Il prelievo di sangue dall'arteria della coda nei ratti sotto anestesia con isoflurano consente un prelievo controllato e a basso stress di volumi di sangue relativamente elevati. La rapida ripresa e l'idoneità al prelievo ripetuto rendono questo metodo ideale per studi longitudinali che richiedono parametri fisiologici affidabili.
Rapporto rapido
Il campionamento ematico dall'arteria caudale in ratti anestetizzati con isoflurano riduce lo stress e migliora l'affidabilità
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo metodo descrive il prelievo di sangue tramite l'arteria della coda in ratti anestetizzati con isoflurano. L'uso dell'isoflurano riduce al minimo i movimenti difensivi, consentendo così una procedura controllata e a basso stress sia per l'animale che per il ricercatore. Ulteriori vantaggi includono il rapido recupero degli animali dopo il prelievo, dovuto alla breve durata d'azione dell'isoflurano, la possibilità di raccogliere volumi di sangue relativamente elevati da un singolo sito di puntura e l'idoneità della tecnica per prelievi ripetuti. Inoltre, il rapido flusso sanguigno arterioso potrebbe ridurre la probabilità di artefatti da coagulazione, sebbene ciò non sia stato specificamente valutato nel presente studio. I risultati sono stati ottenuti nell'ambito di uno studio di farmacocinetica. Il prelievo di sangue è riuscito in tutti gli animali, con un tasso di successo del 100%. Non è stata osservata una perdita significativa di peso corporeo 24 h dopo il prelievo, e gli animali hanno mostrato un rapido recupero senza segni visibili di malessere o complicanze legate alla procedura. Nel complesso, questo approccio si rivela altamente adatto per contesti sperimentali che richiedono un prelievo di sangue affidabile e riproducibile con minimo stress da manipolazione. Dopo una breve fase di apprendimento, la procedura si è dimostrata affidabile per un uso sperimentale routinario. Tuttavia, si deve tenere conto dell'eventuale influenza dell'anestesia con isoflurano sui parametri emogassometrici, metabolici ed endocrini nella pianificazione degli esperimenti e nell'interpretazione dei risultati.
Introduzione
Il prelievo di sangue è una tecnica fondamentale nella ricerca sperimentale con ratti per valutare parametri fisiologici e farmacocinetici. Le tecniche raccomandate includono l'incisione della coda, il prelievo dalla vena caudale laterale, dalla vena safena, dalla vena sublinguale, dalla vena giugulare, dal seno retro- orbitale e la cateterizzazione1,2,3,4,5,6,7. Tuttavia, la scelta del metodo dipende dai risultati desiderati e ciascuno presenta limitazioni intrinseche.
Il prelievo dal vena caudale laterale e l'incisione della coda possono fornire volumi limitati, mentre il prelievo retro-orbitale, sebbene efficiente, è più invasivo, influisce sul recupero1 e comporta rischi di danno tissutale4,8 e preoccupazioni etiche. Il prelievo dalla vena safena richiede immobilizzazione e rasatura del sito di puntura2, procedure che possono indurre stress e influire sui risultati sperimentali. Prelievi ripetuti dalla vena safena possono risultare difficili anche a causa della breve lunghezza della vena e della tendenza all'emostasi. Lo stesso vale per la vena sublinguale. Sebbene volumi elevati di sangue possano essere ottenuti rapidamente mediante puntura della vena giugulare, esiste il rischio di lesione polmonare che può portare a pneumotorace. Inoltre, poiché la vena non è visibile, la puntura deve essere eseguita alla cieca6.
In questo contesto, metodi perfezionati che riducono al minimo la sofferenza animale garantendo al contempo una buona qualità del campione stanno diventando sempre più importanti. Il prelievo di sangue dall'arteria della coda sotto anestesia con isoflurano offre un approccio di questo tipo. L'uso di un'anestesia inalatoria a breve durata riduce lo stress legato alla manipolazione e facilita una procedura controllata. Inoltre, il prelievo di sangue arterioso dovrebbe fornire campioni ematici di buona qualità con un ridotto rischio di artefatti da coagulazione grazie al flusso sanguigno rapido. La tecnica è particolarmente adatta per prelievi ripetuti e disegni di studio longitudinali, poiché gli animali si riprendono rapidamente e il disturbo fisiologico è minimo. Nel complesso, questo metodo unisce affidabilità tecnica a un miglioramento del benessere animale ed è quindi particolarmente indicato per contesti sperimentali che richiedono misurazioni ematiche precise e riproducibili.
