Effetto di Tuina sull'espressione ipotalamica di Orexin-A e sul comportamento del sonno in un modello ratto di insonnia primaria

Sommario

Questo studio indaga se Tuina allevia l'insonnia in un modello ratto regolando l'espressione dell'ipotalamico orexin-A, utilizzando saghi comportamentali, immunoistochimica e PCR quantitativa in tempo reale.

Abstract

L'insonnia è un disturbo del sonno comune che porta a una funzione diurna compromessa e a un aumento del rischio di comorbidità, influenzando significativamente la qualità della vita dei pazienti. I trattamenti attuali, principalmente la terapia cognitivo-comportamentale e la farmacoterapia, sono limitati da problemi come dipendenza da farmaci, tolleranza e rebound da astinenza. La terapia con Tuina ha dimostrato di regolare i sistemi nervoso, endocrino e immunitario, mentre il sistema delle oresine è un regolatore chiave del ciclo sonno-veglia. Questo ha spinto a esplorare se Tuina allevia l'insonnia modulando il sistema ipotalamico delle orexine. Questo protocollo descrive i metodi di intervento di Tuina in un modello ratto di insonnia primaria indotta dal metodo modificato dell'ambiente idrico a piattaforme multiple. Abbiamo randomizzato 64 ratti Wistar in quattro gruppi: controllo, modello, Tuina e antagonista dell'orexina. Sono state effettuate valutazioni comportamentali (test a campo aperto, test del sonno indotto da pentobarbital) e l'espressione di Orexin-A nell'ipotalamo è stata rilevata tramite PCR quantitativa in tempo reale e immunoistochimica. Il protocollo mira a valutare l'efficacia di Tuina e a indagare il suo potenziale meccanismo legato al sistema orexin, fornendo un riferimento per l'applicazione e lo studio meccanicistico di Tuina nei disturbi del sonno.

Introduzione

L'insonnia, caratterizzata da insoddisfazione per la durata o la qualità del sonno che porta a compromissioni diurne, è un problema di salute globale diffuso con un carico significativo per individui e sistemi^{sanitari 1,2}. In Cina, la prevalenza dell'insonnia è notevolmente elevata, aggravandone ulteriormente l'impatto sulla salute^{pubblica 3}. Questo disturbo è associato a una funzione cognitiva compromessibile, un aumento del rischio di malattie cardiovascolari e un'elevata comorbidità con condizioni psichiatriche come depressione e^{ansia 4,5}. La gestione clinica attuale si basa principalmente sulla terapia cognitivo-comportamentale e sulla farmacoterapia, in particolare benzodiazepine e sedativi-ipnotici non benzodiazepini. Tuttavia, la loro applicazione a lungo termine è limitata dalla dipendenza da farmaci, tolleranza, effetti residui diurni e sintomi da astinenza, evidenziando la necessità di alternative non farmacologiche^{efficaci 6}. Nella pratica clinica, Tuina è particolarmente adatta a pazienti con insonnia primaria cronica che cercano interventi non farmacologici, soprattutto per anziani ad alto rischio di dipendenza da farmaci, così come per donne in gravidanza o allattante⁷.

Come pilastro della terapia esterna della Medicina Tradizionale Cinese, Tuina ha dimostrato vantaggi unici nel trattamento^{dell'insonnia 8}. Le evidenze meta-analitiche mostrano che Tuina supera significativamente i farmaci o l'agopuntura da sola in tasso efficace totale (OR = 4,12), qualità del sonno e stati ansio-depressivi, con alta sicurezza⁹. I protocolli specifici di Tuina offrono vantaggi distinti: il Tuina tradizionale raggiunge l'89,5% di efficacia per l'insonnia di tipo flegma-calore, mentre il fregamento addominale riduce i tassi di ricaduta al 14,7% (contro il 38,2% del Tuina convenzionale⁾¹⁰. Il metodo Tuina in tre parti aumenta l'efficacia della terapia erboristica dall'80,49% al 92,68%, migliorando al contempo l'architettura del sonno e i profili dei^{neurotrasmettitori 11}. Studi clinici e revisioni sistematiche hanno confermato che Tuina può migliorare significativamente la qualità del sonno, ridurre i punteggi di ansia e depressione e modulare i livelli sierici di neurotrasmettitori come la 5-idrossitriptamina (5-HT)¹². Si ritiene che i suoi effetti terapeutici siano mediati dalla regolazione olistica della rete neuroendocrina-immunitaria. Le ricerche recenti si sono sempre più concentrate sul sistema dell'oresina, un sistema neuropeptidico chiave originario dell'ipotalamo laterale e fondamentale per promuovere e mantenere la^{veglia 13}. L'iperattività anomala dei neuroni dell'orexina è implicata nella fisiopatologia dell'insonnia, mentre l'inibizione di questa via ha mostrato potenziale^{terapeutico 14}. Evidenze preliminari suggeriscono che manipolazioni come lo sfregamento addominale possano influenzare i livelli cerebrali di Orexin-A nei ratti privati del^{sonno 12}, tuttavia manca un'indagine sistematica sul fatto che Tuina eserciti i suoi effetti anti-insonnia specificamente modulando il sistema delle orexine.

Pertanto, basandosi su un modello ratto di insonnia primaria, questo studio mira a: (1) Valutare il miglioramento del comportamento del sonno dopo un intervento standardizzato con Tuina tramite test comportamentali; e (2) Indagare il meccanismo sottostante esaminando se l'effetto di Tuina sia associato alla riduzione dell'espressione di Orexin-A nell'ipotalamo, confrontandone l'efficacia con quella di un antagonista del recettore dell'oresina. Questa ricerca mira a fornire prove sperimentali sul meccanismo centrale di Tuina nel trattamento dell'insonnia.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali e le valutazioni del benessere animale sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell'Università Medica dello Xinjiang (numero di approvazione etica: IACUC-20020158). Il protocollo segue le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione degli animali

1. Ratti Wistar liberi da patogeni specifici (SPF) della Casa 64 (peso corporeo 250 g ± 50 g, distribuzione pari tra sessi) in un sistema barriera SPF a 18–22 °C con un ciclo chiaro-buio di 12 ore. Fornisci cibo e acqua ad libitum.
2. Dopo 1 settimana di alimentazione adattativa, suddividere casualmente i ratti in 4 gruppi (n = 16 per gruppo): controllo (Gruppo A), modello (Gruppo B), Tuina (Gruppo C) e antagonista (Gruppo D).

