagini utilizzando un algoritmo di stima della massima verosimiglianza per migliorare la chiarezza del segnale e ridurre la fluorescenza fuori fuoco.
  25. Elaborare e analizzare le immagini finali in ImageJ, e selezionare il piano focale ottimale per ogni diffusione di metafase prima dell'analisi a valle.

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Risultati

Questo protocollo (Figura 1B) produce cromosomi metafase puliti, ben dispersi e intatti, adatti all'analisi citogenetica, con cromosomi e segnali DNA-FISH chiaramente visibili tramite microscopia a fluorescenza. L'utilizzo di un microscopio a campo chiaro/contrasto di fase a basso ingrandimento (10× o 20×) è un importante passaggio di controllo qualità per verificare che i nuclei abbiano scoppiato e che i cromosomi si siano dispersi (Fig...

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Discussione

Nonostante i loro vantaggi ben affermati, le propagazioni della metafase DNA-FISH sono poco utilizzate nell'era del WGS. L'organizzazione fisica del DNA amplificato è funzionalmente significativa, poiché può influenzare il comportamento biologico a valle e la risposta terapeutica 61,62,63,64. Gli oncogeni amplificati focalmente possono esistere su ecDNA o all'i...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal NIH R00HG011467 e CPRIT RR23004 to G.S.E. L'imaging per questo progetto è stato supportato dall'Integrated Microscopy Core del Baylor College of Medicine con finanziamenti del NIH (P30 DK056338, P30 CA125123, S10OD030414). Gli autori ringraziano il dottor Pawel Stankiewicz per i suoi consigli fin dall'inizio. Gli autori ringraziano anche il dottor Paul Mischel (Stanford University) per aver fornito le linee cellulari GBM39ec e GBM39hsr.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
15-mL conical centrifugeany sourceNACentrifugazione. 
15-mL conical tubesany sourceNARaccolta delle cellule.
200 proof ethanolany sourceNAFasi di lavaggio. 
Acetic Acid, glacial, 99.7%Millipore Sigma695092Fissativo di Carnoy e fasi di lavaggio delle diapositive.
Antifade Mounting MediumFisherScientificNC9265087Montaggio delle diapositive dopo la preparazione completata
Biological safety cabinet with vaccum outletany sourceNAConservazione dei prodotti chimici.
Colcemid (N-methyl-N-deacetyl-colchicine)Millipore Sigma10295892001Si lega alla tubulina, arresta le cellule in metafase.
Coplin jarsany sourceNAFasi di lavaggio. 
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)Milipore SigmaD8417-1MGColorante fluorescente per il DNA.
EGFR/CON7 FISH probe Empire GenomicsEGFR-CHR07Sonda fluorescente specifica del locus. 
Elmer's rubber cementany sourceNAMantiene la coverslide in posizione durante l'ibridizzazione della sonda durante la notte.
Ethanol resistant permanent markerany sourceNAEtichettatura delle diapositive.
Fluorescent microscopeany sourceNAImaging delle diapositive. 
Glass Cover Slip, 22 x 22mmThermoFisher50-143-780Ibridizzazione della sonda sulla diapositiva.
Glass Slide, precleanedVWR48311-703Per gocciolare le distribuzioni in metafase e eseguire il DNA-FISH.
Humidified CO2 Incubatorany sourceNAIncubazione di cellule vive.
Hybridization BufferEmpire GenomicsHyb-BufferBuffer utilizzato con la sonda. 
Ice bucketany sourceNAMantenere il fissativo di Carnoy freddo. 
KCl (2M)ThermoFisherAM9640GGonfio le cellule prima della fissazione. 
Methanol, 99.9%, HPLC gradeMillipore Sigma1060351000Per il fissativo di Carnoy. 
Microcentrifugeany sourceNACentrifugazione. 
Microcentrifuge tubesany sourceNAPer le cellule durante la fissazione e per la preparazione della sonda. 
MYC / SE 8 ProbeLeicaKI-10106Sonda fluorescente specifica del locus. 
PBS, pH 7.4Gibco10010-023Fasi di lavaggio. 
Phase contrast microscopeany sourceNAImaging delle distribuzioni in metafase immediatamente dopo il goccia
Pipette tipsany sourceNAPrelievo.
Sodium chlorideMillipore SigmaS9888Per il buffer SSC.
Sodium citrateMillipore Sigma567446Per il buffer SSC.
Sterile ultrapure waterany sourceNAFasi di lavaggio. 
ThermoBrite programmable slide incubatorany sourceNAIncubazione delle diapositive.
Tongsany sourceNAPer le fasi di lavaggio delle diapositive. 
Water bathany sourceNAPer l'incubazione di KCl. 

Riferimenti

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