Protocollo
Tutti gli esperimenti relativi al metodo presentato sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Università Medica di Vienna e dal Ministero austriaco dell'Istruzione, della Scienza e della Ricerca.
1. Preparazione
NOTA: Preparare tutti i materiali necessari prima dell'anestesia per garantire una procedura rapida ed efficiente.
- Riempire la siringa con citrato al 3,2% (la quantità dipende dai parametri desiderati) per prevenire la coagulazione del sangue.
- Impostare il flusso di ossigeno a 0,5 L/min, indirizzandolo nella camera di induzione e nella maschera.
- Occludere il tubo collegato alla maschera per assicurare che il gas di induzione e l'ossigeno siano indirizzati esclusivamente nella camera.
- Rimuovere il ratto dalla gabbia e posizionarlo nella camera di induzione.
- Chiudere il coperchio della camera di induzione, assicurandosi che la coda o le zampe del ratto non vengano schiacciate.
- Impostare l'isoflurano al 3% (a seconda del sistema di tubazioni) e mantenere finché l'animale non mostra perdita di movimento spontaneo e del riflesso di raddrizzamento.
- Oscillare delicatamente la camera avanti e indietro per confermare la perdita del riflesso di raddrizzamento.
- Occludere il tubo collegato alla scatola per reindirizzare il gas e l'ossigeno verso la maschera.
- Aprire il coperchio della camera e rimuovere il ratto.
- Posizionare il ratto in posizione supina sul tappetino riscaldante (38 °C) con il naso posizionato nella maschera (Figura 1).
- Pulire la coda con acqua e asciugare con carta da filtro.
- Disinfettare la coda con alcol.
- Confermare l'assenza del riflesso interdigitale pizzicando tra le dita della zampa posteriore del ratto e verificando la mancanza di risposta di ritrazione.
Figura 1: Posizione del ratto. Il ratto è posizionato supino, con il naso inserito nella maschera per l'anestesia. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
2. Prelievo del sangue
NOTA: L'arteria si trova sul lato ventrale della coda. Il sito ottimale per la puntura si trova tra la parte media e quella distale della coda. L'arteria viene identificata principalmente in base alla sua posizione anatomica, ma nei ratti con pigmentazione chiara (ad esempio, Sprague Dawley), l'arteria ventrale della coda può occasionalmente essere visibile come un vaso debolmente bluastro. In questo caso, l'arteria ventrale della coda può solitamente essere identificata con facilità alla base della coda in base alla sua posizione anatomica sulla linea mediana ventrale. Una volta identificata, il suo decorso può essere seguito in direzione distale fino al sito di puntura previsto.
- Seguire l'arteria dalla parte prossimale a quella distale.
- Orientare il bevel dell'ago verso l'alto.
- Inserire l'ago con un angolo di circa 30 ° (Figura 2).
- Avanzare l'ago in direzione craniale e poi parallelamente alla coda (Figura 2).
- Aspirare il sangue nella siringa (Figura 2).
NOTA: Se l'ago può essere avanzato facilmente, prelevare il volume richiesto di sangue in conformità con le linee guida applicabili. Se la pressione sanguigna è troppo bassa per il prelievo, ridurre la concentrazione di isoflurano al 2,5% e ripetere la procedura senza rimuovere l'ago dal sito di puntura. Per ogni prelievo successivo, il sito di puntura deve essere posizionato in direzione craniale rispetto al sito precedente. - Utilizzare un tampone premendo sul sito di iniezione prima di rimuovere l'ago.
- Spegnere l'anestesia gassosa e controllare il sito di inserzione.
NOTA: Una volta cessato il sanguinamento, restituire il ratto alla sua gabbia di provenienza.
Figura 2: Sito di puntura. Il sito di puntura si trova in posizione ventrale tra il terzo medio e quello distale della coda, e l'ago deve essere inserito con un angolo di 30°. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
3. Elaborazione del sangue
- Versare il sangue raccolto in un tubo.
- Conservare il sangue sul ghiaccio fino alla centrifugazione.