2. Stabilizione del modello primario dell'insonnia

NOTA: Ad eccezione del Gruppo A, i ratti dei Gruppi B, C e D si sottopongono alla seguente procedura di modellazione.

1. Prepara un contenitore cilindrico in plastica (diametro superiore: 30 cm, altezza: 40 cm) come scatola per ratti.
2. Fissare una piattaforma cilindrica (diametro: 6 cm, altezza: 10 cm) sul fondo del contenitore.
3. Aggiungi acqua nel contenitore finché il livello dell'acqua non sarà di 1 cm sotto la superficie della piattaforma. Mantieni la temperatura dell'acqua a 20 °C.
4. Posizionare una rete di ferro circolare (diametro: 25 cm, dimensione della maglia: 1 cm) orizzontalmente all'interno del contenitore, a 15 cm sopra la piattaforma. Fissa la rete al bordo del contenitore usando sottili fili di ferro.
5. Metti acqua potabile e cibo sulla rete di ferro. Sostituisci l'acqua ogni giorno e pulisci e disinfetta il contenitore.
6. Posiziona un ratto per container sulla piattaforma per 8 giorni consecutivi.

3. Valutazione del modello utilizzando il test del sonno sinergico del pentobarbital sodio

1. La soluzione di sodio pentobarbital viene preparata introducendo direttamente acqua ultrapura. Pesare 1,0 g di polvere, aggiungere acqua ultrapura sterilizzata a 100 mL, sciogliere e filtrare a 0,22 μm per ottenere una soluzione all'1% (10 mg/mL).
2. Al nono giorno, iniettare a tutti i ratti intraperitonealmente una soluzione di pentobarbital sodio alla dose minima di soglia che induce il sonno (determinata negli esperimenti preliminari).
3. Registra la latenza del sonno (tempo dall'iniezione alla prima perdita del riflesso di raddrizzamento) e la durata del sonno (tempo dalla perdita al recupero del riflesso di riabilitazione). Definisci la perdita del riflesso di raddrizzamento per 1 minuto come inizio del sonno, e il suo recupero come fine del sonno.

4. Intervento Tuina

NOTA: Gli interventi iniziano il giorno successivo alla valutazione del modello di successo e continuano una volta al giorno per 14 giorni consecutivi. Il gruppo A e il gruppo B sono sottoposti a contenzione in un sistema di fissazione per 10 minuti al giorno. Gli operatori ricevono un addestramento rigoroso prima dell'esperimento per garantire coerenza nella forza, frequenza e ritmo.

1. Per il Gruppo C, fissare il ratto in posizione supina su un tavolo operatorio.
2. Fissa delicatamente i quattro arti del ratto usando le cinque dita della mano sinistra, estendendo completamente l'addome.
3. Eseguire la Tuina addominale con la mano destra: utilizzare la polpa della falange distale del dito medio per applicare forza sul punto Guanyuan (CV4, situato 25 mm sotto l'ombelico). Tieni le restanti quattro dita naturalmente estese.
4. Muovi il dito medio usando piccoli movimenti circolari anterolaterali dall'articolazione della spalla, eseguendo attrito traslazionale circolare in senso antiorario sull'addome.
5. Segui un percorso circolare chiuso formato da Jiuwei (CV15, 5 mm sotto il processo xifoide), Guanyuan (CV4) e punti bilaterali Daimai (GB26, punto medio tra l'estremità libera della^dodicesima costola e il bordo superiore della cresta iliaca).
6. Mantieni un movimento circolare fluido, costante e continuo a 5–7 cicli/minuto.
7. Esegui la manipolazione in senso antiorario per 5 minuti, poi la manipolazione in senso orario per 5 minuti.
8. Assicurati che la forza sia costante e ferma, mantenendo il ratto calmo e senza lottare. Applica l'intervento una volta al giorno per 14 giorni.

5. Amministrazione degli antagonisti

1. Per il Gruppo D, somministrare MK-4305 (10 mg/kg) con gavage intragastrico una volta al giorno per 14 giorni. Sciogliere MK-4305 in soluzione salina normale per preparare una soluzione da 5 mL.

