Articolo metodologico

Intensità e Durata del Segnale del TCR nell'Attivazione e Differenziamento di Linfociti T CD8+ Primari di Topo: Un Approccio Standardizzato In Vitro

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DOI:

10.3791/71979

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25 agosto 2026

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1Guangdong Province Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute for Immunology and Pathogenesis, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, 4Center for Immune Ageing and Rejuvenation, Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo sistematico per attivare linfociti T CD8+ naïve murini primari utilizzando un approccio di stimolazione graduata del TCR, che permette un'analisi completa della proliferazione, dell'attivazione e della produzione di citochine da parte dei linfociti T CD8+ in condizioni di diverse intensità del segnale del TCR.

Abstract

L'intensità e la durata del segnale del recettore per cellule T (TCR) sono determinanti fondamentali nell'attivazione, proliferazione e differenziazione funzionale delle cellule T CD8⁺. Tuttavia, i modelli standardizzati in vitro che confrontano in modo sistematico come diversi input di segnale TCR modellino il destino delle cellule T rimangono limitati. Questo studio presenta un metodo riproducibile per attivare cellule T primarie di topo in vitro utilizzando anti-CD3 legato a piastra e anti-CD28 solubile, integrato con interleuchina-2 (IL-2), e analizza come la modulazione della concentrazione di anti-CD3 (intensità del segnale) e del tempo di stimolazione (durata del segnale) influisca sugli esiti di attivazione delle cellule T. Descriviamo un protocollo per l'isolamento di cellule T naive da topi C57BL/6, seguito da stimolazione in un range di concentrazioni di anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) e tempi di stimolazione (6–48 h). Abbiamo effettuato analisi mediante citometria a flusso per valutare i primi eventi di segnalazione indotti dal TCR tramite la proteina ribosomiale S6 fosforilata intracellulare (p-S6) come indicatore dell'attività del complesso 1 del bersaglio meccanicistico della rapamicina (mTORC1), e successivamente abbiamo valutato eventi successivi, inclusi i marcatori di superficie di attivazione (CD69, CD25, ICOS, PD-1), la proliferazione cellulare mediante diluizione del colorante violetto per il tracciamento della proliferazione (CTV) e l'espressione di molecole effettrici (Granzima B, TNF-α) come indicatori della differenziazione funzionale. Il metodo fornisce una guida visiva chiara e passo dopo passo per eseguire stimolazioni riproducibili delle cellule T, consentendo ai ricercatori di analizzare come specifici parametri del segnale TCR dirigano le decisioni sul destino delle cellule T. Questo approccio non solo supporta studi meccanicistici sull'attivazione e la differenziazione delle cellule T, ma offre anche una piattaforma per ottimizzare il condizionamento delle cellule T per terapie immunologiche adottive e saggi di priming in vitro. Integrando una dimostrazione video con una descrizione dettagliata del protocollo, questo protocollo migliorerà la trasparenza metodologica e la riproducibilità nella ricerca di immunologia delle cellule T.

Introduzione

I linfociti T sono indispensabili per le risposte immunitarie protettive contro patogeni e tumori. I linfociti T naïve sono attivamente mantenuti in uno stato di quiescenza per preservarne la sopravvivenza e persistenza a lungo termine1. A seguito della stimolazione da parte dell'antigene, i linfociti T escono dalla quiescenza, subiscono espansione clonale e differenziazione in cellule effettrici2. Il segnale proveniente dal recettore per il linfocita T (TCR) rappresenta il processo fondamentale per l'avvio e la regolazione delle risposte immunitarie adattative3. Al seguito del riconoscimento specifico delle molecole peptido-complesso maggiore di istocompatibilità (pMHC) presentate sulla superficie delle cellule presentanti l'antigene (APC), viene innescata una cascata di eventi di segnalazione, che promuove l'espansione clonale e la differenziazione funzionale dei linfociti T4,5,6.

L'intensità della stimolazione del TCR, determinata da fattori chiave come affinità, avidità e concentrazione dell'antigene, svolge un ruolo fondamentale nel regolare l'entità dell'attivazione dei linfociti T, l'acquisizione di funzioni effettrici e il percorso di differenziazione verso specifici sottoinsiemi di linfociti T effettori o della memoria7,8,9. I modelli attuali in vitro per lo studio dell'attivazione dei linfociti T dipendente dal TCR impiegano prevalentemente anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 legati a piastre o a microsfere, che forniscono simultaneamente segnali di legame al TCR e segnali co-stimolatori10,11. Sebbene tali sistemi siano ampiamente utilizzati, tipicamente impiegano una singola concentrazione, spesso saturante, di anticorpo anti-CD3, consentendo soltanto un confronto binario tutto-o-nulla dell'attivazione dei linfociti T, piuttosto che riprodurre l'ampia dinamica di intensità del segnale del TCR ottenibile mediante un gradiente titolato di stimoli12,13.

Il protocollo descritto in questo articolo fornisce un sistema in vitro standardizzato e riproducibile per valutare sistematicamente in che modo intensità graduate del segnale del recettore per il TCR modulano l'attivazione, la proliferazione e i fenotipi funzionali dei linfociti T CD8+ murini primari, utilizzando gradienti titolati di anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) e una concentrazione costante di anti-CD28 (1 µg/mL). Questo approccio si basa sulla citometria a flusso multiparametrica, che permette di rilevare sia i segnali a monte — attraverso la proteina ribosomiale S6 fosforilata intracellulare (p-S6) come indicatore dell'attività del complesso 1 del target meccanicistico della rapamicina (mTORC1) — sia gli esiti cellulari a valle, inclusa la proliferazione monitorata mediante la diluizione del CTV, i marcatori di superficie di attivazione (CD69, CD25, costimolatore inducibile delle cellule T [ICOS], proteina 1 del fattore di morte cellulare programmata [PD-1]) e l'espressione delle molecole effettrici (Granzima B, fattore di necrosi tumorale-alfa [TNF-α]), in un arco temporale compreso tra 6 e 48 ore.

Il nostro protocollo utilizza un gradiente di concentrazione di anticorpi anti-CD3 legati alla piastra per modulare con precisione l'intensità della stimolazione, imitando così l'avidità differenziale di legame del TCR osservata in condizioni fisiologiche. Il metodo consente un'elevata efficienza nella cross-linking del TCR e una robusta attivazione dei linfociti T primari in stato di riposo. La procedura standardizzata di rivestimento garantisce una distribuzione uniforme degli anticorpi sulla superficie della piastra, determinando una stimolazione costante tra le cellule all'interno dello stesso lotto e un'eccellente riproducibilità sperimentale. Questo formato rappresenta un approccio economico e operativamente semplice per l'attivazione dei linfociti T.