Risultati
I dati presentati in questo articolo metodologico sono stati ottenuti durante uno studio di farmacocinetica. Sono stati inclusi solo ratti Sprague Dawley maschi di età compresa tra 6 e 8 settimane, con un peso corporeo compreso tra 393 g e 429 g. Un singolo campione di sangue (0,3 mL) è stato prelevato dall'arteria della coda al giorno 0. Il peso corporeo è stato registrato immediatamente prima del prelievo ematico e nuovamente 24 h dopo il campionamento. Il gas anestetico è stato rapidamente espirato e gli animali si sono ripresi velocemente. Poco dopo hanno iniziato a mangiare e non hanno mostrato segni di compromissione del benessere generale. I ratti non hanno mostrato segni di stress o paura quando sono stati rimossi dalla gabbia per i successivi prelievi ematici. Inoltre, nei giorni successivi alla procedura non è stata osservata alcuna condotta difensiva. Nessun ematoma era visibile sulla coda quando la procedura è stata eseguita correttamente. Gli animali non hanno mostrato segni di dolore né immediatamente dopo il prelievo ematico né nei giorni successivi, e i siti di prelievo sulla coda erano altresì indolore al tatto. Nessuna perdita di peso corporeo è stata osservata entro 24 h dal prelievo ematico. Il peso corporeo medio è aumentato da 409 g al giorno 0 a 419 g al giorno 1, corrispondente a un guadagno medio di peso corporeo del 2,6% ±± 1,1%, suggerendo che la procedura di prelievo ematico è stata ben tollerata (Figura 3).
Figura 3: Variazione del peso corporeo. Peso corporeo (g) prima (d0) e 24 ore dopo (d1) il prelievo di sangue in ratti (n = 12). Non è stata osservata alcuna perdita di peso corporeo dopo il prelievo ematico. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussione
La tecnica di prelievo ematico descritta dall'arteria della coda è particolarmente adatta per studi che richiedono prelievi ripetuti o volumi relativamente ampi di sangue. Rispetto al prelievo dalla vena della coda, questa tecnica consente di raccogliere volumi maggiori di sangue da un singolo sito di puntura e può offrire vantaggi pratici nei prelievi ripetuti, poiché le punture venose ripetute possono risultare più difficili a causa della formazione di ematomi e della ridotta accessibilità venosa. Secondo le raccomandazioni della Die Gesellschaft für Versuchstierkunde / Society of Laboratory Animal Science (GV-SOLAS) e della Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA), un singolo prelievo ematico non dovrebbe superare il 10% del volume ematico circolante, mentre i prelievi ripetuti giornalieri dovrebbero essere limitati a circa l'1% del volume ematico circolante ogni 24 ore, seguiti da un adeguato periodo di recupero. La tecnica descritta permette di ottenere tali volumi raccomandati in modo affidabile e riproducibile, risultando pertanto adatta sia per protocolli di prelievo singolo che ripetuto.
Una tecnica ideale di prelievo del sangue dovrebbe fornire volumi ematici sufficienti per le analisi previste, minimizzando al contempo lo stress procedurale e garantendo campioni di alta qualità. Il prelievo del sangue dal plesso venoso retro-orbitale e dalla vena sublinguale può causare problemi di coagulazione a causa del trauma tissutale8,9, il che sarebbe subottimale per studi sulla coagulazione. Analogamente, le tecniche a gocciolamento—come lo "spizzicamento" della vena della coda—potrebbero anch'esse indurre coagulazione durante il campionamento. Rispetto a questi metodi di prelievo, il sangue arterioso ottenuto attraverso la coda sembra meno soggetto a coagulazione precoce. Ciò potrebbe essere attribuito alla rapidità del processo di raccolta, all'assenza di trauma tissutale e al contatto immediato del sangue con il citrato nella siringa, che impedisce efficacemente la coagulazione. Altre tecniche, come la puntura della vena giugulare, comportano il rischio di danni agli organi1,6 e le procedure raccomandate di cateterizzazione richiedono anestesia generale, seguita da cure postoperatorie e gestione delle ferite. È necessario effettuare regolarmente il lavaggio del catetere per prevenire ostruzioni, e sussiste sempre il rischio che gli animali rimuovano il catetere.
Il prelievo di sangue dall'arteria caudale richiede una breve sedazione, poiché gli animali devono essere posizionati in posizione supina e la puntura è dolorosa, rendendo probabili movimenti difensivi. L'uso dell'anestesia con isoflurano riduce al minimo i movimenti difensivi, consentendo di eseguire la procedura in modo controllato ed efficiente. Di conseguenza, il prelievo ematico può essere completato rapidamente, riducendo il carico complessivo sull'animale rispetto alle tecniche di venipuntura che utilizzano la vena della coda, nelle quali può richiedere più tempo raccogliere la quantità desiderata di sangue. L'assenza di movimenti difensivi riduce anche la probabilità di punture ripetute con l'ago. È importante sottolineare che gli animali non percepiscono consciamente la procedura, si riprendono rapidamente e in genere tornano a un comportamento normale poco dopo il campionamento1. Dopo il prelievo del sangue, gli animali si sono ripresi rapidamente dall'anestesia con isoflurano e tipicamente hanno ripreso un comportamento normale poco dopo. Nello studio attuale, il peso corporeo misurato 24 h dopo il prelievo del sangue ha mostrato un lieve aumento rispetto al valore basale, suggerendo che l'assunzione di cibo non è stata negativamente influenzata dalla procedura e supportando un recupero a breve termine senza complicazioni.