6. Test in campo aperto

1. Dopo il periodo di intervento, eseguire il test in campo aperto utilizzando una scatola cubica nera (base: 100 cm × 100 cm, altezza: 40 cm). Dividere il pavimento in 25 quadrati uguali con linee grigie (16 periferiche, 9 centrali).
2. Posiziona il topo nel quadrato centrale e inizia a sincronizzare.
3. Registra la distanza totale percorsa, il numero di episodi di crescita e il tempo trascorso nell'area centrale per oltre 3 minuti utilizzando un sistema di acquisizione dell'immagine.
4. Dopo ogni test, rimuovere le feci e pulire il pavimento e le pareti interne con il 75% di etanolo.
5. Funzionamento del sistema di acquisizione immagini
   1. Configura il sistema di acquisizione delle immagini. Montare una fotocamera digitale CCD (risoluzione: 1280 × 720 pixel; frame rate: 25 fps) verticalmente 1,5 m sopra il campo aperto. Collega la fotocamera a un computer tramite un'interfaccia USB.
   2. Configura il software di tracciamento e le impostazioni di analisi. Esegui il tracciamento automatico utilizzando software di analisi video comportamentale. Imposta i parametri di tracciamento come segue:
      1. Definisci il focus di tracciamento come il punto centrale (centro di massa) del ratto.
      2. Imposta il frame rate a 25 fps sia per l'acquisizione che per l'analisi dell'immagine.
      3. Calibrare la risoluzione spaziale in modo che ogni pixel corrisponda a 1,5 mm di distanza reale in base alle dimensioni del campo aperto e alla risoluzione video.
      4. Imposta la soglia di sottrazione dello sfondo a 15 livelli di grigio (intervallo: 0–255) per distinguere il ratto dallo sfondo.
      5. Imposta la durata minima dell'evento a 0,2 s (5 fotogrammi) per minimizzare i rilevamenti di falsi positivi causati dal rumore.
      6. Dividere virtualmente il campo aperto in 5 × 5 quadrati di uguale area (Zone 1–25). Definire la zona centrale come Zone 7, 8, 9, 12, 13, 14, 17, 18 e 19 (le 3 × 3 quadrate centrali, che rappresentano il 36% dell'area totale). Definisci la zona periferica come i quadrati rimanenti.
   3. Registra i seguenti parametri di output: distanza totale percorsa (mm), velocità media (mm/s), tempo trascorso immobile (s), tempo trascorso in movimento (s), tempo trascorso in ciascuna zona(s), distanza percorsa in ciascuna zona (mm), numero di ingressi in ciascuna zona e numero di episodi di rialzatura. Verifica manualmente gli episodi di allevamento.

7. Perfusione per immunoistochimica

NOTA: Utilizzare 4 ratti di ciascun gruppo per immunoistochimica.

1. Prepara soluzione salina allo 0,9% (preriscaldata a 37 °C) e una soluzione di paraformaldeide al 4% (conservata a 4 °C).
2. Anestetizzare profondamente i ratti con uretano intraperitoneale (soluzione al 25%, 0,6 mL/100 g di peso corporeo). Conferma la perdita dei riflessi pedali, corneali e di raddrizzamento.
3. Fissa il ratto supino su una tavola di schiuma. Apri rapidamente la cavità toracica tagliando pelle, fascia e sterno.
4. Ritrae delicatamente il cuore per esporre l'aorta. Inserire un ago attraverso l'apice ventricolare sinistro nell'aorta finché la punta dell'ago non sarà visibile nel lumen aortico. Assicurati che ago, ventricolo sinistro e aorta siano allineati orizzontalmente.
5. Clampa aorta e ago insieme con una pinza emostatica. Taglia immediatamente l'atrio destro per permettere il flusso sanguigno.
6. Perfondere con 150–200 mL di soluzione salina preriscaldata allo 0,9% (37 °C). La perfusione riuscita è indicata dall'imbiancamento del fegato, del mesentere e degli arti anteriori, e da liquido trasparente dall'atrio destro.
7. Passa a paraformaldeide freddo al 4% (4 °C) e perfuso 400 mL. Eseguire rapidamente la perfusione iniziale fino a quando non si verificano fascicolazioni muscolari a tutto il corpo e irrigidimento degli arti. Poi riduci la portata a 2 gocce/s finché tutto il fissativo non è perfuso.
8. Conferma la fissazione efficace quando il cervello appare pallido e duro.

8. Dissezione cerebrale

1. Dopo la perfusione, decapita il ratto e rimuovi con cura tutto il cervello dal cranio.
2. Incisci il cranio lungo la sutura sagittale usando delle forbici. Rimuovere le ossa parietali e occipitali con le ossa rongeurs.
3. Sollevare delicatamente il cervello con una spatola, recidendo i nervi cranici e ottici con forbici sottili.
4. Per l'immunoistochimica: trasferire immediatamente l'intero cervello nel paraformaldeide al 4% e fissare a 4 °C per 24 ore.
5. Per la PCR quantitativa in tempo reale: risciacquare la superficie cerebrale con soluzione salina pre-raffreddata, asciugare con carta filtrante, congelare in azoto liquido per 5–10 minuti e conservare a –80 °C. Esegui tutti i passaggi sul ghiaccio.

9. Colorazione immunoistochimica

1. Inserire tessuto ipotalamico nella paraffina e tagliare sezioni coronali a spessore 4–5 μm utilizzando un microtomo. Montare le sezioni su slitte anti-caduta, cuocere a 65 °C per 1,5–2 ore.
2. Sezioni di dewax in xilene I e II (10 min ciascuna). Reidratare con etanolo classificato: etanolo anidro I e II (5 min ciascuno), poi 95%, 90%, 80%, 70% etanolo (5 min ciascuno), infine acqua distillata (5 min).
3. Esegui il recupero dell'antigene inserendo sezioni in un tampone bollente di citrato di 0,01 M (pH 6,0) in una pentola a pressione. Riscalda finché la valvola di pressione non aumenta, poi spegni il riscaldamento. Lascia ammollare per 10 minuti, poi raffredda naturalmente a temperatura ambiente.
4. Inattivare la perossidasi endogena immergendo sezioni in H₂O₂ fresco al 3% per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare 3× con PBS (5 min ciascuno).
5. Cerchia il tessuto con una penna per immunoistochimica. Applicare anticorpi policlonali anti-HCRT/Orexin-A (diluizione 1:50, ~50 μL per vetrino). Incubare durante la notte a 4 °C in una scatola umidificata.
6. Il giorno dopo, riscalda a temperatura ambiente per 20 minuti. Lavare 3× con PBS (5 min ciascuno).
7. Applicare un anticorpo secondario marcato con perossidasi di rafano. Incubare 20 minuti a temperatura ambiente. Lava 3× con PBS (3 min ciascuno).
8. Applicare una soluzione operativa di streptavidina marcata con perossidasi di rafano. Incubare 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare 3× con PBS (5 min ciascuno).
9. Prepara la soluzione cromogenica DAB (0,85 mL di acqua distillata + 50 μL ciascuno dei reagenti A, B, C). Applicare su sezioni e sviluppare per 3–10 minuti a temperatura ambiente, monitorando al microscopio. Ferma la reazione immergendola nell'acqua del rubinetto per 3 minuti.
10. Controcolora con ematossilina per 3 minuti. Differenziare nell'alcol acido cloridrico all'1% per 1–2 secondi. Blu nell'acqua del rubinetto per 5 minuti.
11. Disidratare tramite acqua distillata (3 minuti), 70%, 80%, 90%, 90%, 95% etanolo (3 min ciascuno) e etanolo anidro I e II (5 min ciascuno). Trasparenti in xilene I e II (5 min ciascuno).
12. Applica balsamo neutro e copertura. Secco durante la notte a 37 °C.
13. Osserva e fotografa le sezioni con un microscopio onico (40×, 100×, 200×, 400×). Contare le cellule positive a Orexin-A (precipitato granulare marrone nel citoplasma) utilizzando ImageJ.
14. Calcola il punteggio totale (0–12) come punteggio di intensità di colorazione (0 = negativo, 1 = giallo chiaro, 2 = marrone chiaro, 3 = marrone scuro) moltiplicato per percentuale positiva della cella (0 = 0%, 1 = 1–25%, 2 = 26–50%, 3 = 51–75%, 4 = 76–100%). Definisci 1–5 come bassa espressione, 6–12 come alta espressione.