Tuttavia, è necessario riconoscere alcuni limiti di questo approccio. La stimolazione mediata da anticorpi anti-CD3/CD28 differisce notevolmente dal contesto fisiologico in vivo. Sebbene i metodi sperimentali che utilizzano esclusivamente anticorpi agonisti anti-CD3 e anti-CD28 per valutare l'attivazione dei linfociti T possano fornire letture efficaci dell'attivazione, essi non riescono a riprodurre pienamente le interazioni tra cellule presentatrici di antigene e linfociti T, né il microambiente co-stimolatorio che si verifica in condizioni fisiologiche14.

Nonostante questi limiti, questo protocollo offre una piattaforma sistematica e riproducibile che funge da strumento prezioso e accessibile per lo studio delle risposte delle cellule T dipendenti dall'intensità del segnale del TCR e può integrare modelli più complessi specifici per l'antigene.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali di questo studio sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università Militare Medica di Terzo Livello.

1. Preparazione dei reagenti e delle piastre

  1. Preparare l'anticorpo anti-CD3 legato alla piastra in PBS sterile a 0,1, 0,5, 1, 5 e 10 µg/mL.
  2. Aggiungere 50 µL della soluzione di rivestimento anti-CD3 per pozzetto in piastre a 96 pozzetti con fondo piatto.
  3. Sigillare le piastre con pellicola adesiva e incubare tutta la notte a 4 °C.
  4. Aspirare la soluzione di rivestimento e lavare ogni pozzetto due volte con 200 µL di PBS sterile prima di aggiungere le cellule.

2. Isolamento di linfociti T CD8+ naïve dalla milza di topo

  1. Selezionare topi maschi C57BL/6 di 6–8 settimane di età (acquistati da Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.) ed eutanizzare mediante inalazione di CO2 seguita da dislocazione cervicale. I topi vengono allevati in condizioni libere da patogeni specifici, con un ciclo luce/buio di 12 ore e libero accesso a cibo e acqua. Per ogni esperimento indipendente si utilizzano almeno 3 topi.
  2. Incidere con attenzione il peritoneo con forbici chirurgiche per esporre la milza, afferrare ed estrarre la milza utilizzando pinze e posizionarla in una capsula di raccolta contenente RPMI 1640 pre-rafreddato integrato con siero fetale bovino (FBS) al 2% (R2). Mantenere la capsula in ghiaccio fino alla dissociazione.
    NOTA: Raccogliere tutti i resti animali e i rifiuti della coltura cellulare in appositi sacchetti per rifiuti biologici e sterilizzarli in autoclave a 121 °C per 20 minuti prima dello smaltimento.
  3. Rimuovere la milza dalla capsula di raccolta e trasferirla in una capsula da 60 mm contenente 3 mL di tampone di lisi 1 × ammonio-cloruro-potassio (ACK).
  4. Preparare una sospensione monocellulare frantumando delicatamente la milza attraverso un filtro cellulare da 70 µm utilizzando lo stantuffo di una siringa da 3 mL.
  5. Incubare la sospensione per 1 min a temperatura ambiente (RT), quindi aggiungere 3 mL di mezzo R2 pre-rafreddato per neutralizzare il tampone di lisi ammonio-cloruro-potassio (ACK).
  6. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 500 × g per 5 min a 4 °C.
  7. Al termine della centrifugazione, aspirare il soprannatante e risospendere il pellet in 10 mL di tampone di marcatura per citometria a flusso (PBS con FBS al 2%).
  8. Filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 70 µm in un nuovo tubo conico da 15 mL, quindi centrifugare nuovamente a 500 × g per 5 min a 4 °C.
    NOTA: L'azide di sodio deve essere omesso dal tampone di marcatura per citometria a flusso per preservare la vitalità cellulare nei saggi funzionali. Tutti i campioni devono essere mantenuti a 4 °C e analizzati immediatamente.
  9. Aspirare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 200 µL di cocktail di anticorpi biotinilati per milza di topo (contenente anti-CD16/32 (blocco Fc), anti-TER-119, anti-CD19, anti-CD4, anti-B220, anti-NK1.1, anti-Ly-6G, anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD49b, anti-CD44 e anti-F4/80).
  10. Incubare in ghiaccio per 25 min, capovolgendo delicatamente il tubo ogni 5 min per garantire una miscelazione completa.
  11. Lavare le cellule con un ampio volume di tampone di marcatura per citometria a flusso, centrifugare a 500 × g per 5 min e scartare il soprannatante.
  12. Risospendere il pellet nello stesso volume di tampone di marcatura per citometria a flusso utilizzato per il cocktail di anticorpi biotinilati, aggiungere microsferette magnetiche ricoperte di streptavidina pari alla metà di tale volume e incubare in ghiaccio per 15 min, capovolgendo delicatamente il tubo ogni 5 min per garantire una miscelazione completa.
  13. Centrifugare brevemente il tubo, posizionarlo su un supporto magnetico per 2–3 min e trasferire con attenzione il soprannatante (cellule T CD8+ naive arricchite) in un nuovo tubo conico da 15 mL.
  14. Lavare le cellule raccolte una volta con tampone di marcatura per citometria a flusso, quindi centrifugare nuovamente a 500 × g per 5 min.
  15. Scartare il soprannatante e risospendere il pellet in RPMI 1640 integrato con FBS al 10% (R10) per le applicazioni successive.

3. Marcatura con il colorante violetto per il tracciamento della proliferazione (CTV) per il monitoraggio della proliferazione

  1. Preparare 2 × soluzione lavorativa fresca di CTV (10 µM) immediatamente prima dell'uso. Mescolare completamente la soluzione madre di CTV 5 mM (in dimetilsulfossido [DMSO]) mediante vortex e diluirla ulteriormente con PBS sterile per ottenere una concentrazione finale di 10 µM.
    ATTENZIONE: Manipolare la soluzione madre di CTV (preparata in DMSO) con guanti in nitrile sotto cappa, poiché il DMSO facilita l'assorbimento cutaneo di sostanze tossiche. Evitare inalazione e contatto con la pelle.
  2. Risospendere metà delle cellule T CD8+ naive isolate in PBS pre-raffreddato a una densità di 8 × 107 cellule/mL.
  3. Aggiungere rapidamente un volume uguale di soluzione lavorativa 2 × di CTV (10 µM) alla sospensione cellulare e mescolare accuratamente mediante pipetta, ottenendo una concentrazione finale di CTV di 5 µM.
  4. Incubare le cellule a temperatura ambiente al buio per 20 minuti, capovolgendo delicatamente i tubi ogni 5 minuti per garantire un'adeguata mescolanza.
  5. Aggiungere 5 volumi di mezzo di coltura (contenente almeno il 10% di FBS) alle cellule e incubare per 5 minuti sul ghiaccio per rimuovere qualsiasi colorante non legato.
  6. Centrifugare le cellule a 500 × g per 5 minuti e risospendere il pellet in mezzo completo R10 appena preriscaldato, integrato con anti-CD28 (concentrazione finale: 1 µg/mL) e IL-2 (concentrazione finale: 10 ng/mL).
  7. Aggiungere 250 µL di sospensione cellulare (contenente 6 × 105 cellule) in ciascuna pozzetta delle piastre a 96 pozzetti pre-ricoperte.
  8. Coltivare le cellule a 37 °C con 5% di CO₂ per un massimo di 48 ore.