È noto che l'isoflurano riduce la pressione sanguigna10,11, il che può complicare il prelievo di sangue venoso a causa di un ridotto riempimento venoso. Al contrario, eseguire il prelievo venoso senza anestesia richiede un contenimento1,2, che può indurre uno stress significativo e potenzialmente influenzare i risultati sperimentali. Oltre a ciò, lo stress provoca vasocostrizione, il che può rendere più difficile il prelievo del sangue. Una pressione sanguigna ridotta può influire anche sul prelievo arterioso; tuttavia, secondo la nostra esperienza, questo problema può essere facilmente gestito regolando la concentrazione di isoflurano, mantenendo così un flusso ematico sufficiente per il prelievo.
Si sa tuttavia che l'isoflurano influisce anche su parametri fisiologici, in particolare sui valori dei gas nel sangue, a causa della depressione respiratoria12,13. L'isoflurano può alterare la funzione respiratoria e lo scambio gassoso, modificando potenzialmente i livelli arteriosi di ossigeno e anidride carbonica. Diversi studi hanno dimostrato che l'isoflurano può influenzare anche parametri metabolici ed endocrini, tra cui glucosio ematico, lattato, insulina, corticosterone e metabolismo dei lipidi14,15,16. Tuttavia, si è osservato che l'isoflurano induce meno alterazioni nei parametri legati allo stress rispetto ad altri regimi anestetici e offre vantaggi come induzione rapida, tempo di recupero breve e controllo preciso della profondità anestetica, rendendolo particolarmente adatto per procedure di campionamento ematico di routine14. Di conseguenza, l'influenza potenziale dell'isoflurano deve essere presa in considerazione nella pianificazione e nell'interpretazione degli esperimenti, poiché i campioni di sangue arterioso ottenuti sotto anestesia potrebbero non riflettere accuratamente le condizioni fisiologiche di base. Negli studi farmacocinetici, tuttavia, questi effetti sono spesso di scarsa rilevanza rispetto ai benefici derivanti dall'ottenere campioni ematici riproducibili riducendo al contempo lo stress legato alla manipolazione degli animali.
Un'ulteriore considerazione riguarda l'esposizione professionale dell'operatore all'isoflurano. Poiché il sistema non è completamente chiuso, esiste il rischio di esposizione al gas anestetico durante la procedura. Lavorare sotto una cappa a flusso laminare o con adeguati sistemi di aspirazione ridurrebbe l'esposizione, ma tale attrezzatura potrebbe non essere disponibile in tutti gli ambienti sperimentali.
Nell'insieme, la tecnica descritta rappresenta un'alternativa preziosa ai metodi convenzionali di prelievo del sangue, combinando una qualità del campione prevista buona con uno stress ridotto e condizioni di manipolazione migliorate. Offre vantaggi evidenti in termini di benessere animale ed efficienza procedurale. La sua idoneità dipende infine dalla specifica domanda di ricerca, ma risulta particolarmente vantaggiosa in contesti sperimentali in cui sono essenziali parametri ematici affidabili e una minima perturbazione fisiologica.
Dichiarazioni
L'autore non ha conflitti di interessi da dichiarare.
Ringraziamenti
L'autore desidererebbe ringraziare Katharina Tillmann per averla ispirata a pubblicare questo metodo.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema di Anestesia | Dräger | https://www.draeger.com/en-us_us/Productfinder/Anaesthesia/Anaesthesia-Machines#products | Anestesia Gassosa |
| Vacutainer Citrato (citrato di sodio 3,2%) | Greiner Bio-One | 454332 | Anticoagulante |
| Provetta Eppendorf 1,5 mL | Eppendorf | 3,01,25,150 | Conservazione del sangue |
| Isoflurano Liquido (Isospire) | Dechra | Anestesia Gassosa | |
| Ago (25 G ´ 5/8'') | BD Microlance | 300600 | Prelievo ematico |
| Siringa 1 mL (Tubercolina Luer) | Chirana | CHTUB01 | Prelievo ematico |
| Thermomaquet 2000 | Maquet | Thermomaquet 2000 | Sistema di riscaldamento |
| Tamponi in Cellulosa Zelletten 5 cm ´ 4 cm | Lohmann&Rauscher | Emostasi |
Riferimenti
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