10. PCR quantitativa in tempo reale per l'mRNA di Oresina-A

1. La lavorazione dell'RNA dopo lo scongelamento dei tessuti deve essere eseguita in condizioni prive di RNasi. I requisiti specifici senza RNase sono i seguenti:
   1. Ambiente di lavoro: Utilizzare un'area di lavoro dedicata all'RNA che è stata pulita con un decontaminante RNasi ed esposta all'irradiazione UV.
   2. Consumabili: Utilizzare tubi centrifughe certificati e punte di pipetta senza RNasi, oppure, immergerli in acqua DEPC allo 0,1% seguita dall'autoclav.
   3. Reagenti: Utilizzare tampone di lisi senza RNasi e acqua trattata con DEPC.
   4. Operazione: Indossare guanti senza polvere durante tutta la procedura, cambiare guanti frequentemente ed evitare il contatto diretto con l'interno dei consumabili e dei campioni.
   5. Procedura sperimentale
      NOTA: Durante le fasi di estrazione e trascrizione inversa dell'RNA, tutti i consumabili e strumenti che entrano in contatto con reagenti di RNA o trascrizione inversa devono essere privi di RNasi. Nella fase di amplificazione PCR, poiché il cDNA è una struttura a doppio filamento e la RNasi non può degradare il DNA a doppio filamento, consumabili e strumenti in questa fase devono essere privi solo di DNasi e altre impurità che potrebbero inibire le reazioni PCR; non è necessario un trattamento aggiuntivo senza RNasi. Macinare tessuto ipotalamico congelato sotto azoto liquido. Pesa 50–100 mg di polvere di tessuto in un tubo con 1 mL di Trizol. Mescola e lascia a temperatura ambiente per 15 minuti.
2. Aggiungi 200 μL di cloroformio, mescola per inversione e lascia a temperatura ambiente per 5 minuti. Centrifugare a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
3. Trasferire la fase acquosa superiore in un nuovo tubo. Aggiungi lo stesso volume di isopropanolo, mescola e lascia a –20 °C per 35 minuti. Centrifugare a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Scartate il soprannatante.
4. Lavare il precipitato con etanolo al 75%, centrifugare a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Scarta il soprantantante e ripeti il lavaggio una volta.
5. Precipitazione ad aria a temperatura ambiente. Sciogliere in acqua priva di RNasi.
6. Misurare la concentrazione e la purezza dell'RNA (rapporto A260/A280 1,8–2,1). Valuta l'integrità tramite elettroforesi gel dell'agarosio all'1% (bande 28S e 18S chiare, banda 5S debole o assente).
7. Preparare la reazione di tracrizione inversa (20 μL): 800 ng di RNA totale, 1 μL Primer Casuale (0,1 μg/μL), 10 μL 2× Mix di reazione TS, 1 μL Mix enzimatico TransScript RT/RI, 1 μL di Dissolvere gDNA e acqua a volume senza RNasi.
8. Incubare a 25 °C per 10 minuti, poi 85 °C per 5 secondi per sintetizzare il cDNA del primo filamento. Diluire cDNA 1:1 con acqua priva di RNasi.
9. Preparare la reazione qPCR (10 μL): 5 μL EvaGreen 2× qPCR MasterMix, 0,3 μL primer diretto (10 μM), primer inverso da 0,3 μL (10 μM), 1 μL template cDNA, acqua senza RNase al volume. Funziona in triplice.
   NOTA: Primer: Orexin-A-F: 5'-CGCCAGAAGGTGTTCCT-3'; Orexin-A-R: 5'-GCCGCTTTCCCAGAGTGAG-3' (lunghezza del prodotto 88 bp); β-Actin-F: 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'
   β-Actin-R: 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (lunghezza del prodotto 150 bp).
10. Eseguire il programma qPCR: 95 °C per 30 secondi (pre-denaturazione); 40 cicli a 95 °C per 5 secondi (denaturazione) e 60 °C per 30 secondi (ricottezza/estensione).
11. Verifica le curve di amplificazione e fusione. Eseguire 5 μL di prodotto su gel di agarosio al 2% per confermare la specificità.
12. Calcola l'espressione relativa dell'mRNA di Oressina-A utilizzando il metodo 2^⁻ΔΔCt con β-Actin come controllo interno.