4. Rilevamento di CTV mediante citometria a flusso

  1. Raccogliere le cellule in una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo a 6, 36 e 48 h. Centrifugare a 500 × g per 5 minuti e lavare due volte con tampone di marcatura per citometria a flusso.
  2. Per la marcatura della superficie, incubare le cellule con 50 µL di un cocktail di anticorpi contenente anti-CD8, colorante vitale fissabile e anti-CD44 per 30 minuti sul ghiaccio al buio.
    NOTA: Raccogliere tutti i soprannatanti contenenti anticorpi coniugati con fluorocromi in contenitori per rifiuti designati, integrati con ipoclorito di sodio allo 0,5% per la decontaminazione, e smaltirli secondo i protocolli istituzionali per i rifiuti biologicamente pericolosi.
  3. Lavare le cellule due volte con tampone di marcatura per citometria a flusso e risospendere in 200 µL di tampone di marcatura per citometria a flusso per l'acquisizione al citometro a flusso.
  4. Acquisire i campioni su un citometro a flusso dotato di tre laser. Preparare provette di controllo monocromatiche utilizzando cellule marcate per impostare i parametri di compensazione.
  5. Applicare la seguente strategia di gating: escludere i detriti mediante gating in base allo scatter anteriore (FSC) rispetto allo scatter laterale (SSC), eliminare i doppietti mediante gating dei singoletti e selezionare le cellule T CD8+ vitali (negative al colorante vitale fissabile) per l'analisi.
  6. Raccogliere almeno 1 × 104 eventi di cellule T CD8+ gated per campione. Analizzare i dati utilizzando il software di analisi della citometria a flusso e calcolare la proporzione di cellule che hanno subito una o più divisioni mediante il modulo di analisi della proliferazione.

5. Colorazione della superficie e intracellulare per l'attivazione e il segnale

  1. Risospendere un'altra metà di linfociti T CD8+ naïve in R10 integrato con anti-CD28 a 1 µg/mL e IL-2 a 10 ng/mL a una concentrazione di 2,4 × 106 cellule/mL.
  2. Aggiungere 250 µL di sospensione cellulare (6 × 105 cellule) in ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti pre-ricoperte.
  3. Coltivare le cellule a 37 °C con 5% di CO₂ per un massimo di 48 h.
  4. Nei punti temporali indicati (6, 10, 12, 24 e 36 h), raccogliere le cellule in una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo.
    NOTA: A 6 h si rilevano i segnali precoci del TCR (p-S6) e CD69; quest'ultimo viene ulteriormente valutato a 12, 24 e 36 h per monitorarne la cinetica completa. CD25, PD-1 e ICOS vengono monitorati a 10, 12, 24 e 36 h; il punto a 48 h è riservato alla proliferazione (Sezione 4) e al rilevamento delle citochine (Sezione 6).
  5. Centrifugare a 500 × g per 1 minuto e risospendere il pellet cellulare in 200 µL di tampone di marcatura per citometria a flusso.
  6. Centrifugare a 500 × g per 1 minuto ed eliminare il soprannatante. Lavare le cellule due volte con 200 µL di tampone di marcatura per citometria a flusso.
  7. Per la marcatura della superficie, incubare le cellule con 50 µL di un cocktail di anticorpi contenente anti-CD69, anti-CD25, anti-CD8, anti-PD-1, anti-ICOS e un colorante vitalizio fissabile per 30 minuti sul ghiaccio al buio.
  8. Lavare le cellule tre volte con tampone di marcatura per citometria a flusso per rimuovere gli anticorpi non legati.
  9. Risospendere il pellet cellulare in 200 µL di paraformaldeide al 1% e fissare le cellule a temperatura ambiente al buio per 15 minuti.
    ATTENZIONE: Eseguire tutti i passaggi che coinvolgono la paraformaldeide in cappa chimica per evitare l'inalazione di vapori. Raccogliere tutti i rifiuti liquidi contenenti il fissativo in un contenitore separato contrassegnato per lo smaltimento di sostanze chimiche pericolose.
  10. Centrifugare a 500 × g per 1 minuto e lavare una volta con tampone di marcatura per citometria a flusso.
  11. Preriscaldare il tampone lisi/fissazione 5 × a temperatura ambiente e preparare una soluzione di lavoro 1 × con acqua distillata.
  12. Aggiungere 200 µL di soluzione di lavoro (tampone lisi/fissazione 1 ×) in ciascun pozzetto, incubare le cellule a temperatura ambiente al buio per 30 minuti.
  13. Lavare due volte con tampone di permeabilizzazione/lavaggio 1 × per la marcatura degli epitopi fosforilati. Risospendere il pellet in tampone di permeabilizzazione/lavaggio 1 × per la marcatura degli epitopi fosforilati e incubare a temperatura ambiente al buio per 10 minuti.
  14. Centrifugare a 500 × g per 1 minuto ed eliminare i soprannatanti.
  15. Per la marcatura intracellulare, incubare le cellule con 50 µL di un cocktail di anticorpi contenente anti-p-S6 per 60 minuti a temperatura ambiente al buio.
  16. Lavare le cellule tre volte con tampone di permeabilizzazione/lavaggio 1 × per la marcatura degli epitopi fosforilati.
  17. Per la marcatura con anticorpo secondario, incubare le cellule con 50 µL di un cocktail di anticorpi contenente anticorpo secondario anti-coniglio per 30 minuti sul ghiaccio al buio.
  18. Lavare le cellule tre volte con tampone di permeabilizzazione/lavaggio 1 × per la marcatura degli epitopi fosforilati e una volta con tampone di marcatura per citometria a flusso.
  19. Risospendere il pellet cellulare in 200 µL di tampone di marcatura per citometria a flusso e acquisire i campioni sullo stesso citofluorimetro.
  20. Applicare la stessa strategia di gating descritta nella Sezione 4.5 e raccogliere almeno 1 × 104 linfociti T CD8+ per campione.
  21. Analizzare l'intensità mediana di fluorescenza (MFI) per ciascun marcatore utilizzando un software di analisi per citometria a flusso.

6. Blocco e rilevamento delle citochine intracellulari

  1. 5 ore prima del prelievo, aggiungere 100 µL per pozzetto di R10 fresco integrato con PMA (50 ng/mL), ionomicina (1 µg/mL), inibitori del trasporto proteico (monensina) (1:1000) e inibitori del trasporto proteico (a base di brefeldina A) (1:1000). Mescolare delicatamente e reinserire le piastre nell'incubatore a 37 °C per bloccare la secrezione di citochine e consentire l'accumulo intracellulare.
  2. Al tempo desiderato, raccogliere le cellule in una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo.
  3. Centrifugare a 500 × g per 1 minuto e risospendere il pellet cellulare in 200 µL di tampone di marcatura per citometria a flusso.
  4. Centrifugare a 500 × g per 1 minuto ed eliminare il soprannatante. Lavare due volte con 200 µL di tampone di marcatura per citometria a flusso.
  5. Per la marcatura dei marcatori di superficie, incubare le cellule con 50 µL di un cocktail di anticorpi contenente anti-CD44, anti-CD8 e colorante vitalizio fissabile per 30 minuti sul ghiaccio al buio.
  6. Lavare tre volte con tampone di marcatura per citometria a flusso per rimuovere gli anticorpi non legati.
  7. Permeabilizzare le cellule aggiungendo 200 µL di soluzione di fissazione e permeabilizzazione e incubare per 30 minuti sul ghiaccio al buio.
    ATTENZIONE: Eseguire tutti i passaggi che coinvolgono la soluzione di fissazione/permeabilizzazione (contenente paraformaldeide) in una cappa aspirante per evitare l'inalazione di vapori. Raccogliere tutti i rifiuti liquidi contenenti fissativo in un contenitore separato contrassegnato per lo smaltimento di rifiuti chimici pericolosi.
  8. Centrifugare a 500 × g per 1 minuto e scartare il soprannatante nei rifiuti chimici pericolosi.
  9. Lavare le cellule tre volte con tampone di permeabilizzazione/lavaggio 1 ×.
  10. Per la marcatura delle citochine intracellulari, incubare con 50 µL di un cocktail di anticorpi contenente anti-TNF-α e anti-Granzima B per 30 minuti sul ghiaccio al buio.
  11. Lavare le cellule tre volte con tampone di permeabilizzazione/lavaggio 1 × per rimuovere gli anticorpi non legati ed effettuare un ultimo lavaggio con tampone di marcatura per citometria a flusso.
  12. Risospendere il pellet cellulare in 200 µL di tampone di marcatura per citometria a flusso ed acquisire i campioni sullo stesso citometro a flusso.
  13. Applicare la stessa strategia di gating descritta nella Sezione 4.5 e raccogliere almeno 1 × 104 cellule T CD8+ per campione. Analizzare la percentuale di positività e l'MFI per ciascun marcatore mediante software di analisi della citometria a flusso.

Risultati

Per studiare gli effetti di diverse intensità di stimolazione con anti-CD3 sull'attivazione dei linfociti T, abbiamo isolato splenociti murini e purificato cellule T CD8+ per la coltura in vitro, quindi abbiamo eseguito saggi di attivazione dei linfociti T e analisi citofluorimetrica. Per l'analisi dei dati, i linfociti sono stati innanzitutto selezionati utilizzando una combinazione di FSC-A e SSC-A, seguita dalla selezione dei singoletti tramite FSC-H e FSC-W, e successivamente SSC-H con SSC-W. Le cellule T CD8+ vitali sono state ulteriormente selezionate impiegando CD8 insieme a un colorante vitalizio fissabile per le analisi successive (Figura 1A).

Per confermare che il sistema di stimolazione con anticorpi immobilizzati su piastra attivi efficacemente i linfociti T in vitro, abbiamo esaminato la fosforilazione della proteina ribosomiale S6 (p-S6), un indicatore consolidato dell'attività di mTORC1 e un punto di convergenza per le vie di segnalazione PI3K-mTOR e MEK-ERK MAPK a valle dell'attivazione del TCR15,16. In linea con questi risultati, abbiamo osservato un aumento dose-dipendente dei livelli di p-S6 a 6 ore dalla stimolazione, con concentrazioni crescenti di anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) (Figura 1B), confermando così che il sistema con anti-CD3 immobilizzato su piastra attiva l'asse TCR-mTORC1-S6 in maniera dipendente dall'intensità del segnale. Questo precoce evento di fosforilazione è coerente con l'attivazione di vie metaboliche dipendenti da mTORC1, che sostengono la successiva proliferazione dei linfociti T e la loro differenziazione in cellule effettrici.

La proliferazione cellulare è stata valutata mediante citometria a flusso di diluizione del CTV dopo stimolazione del TCR con concentrazioni crescenti di anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) in tre punti temporali successivi alla stimolazione: 6, 36 e 48 h. Nel precoce punto temporale di segnalazione a 6 h, si è osservata solo una minima diluizione proliferativa in tutte le condizioni di stimolazione. A 36 h, il gruppo con stimolazione a basso dosaggio (0,1 µg/mL) non ha ancora indotto un'espansione clonale apprezzabile, mentre i gruppi con stimolazione intermedia e ad alto dosaggio hanno mostrato picchi ben definiti di diluizione del CTV (5 e 10 µg/mL), indicando l'inizio del progresso del ciclo cellulare. A 48 h, le fenotipologie proliferative differenziali in funzione delle concentrazioni di stimolazione erano le più marcate. Una debole stimolazione del TCR (0,1 µg/mL) ha prodotto solo l'1,25% di cellule in proliferazione e un singolo picco di CTV non diluito, indicando un'attivazione subottimale. La stimolazione intermedia (1–5 µg/mL) ha indotto tre picchi di divisione ben risolti, con frazioni proliferanti crescenti dal 70,8% all'84,0%. La stimolazione intensa (10 µg/mL) ha raggiunto la frazione proliferante più elevata (89,5%), mostrando il numero massimo di generazioni di divisione e dimostrando il raggiungimento della saturazione della proliferazione (Figura 2).