11. Analisi statistica

1. Usa SPSS 26.0 per l'analisi dei dati. Esprimi tutti i dati come media ± deviazione standard. Per confronti tra due gruppi, si usano campioni indipendenti t-test se i dati sono normalmente distribuiti; altrimenti usa il test Mann-Whitney U.
2. Per confronti tra più gruppi, si utilizza ANOVA unidirezionale con test post-hoc LSD per varianze omogenee o il test di Tamhane per varianze eterogenee. Se i dati non sono normalmente distribuiti, si utilizza il test H di Kruskal-Wallis. Considera P < 0,05 statisticamente significativo.

Risultati

La Tabella 1 mostra che, rispetto al gruppo A, la latenza del sonno nei gruppi B, C e D era significativamente prolungata e la durata del sonno si è significativamente ridotta dopo la modellazione, indicando che il modello primario del ratto insonniale è stato stabilito con successo. I risultati della Tabella 2 e della Tabella 3 offrono un supporto preliminare sull'effetto terapeutico di Tuina nel trattamento dell'insonnia. Il Test di Campo Aperto (OFT) è uno dei paradigmi più classici e comunemente utilizzati nelle neuroscienze comportamentali per valutare comportamenti simili all'ansia nei^{roditori 15}. Gli studi hanno dimostrato che la preferenza per l'area dei quattro angoli è un indicatore sensibile per misurare comportamenti simili all'ansia, e può essere più discriminatoria rispetto all'indicatore dell'area centrale in caso di ansia da moderati a bassi. I ratti modello per insonnia hanno mostrato comportamenti significativi simili all'ansia e^{cambiamenti 16,17} nel comportamento esplorativo, mentre l'intervento di Tuina ha efficacemente alleviato i comportamenti simili all'ansia in questi ratti. I risultati di biologia molecolare presentati nelle Tabelle 4, 5 e nella Figura 1 dimostrano ulteriormente che Tuina regola efficacemente la sovraespressione di Orexin-A nell'ipotalamo dei ratti modello di insonnia.

Figura 1: Risultati della colorazione immunoistochimica di Orexin-A nell'ipotalamo dei ratti di ciascun gruppo (40×, 100×, 200×, 400×). (A) Neuroni Orexin-A positivi sono stati osservati nel tessuto ipotalamico del ratto, apparendo come segnali granulari marrone scuro. Il punteggio di intensità della colorazione era di 3 punti, la percentuale di cellule positive era del 40% (rientrando nell'intervallo 26%–50%, con 2 punti), e il punteggio totale era di 6 punti, che rientra nell'intervallo di massima espressione. (B) Il numero di neuroni positivi all'Orexin-A nel tessuto ipotalamico del ratto è aumentato significativamente rispetto al gruppo normale, con una distribuzione più densa di cellule positive. Il punteggio di intensità della colorazione era di 3 punti (marrone scuro), la percentuale di cellule positive ha raggiunto l'80% (rientrando nell'intervallo 76%–100%, con un punteggio di 4 punti), e il punteggio totale è stato di 12 punti, che rientra nell'intervallo di massima espressione. (C) Il numero di neuroni positivi all'Oresina-A nel tessuto ipotalamico del ratto è stato ridotto rispetto al gruppo modello. Il punteggio di intensità della colorazione era di 3 punti (marrone scuro), la percentuale di cellule positive era del 75% (rientrando nell'intervallo 51%–75%, con 3 punti), e il punteggio totale era di 9 punti, che rientra nell'intervallo di massima espressione. (D) Il numero di neuroni positivi all'Oresina-A nel tessuto ipotalamico del ratto è stato anch'esso ridotto rispetto al gruppo modello. Il punteggio di intensità della colorazione era di 3 punti (marrone scuro), la percentuale di cellule positive era del 60% (rientra nell'intervallo 51%–75%, con un punteggio di 3 punti) e il punteggio totale era di 9 punti, che rientra nell'intervallo di massima espressione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gruppo	Latenza del sonno / min	Durata del sonno / min
A	4.13 ± 1.80	49,75 ± 38,46
B	6.31 ± 2.80*	22.13 ± 11.41*
C	6.33 ± 2.60*	24,93 ± 14,43*
D	6,53 ± 1,90*	24.73 ± 17.59*

Tabella 1: Confronto dei test del sonno indotti dal pentobarbital sodio tra gruppi dopo la modellazione. * indica P < 0,05 rispetto al gruppo di controllo.

Gruppo	Frequenza di allevamento	Tempo di immobilità	Tempo(s) di locomozione	Distanza di locomozione (m)	Tempo nella Zona Centrale (S)	Distanza nella Zona Centrale (m)	Tempo nella Zona d'Angolo	Distanza nella Zona d'Angolo (m)	Tempo nella Zona d'Angolo	Distanza nella Zona Laterale (m)
A	1.875 ± 0.835	76.700 ± 34.324	103.350 ± 34.307	18.318 ± 16.314	8.750 ± 7.718	2.937 ± 5.112	103.000 ± 28.582	6.315 ± 3.893	56.600 ± 27.772	6.705 ± 3.666
B	7.125 ± 5.668	31.513 ± 10.964	148.488 ± 10.964	22.399 ± 9.159	16.275 ± 10.703	3.244 ± 2.991	75.088 ± 21.561	6.578 ± 1.972	85.463 ± 23.374	11.724 ± 4.959
Valore T	-2.592	3.547	-3.545	-0.617	-1.613	-0.146	2.205	-0.171	-2.249	-2.302
Valore P	0.035	0.007*	0.007*	0.547	0.129	0.886	0.045*	0.867	0.041*	0.037*

Tabella 2: L'analisi dell'influenza di ciascun livello indicatore tra il gruppo di controllo (A) e il gruppo modello (B).* indica P < 0,05 rispetto al gruppo di controllo.

Gruppo	Frequenza di allevamento	Tempo di immobilità	Tempo(s) di locomozione	Distanza di locomozione (m)	Tempo nella Zona Centrale (S)	Distanza nella Zona Centrale (m)	Tempo nella Zona d'Angolo	Distanza nella Zona d'Angolo (m)	Tempo nella Zona d'Angolo	Distanza nella Zona Laterale (m)
B	5.875 ± 2.295	29.819 ± 12.871	150.219 ± 12.867	19.165 ± 8.054	24.838 ± 13.068	3.178 ± 2.438	69.075 ± 13.992	5.823 ± 1.422	83.019 ± 15.464	9.878 ± 4.393
C	6.357 ± 0.627	35.993 ± 32.237	144.021 ± 32.246	23.291 ± 4.873	14.321 ± 3.774	3.106 ± 2.214	87.057 ± 12.658 △	8.087 ± 1.496 △	68.943 ± 9.240	10.420 ± 1.225
D	6.667 ± 1.633	30.808 ± 15.389	149.200 ± 15.380	18.584 ± 4.969	27.792 ± 12.460	3.085 ± 1.114	74.600 ± 22.248	5.744 ± 1.291▲	74.192 ± 17.011	9.465 ± 3.380

Tabella 3: Analisi dell'influenza di ciascun livello indicatore tra il gruppo modello (B), il gruppo di Tuina (C) e il gruppo antagonista (D). ^△P < 0,05 rispetto al gruppo di modelli (B); ^▲P < 0,05 rispetto al gruppo di Tuina (C).

Gruppo	Orexin-A
A	1.011 ± 0.173
B	10.436 ± 2.512△
C	2,392 ± 0,998▲
D	3.227 ± 1.703▲

Tabella 4: Livelli di espressione dell'mRNA di Oresina-A nel tessuto ipotalamo. ^△P < 0,05 rispetto al gruppo di controllo (A); ^▲P < 0,05 rispetto al gruppo di modelli(B).

Gruppo	Orexin-A
	Intensità della colorazione	Percentuale di cellule positive	Punteggio percentuale	Punteggio
A	3	40%	2	6
B	3	80%	4	12
C	3	75%	3	9
D	3	60%	3	9

Tabella 5: Punteggi di colorazione immunoistochimica di Orexin-A nell'ipotalamo dei ratti di ciascun gruppo. Criteri di punteggio per l'intensità della colorazione: 0 = colorazione negativa (incolore), 1 = giallo chiaro, 2 = marrone chiaro, 3 = marrone scuro. Percentuale di criteri di punteggio delle celle positive: 0 = 0%, 1 = 1%–25%, 2 = 26%–50%, 3 = 51%–75%, 4 = 76%–100%. Punteggio totale = punteggio di intensità di colorazione × punteggio percentuale. I punteggi totali da 1 a 5 sono stati definiti come bassa espressione, e i punteggi da 6 a 12 sono stati definiti come ad alta espressione.

Discussione

Questo studio mirava a valutare l'efficacia di Tuina in un modello di ratto insonnia primaria ed esplorare il suo potenziale meccanismo legato al sistema dell'orexina ipotalamica. I risultati attuali dimostrano che un protocollo standardizzato di Tuina ha migliorato significativamente la latenza e la durata del sonno, alleviato comportamenti simili all'ansia e ha efficacemente ridotto la sovraespressione di Orexin-A sia a livello di mRNA che di proteina nell'ipotalamo. In particolare, l'effetto di Tuina è stato paragonabile a quello dell'antagonista dei recettori dell'orexina MK-4305, suggerendo che la modulazione del sistema dell'orexina possa essere un meccanismo fondamentale attraverso cui Tuina allevia l'insonnia.

Rispetto agli interventi farmacologici, Tuina, come terapia esterna non invasiva, offre vantaggi in termini di sicurezza, effetti collaterali minimi e compliance per il paziente^12,18. I suoi benefici terapeutici per l'insonnia sono supportati da evidenze cliniche che mostrano miglioramenti nella qualità del sonno e nello stato^{psicologico 18,19}. Il meccanismo è multifaccettato, coinvolgendo la regolazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrenale, l'omeostasi del sistema nervoso autonomo e neurotrasmettitori chiave come 5-HT^18,20. I risultati ampliano questa comprensione individuando il sistema degli oresine come un obiettivo specifico. I neuroni dell'orexina sono motori centrali della veglia, e la loro ipereccitabilità è collegata all'instabilità del^sonno 21,22,23. La riduzione della regolazione dell'orossina-A osservata dopo Tuina sembra essere coerente con l'effetto del nuovo farmaco insonniale, antagonista del recettore doppio dell'oresina, evidenziando una possibile via convergente tra interventi farmacologici e non^{farmacologici 24,25}.

Sebbene questo studio si basi sul nostro lavoro precedentemente pubblicato riguardante la tuina addominale e la regolamentazione²⁵ dell'oresina-A, l'attuale manoscritto rappresenta un'estensione sostanziale e un perfezionamento metodologico oltre il rapporto originale. In particolare, questo studio amplia la dimensione del campione a 64 ratti per aumentare la potenza statistica e introduce una serie completa di valutazioni comportamentali, inclusi il test a campo aperto e i test del sonno indotti dal pentobarbital, per valutare sistematicamente l'architettura del sonno e i comportamenti simili all'ansia, che non erano stati affrontati nello studio precedente. A differenza del lavoro precedente, che si concentrava fortemente sullo stress ossidativo e sui neurotrasmettitori classici, questo articolo dà priorità alla validazione funzionale del sistema orexin attraverso risultati comportamentali integrati e saghi molecolari, fungendo da indagine meccanicistica autonoma che integra piuttosto che replicare i risultati precedenti.