Abbiamo successivamente esaminato l'espressione dei marcatori precoci di attivazione CD69 e CD25. In particolare, lo studio ha rivelato un rapido e dose-dipendente aumento dell'espressione di CD69, basato sull'intensità di fluorescenza mediana (MFI). In condizioni di stimolazione intermedia e forte (5 e 10 µg/mL), CD69 è risultato rapidamente aumentato a 24 h, seguito da un graduale declino tra 24 e 36 h. Tuttavia, in condizioni di stimolazione debole (0,1, 0,5 e 1 µg/mL), CD69 è risultato progressivamente aumentato durante l'intera finestra di stimolazione. Il profilo cinetico di espressione di CD69 sopra descritto è coerente con il suo ruolo come marcatore precoce di attivazione dei linfociti T (Figura 3A)17. In modo interessante, abbiamo osservato che l'espressione di CD25 mostrava un incremento progressivo in maniera dose- e tempo-dipendente (Figura 3B). In accordo con studi precedenti, l'upregolazione di CD25 risultava più lenta rispetto a quella di CD69, specialmente in seguito a stimolazione ottimale18,19.

Per approfondire l'effetto regolatorio dell'intensità della stimolazione del TCR sull'espressione dei recettori inibitori e delle molecole co-stimolatorie nei linfociti T CD8+, abbiamo esaminato i livelli di espressione di PD-1 e ICOS. L'espressione indotta di PD-1 dipende da una stimolazione del TCR ad alta intensità. Nel gruppo con stimolazione a bassa intensità (0,5–1 µg/mL), PD-1 è stato espresso a livelli bassi per tutta la durata del periodo di stimolazione. Al contrario, nel gruppo con stimolazione a intensità media-alta (5–10 µg/mL), l'espressione di PD-1 è aumentata gradualmente a partire da 10 h e ha raggiunto il picco a 36 h (Figura 4A). Anche l'espressione di ICOS è aumentata in modo proporzionale all'intensità della stimolazione, raggiungendo il livello massimo a 5–10 µg/mL a 36 h (Figura 4B). Questi risultati indicano che una stimolazione del TCR ad alta intensità può aumentare significativamente i livelli di espressione di PD-1 e ICOS.

Infine, abbiamo esaminato la capacità funzionale delle cellule T stimolate mediante restimolazione con PMA e ionomicina a 24 h e 48 h dalla stimolazione. A 24 h, abbiamo quantificato la produzione di TNF-α e Granzima B e osservato che le frequenze di cellule TNF-α+, Granzima B+ e TNF-α+Granzima B+ aumentavano gradualmente in modo dipendente dalla dose di anti-CD3 (Figura 5A, B). In modo coerente, anche il valore MFI di TNF-α e Granzima B mostrava un incremento dipendente dalla concentrazione, raggiungendo il massimo in condizioni di stimolazione intensa (10 µg/mL) (Figura 5C), indicando una differenziazione precoce in cellule effettrici dipendente dall'intensità del segnale del recettore per il TCR. A 48 h, tuttavia, questo andamento si invertiva in modo evidente. Concentrazioni più elevate di anti-CD3 riducevano significativamente la percentuale di cellule TNF-α+Granzima B+ e riducevano l'espressione delle molecole effettrici a livello cellulare.

Tutti i dati mostrati sono rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti. Le analisi statistiche sono state eseguite mediante ANOVA a una o due vie con test post-hoc di Tukey; i dati sono espressi come media ± SEM. La vitalità cellulare ha superato costantemente il 90% e sono stati acquisiti almeno 1 × 104 eventi di linfociti T CD8+ vitali per campione.