Il disegno sperimentale aderiva alla teoria della MTC concentrandosi sull'addome e su punti di agopuntu specifici come Guanyuan (CV 4), che si ritiene tonifichi il Qi primordiale e regoli la funzione viscerale, all'interno di un percorso di manipolazione a ciclo^{chiuso 26,27}. I parametri (frequenza, durata, corso) sono stati standardizzati sulla base di lavori preliminari per garantire coerenza e riproducibilità, un aspetto cruciale per gli studi meccanicistici sugli^{animali 12}.

Tuttavia, questo protocollo presenta delle limitazioni. Innanzitutto, l'intervento è stato somministrato in un unico punto temporale post-modellazione. Studi futuri dovrebbero indagare diverse durate e frequenze di intervento per stabilire una relazione ottimale "dose-risposta" per Tuina. In secondo luogo, questo studio è un disegno di ricerca osservazionale. Sebbene sia stata riscontrata una correlazione tra Tuina e una riduzione dell'espressione di Orexin-A e il miglioramento comportamentale, non è ancora chiaro se questa associazione sia un effetto diretto o indiretto di Tuina o di altri fattori. Ricerche future potranno utilizzare strategie sperimentali come il knockout genico, l'inibizione chemogenetica o il blocco degli antagonisti per verificare ulteriormente se Tuina migliori il comportamento dell'insonnia regolando l'espressione di Orexin-A, chiarindone così il meccanismo causale. Infine, questo studio non ha stabilito un gruppo di controllo di intervento fittizio o intervento placebo. Tuttavia, questo studio ha tenuto conto di questo durante la progettazione, e tutti i gruppi di animali hanno ricevuto lo stesso livello di operazioni di presa e fissazione, che, in una certa misura, hanno controllato l'influenza di fattori di stress non specifici. Inoltre, la frequenza, l'intensità e il percorso d'azione del programma Tuina in questo studio sono stati standardizzati sulla base di esperimenti preliminari per garantire coerenza e riproducibilità dell'intervento. Le ricerche future dovrebbero concentrarsi sullo sviluppo di metodi di controllo più rigorosi, come l'uso di simulazioni senza contatto o stimolazione tattile minima, per chiarire gli effetti specifici delle operazioni Tuina.

I passaggi chiave per il successo di questo protocollo includono: innanzitutto, un rigoroso controllo della temperatura dell'acqua e delle dimensioni delle piattaforme nel metodo modificato dell'ambiente idrico multiplo a piattaforma multipla; secondo, titolazione pre-sperimentale della dose sub-soglia di pentobarbital sodico; terzo, la standardizzazione dei parametri di manipolazione di Tuina (frequenza di 5–7 cicli/min, manipolazione in senso antiorario e poi in senso orario per 5 minuti ciascuno) e l'addestramento degli operatori; e quarto, il rapido congelamento del tessuto ipotalamico in azoto liquido seguito da una manipolazione senza RNasi per garantire la stabilità dell'mRNA di Oresina-A.

Le possibili modifiche includono: innanzitutto, lo sviluppo di un dispositivo automatico Tuina meccanico per ridurre la variabilità tra operatori; secondo, l'uso della telemetria EEG/EMG per sostituire il test del sonno pentobarbitale sodico, consentendo il monitoraggio continuo della fase del sonno; e terzo, la combinazione di approcci chemogenetici o optogenetici per verificare la necessità dei neuroni orexin nella mediazione degli effetti del Tuina.

La riproducibilità di questo protocollo si basa su: traiettorie e parametri operativi dettagliati, l'uso di un farmaco di controllo positivo, la rilevazione a doppia dimensione sia a livello di proteina che di mRNA, e una rigorosa segnalazione statistica. La sua usabilità pratica si riflette nei seguenti aspetti: bassi requisiti di attrezzature per i test comportamentali senza la necessità di costosi sistemi di telemetria; un ciclo sperimentale totale di soli 8 giorni per la modellazione e 14 giorni per l'intervento Tuina, completato entro 4 settimane, che si allinea bene con i cicli di finanziamento e i tempi di laboratorio della maggior parte dei progetti di ricerca di routine, facilitando la rapida raccolta dei dati e la validazione metodologica. Inoltre, il protocollo di manipolazione di Tuina è chiaramente quantificato in termini di traiettoria operativa (CV15 → CV4 → GB26 bilaterale → ritorno a CV15), frequenza (5–7 cicli/min), sequenza direzionale (in senso antiorario seguito da orario) e durata (10 minuti per sessione). Queste specifiche permettono a diversi operatori di padroneggiare la tecnica dopo un breve addestramento, riducendo così il rischio di scarsa riproducibilità causata dalle differenze individuali comunemente osservate negli studi di manipolazione manuale.

Durante l'implementazione di questo protocollo, possono sorgere diversi problemi comuni e si raccomandano misure di risoluzione dei problemi appropriate. Innanzitutto, i ratti possono cadere dalla piattaforma durante la procedura modificata dell'ambiente idrico multiplo delle piattaforme. Questo è solitamente causato da una superficie della piattaforma eccessivamente scivolosa. La soluzione è rendere leggermente ruvida la superficie della piattaforma con carta vetrata fine per aumentare l'attrito. Inoltre, ogni contenitore dovrebbe ospitare un solo ratto per evitare disturbi reciproci. In secondo luogo, il test del sonno con pentobarbital sodio potrebbe non mostrare differenze significative tra i gruppi. La soluzione è ri-titolare la dose minima sub-soglia in incrementi di 5 mg/kg durante esperimenti pilota utilizzando una coorte separata di animali (3–4 per gruppo). Le iniezioni dovrebbero essere eseguite alla stessa ora ogni giorno (preferibilmente tra le 9:00 e le 11:00) per minimizzare la variazione circadiana. Terzo, i ratti possono lottare o vocalizzare durante la manipolazione del Tuina, il che tipicamente indica forza eccessiva o una contenzione impropria. L'operatore dovrebbe ridurre la forza applicata finché il ratto non rimane calmo senza lottare. Si raccomanda un addestramento pregresso con un manichino a rilevamento di pressione per standardizzare l'applicazione della forza. Il ratto dovrebbe essere posizionato supino con tutti e quattro gli arti fissati delicatamente ma in modo sicuro, garantendo la piena esposizione dell'addome. In quarto luogo, una grande variabilità nella percentuale di cellule positive all'Orexin-A all'interno dello stesso gruppo sperimentale deriva spesso da piani di sezione incoerenti nell'ipotalamo, bias di conteggio soggettivo o variazioni da batch a lotto nella colorazione. La soluzione raccomandata è standardizzare il livello anatomico facendo riferimento a un atlante cerebrale di ratto (ad esempio, Paxinos & Watson), raccogliendo sezioni coronali dal bregma –1,8 mm a –3,3 mm per l'analisi ipotalamica. Due osservatori indipendenti ciechi all'allocazione dei gruppi dovrebbero effettuare il conteggio delle celle e utilizzare il valore medio. Tutti i campioni per una determinata misura di risultato devono essere colorati nello stesso lotto, e si incoraggia un'analisi semi-automatica delle soglie tramite ImageJ per ridurre la soggettività degli osservatori.