Dati di citometria a flusso: diagrammi di selezione delle popolazioni cellulari, istogrammi di quantificazione proteica e grafico a barre.
Figura 1: Attivazione in vitro e analisi citometrica in flusso di CD8+ Cellule T (A) CD8 purificati+ I linfociti T provenienti da splenociti di topo sono stati stimolati in vitro con concentrazioni variabili di anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) combinato con una concentrazione fissa di anti-CD28 (1 µg/mL) per 6-48 h, seguita da analisi citofluorimetrica dell'attivazione cellulare. I detriti cellulari sono stati esclusi mediante selezione in base allo scatter anteriore (FSC) e allo scatter laterale (SSC), le coppie cellulari sono state escluse mediante gating dei singoletti, e le cellule CD8 positive, negative per il colorante vitale fissabile+ I linfociti T sono stati infine selezionati per le analisi successive.BFosforilazione della proteina ribosomiale S6 (p-S6) in CD8+ Linfciti T a 6 h dallo stimolo con concentrazioni indicate di anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) più anti-CD28 costante (1 µg/mL). Istogramma rappresentativo (a sinistra) e sintesi dell'MFI (a destra). I grafici di citometria a flusso sono rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti. I dati mostrano la media ± SEM. Statistica: ANOVA a una via con misure ripetute con test post-hoc di Tukey. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0,0001; ns, non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Saggio di proliferazione cellulare, grafico a istogramma, che mostra CTV rispetto alla percentuale di proliferazione nel tempo.
Figura 2: Analisi della proliferazione basata sul colorante violetto per il tracciamento della proliferazione (CTV) di linfociti T CD8+ primari di topo in condizioni di stimolazione TCR graduata. I linfociti T CD8+ marcati con CTV sono stati stimolati in vitro con anti-CD3 a concentrazioni graduali comprese tra 0,1 e 10 µg/mL per un periodo da 6 a 48 ore. La proliferazione cellulare è stata valutata in base alla diluizione e all'attenuazione della fluorescenza del CTV nei linfociti T CD8+ mediante analisi citofluorimetrica. Gli istogrammi mostrano la distribuzione della fluorescenza del CTV per ciascun gruppo di concentrazione, con la percentuale di cellule che hanno subito una o più divisioni indicata. I grafici della citometria a flusso sono rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Analisi di citometria a flusso, espressione di CD69 e CD25, istogramma e grafico lineare, attivazione delle cellule immunitarie.
Figura 3: Cinetiche di espressione dei marcatori precoci di attivazione CD69 e CD25 su linfociti T CD8+ dopo stimolazione con anti-CD3. Linfociti T CD8+ naïve sono stati stimolati con anti-CD3 legato alla piastra alle concentrazioni indicate (0,1–10 µg/mL) in aggiunta a anti-CD28 costante (1 µg/mL). L'espressione di CD69 è stata misurata a 6, 12, 24 e 36 ore; CD25 a 10, 12, 24 e 36 ore ed analizzata mediante citometria a flusso. I pannelli a sinistra mostrano istogrammi rappresentativi ai tempi indicati; i pannelli a destra mostrano le variazioni dinamiche dell'MFI nel tempo. (A) CD69. (B) CD25. I grafici di citometria a flusso sono rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti. I dati mostrano la media ± SEM. Analisi statistiche: ANOVA a due vie con misure ripetute e test post-hoc di Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, non significativo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Analisi di citometria a flusso, espressione di PD-1 e ICOS, istogrammi e grafici, risposta cellulare nel tempo.
Figura 4: Cinetica di espressione del recettore inibitorio PD-1 e della molecola co-stimolatoria ICOS su linfociti T CD8+ dopo stimolazione con anti-CD3. Linfociti T CD8+ naïve sono stati stimolati con anti-CD3 legato alla piastra alle concentrazioni indicate (0,1–10 µg/mL) in aggiunta a anti-CD28 costante (1 µg/mL). Le cellule sono state raccolte a 10, 12, 24 e 36 ore e analizzate mediante citometria a flusso. I pannelli a sinistra mostrano istogrammi rappresentativi ai diversi tempi indicati; i pannelli a destra mostrano le variazioni dinamiche dell'MFI nel tempo. (A) PD-1. (B) ICOS. I grafici di citometria a flusso sono rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti. I dati mostrano la media ± SEM. Analisi statistiche: ANOVA a due vie con misure ripetute e test post-hoc di Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, non significativo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati dell'analisi di citometria a flusso, espressione di TNF-α e granzima B, grafici a barre e a dispersione, studio immunologico.
Figura 5: La produzione intracellulare di citochine da parte delle cellule T CD8+ dipende dall'intensità del TCR. Cellule T CD8+ naive sono state stimolate con concentrazioni crescenti di anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) più anti-CD28 costante (1 µg/mL). A 24 h e 48 h dallo stimolo, le cellule sono state raccolte dopo un'incubazione di 5 h con inibitori del trasporto proteico (monensina e brefeldina A) in presenza di PMA e ionomicina, per bloccare la secrezione di citochine e consentire l'accumulo intracellulare. (A) I grafici a contorno mostrano le frequenze di cellule positive per TNF-α e granzima B a ciascuna concentrazione e punto temporale indicati. Le cellule non stimolate sono state utilizzate come controllo negativo. (B) Le proporzioni di cellule TNF-α+, granzima B+ e TNF-α+ granzima B+. (C) Il valore medio di intensità di fluorescenza (MFI) di TNF-α e granzima B. I grafici di citometria a flusso sono rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti. I dati mostrano la media ± SEM. Analisi statistica: ANOVA a due vie con misure ripetute e test post-hoc di Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, non significativo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Questo protocollo fornisce un metodo sistematico e riproducibile per lo studio delle risposte delle cellule T in funzione dell'intensità del segnale del TCR. La strategia di rivestimento graduale con anti-CD3 consente un controllo preciso dell'intensità della stimolazione, permettendo ai ricercatori di analizzare la relazione quantitativa tra l'input del TCR e gli esiti funzionali a valle. I punti chiave della procedura includono la purificazione delle cellule T CD8⁺ naive, il controllo preciso del gradiente di concentrazione del rivestimento con anti-CD3 e la rigorosa normalizzazione del numero di cellule per pozzetto. Per garantire la confrontabilità dei dati tra esperimenti, si raccomanda inoltre di utilizzare impostazioni strumentali costanti, matrici di compensazione e strategie di gating uniformi, e di impiegare lotti identici di anticorpi e batch di coloranti vitali fissabili ogni volta che possibile. L'affidabilità di questi passaggi critici determina direttamente se i risultati sperimentali possono riflettere con precisione gli effetti delle diverse intensità di stimolazione del TCR sulla dinamica fenotipica delle cellule T.

In questo protocollo, abbiamo utilizzato una stimolazione mediata da anticorpi immobilizzati su piastra, in cui gli anticorpi anti-CD3 vengono direttamente rivestiti sulla superficie della piastra di coltura per indurre il crosslinking del complesso TCR-CD3. Questo approccio offre vantaggi in termini di economicità, distribuzione uniforme degli anticorpi, ridotta variabilità tra pozzetti ed eccellente riproducibilità. In particolare, la titolazione delle concentrazioni di anticorpo di rivestimento consente una modulazione precisa e graduata dell'intensità della stimolazione, una caratteristica che distingue questo sistema dalla stimolazione mediata da microsfere coniugate, in cui la densità di ligando è tipicamente fissata a livelli di saturazione, limitando così la modulazione fine del segnale14. Tuttavia, la stimolazione su piastra induce un crosslinking del TCR di intensità superiore a quella fisiologica e sostenuto nel tempo, il quale differisce fondamentalmente dall'interazione transitoria e dipendente dall'affinità indotta dai complessi peptidici-MHC presenti sulle cellule presentanti l'antigene. Sebbene più fisiologicamente rilevante, la stimolazione basata su pMHC è tecnicamente complessa, richiede competenze specialistiche per la produzione di multimeri e comporta costi notevolmente più elevati. Per l'isolamento cellulare, abbiamo utilizzato una selezione immunomagnetica negativa, che risulta semplice, rapida ed economica. Sebbene garantisca una purezza inferiore rispetto alla FACS, questo metodo evita lo stress meccanico e l'etichettatura fluorescente che potrebbero compromettere lo stato fisiologico delle cellule ordinate20,21.

I problemi principali che possono verificarsi durante l'esecuzione del protocollo includono bassa purezza del sorting, debole proliferazione, citotossicità indotta dal CTV, scarsa vitalità dopo la coltura e colorazione non uniforme. In caso di bassa purezza, assicurarsi di mescolare adeguatamente le cellule con il cocktail di anticorpi biotinilati e le microsferette rivestite di streptavidina, prolungare il tempo di separazione magnetica se necessario e ottimizzare il rapporto microsferette-anticorpo per ogni nuovo lotto di reagenti. Se si osserva una proliferazione minima anche alla concentrazione più elevata di anti-CD3, verificare la vitalità e la purezza (in particolare la contaminazione da cellule CD44hi) delle cellule naive isolate, controllare la procedura di rivestimento con anti-CD3 (sigillare le piastre con pellicola durante l'incubazione notturna a 4 °C e assicurarsi di avere una copertura uniforme di anticorpo) e validare la concentrazione di IL-2, poiché questa citochina è essenziale per sostenere l'espansione delle cellule T. Per ridurre la citotossicità indotta dal CTV, diminuire la concentrazione di colorazione mantenendo comunque una chiara risoluzione dei picchi di divisione e assicurarsi che il passaggio di blocco venga eseguito rigorosamente sul ghiaccio per l'intero periodo di 5 minuti, al fine di rimuovere il colorante libero residuo22,23. In caso di scarsa vitalità dopo la coltura, controllare la densità cellulare, assicurarsi di utilizzare un volume sufficiente di mezzo e mantenere una tecnica asettica. Se si osserva una colorazione non uniforme o una elevata variabilità citofluorimetrica, preparare i cocktail di anticorpi come miscele master, proteggere tutti i campioni colorati dalla luce e utilizzare gli stessi lotti di anticorpi e gli stessi lotti di colorante vitale fissabile tra i replicati.

Tuttavia, questo protocollo presenta alcune limitazioni. In quanto sistema in vitro, non è in grado di riprodurre il complesso microambiente tissutale, le interazioni cellulari o l'ambiente di citochine degli organi linfoidi secondari. La finestra temporale di coltura è limitata a 48 h, il che restringe l'analisi agli eventi precoci di attivazione ed esclude la valutazione della differenziazione tardiva, dell'esaurimento o della formazione della memoria. Inoltre, il protocollo si basa fortemente su letture mediante citometria a flusso, che richiedono una rigorosa standardizzazione delle impostazioni dello strumento, delle matrici di compensazione e delle strategie di gating tra esperimenti indipendenti. Inoltre, i risultati ottenuti con questo sistema basato sull'anti-CD3/CD28 derivano esclusivamente da linfociti T CD8+ e potrebbero non essere direttamente estendibili ai linfociti T CD4+, i cui livelli di attivazione, requisiti di co-stimolazione e traiettorie di differenziazione successive sono noti per essere diversi12,24,25. In aggiunta, lo stato basale di attivazione dei linfociti T può variare tra diverse colonie di topi a causa delle differenze nella microflora commensale, costituendo una potenziale fonte di variabilità tra laboratori che deve essere considerata nell'interpretazione dei risultati tra diversi studi.

Il sistema di stimolazione graduata descritto in questo studio consente ai ricercatori di modulare la forza del segnale del TCR in base a specifici obiettivi sperimentali, a seconda dei diversi modelli di risposta osservati nei vari esiti misurati. Questi dati mostrano che la scelta della concentrazione di anti-CD3 e del momento del prelievo deve essere guidata dalla domanda biologica specifica. Per i marcatori precoci di attivazione, l'upregolazione di CD69 è rilevabile già a 6–12 h a tutte le concentrazioni, ma con cinetiche distinte: concentrazioni elevate (5–10 µg/mL) inducono un picco rapido seguito da un calo, mentre concentrazioni basse (0,5–1 µg/mL) determinano un aumento graduale e sostenuto. Per i saggi di proliferazione, concentrazioni inferiori a 1 µg/mL risultano subottimali e possono essere utilizzate come controlli negativi interni, mentre concentrazioni di 5–10 µg/mL inducono in modo affidabile una marcata espansione clonale, rilevabile mediante diluizione del CTV a 48 h. L'espressione del recettore co-inibitorio PD-1 e della molecola co-stimolatoria ICOS richiede una stimolazione ad alta intensità (5–10 µg/mL) e raggiunge il massimo a 36 h, indicando che studi su queste molecole dovrebbero evitare condizioni con tempi più precoci o dosi più basse. Per gli esiti funzionali effettori (TNF-α e Granzima B), la relazione tra intensità della stimolazione e produzione di citochine dipende dal tempo e segue un andamento biphasico distinto. A 24 h, la produzione di molecole effettrici aumenta in modo proporzionale alla concentrazione di anti-CD3, con dosi più elevate che determinano una maggiore produzione di citochine. Entro 48 h, tuttavia, sebbene i livelli assoluti di cellule produttrici di citochine siano notevolmente più elevati in tutte le condizioni rispetto a 24 h, la relazione dose-risposta si inverte: concentrazioni di stimolazione più basse (0,5–1 µg/mL) producono frequenze relativamente più elevate di cellule TNF-α⁺ Granzima B⁺ rispetto a dosi elevate (5–10 µg/mL). Questa inversione suggerisce che una segnalazione TCR intensa e prolungata, nonostante promuova inizialmente la differenziazione effettore, possa imporre un limite relativo al mantenimento della capacità produttiva di citochine per cellula, riflettendo probabilmente l'insorgenza di una condizione di esaurimento o iporesponsività indotta dall'attivazione.