In conclusione, questo studio ha stabilito un protocollo standardizzato di intervento Tuina e un sistema di valutazione multilivello in un modello primario di insonnia. Fornisce prove convincenti che Tuina migliora i comportamenti d'insonnia, potenzialmente attraverso un meccanismo che coinvolge la soppressione dell'ipotalamico Orexin-A. Questo quadro metodologico non solo offre un paradigma riproducibile per indagare i meccanismi centrali di Tuina, ma fornisce anche un riferimento per studi meccanicistici su altri interventi non farmacologici per i disturbi del sonno.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
5x All-In-One RT MasterMix	abm	G492	sintesi cDNA
Acetilcolina (Ach)	Nanjing Jiancheng	A105-1	reagente ELISA
Lamelle per microscopio di adesione	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	Montaggio sezioni tissutali
Agarosio	Sangon Biotech (Shanghai)	A811BA0014	Elettroforesi su gel
Etanolo anidro	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Disidratazione del tessuto
Diluente anticorpi	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9029	Diluzione anticorpo primario
Cestello	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	N/A	Porta vetrine
Polvere di citrato	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	MVS-0066	Preparazione del buffer di recupero antigene
Vetrina	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	Microscopia
Kit di colorazione DAB	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	DAB-1031	Rivelamento cromogenico
DEPC	Sangon Biotech (Shanghai)	B417BA0001	Trattamento privo di RNase
Dopamina (DA)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08660r	reagente ELISA
Cella per elettroforesi	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYCZ-21	Elettroforesi su gel
Alimentatore per elettroforesi	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYY-6C	Elettroforesi su gel
EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-Low Rox	abm	G891 / MasterMix-EL	reagente qPCR
Acido gamma-aminobutirrico (γ-GABA)	AMOKE	AE91068Ra	reagente ELISA per neurotrasmettitore
Sistema di imaging per gel	Shanghai Tanon	2500	Documentazione del gel
H2O2 (30%)	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Blocco perossidasi endogena
Soluzione di colorazione con ematossilina	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	CTS-1097	Contrcolorazione
Centrifughe a freddo ad alta velocità	Shanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd.	Nefuqe 15R	Centrifugazione del campione
Istidina (HIS)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	EH171-1	reagente ELISA
Forno a circolazione d'aria calda	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	Serie DHG	Essiccazione dei campioni
Camera di umidità per colorazione IHC	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	BOX-1001	Camera di incubazione umida
Kit per colorazione immunoistochimica	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	SP9000	Colorazione IHC
Incubatrice	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	DNP-9272	Incubazione a temperatura controllata
Fornello a induzione	Guangdong Midea Living Electric Manufacturing Co., Ltd.	C21-RK2101	Fonte di calore
Lettore di micropiastre	Bio-Rad, China	xMark	Misura dell'assorbanza
Microscopio	Nikon	E200	Immagini microscopiche
MK-4305	Meilun Bio	MB3773	Reagente sperimentale
Balsamo neutro	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9555	Medium di montaggio
Norepinefrina (NA)	Nanjing Jiancheng	H096	reagente ELISA
Quantificatore di acidi nucleici e proteine	Beijing Kaiao	K5500	Quantificazione degli acidi nucleici
Orexin A	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08860r	reagente ELISA
Ciclotermico per PCR	Bio-Rad, USA	MyCycler Thermal Cycler	Amplificazione PCR
Soluzione salina fosfata (PBS)	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PBS-0060/0061	Soluzione di lavaggio
Pipetta	Eppendorf, Germany	Dragon lab	Manipolazione di liquidi
Pentola a pressione	Zhejiang Supor Co., Ltd.	YW20F1	Recupero dell'antigene
Kit di quantificazione delle proteine	TransGen Biotech	DQ111-01	Kit di dosaggio proteico BCA
Anticorpo policlonale anti-HCRT (Orexin-A) di coniglio	Sangon Biotech (Shanghai)	D163595	Anticorpo primario
Strumento per PCR in tempo reale	ABI (Thermo Fisher)	QuantStudio 6 Flex	Analisi qPCR
Frigorifero	Hefei Meiling Co., Ltd.	BCD-249LCK	Conservazione del campione
Serotonina (5-HT)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08364r	reagente ELISA
Contenitore per colorazione vetrine	Generic	N/A	Contenitore per colorazione vetrine
Penna per immunoistochimica super	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PEN-0002	Penna per barriera idrofobica
Trans2K DNA Marker	TransGen Biotech	BM101	Scala di DNA
TRIzol Reagent	Ambion	15596026	Estrazione dell'RNA
Vortice	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.	GL-88B	Miscelatore da laboratorio
Xileno	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Deparaffinizzazione