Nel complesso, queste osservazioni empiriche collocano il nostro protocollo come un quadro di riferimento che consente agli utenti di preselezionare le condizioni di stimolazione in base a specifici endpoint finali, migliorando così l'efficienza della progettazione sperimentale e l'interpretabilità dei dati. Oltre agli studi meccanicistici di base, questo sistema può inoltre guidare l'ottimizzazione dei protocolli di espansione dei linfociti T per l'immunoterapia adottiva, in cui una regolazione precisa dell'intensità del segnale del recettore dei linfociti T (TCR) potrebbe favorire la differenziazione verso fenotipi effettrici o di memoria desiderabili26,27,28.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation of China (n. T2394504, LY) e dal fondo per l'avvio della ricerca del Chief Scientist Lilin Ye (n. R2045, LY).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta conica da 15 mLLabgicCD-002-15AProvetta conica sterile da 15 mL per centrifuga
Paraformaldeide al 4%BeyotimeP0099Fissativo acquoso al 4% per la conservazione delle cellule prima della colorazione
Piastra da 60 mmLabgic12211Piastra da coltura cellulare da 60 mm
Filtro cellulare da 70 µmLabgicBS-70-CSFiltro in rete di nylon da 70 µm per la preparazione di sospensioni cellulari singole
Piastra da 96 pozzetti a fondo rotondoBeyotimeFPT016Piastra da 96 pozzetti a fondo rotondo per coltura cellulare e colorazione
Buffer di lisi ACKBeyotimeC3702Buffer di lisi dei globuli rossi a base di cloruro di ammonio
Anti-mouse CD25Biolegend101910Anticorpo anti-mouse CD25 coniugato con APC, clone 3C7, per citometria a flusso
Anti-mouse CD28Bio X CellBE0015-1Anticorpo anti-mouse CD28 purificato, clone 37.51, per costimolazione dei linfociti T
Anti-mouse CD3Bio X CellBP0001-1Anticorpo anti-mouse CD3ε purificato, clone 145-2C11, per attivazione dei linfociti T
Anti-mouse CD69BD Biosciences553237Anticorpo anti-mouse CD69 coniugato con PE, per colorazione del marcatore di attivazione
Anti-mouse CD8Invitrogen17-0081-82Anticorpo anti-mouse CD8a coniugato con APC, clone 53-6.7, per citometria a flusso
Anti-mouse GZMBBiolegend372212Anticorpo anti-granzima B umano/mouse coniugato con PerCP/Cyanine5.5, clone QA16A02, per citometria a flusso intracellulare
Anti-mouse ICOSBD Biosciences565886Anticorpo anti-mouse ICOS (CD278) coniugato con BV421, per citometria a flusso
Anti-mouse PD-1Biolegend135220Anticorpo anti-mouse PD-1 (CD279) coniugato con BV605, clone 29F.1A12, per citometria a flusso
Anti-mouse TNF-αInvitrogen46-7321-82Anticorpo anti-mouse TNF-α coniugato con PerCP-eFluor 710, clone MP6-XT22, per citometria a flusso intracellulare
Anti-mouse/human CD44Biolegend103030Anticorpo anti-mouse/human CD44 coniugato con PE/Cyanine7, clone IM7, per citometria a flusso
Biotina anti-mouse CD11bBiolegend101204Anticorpo anti-mouse CD11b coniugato con biotina per deplezione di linea cellulare
Biotina anti-mouse CD11cBiolegend117304Anticorpo anti-mouse CD11c coniugato con biotina per deplezione di linea cellulare
Biotina anti-mouse CD16/32Biolegend156604Anticorpo anti-mouse CD16/32 coniugato con biotina per deplezione di linea cellulare
Biotina anti-mouse CD19Biolegend115504Anticorpo anti-mouse CD19 coniugato con biotina per deplezione di linea cellulare
Biotina anti-mouse CD4Biolegend100508Anticorpo anti-mouse CD4 coniugato con biotina per deplezione di linea cellulare
Biotina anti-mouse CD44Biolegend103004Anticorpo anti-mouse CD44 coniugato con biotina per deplezione di linea cellulare
Biotina anti-mouse CD45RBiolegend103204Anticorpo anti-mouse CD45R/B220 coniugato con biotina per deplezione di linea cellulare
Biotina anti-mouse CD49bInvitrogen13-5971-85Anticorpo anti-mouse CD49b coniugato con biotina per deplezione di linea cellulare
Biotina anti-mouse F4/80Biolegend123106Anticorpo anti-mouse F4/80 coniugato con biotina per deplezione di linea cellulare
Biotina anti-mouse Ly6GBiolegend127604Anticorpo anti-mouse Ly6G coniugato con biotina per deplezione di linea cellulare
Biotina anti-mouse NK1.1Biolegend108704Anticorpo anti-mouse NK1.1 coniugato con biotina per deplezione di linea cellulare
Biotina anti-mouse TER119Biolegend116204Anticorpo anti-mouse TER-119 coniugato con biotina per deplezione di linea cellulare
Topi C57BL/6Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.N/ATopi maschi di 6–8 settimane utilizzati per gli esperimenti
Incubatore a biossido di carbonio (CO2)Thermo Fisher3120Incubatore umidificato a CO2 per coltura cellulare di mammiferi
Colorante CellTrace VioletInvitrogenC34557Colorante fluorescente violetto per il monitoraggio della proliferazione cellulare
DMSOSigmaD2650Dietilsolfossido; solvente per la preparazione di soluzioni stock di reagenti
Secondario anticorpo anti-IgG di coniglio (H+L) altamente adsorbito, secondario anticorpo anti-coniglio di asino, Alexa Fluor™ 488InvitrogenA-21206Secondario anticorpo anti-IgG di coniglio di asino coniugato con Alexa Fluor 488
D-PBSVivaCell BiosciencesC3590-0500Soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco’s per lavaggi e preparazione di reagenti
Siero fetale bovino (FBS)GibcoC11995500BTIntegratore sierico per mezzo di coltura cellulare di mammiferi
Colorante vitalizio fissabileInvitrogen65-0865-14Colorante vitalizio fissabile per escludere le cellule morte durante la citometria a flusso
Soluzione di fissazione e permeabilizzazioneBD Biosciences51-2090KZReagente di fissazione e permeabilizzazione per colorazione intracellulare
Piastra da 96 pozzetti a fondo piattoLabgic11510Piastra da 96 pozzetti a fondo piatto per coltura cellulare e saggi di stimolazione
Citometro a flussoBD BiosciencesLSRFortessa-3 laserCitometro a flusso a tre laser per acquisizione multicolore di fluorescenza
Golgi PlugBD Biosciences51-2301KZInibitore del trasporto proteico a base di brefeldina A per colorazione intracellulare di citochine
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZInibitore del trasporto proteico a base di monensina per colorazione intracellulare di citochine
Sale di calcio di ionomicinaSigmaI3909-1MLIonoforo del calcio utilizzato con PMA per stimolazione cellulare
Buffer Perm/WashBD Biosciences51-20911KZBuffer di permeabilizzazione e lavaggio per colorazione intracellulare
Phosflow Lyse/Fix BufferBD Biosciences558049Buffer 5× per lisi simultanea dei globuli rossi e fissazione dei leucociti
Phosflow Perm/Wash Buffer IBD Biosciences557885Buffer di permeabilizzazione a base di metanolo per colorazione intracellulare di fosfoproteine
Anticorpo monoclonale coniglio anti-fosfo-S6 proteina ribosomiale (Ser235/236) (D57.2.2E)Cell Signaling4858SAnticorpo monoclonale coniglio anti-fosfo-S6 proteina ribosomiale (Ser235/236), clone D57.2.2E
PMASigmaP1585-1MGForbolo 12-miristato 13-acetato; attivatore utilizzato per stimolazione cellulare ex vivo
Interleuchina-2 murina ricombinanteGibco200-02-50UGInterleuchina-2 murina ricombinante per coltura ed espansione dei linfociti T
RPMI 1640Life-LabAC01L064Mezzo Roswell Park Memorial Institute 1640 per coltura cellulare di mammiferi
Microsfera magnetica di streptavidinaBEAVER22307Microsfera magnetica rivestita con streptavidina per deplezione cellulare basata su anticorpi biotinilati
Buffer per colorazione in citometria a flussoNon specificatoNon specificatoBuffer per colorazione in citometria a flusso; fornitore o formula di preparazione non forniti
Parafilm M pellicola da laboratorioAmcorPM996Pellicola flessibile autoadesiva da laboratorio per sigillare piastre, provette e contenitori di coltura
Lyse/Fix BufferBD Biosciences558049Buffer 5× per lisi simultanea dei globuli rossi e fissazione dei leucociti
FlowJoBD Biosciencesv10.8.1Software, versione 10.8.1, per l'analisi dei dati di citometria a flusso

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